一种基于HaCaT细胞对纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法与流程

本发明属于外用材料检测领域，具体涉及一种基于hacat细胞对纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法。

背景技术：

纳米tio2(nano-tio2)是一种广泛使用的纳米材料，主要用于化妆品、医药、环保、涂料等领域。纳米材料因为其独特优势如比表面积大、粒径小，在各行各业得到广泛使用，尤其是化妆品行业中，因为纳米二氧化钛具有吸收散射紫外光的特性，所以它被广泛运用到防晒霜当中。目前全世界每年用于化妆品的纳米tio2已达数千吨。也正是因为它的这些特性，可能会带来更大的危害，纳米二氧化钛对皮肤的安全性研究一直受到科研人员高度重视。

纳米tio2的危害主要在于它具有光催化性，尤其在紫外光下，它会产生大量的氧自由基(ros)，包括ho·、o2·^－和¹o2.正常条件下，ros对维持细胞正常功能，在胞内、胞间传递信号有重要作用；但是当氧自由基水平升高，远远超过自身正常水平，会给细胞损伤，破坏正常结构，影响功能。目前对于纳米二氧化钛在细胞水平的研究主要在于，ros会造成细胞膜完整性破坏，造成脂质过氧化，dna断裂，破坏线粒体的完整性，造成细胞骨架损坏，从而影响细胞的正常功能。但是作为细胞主要成分之一的糖类却鲜少有人研究它在纳米材料毒性中发生怎样的变化。糖以共价键与蛋白质或者脂质结合，形成糖蛋白，蛋白聚糖和糖脂，它们参与细胞识别与分化，细胞粘附，迁移等方面发挥作用。例如yin等人在2012年就发现nano-tio2造成的光毒性损伤随着紫外光(uv)的剂量和纳米材料的剂量增加而增加；粒径越小造成的损伤越大。它在uv光下会产生大量的ros，造成脂质蛋白质过氧化诱导细胞凋亡。

目前，报道的对于纳米二氧化钛的皮肤安全评价方法，涉及系统生物学层面，通过建立代谢网络，观察细胞代谢网络中不同代谢物的变化，寻找二氧化钛纳米颗粒影响细胞皮肤安全性的代谢标志物和作用靶点，全面解析二氧化钛纳米颗粒诱导细胞损伤的内在代谢通路。例如专利公开号为cn102373261a的专利公开了纳米二氧化钛的细胞安全评价，建立模型，根据细胞中差异代谢物的变化，构建代谢网络，然后探讨二氧化钛颗粒影响细胞的代谢机制，综合评价二氧化钛纳米颗粒与细胞皮肤安全性之间的关系。所述方法可以快速、准确地寻找到与二氧化钛纳米颗粒诱发代谢网络紊乱相关的关键代谢物，但是所述方法需要分析多个代谢途径的变化和统计分析，方法复杂，不能直接反应出安全评估结果。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于hacat细胞对纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法，步骤简单，能够直接反应出安全评估的结果。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于hacat细胞对纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法，包括以下步骤：

1)将hacat细胞接种在细胞培养基中培养，待所述hacat细胞生长至对数期进行消化，消化后的hacat细胞悬液进行贴壁培养24h，得到贴壁生长的hacat细胞；

2)将纳米二氧化钛分散在pbs缓冲液中，超声，得到纳米二氧化钛溶液；

3)将所述步骤2)中的纳米二氧化钛溶液稀释成若干浓度，分别加入到所述步骤1)得到的贴壁生长的hacat细胞中，培养21～22h，再紫外线照射30～60min；

4)将所述步骤3)中紫外线照射后的hacat细胞进行培养，将培养后的hacat细胞在mtt溶液中继续培养；将培养后的hacat细胞在dmso溶液中在492nm波长下测定吸光值，得到实验组结果；

设置调零组，所述调零组结果为仅先后包含dmem、mtt溶液和dmso的溶液测得的吸光度；

设置实验对照组，所述实验对照组结果为将hacat细胞依次经dmem，mtt溶液，dmso溶液处理后测得的吸光度值；

将所述实验组结果、调零组结果和实验对照组结果代入式i所示公式计算得到细胞存活率；

所述细胞存活率＝(odexp-odneg)/(odcon-odneg)×100％式i

其中odexp代表实验组吸光度值，odneg代表调零组吸光度值，odcon代表实验对照组吸光度值；

根据实验组中细胞存活率在50％～90％的纳米二氧化钛溶液的浓度作为潜在危险浓度；

5)用所述步骤4)中得到的潜在危险浓度的纳米二氧化钛溶液处理所述步骤1)中消化后的对数期hacat细胞21小时，得到的处理后的hacat细胞依次进行紫外线处理30～60min、继续培养2h、第一清洗、固定，向固定后的hacat细胞中加入fitc标记凝集素溶液，依次进行孵育、染色、第二清洗，测定清洗后的hacat细胞的荧光强度，得到hacat细胞的唾液酸表达水平；

