一种用于骨肉瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统及其应用的制作方法

本发明涉及生物检测
技术领域：
，特别地，涉及一种荧光定量pcr检测试剂盒，并进一步公开其用于检测骨肉瘤的应用。
背景技术：
：随着科学研究的不断发展，尤其是人类基因组计划完成后，后基因组计划的全面展开，以基因检测为主导的最新技术在疾病防控领域的应用得到广泛的关注。目前运用遗传学的理论和方法进行疾病风险预测已经有了初步进展，常用的基因检测方法包括：直接测序法(directsequencing，ds)、连接酶检测反应法(ligasedetectionreaction，ldr)、限制性片段长度多态性分析法(restrictionfragmentlengthpolymorphism，rflp)、变性高效液相色谱分析法(denaturinghighperformanceliquidchromotography，dhplc)、以及定量pcr检测法，其中，利用dna分析仪进行直接测序是金标准，但是该方法却存在着成本高、准确率低、操作繁琐和重复性差等诸多问题。实时荧光定量核酸扩增检测系统(real-timequantitativepcrdetectingsystem，qpcr)，又称实时定量基因扩增荧光检测系统、荧光定量pcr(realtimepcr)检测技术，是通过在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实现实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。qpcr系统为第三代的pcr检测技术，具有检测灵敏度高、检测线性范围宽、检测精度和重复性好等突出优势，并因此被公认为当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术，可以高效、准确的用于运动基因检测。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，snp)是指在基因组上单个核苷酸的变异，这种变异包括转换、颠换、缺失和插入，进而形成的遗传标记，其数量很多且多态性丰富。snp为第三代遗传标志，人体许多表型的差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与snp有关，因此snp研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。这主要是因为snp将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。snp在人类基因组中分布相当广泛，平均每500-1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个，甚至更多研究表明在人类基因组中每300碱基对就出现一次。大量存在的snp位点，使人们有机会发现其与包括肿瘤相关基因组突变在内的各种疾病，且从实验操作来看，通过snp发现疾病相关基因突变要比通过家系研究来得容易。虽然有些snp并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，进而也成为重要的标记。snp在基础研究中也发挥了巨大的作用，并通过对y染色体snp的分析，使得其在人类进化、人类种群的演化和迁徙领域都取得了一系列重要成果。已有越来越多的文献对荧光定量pcr技术从各方面的应用角度进行阐述，大部分文献公开了多种单一片段通过荧光定量pcr技术进行检测的具体方式方法，但在发明人进行荧光定量pcr检测snp位点的过程中，发现单一片段的检测不足以满足检测要求，对于具有两个或多个snp位点的综合性检测，需要重复检测，步骤繁琐且操作时间长。骨肉瘤是成人和儿童最常见的一种非血源性的骨恶性肿瘤，占原发性恶性骨肿瘤的20％左右，且多起源于骨间叶组织。典型的骨肉瘤好发于长管状骨干骺端，且通常预后不佳、恶性程度高，早期极有可能发生肺转移，约有10-20％的病人在诊断时发现有转移灶，仅约10％的病人在治疗后具有较长时间的无症状期。骨肉瘤典型的组织学特点是易产生恶性细胞的类骨样物质，与骨肉瘤相关的遗传和表观遗传学改变已有大量报道，但仍没有达成共识。随着对干细胞生物学和癌症干细胞相关知识的逐渐了解，越来越多的证据表明骨肉瘤可能是一个与干细胞分化有关的疾病，且由多潜能干细胞逐渐分化形成的成骨细胞再继续分化成熟为骨细胞的过程，是一个受到一系列信号传导通路精密调节的过程。很多分子水平的变化强烈的提示我们，是遗传和表观遗传学的因素干扰这一分化过程，继而诱发骨肉瘤。虽然目前关于骨肉瘤的治疗手段主要局限于抑制骨肉瘤的增殖，但是促进其分化和/或规避分化障碍很有可能是一种有效的辅助治疗手段。但由于骨肉瘤发生的分子机制尚未阐明，且一些基因的异常表达可以增加骨肉瘤发病的易感性，如患有遗传性视网膜母细胞瘤的病人、paget’s病的病人都是骨肉瘤的好发人群。细胞遗传学对骨肉瘤的研究显示，骨肉瘤具有多种遗传的改变，导致了多种肿瘤抑癌基因的失活以及癌基因的过表达。其中，rb基因、p53基因以及kras基因的异常与骨肉瘤的发生密切相关。