本发明涉及基因检测，生物化学领域，特别涉及肿瘤个体化化疗用药指导基因snp位点检测组合物。
背景技术：
：据统计，我国每年新发肿瘤病例约为3120000例，每天约为8500例，每分钟有6人被诊断为拥有癌症，人们一生患癌概率为22％。目前，肺癌是全国恶性肿瘤死亡率最高的，其次为肝癌，胃癌，食管癌和结直肠癌，男性人群常发生的主要癌症为肺癌，肝癌，胃癌，食管癌和结直肠癌，女性人群常发现的主要癌症为肺癌，肝癌，胃癌，乳腺癌和结直肠癌。恶性肿瘤主要治疗方法有外科手术，化疗，放疗和分子靶向药物治疗，外科手术是指用外科手术的方法，去除癌变组织、修复损伤、移植器官等，放疗是指用特殊的放射线间接或直接损伤细胞dna，化疗是指利用化学药物抑制肿瘤细胞生长繁殖、杀死肿瘤细胞或促进肿瘤细胞分化的一种治疗方法。目前，在几种方法之间，化疗在肿瘤临床治疗中约占70％，特别对于失去外科手术治疗意义的晚期癌症病人，化疗更是主要甚至唯一的治疗手段。随着人类基因组学、药物基因组学及肿瘤分子生物学研究的不断深入和发展，人们发现了一些肿瘤发生、扩散、转移相关的蛋白分子，从而以它们作为靶点研发出一些分子靶向抗肿瘤药物，这些药物相比传统的细胞毒抗肿瘤药不同，它不仅可以抑制肿瘤细胞增殖，并且毒副作用小，特异性高，安全性强、可口服。尽管各种治疗手段对于癌症都有一定的抑制效果，但越来越多的临床数据显示，对于同一期，同一病理类型的患者，即使采用相同的治疗方案，其疗效也存在明显的差异，我们称这种差异为个体化差异，随着人类基因组计划的完成，人们逐渐意识到：同一类型肿瘤的细胞分子生物学差异可能是导致肿瘤个体化差异的原因所在，近年来，不少大型临床研究数据(ipass，insform等)表明某些基因的snp位点的突变和表达变化可以帮助医生诊断病情和预测疗效，如果我们能在治疗前对患者的这些特殊基因的snp位点进行测序，对突变情况进行诊断，我们就能根据诊断结果给予最优的治疗方案，减少许多无意义治疗时间，减少治疗费用，提高生成质量，延长生存周期。这种治疗方法就是肿瘤的个性化治疗。大量的临床研究证实，肿瘤细胞中与化疗药物作用或代谢相关的基因表达水平对化疗的疗效有重要的影响，相关基因表达水平的检测是选择化疗药物的必要依据，是确保个体化化疗预期疗效的重要保证。nccn非小细胞临床治疗指南指出：“在接受铂类化疗前进行ercc1mrna表达水平检测可显著提高治疗有效率和患者的生存率，非小细胞肺癌患者rrm1的表达与吉西他滨的疗效密切相关，在吉西他滨用药前应进行rrm1基因表达水平的检测。”香港中文大学医学院tonymok教授发起的ipass研究，比较了吉非替尼单药与卡铂+紫杉醇双药化疗作为nsclc一线治疗的疗效差异，结果显示，与卡铂+紫杉醇化疗相比，比携带egfr突变的患者中，吉非替尼使其死亡危险减低52％(p<0.001),有效率为71.2％；然而，对于egfr野生型的患者，吉非替尼的治疗则增加了死亡风险(hr＝2.85，p<0.001),有效率仅为1.1％，所以在使用吉非替尼前应进行egfr的基因表达水平的检测。对于其他化疗药物的使用，也应该依据相应的基因表达水平而定，如brca1和brca2基因参与dna重组酶rad51亚核的装配，brca1能使经顺铂处理后细胞继续存活。因此，brca1基因表达水平低的肿瘤患者更适合以顺铂为基础的化疗；xrcc1参与dna损伤的碱基切除修复途径，参与顺铂或卡铂引起的dna损伤修复过程。因此xrcc1基因表达水平高的患者使用顺铂或卡铂的化疗效果有显著提高。还有通过临床研究发现，tyms及dpd表达水平低的肿瘤患者接受氰类药物化疗效果较好，stmn1表达水平低的肿瘤患者接受长春瑞滨治疗的效果较好，top2a表达水平高的肿瘤患者使用依托泊苷效果较好。因为肿瘤用药和每个人的基因相关，所以肿瘤个体化化疗用药基因snp位点检测和诊断对每个肿瘤患者意义重大。通过检测肿瘤患者的整体基因多态信息,为癌症患者进行最科学的化疗药物疗效及毒副作用评估，辅助医生为患者制定个性化治疗方案。给予患者最适合的治疗方案。目前，普遍应用于肿瘤个体化化疗用药指导基因snp位点检测方法主要有以下几种：限制小片段长度多态性分析方法(rflp法)用于检测酶切位点改变的基因，可直接判断基因型，但不能用于没有产生新酶切位点的基因检测，而且rflp实验操作繁琐，检测周期长，成本高，假阳性高，难以满足临床检测要求。荧光定量pcr技术，虽然它灵敏性高，特异性高，自动化程度强，但是会存在样品污染、假阳性高的情况，而且每次只能测一种基因类型。dna一代测序法，灵敏度低，每次只能测一个基因，难以检测低频突变位点和假阴性率高，测序所需样本量大，测序周期长，成本高，操作复杂，因此这方法不适合临床检测。因此，如何提供一种能够相对方便快捷、测序周期短、针对性强、检测结果准确可靠的检测手段成为了业界需要解决的问题。技术实现要素：针对现有技术的缺点，本发明的目的是提供肿瘤个体化化疗用药指导基因snp位点检测组合物，其检测灵敏度高，特异性强；一次检测能覆盖46个基因，共58个snp位点。为了实现上述目的，本发明提供了肿瘤个体化化疗用药指导基因snp位点检测组合物，肿瘤个体化化疗用药指导基因snp位点检测组合物包括包括xlno:1～xlno:114引物；所述xlno:1～xlno:114引物序列见表1。本发明检测通量高、灵敏度高、特异性高的特征，灵敏度可以达到1％，样本的dna浓度可以低至0.1～1ng/μl。