设置调零组和实验对照组；所述调零组结果为仅先后包含纳米二氧化钛溶液、紫外照射和荧光染色，孵育、清洗后的溶液测得的荧光强度；所述实验对照组结果为将hacat细胞依次经纳米二氧化钛溶液、紫外照射和荧光染色，孵育、清洗后测得的荧光强度；将实验组结果、调零组结果和实验对照组结果代入式ⅱ中计算，得到相对荧光强度；

相对荧光强度＝(mfexp-mfneg)/(mfcon-mfneg)×100％式ⅱ

其中mfexp代表实验组荧光强度，mfneg代表调零组荧光强度，mfcon代表实验对照组荧光强度；

通过分析经过不同浓度下的纳米二氧化钛溶液和紫外光处理的hacat细胞中唾液酸表达水平与对照组之间是否有显著性差异，来判断细胞的损伤程度；

所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。

优选的，所述步骤3)和步骤5)中紫外线照射的功率为6～10w；所述紫外线的波长为365nm，所述紫外线的光源和hacat细胞之间距离为9～11cm。

优选的，所述步骤5)中fitc标记凝集素溶液为fitc标记的接骨木素溶液；所述fitc标记的接骨木素溶液的质量浓度为8～12μg/ml。

优选的，所述步骤5)中第一孵育的时间为50～70min。

优选的，所述步骤5)中第一清洗和第二清洗用溶液为pbs缓冲液。

优选的，所述步骤5)中固定用溶液为质量浓度为4％的多聚甲醛溶液；所述固定的时间为12～17min。

优选的，其特征在于，所述步骤5)中测定清洗后的hacat细胞的荧光强度的激发波长为488nm。

优选的，所述步骤1)中消化后的hacat细胞悬液的细胞浓度为1x10⁵/ml；所述步骤3)中纳米二氧化钛溶液的梯度浓度为10～1000μg/ml；所述纳米二氧化钛溶液的加入体积与hacat细胞贴壁培养时细胞培养基的体积相同。

优选的，所述步骤1)中细胞培养基是以dmem完全培养基为基础培养基，包含有质量百分含量为1％的青霉素、质量百分含量为1％的链霉素和质量百分含量为10％胎牛血清。

优选的，所述步骤2)中纳米二氧化钛的粒度为20～800nm；纳米二氧化钛的质量浓度在10～1000μg/ml。

本发明提供了一种基于hacat细胞对纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法，相较于传统的纳米二氧化钛的生物性评价方法主要针对遗传物质，蛋白质，脂质的变化以及生物学功能的影响，本发明的纳米二氧化钛的生物性评价方法是基于纳米二氧化钛在紫外光条件下诱导细胞损伤的多糖类物质(唾液酸属于多糖类物质)的变化，分析其变化的原因，有助于得到有效的评价纳米二氧化钛细胞生物性的手段和方法。通过本发明的实验结果可以看出，纳米二氧化钛材料不仅会对dna、蛋白质、脂质等产生影响，也会影响多糖的结构和功能，这有助于更加深入的了解纳米二氧化钛对细胞的影响，也能更客观、深入的研究它的机制；同时本发明也为纳米二氧化钛的安全使用提供可靠的科学依据，也为其他纳米材料的安全性评价提供参考。

附图说明

图1为实施例1中纳米二氧化钛和紫外线对hacat细胞存活率的影响；

图2为实施例2中hacat细胞经过纳米二氧化钛和紫外处理后细胞上的α-2,6唾液酸的表达变化；

图3为实施例2中hacat细胞经过纳米二氧化钛和紫外处理后细胞上的唾液酸相对荧光强度；

图4为实施例2中hacat细胞经过纳米二氧化钛和紫外线处理后细胞内产生的ros量的变化；

图5为实施例3中hacat细胞上α-2,6唾液酸的表达变化与ros的关系；

图6为实施例4中用荧光分光光度计进行定量细胞的d-甘露糖表达水平的变化；

图7为实施例5中纳米二氧化钛基因毒性检测实验结果；

图8为实施例6中纳米二氧化钛对hacat细胞的超氧化物岐化酶(sod)影响实验结果；

图9为实施例7中纳米二氧化钛对hacat细胞的超氧化物岐化酶(sod)影响实验结果；

图10为实施例8中纳米二氧化钛对hacat细胞的脂质过氧化检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种基于hacat细胞对纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法，包括以下步骤：