并且现有数据也表明，骨肉瘤存在着大量遗传和分子水平的改变，包括染色体增加、减少或染色体区域重组所致的肿瘤抑制基因失活，以及主要信号通路失衡等。现有的骨肉瘤相关的基因位点是基于欧洲人群大样本量gwas研究得出的强关联位点，在应用于亚洲人群，尤其是我国人群时，位点关联性较弱，难以通过检测得到较为准确的结果，因此建立中国人群的评估系统是十分有必要的。技术实现要素：本发明提供了一种用于骨肉瘤基因筛查的荧光定量pcr检测试剂盒，并进一步公开其在骨肉瘤基因筛查领域的应用。为实现上述目的，本发明提出了荧光定量pcr检测系统用于制备骨肉瘤基因筛查系统的用途。本发明还公开了一种用于骨肉瘤基因筛查的荧光定量pcr检测系统，所述检测系统包括用于待测基因检测的荧光定量pcr检测试剂盒，以及检测结果对照评价系统；所述检测结果对照评价系统包括位点对应的检测结果处理部分及参考数据库；所述荧光定量pcr检测试剂盒包括对至少两个骨肉瘤相关基因位点检测的荧光定量pcr检测试剂。所述荧光定量pcr检测的相关位点包括rs231775、rs1129055、rs7034162、rs1906953、rs7591996位点。检测所述骨肉瘤基因位点的引物和探针序列结构如下表所示：所述参考数据库是以千人基因组中的东亚人群基因组数据作为普通人群水平，并将检测结果实时收入数据库内。所述检测结果对照评价系统是通过将待测基因的荧光定量pcr检测结果对应至风险级别中，其中，待测基因的风险值p为多个检测基因位点的乘积，平均风险值为pa，平均方差为s，并以此判断待测基因的风险级别：pa+0.6s≤p为高风险级别；pa+0.2s≤p＜pa+0.6s为偏高风险级别；pa-0.2s≤p＜pa+0.2s为一般风险级别；pa-0.6s≤p＜pa-0.2s为偏低风险级别；p＜pa-0.6s为低风险级别。更进一步的，所述平均方差s的计算方式如下：其中，i为待测基因的检测位点数量；平均风险值pa为通过东亚人群的基因组数据，pa的计算公式为：其中，人群总人数为n。本发明还公开了所述的荧光定量pcr检测系统在骨肉瘤基因筛查领域中的应用。本发明还公开了一种基于荧光定量pcr法筛查骨肉瘤基因的方法，包括利用所述的荧光定量pcr检测系统对骨肉瘤相关基因进行荧光定量pcr检测的步骤，所述荧光定量pcr检测的位点包括rs231775、rs1129055、rs7034162、rs1906953、rs7591996位点。更优的，所述的利用荧光定量pcr法检测骨肉瘤基因的方法，具体包括如下步骤：(1)待测样本的扩增：根据待测基因位点的结构，采用单荧光标记探针，设计待测样本的引物及探针序列，进行pcr扩增；(2)样本检测：通过熔解曲线峰型图检测已扩增的位点，得到对应位点的检测结果；(3)根据检测结果进行处理，将各位点的风险积点统计后得出该待测基因的风险值，并对应所述参考数据库中的风险级别；(4)根据检测结果的对应级别，综合得到基因风险及相关处理结果。本发明所述荧光定量pcr检测系统，包括对特定位点基因的检测试剂盒，并根据每个位点对骨肉瘤风险的风险值来计算骨肉瘤风险的得分，并根据现有的数据库去进行人群分级，通过个人得分得到个人的骨肉瘤风险级别，从而评估受检者的骨肉瘤风险，引导高风险者改善生活方式，并避免诱发因素及增加体检频率。与此同时，本发明通过对选定的5个基因多态性位点建立中国人群数据库，为建立中国人群特有的骨肉瘤评估奠定了基础。本发明所述荧光定量pcr检测系统，可以对受检者的骨肉瘤相关风险进行评估。本发明提供的检测试剂盒，具有特异性强、检出率高，效率高、成本低的优势，能够综合检测与分析受检人群是否携带“骨肉瘤易感基因”，并评估其患骨肉瘤的风险，将易感人群从普通人群中筛选出来，给予个性化指导建议，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。附图说明图1为本发明所述的检测样品rs1129055的实验结果；图2为本发明所述的检测样品rs1129055的测序结果；图3为本发明所述的检测样品rs7034162的实验结果；图4为本发明所述的检测样品rs7034162的测序结果；图5为本发明所述的检测样品rs1906953的实验结果；图6为本发明所述的检测样品rs1906953的测序结果；图7为本发明所述的检测样品rs7591996的实验结果；图8为本发明所述的检测样品rs7591996的测序结果；图9为本发明所述的检测样品rs231775的实验结果；图10为本发明所述的检测样品rs231775的测序结果；图11为本发明根据检测样品实验结果进行评估的流程图。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。实施例1本实施例中采用骨肉瘤荧光定量pcr检测试剂盒进行骨肉瘤相关基因的检测，其中对骨肉瘤相关的五个基因上的5个多态性位点进行检测，包括rs231775、rs1129055、rs7034162、rs1906953、rs7591996位点，共计5个位点。利用特异性设计的引物和探针，优化扩增体系和条件，在同一体系同时完成两个基因上的2个多态性位点的检测。本实施例中采用单荧光标记探针，罗氏480平台，最后通过熔解曲线峰型图检测rs231775、rs1129055、rs7034162、rs1906953、rs7591996位点。