1)将hacat细胞接种在细胞培养基中培养，待所述hacat细胞生长至对数期进行消化，将消化后的hacat细胞进行贴壁培养24h，得到贴壁生长的hacat细胞；

2)将纳米二氧化钛分散在pbs缓冲液中，超声，得到纳米二氧化钛溶液；

3)将所述步骤2)中的纳米二氧化钛溶液稀释成若干浓度，分别加入到所述步骤1)得到的贴壁生长hacat细胞中，培养21～22h，紫外线照射30～60min；

4)将所述步骤3)中紫外线照射的hacat细胞进行培养，将培养后的hacat细胞在mtt溶液中继续培养；将培养后的hacat细胞在dmso溶液中测定吸光值作为实验组结果；

设置凋零组，所述调零组为仅包含dmem、mtt溶液和dmso的混合溶液测得的吸光度；

设置实验对照组，所述实验对照组为将hacat细胞依次经dmem，mtt溶液，dmso处理后测得的吸光度值；

将所述实验组结果、调零组结果和实验对照组结果代入式i中计算，得到细胞存活率；所述细胞存活率＝(odexp-odneg)/(odcon-odneg)×100％式i

其中odexp代表实验组，odneg代表调零组，odcon代表实验对照组；

将实验组中细胞存活率在50％～90％的纳米二氧化钛溶液的浓度作为潜在危险浓度；

5)用所述步骤4)中得到的潜在危险浓度的纳米二氧化钛处理所述步骤1)中消化后的对数期hacat细胞21小时，得到的处理后的hacat细胞依次进行紫外线处理30～60min，继续培养，第一清洗，固定，向固定后的hacat细胞中加入fitc标记凝集素溶液，依次进行孵育，染色，第二清洗，测定清洗后的hacat细胞的吸光度，得到hacat细胞的唾液酸表达水平；

设置调零组和实验对照组；所述调零组结果为仅先后包含纳米二氧化钛溶液、紫外照射和荧光染色，孵育、清洗后的溶液测得的荧光强度；所述实验对照组结果为将hacat细胞依次经纳米二氧化钛溶液、紫外照射和荧光染色，孵育、清洗后测得的荧光强度；将实验组结果、调零组结果和实验对照组结果代入式ⅱ中计算，得到相对荧光强度。

相对荧光强度＝(mfexp-mfneg)/(mfcon-mfneg)×100％式ⅱ

其中mfexp代表实验组荧光强度，mfneg代表调零组荧光强度，mfcon代表实验对照组荧光强度；

通过分析经过不同浓度下的纳米二氧化钛溶液和紫外光处理的hacat细胞中唾液酸表达水平与对照组之间是否有显著性差异，来判断细胞的损伤程度；

所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。

本发明中将hacat细胞接种在细胞培养基中培养，待所述hacat细胞生长至对数期进行消化，将消化后的hacat细胞进行贴壁培养24h，得到贴壁生长的hacat细胞。

本发明中，所述hacat细胞的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的hacat细胞即可。本发明实施例中，所述hacat细胞由中国细胞资源库提供。

本发明对接种的方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的接种方法即可。hacat细胞的接种量优选为每孔6000～12000，更优选为每孔10000个细胞。所述培养优选在96孔进行。

本发明中，所述细胞培养基是以dmem完全培养基为基础培养基，包含有质量百分含量为1％的青霉素、质量百分含量为1％的链霉素和质量百分含量为10％胎牛血清。

本发明中，所述对数期的细胞的形态为中间宽两头尖的梭形，向四周生出触足。

本发明中，所述消化优选采用胰酶进行。所述胰酶的质量浓度优选为0.2～0.3％，更优选为0.25％。所述胰酶的消化时间优选为3～5min，更优选为4min。

本发明中，所述培养和消化后继续培养的条件独立为：培养的温度优选为36.5～37.5℃，更优选为37℃。所述co2的体积浓度优选为4％～6％，更优选为5％。

本发明中，消化培养后优选对得到的hacat细胞悬液进行稀释。所述稀释后的hacat细胞悬液的浓度优选为0.8～1.5x10⁵/ml，更优选为1x10⁵/ml。

本发明将纳米二氧化钛分散在pbs缓冲液中，超声，得到纳米二氧化钛溶液。

本发明中，所述纳米二氧化钛的粒度优选为10～800nm，更优选为10～100nm，最优选为25nm。纳米二氧化钛溶液的质量浓度在10～1000μg/ml。本发明对所述纳米二氧化钛的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的纳米二氧化钛即可。本发明实施例中，所述纳米二氧化钛购自德国德固赛公司。

本发明中，所述pbs缓冲液为包含摩尔浓度为0.067m的磷酸缓冲溶液；所述pbs缓冲液的ph值优选为6.8～7.4，更优选为7.2。

本发明中，所述超声的频率优选为20～40khz，所述超声的功率优选为25khz～30khzw，所述超声的时间优选为4～6min，更优选为5min。本发明对所述超声用仪器设备没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的超声仪器设备即可。

得到纳米二氧化钛溶液和消化后的对数期hacat细胞悬液后，本发明将所述纳米二氧化钛溶液稀释成若干浓度，分别加入到所述消化后的对数期hacat细胞悬液中，培养21～22h，紫外线照射30～60h。

本发明中，稀释纳米二氧化钛溶液用稀释剂优选为dmem培养基。所述纳米二氧化钛溶液的若干浓度为10～1000μg/ml，更优选为10,50,100,500,1000μg/ml。

本发明中，所述hacat细胞悬液液和纳米二氧化钛溶液的体积比优选为1：1。

本发明中，所述在纳米二氧化钛溶液中培养细胞的条件包括：环境培养的温度优选为36.5～37.5℃，更优选为37℃；co2的体积浓度优选为4％～6％，更优选为5％。

本发明中，培养后优选将hacat细胞清洗后再在pbs溶液进行紫外线照射。所述清洗的次数优选为2～4次，更优选为3次。清洗用溶液为pbs溶液。

本发明中，所述紫外线照射优选采用紫外灯进行；所述紫外灯的功率优选为6～10w，更优选为8w；所述紫外线的波长优选为365nm，所述紫外灯与hacat细胞之间距离优选为9～11cm，更优选为10cm。

经紫外线照射后，本发明将所述紫外线照射的hacat细胞进行培养，将培养后的hacat细胞在mtt溶液中继续培养；将在所述mtt溶液中培养后的hacat细胞在dmso中测定吸光值，得到实验组结果；设置调零组，所述调零组为仅包含dmem、mtt溶液和dmso的混合溶液测得的吸光度；设置实验对照组，实验对照组为将hacat细胞依次经dmem，mtt溶液，dmso处理后在492nm波长下测得的吸光度值；将所述实验组结果、调零组结果和实验对照组结果代入式i中得到细胞存活率；所述细胞存活率＝(odexp-odneg)/(odcon-odneg)×100％(式i)，其中odexp代表实验组吸光度，odneg代表调零组吸光度，odcon代表实验对照组吸光度。

本发明中，所述紫外线照射的hacat细胞进行培养的时间优选为1h，以便细胞恢复活力。所述紫外线照射的hacat细胞优选在dmem培养基的环境下进行培养。

本发明中，所述hacat细胞在mtt溶液中继续培养的时间优选为3.5～5h，更优选为4h。所述hacat细胞在mtt溶液中继续培养前优选采用pbs溶液清洗。所述清洗的次数优选为2～4次，更优选为3次。所述mtt溶液的质量浓度优选为0.03～0.08mg/ml，更优选为0.05mg/ml。用mtt溶液继续培养hacat细胞的目的是检测细胞是否发生损伤，判断不同浓度的纳米二氧化钛的光毒性变化趋势。本发明对所述mtt溶液中培养的条件没有特殊限制，采用在培养基中培养条件即可。本发明中，采用mtt溶液培养后优选采用上述pbs缓冲液清洗。所述清洗的次数优选为2～3次。

本发明中，所述测定吸光值的波长为492nm。

本发明中，通过测定不同浓度的纳米二氧化钛和紫外线处理对hacat细胞产生的光毒性的影响，通过计算细胞存活率能够得到在一定紫外线照射情况下对细胞有致死性的纳米二氧化钛溶液的浓度，从而得到对细胞没有致死性的潜在危险浓度。通过计算不同浓度的纳米二氧化钛溶液的细胞存活率，确定细胞存活率在50％～90％确定为纳米二氧化钛溶的潜在危险浓度，根据所述潜在危险浓度便于后续选择能够使细胞处于不同凋亡时期的纳米二氧化钛溶液的浓度。本发明中，所述紫外灯的功率为6～10w，紫外线的波长为365nm，所述紫外灯与hacat细胞之间距离为9～11cm处理条件下，纳米二氧化钛溶的潜在危险浓度优选为10～50μg/ml，更优选为50μg/ml。