具体的，rs231775、rs1129055、rs7034162、rs1906953、rs7591996位点的双重荧光定量pcr检测方法中，对于rs231775、rs1129055、rs7034162、rs1906953、rs7591996位点的引物及探针设计如下表1所示。表1引物及探针设计对于上述rs231775、rs1129055、rs7034162、rs1906953、rs7591996位点，分别设计如下表2-4所示的试剂反应体系：表2位点rs1129055和rs7034162的双重试剂体系表3位点rs1906953和rs7591996的双重试剂体系表4位点rs231775的试剂体系对上述rs231775、rs1129055、rs7034162、rs1906953、rs7591996位点进行pcr扩增，并设计pcr反应程序(循环)设置参数如下表5所示。表5pcr反应参数设定按照上述设计的引物、试剂盒pcr参数，对上述rs231775、rs1129055、rs7034162、rs1906953、rs7591996位点进行pcr扩增，且对扩增结果进行检测，检测结果分别如图1-10所示。如图1-10所示的检测结果中：检测样品rs1129055实验结果为ag，其测序结果ag；检测样品rs7034162实验结果为at，其测序结果at；检测样品rs1906953实验结果为tt，其测序结果tt；检测样品rs7591996实验结果为ac、反链为gt，其测序结果gt；检测样品rs231775实验结果为gg、反链为cc，其测序结果cc。且通过测序进行复检，证明本实验方法具有准确性和可靠性。实施例2实施例1中的5个位点分别来自bezzina等和ar-king博士发表的文章，文章通过gwas研究得出了与骨肉瘤直接相关的两个易感位点，并计算出了两个位点的风险等位基因型风险值，即or值。gwas研究发现nfib、grm4基因和2p25.2上的常见遗传变异可能与骨肉瘤发生有关。mirabellol等发现nfib基因上的snp位点(rs7034162)是骨肉瘤细胞迁移、增殖和集落形成的危险因素。rs7034162突变(生殖细胞的遗传变异)是肿瘤细胞转移的易感基因。骨肉瘤是青少年和青年人最常见的原发性骨恶性肿瘤。为了更好地了解骨肉瘤的遗传病因，savagesa等进行了一个多阶段的全基因组关联研究，包括941名骨肉瘤患者和3291名没有患癌症的欧洲成人对照组。grm4基因与细胞内信号转导与环磷酸腺苷(camp)信号级联反应的抑制有关。在动物模型研究中，camp依赖的蛋白激酶(prkar1α)是骨肉瘤的抑癌基因参与肿瘤的发生。这些都表明camp途径在骨肉瘤中起重要作用。grm4基因上的snp位点(rs1906953)变异会改变camp途径，从而影响骨肉瘤的发生。分别对上述5个位点进行评估，计算不同基因型及其风险值(or)分别为：ctla-4基因rs231775位点的aa-ag-gg基因型的or值分别为1.9881-1.41-1；cd86基因rs1129055位点的aa-ag-gg基因型的or值分别为2.0449-1.43-1；nfib基因rs7034162位点的aa-at-tt基因型的or值分别为5.9049-2.43-1；grm4基因rs1906953位点的tt-tc-cc基因型的or值分别为2.4649-1.57-1；2p25.2上rs7591996位点的cc-ca-aa基因型的or值分别为1.9321-1.39-1。由于骨肉瘤的发病率小于10％，所以or值近似于rr值，即风险值。每个位点的风险值则按照基因型来计算，即纯合风险等位基因型的风险值为or值的平方，杂合风险等位基因型的风险值为or值，纯合非风险等位基因型为1，对于一个受检者，每个snp位点根据检测得到的基因型，都有一个易感值，我们定义这个分值为s，那么受检者的个人骨肉瘤易感值为p，p值为五项基因型的or值的乘积即：根据上述基因检测的结果，对个人的骨肉瘤风险进行评估，并建立中国人群的骨肉瘤易感数据库。以千人基因组中东亚人群的基因组数据为普通人群水平，总人数定义为n。以千人基因组中东亚人群位点的基因型平均分：其中，人群总人数为n。并计算出平均方差，根据pa与s，将东亚人群的骨肉瘤风险值进行分级，将受检者的个人骨肉瘤风险值p对应到人群分级中去，人群分级共五级，分别为高-略高-一般-略低-低五个风险级别，具体为：pa+0.6s≤p为高风险级别；pa+0.2s≤p＜pa+0.6s为偏高风险级别；pa-0.2s≤p＜pa+0.2s为一般风险级别；pa-0.6s≤p＜pa-0.2s为偏低风险级别；p＜pa-0.6s为低风险级别。基于东亚人群划分的骨肉瘤风险级别，p值≥20.35为高风险级别，315.54≤p值＜20.35为偏高风险，10.74≤p值＜15.54为一般风险，5.93≤p值＜10.74为偏低风险，p值＜5.93为低风险。如图11所示的根据检测样品实验结果进行评估的流程图，根据基因检测结果，将5项or值相乘得出个人骨肉瘤的易感值，也就是风险值。对应到由分级方法得到个人的骨肉瘤风险级别，根据受检者的p值对应的级别，综合得到受检者的骨肉瘤的风险，从而给出个体健康管理方案。实施例3本发明所述方法通过采集受检者的基因样本然后提取dna，用罗氏lightcycler480实时定量仪进行检测，得到的结果如图1，3，5，7，9。