根据上述得到的纳米二氧化钛溶液对hacat细胞的潜在危险浓度，选择潜在危险浓度的钛纳米二氧化溶液处理所述消化后的对数期hacat细胞21小时，得到的处理后的hacat细胞依次进行紫外线处理30～60min，继续培养，第一清洗，固定，向固定后的hacat细胞中加入fitc标记凝集素溶液，依次进行孵育，荧光染色，第二清洗，测定清洗后的hacat细胞的荧光强度，得到hacat细胞的唾液酸表达水平。

所述二氧化钛溶液处理时的条件和紫外线处理的条件同上述得到细胞存活率的技术方案。

本发明中，孵育的时间优选为50～70min，更优选为60min。所述孵育的条件为：温度优选为36.5～37.5℃，更优选为37℃；co2的浓度优选为4～6％，更优选为5％。

本发明中，所述第一清洗和第二清洗用溶液优选为pbs缓冲液。

本发明中，所述固定用溶液为质量浓度优选为4％的多聚甲醛溶液；所述固定的时间优选为12～17min，更优选为15min。

本发明中，所述fitc标记凝集素溶液优选为fitc标记的接骨木素溶液；所述fitc标记的接骨木素溶液的质量浓度优选为8～12μg/ml，更优选为10μg/ml。fitc标记的凝集素溶液的添加体积优选为500～1000μl，更优选为800μl。

本发明对所述染色没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的染色方案即可。

本发明中，所述测定清洗后的hacat细胞的荧光强度的激发波长优选为488nm。

本发明中，测定hacat细胞的荧光强度为实验组结果后，优选还包括设置调零组和实验对照组。所述调零组结果为仅先后包含纳米二氧化钛溶液、紫外照射和荧光染色，孵育、清洗后的溶液测得的荧光强度；所述实验对照组结果为将hacat细胞依次经纳米二氧化钛溶液、紫外照射和荧光染色，孵育、清洗后测得的荧光强度；将实验组结果、调零组结果和实验对照组结果代入式ⅱ中计算，得到相对荧光强度。

相对荧光强度＝(mfexp-mfneg)/(mfcon-mfneg)×100％式ⅱ

其中mfexp代表实验组荧光强度，mfneg代表调零组荧光强度，mfcon代表实验对照组荧光强度。

本发明中，经过纳米二氧化钛和紫外光处理之后，细胞内ros含量会增加，ros的水平会使细胞的α-2,6唾液酸表达水平增加，因此，可以得到α-2,6唾液酸的表达水平能反应细胞损伤的程度，因此，通过检测α-2,6唾液酸的表达水平能够反应出存在的细胞的损伤情况，从而得到存活的细胞的生长状态。

通过分析经过纳米材料和紫外光处理的细胞唾液酸表达情况与对照组之间是否有显著性差异，来判断细胞的损伤程度。

本发明中，采用得到的潜在危险浓度的纳米二氧化钛溶液处理细胞来验证其安全性，结果表明：纳米二氧化钛在紫外光下会给hacat细胞中的d-甘露糖、超氧化物岐化酶、基因、谷胱甘肽(gsh)、脂质发生过氧化带来很大损伤和破坏。这说明本发明提供的方法能有效得到纳米二氧化钛溶液的使用安全浓度的方法。

下面结合实施例对本发明提供的一种基于hacat细胞对纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

材料

细胞株

人角质形成细胞hacatatcc

主要试剂

实施例1

细胞培养：hacat的细胞在含有10％胎牛血清，1％的青霉素和链霉素的dmem完全培养基中培养，培养环境为5％的co2和37℃恒温培养箱。每天换液，取对数生长期的细胞进行实验。

纳米二氧化钛悬液的制备：精确称取5mg纳米二氧化钛，加入1mlpbs混合后，超声5min，用dmem培养基稀释到10,50,100,500,1000μg/ml备用。

纳米二氧化钛光毒性实验：取对数生长期的hacat细胞，加入0.25％胰酶消化，细胞悬液1x10⁵/ml，每孔100μl加入96孔板中，在培养箱中培养24小时。将纳米二氧化钛用dmem稀释不同浓度10，50，100，500，1000μg/ml每孔加入100μl依次加入，同时设置不含纳米二氧化钛的dmem培养细胞作为对照组，每组设置6个复孔。培养21小时后，吸弃含有纳米二氧化钛的上清液，用pbs缓冲液清洗2～3次，每孔加入100μlpbs，在8w的小紫外灯下用365nm紫外光照射1小时，灯距离细胞10cm；照射完成后用dmem替代pbs继续放在培养箱中培养2小时。之后弃掉上清液，pbs洗2-3次，加入0.05mg/ml的mtt溶液，继续培养4小时。弃掉上清，加入150μldmso，待充分溶解紫色结晶物后，在酶标仪492nm测定吸光值，同时设置调零组：仅加dmem和mtt溶液，dmso；对照组：hacat细胞，dmem，mtt溶液，dmso。使用origin7.0软件对实验结果进行分析，p<0.01为显著性差异。细胞存活率＝(odexp-odneg)/(odcon-odneg)x100％，其中odexp代表实验组，odneg代表调零组，odcon代表实验对照组。

结果：hacat细胞经过不同浓度的纳米二氧化钛处理之后，细胞活性随着纳米二氧化钛浓度的升高而降低。如图1在低剂量水平下(10μg/ml，50μg/ml)，纳米二氧化钛对细胞的存活率和对照组相比几乎没有影响，细胞存活率在90％以上；但是在中高剂量下(100,500,1000μg/ml)下，细胞毒性明显增加，细胞存活率在70％以下。加入紫外光照射后，明显增大了纳米二氧化钛的毒性，单独纳米二氧化钛处理在低剂量下，细胞存活率达到90％，但是加入紫外光照射，在50μg/ml纳米二氧化钛处理下，细胞存活率在50％左右而之后100、500、1000μg/ml，在原来降低的存活率基础上，继续降低。这说明，紫外光和纳米二氧化钛共同作用会产生更大的细胞毒性。

实施例2

细胞的α-2，6唾液酸表达水平的变化：取对数生长期的hacat细胞，以每孔3x10⁶个细胞加入到含有灭菌的盖玻片的6孔板中，培养24h。加入浓度为0，50μg/ml的纳米二氧化钛dmem培养基处理hacat细胞21小时。洗去上清，加入pbs后，用365nm的紫外光处理1小时后，用dmem培养基替换pbs，然后在培养箱中再孵育2小时。之后弃掉上清液，用pbs洗2-3次，用4％多聚甲醛固定细胞15分钟，然后加入10μg/ml的fitc标记的sna孵育1小时，用pbs洗去多余的染料。再加入dapi染色15分钟，用pbs洗去多余染料。将盖玻片转移到载玻片上，细胞与载玻片之间滴加抗荧光淬灭剂，然后用中性树脂封片。带中性树脂风干，即可以用共聚焦显微镜检测。拍照时细胞核呈蓝色，α-2,6唾液酸呈绿色。用荧光分光光度计进行定量(结果见图3)。

结果：hacat细胞经过纳米二氧化钛和紫外光处理之后，其细胞上的α-2,6唾液酸表达水平发生明显变化。如图2所示，和对照组相比，经过单独的纳米二氧化钛和紫外光处理，细胞表面的α-2,6唾液酸表达水平有一定增加。但是经过二者共同处理之后，其表达量增加的更加明显，大约增加了6倍(图4)。所以这些结果说明了纳米二氧化钛和紫外光处理hacat细胞之后会造成α-2,6唾液酸表达水平增加。

实施例3

细胞的唾液酸表达水平的变化受紫外光下纳米二氧化钛产生的ros影响：细胞用0,50μg/ml的纳米二氧化钛和紫外光处理后，加入10μmol/l的dcfh-da，继续孵育30min，用pbs洗2-3次，可以用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞内ros水平，激发波长为488nm，发射波长530nm。rosup是一种ros阳性试剂，处理细胞后产生大量的ros，加入50μg/ml的rosup试剂，和细胞孵育24h后，用fitc标记的sna染色，观察结果。维生素c(vc)是一种抗氧化剂可以清除ros，在加入纳米二氧化钛和紫外处理细胞的同时加入1mm的维生素c共同孵育后，通过凝集素sna染色，检测hacat

通过荧光显微镜的结果，可以看出经过纳米二氧化钛或者紫外光处理之后，细胞内ros含量有些许增加；而纳米二氧化钛和紫外光共同处理之后，hacat细胞内ros明显增加。根据流式定量结果，可以看出，细胞经过纳米二氧化钛和紫外光共同处理之后，细胞内的ros和对照组相比增加了10倍(图5)。而胞内ros的结果和α-2,6唾液酸表达水平的趋细胞的唾液酸表达水平的变化受紫外光下纳米二氧化钛产生的ros影响势一致，为了验证二者之间的关系，采用rosup试剂作为阳性对照组，它可以使细胞产生大量的ros；维生素c可以清除ros。实验结果表明：加入rosup孵育24h的hacat细胞，其α-2,6唾液酸表达水平明显增加；而在紫外光和纳米二氧化钛处理细胞同时，加入维生素c，hacat细胞的α-2,6唾液酸表达水平和紫外光和纳米二氧化钛处理后细胞相比，明显降低。这些结果可以说明细胞的α-2,6唾液酸表达水平受到ros的影响。