如下一个受检者的检测结果如下表6所示。某个受检者ctla-4基因rs231775基因型为gg，对应or值为1；cd86基因rs1129055基因型为ag，对应or值为1.43；nfib基因rs7034162基因型为at，对应or值为2.43；grm4基因rs1906953基因型为cc，对应or值为1；2p25.2上rs7591996基因型为cc，对应or值为1.9321。上述or值来自于ncbi的文献研究。计算该受检者的个人骨肉瘤易感值p＝1*1.43*2.43*1*1.9321＝6.71。表6受检者的基因检测结果rs231775rs1129055rs7034162rs1906953rs7591996受检者ggagatcccchg00403agaaatccachg00404gggaatcccchg00406aggattcccc千人基因组数据库中有504个东亚人，比如hg00403这个人p＝1.41*2.0449*2.43*1*1.39＝9.74，其余人同样可以计算得出，则东亚人群位点的基因型平均分pa＝13.14，平均方差＝12.01。此受检者p<pa-0.2s＝13.14-0.2*12.01，所以骨肉瘤风险等级为偏低，所以该受检者的骨肉瘤风险等级均低于或等于一般风险等级，但不代表受检者一定不会患此类疾病，因此，提示受检者继续保持乐观心态，以及健康的生活方式，每年例行体检。以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。序列表<110>深圳美因临床检验所有限公司<120>一种用于骨肉瘤基因筛查的荧光定量pcr检测系统及其应用<130>my17016p<160>15<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>rs231775f端引物<400>1gaacaccgctcccataaag19<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>rs231775r端引物<400>2aacacctcctccatcttcat20<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>rs231775探针序列<400>3ctgaacctggctgccaggacct22<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>rs1129055f端引物<400>4ttccaatggcaacctctattc21<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>rs1129055r端引物<400>5ttgtcgcatgaagatgtctt20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>rs1129055探针序列<400>6ctgatgaagcccagcgtgtt20<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>rs7034162f端引物<400>7tgtgattaataaccagtccttgt23<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>rs7034162r端引物<400>8tatgaacagaagcagtaatgaatac25<210>9<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>rs7034162探针序列<400>9tgtatacatttaatctcaagatgcat26<210>10<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>rs1906953f端引物<400>10ccagcagcctccagatca18<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>rs1906953r端引物<400>11gagcccagtgtccaaggt18<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>rs1906953探针序列<400>12ttcctttcagcccgcccagg20<210>13<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>rs7591996f端引物<400>13aagaagagctagaaccaatactac24<210>14<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>rs7591996r端引物<400>14gcatctgtgttcatcaggtata22<210>15<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>rs7591996探针序列<400>15ttccaccctaattcattctatgg23当前第1页12