实施例4

细胞的d-甘露糖表达水平的变化：取对数生长期的hacat细胞，以每孔3x10⁶个细胞加入到含有灭菌的盖玻片的6孔板中，培养24h。加入浓度为0，50μg/ml的纳米二氧化钛dmem培养基处理hacat细胞21小时。洗去上清，加入pbs后，用365nm的紫外光处理1小时后，用dmem培养基替换pbs，然后在培养箱中再孵育2小时。之后弃掉上清液，用pbs洗2-3次，用4％多聚甲醛固定细胞15分钟，然后加入10μg/ml的fitc标记的psa孵育1小时，用pbs洗去多余的染料。再加入dapi染色15分钟，用pbs洗去多余染料。将盖玻片转移到载玻片上，细胞与载玻片之间滴加抗荧光淬灭剂，然后用中性树脂封片。待中性树脂风干，即可以用共聚焦显微镜检测。拍照时细胞核呈蓝色，psa呈绿色。用荧光分光光度计进行定量(结果见图6)。

结果：hacat细胞经过纳米二氧化钛和紫外光处理之后，其细胞上的d-甘露糖表达水平发生明显变化。如图6所示，和对照组相比，经过单独的纳米二氧化钛和紫外光处理，细胞表面的d-甘露糖表达水平有一定增加。但是经过二者共同处理之后，其表达量增加的更加明显，大约增加了8倍(图6)。所以这些结果说明了纳米二氧化钛和紫外光处理hacat细胞之后会造成d甘露糖表达水平增加。

实施例5

纳米二氧化钛基因毒性检测实验：

1、取对数生长期的hacat细胞，加入0.25％胰酶消化，细胞悬液1x106/ml，每孔1ml加入12孔板中，在培养箱中培养24小时。

2、将纳米二氧化钛用dmem稀释50μg/ml每孔加入1ml依次加入，同时设置不含纳米二氧化钛的dmem培养细胞作为对照组，每组设置3个复孔。培养21小时后，吸弃含有纳米二氧化钛的上清液，用pbs缓冲液清洗2～3次，每孔加入1mlpbs，在8w的小紫外灯下用365nm紫外光照射1小时，灯距离细胞10cm；照射完成后用dmem替代pbs继续放在培养箱中培养2小时。

3、之后弃掉上清液，用冷浴pbs洗2-3次，然后每孔加入0.5ml细胞裂解液，在冰上裂解细胞约15min。然后将裂解产物在12000g的离心机上离心15min，取上清作为待检测产品。

4、然后进行单细胞凝胶电泳，将样品在琼脂糖凝胶电泳上以25v，300ma的条件下跑30min电泳，然后取出载玻片，用tri-hcl中和凝胶15min，最后用溴化乙锭染色。利用紫外成像系统，获取结果，再用casp图像处理软件对结果进行计数分析。

dna损伤＝dna尾部荧光数量/dna总彗星荧光数量x100％

可以判断不同处理的细胞其基因毒性的强弱。

结果分析：如图7可知，单独的纳米二氧化钛处理细胞之后，其基因毒性并不强烈，只是比对照组稍稍增长。但是在50μg/ml和紫外光共同处理之后，细胞的基因毒性明显增加，从原来5％左右增加到20％左右。这些说明纳米二氧化钛在紫外光下会给细胞带来严重的基因损伤。

实施例6

纳米二氧化钛对hacat细胞的超氧化物岐化酶(sod)影响实验：

1、取对数生长期的hacat细胞，加入0.25％胰酶消化，细胞悬液1x10⁶/ml，每孔1ml加入12孔板中，在培养箱中培养24小时。

2、将纳米二氧化钛用dmem稀释不同浓度0μg/ml，50μg/ml每孔加入1ml依次加入，同时设置不含纳米二氧化钛的dmem培养细胞作为对照组，每组设置3个复孔。培养21小时后，吸弃含有纳米二氧化钛的上清液，用pbs缓冲液清洗2～3次，每孔加入1mlpbs，在8w的小紫外灯下用365nm紫外光照射1小时，灯距离细胞10cm；照射完成后用dmem替代pbs继续放在培养箱中培养2小时。

3、之后弃掉上清液，用冷浴pbs洗2-3次，然后每孔加入0.5ml细胞裂解液，在冰上裂解细胞约15min。然后将裂解产物在12000g的离心机上离心15min，取上清作为待检测产品。

4、然后采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶的活力。sod试剂盒，根据其中说明书，依次加入不同试剂，反应5min后，再加入显色剂，在550nm处的紫外分光光度计下检测。

5、sod活力(u/ml)＝(od测定-od空白)/(od标准-od空白)/50x稀释倍数/蛋白质质量浓度(mg/ml)。

结果分析：如图8可知，单纯的纳米二氧化钛处理细胞之后，细胞的sod活力水平相比较未经处理组的细胞而言，只有少许降低。但是在50μg/ml和紫外光共同处理之后，细胞的sod值明显降低，从原来3.5左右降低到1左右。这些说明纳米二氧化钛在紫外光下会给hacat细胞的超氧化物岐化酶带来很大破坏。

实施例7

纳米二氧化钛对hacat细胞的谷胱甘肽(gsh)影响实验：

1、取对数生长期的hacat细胞，加入0.25％胰酶消化，细胞悬液1x10⁶/ml，每孔1ml加入12孔板中，在培养箱中培养24小时。

2、将纳米二氧化钛用dmem稀释不同浓度0，50μg/ml每孔加入1ml依次加入，同时设置不含纳米二氧化钛的dmem培养细胞作为对照组，每组设置3个复孔。培养21小时后，吸弃含有纳米二氧化钛的上清液，用pbs缓冲液清洗2～3次，每孔加入1mlpbs，在8w的小紫外灯下用365nm紫外光照射1小时，灯距离细胞10cm；照射完成后用dmem替代pbs继续放在培养箱中培养2小时。

3、之后弃掉上清液，用冷浴pbs洗2-3次，然后每孔加入0.5ml细胞裂解液，在冰上裂解细胞约15min。然后将裂解产物在12000g的离心机上离心15min，取上清作为待检测产品。

4、然后采用gsh试剂盒，根据其中说明书，依次加入不同试剂，反应5min后，再加入显色剂，在412nm处的紫外分光光度计下检测。

5、gsh浓度(μmol/l)＝(od测定-od空白)/(od标准-od空白)x标准品浓度x稀释倍数/蛋白质质量浓度(mg/ml)。

结果分析：如图9可知，单纯的纳米二氧化钛处理细胞之后，细胞的gsh活力水平相比较未经处理组的细胞而言，只有少许降低。但是在50μg/ml和紫外光共同处理之后，细胞的gsh值明显降低，从原来4.5左右降低到1.9左右。这些说明纳米二氧化钛在紫外光下会给hacat细胞的谷胱甘肽带来很大破坏。

实施例8

纳米二氧化钛对hacat细胞的脂质过氧化检测：

1.取对数生长期的hacat细胞，加入0.25％胰酶消化，细胞悬液1x106/ml，每孔1ml加入12孔板中，在培养箱中培养24小时。

2.将纳米二氧化钛用dmem稀释不同浓度0μg/ml，50μg/ml每孔加入1ml依次加入，同时设置不含纳米二氧化钛的dmem培养细胞作为对照组，每组设置3个复孔。培养21小时后，吸弃含有纳米二氧化钛的上清液，用pbs缓冲液清洗2～3次，每孔加入1mlpbs，在8w的小紫外灯下用365nm紫外光照射1小时，灯距离细胞10cm；照射完成后用dmem替代pbs继续放在培养箱中培养2小时。

3.之后弃掉上清液，用冷浴pbs洗2-3次，然后每孔加入0.5ml细胞裂解液，在冰上裂解细胞约15min。然后将裂解产物在12000g的离心机上离心15min，取上清作为待检测产品。

4.然后采用运用tba实验评价纳米二氧化钛在紫外光作用下对细胞脂质过氧化影响。利用tbar试剂盒，根据其中说明书，依次加入不同试剂，反应5min后，再加入显色剂，在535nm处的紫外分光光度计下检测。

5.mda浓度(μmol/l)＝(od测定-od空白)/(od标准-od空白)x10/蛋白质质量浓度(mg/ml)

结果分析：如图10可知，单纯的纳米二氧化钛处理细胞之后，细胞的脂质氧化水平相比较未经处理组的细胞而言，只有少许增加。但是在50μg/ml和紫外光共同处理之后，细胞的脂质氧化明显增加，从原来1左右降低到4左右。这些说明纳米二氧化钛在紫外光下会让hacat细胞中的脂质发生过氧化，带来损伤。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。