根据本发明另一具体实施方式，肿瘤个体化化疗用药指导基因snp位点检测组合物的组成为：mastermix8μl、接头引物ns-topgene-pea和包括xlno:1～xlno:114引物的引物panel；引物panel中xlno:1～xlno:114引物的浓度为100nm。根据本发明另一具体实施方式，mastermix的组成为：pcrbuffer(5x)5ul、mgcl22μl、taq酶1.5μl和ddh2o8.5μl。根据本发明另一具体实施方式，接头引物ns-topgene-pea包括ns-topgene-pea1.0：tacactctttccctacacgacgctcttccgatct和ns-topgene-pea1.1：gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac。根据本发明另一具体实施方式，肿瘤个体化化疗用药指导基因snp位点检测组合物的pcr(聚合酶链式反应)反应条件包括：预热阶段：92～97℃预热变性3～10分钟；扩增阶段：92～97℃变性10～20s，58～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～20s，并进行10～20个循环。待测dna样本采用多重pcr酶进行扩增后，构建文库与上机质控品一起进行大规模的平行测序(二代测序)，仪器获得的结果经数据处理和生物信息学分析，得出样本中含有的snp位点的信息，然后通过大型药物基因组数据库和大数据算法，为医生提供最优的用药方案参考。待测dna样品为人类基因组dna。多重pcr过程同时进行阴性对照实验，所用阴性样本为正常人基因组dna。待测dna样本为人类细胞dna、肿瘤组织基因组dna、外周血细胞dna或唾液dna。本发明检测基因为46个肿瘤个体化化疗用药指导基因，包括ercc1、rrm1、xrcc1、tyms及dpd等基因，均包括与肿瘤用药密切相关的重要snp位点。本发明所称的肿瘤个体化化疗用药指导基因包含46个基因的与肿瘤用药密切相关的重要的snp位点，其包括abcc2基因与dnmbp基因间隙的内含子基因chr10：101620771(rs12762549)，ercc1基因chr19：45923653(rs11615)等58个重要snp位点(见表2)。本发明组合物中的xlno:1～xlno:114引物是针对每个肿瘤个体化化疗用药指导基因的每个重要snp位点附近的一段序列进行设计。通过软件的设计和筛选和引物经优化修饰后，偏向性扩增的程度降低，各引物之间相互干扰性小，特异性强，扩增效果号。这些引物以混合物形式溶解于试管中，在实验中同时加入。上机模板准备过程包括文库模板稀释、混合、变性、桥式pcr扩增和测序，所述过程中试剂组成包括2nnaoh，带荧光修饰的游离dntp、测序引物和聚合酶等。上机测序反应过程包括nextseqcn500测序反应过程，其原理是通过可逆阻断的边合成边测序和cdd阵列采集光学信号来检测合成过程中核苷酸的荧光信号，以此来测定dna的碱基序列模板文库构建过程包括目标模板扩增和nextseqcn500通用模板扩增，所述反应体系中包括0.2-1u扩增taq酶、10～20μm测序接头通用引物、1-10xbuffer和0.2-1.8xampure纯化磁珠等试剂。测试数据处理分析包括测序数据的转换、拼接、比对、质控、假阳性位点筛选和突变位点分析等过程，通过数据的处理最终获得检测样本snp位点的信息。xlno:1～xlno:114引物序列如表1所示。表1肿瘤个体化化疗用药指导基因snp位点检测引物序列检测肿瘤个体化化疗用药指导相关的snp位点基因，本发明待检测易感snp位点如下：表2肿瘤个体化化疗用药指导相关的snp位点基因：与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：1、特异性强：针对特定基因的特殊snp设计引物，定位捕获特定的snp位点附件的碱基序列，特异性极强。2、实用性强：针对的46个基因的58个snp位点都与临床相关，对于癌症患者的用药有指导意义，能帮助医生为癌症患者提供最合适的治疗方案。3、检测结果直接反映snp位点的基因表达情况，十分精准。4、灵敏度高：检测灵敏度达到0.01％，能检测所有低频突变位点。5、操作简单高效：引物处于混合物中，混合物置于一根试管内；pcr过程直接加入，不需要过多操作，仅需要一天能得出结果，效率极高。6、安全：整个体系不包含有毒有害物质，对实验人员以及环境都无危害。本发明全面综合了对肿瘤个体化化疗用药指导基因具有检测意义的相关易感snp位点，对各引物的序列以及实验反应体系进行优化，表现出检测能力的强大优势；不仅使检测简单高效，而且还有具有较高的准确度，极高的特异性、实验可重复性以及实用性。对肿瘤个体化化疗用药指导用药基因相关易感snp位点具有检测灵敏度高，特异性强，不易污染，安全性高的优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，对需要化疗的癌症患者具有重要的意义，能辅助医生充分了解患者肿瘤个体化化疗用药指导基因的表达情况，并给予适合的建议，为肿瘤患者设计出最合适的治疗方案。下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。附图说明图1a是实施例1中，文库构建完成后的片段分布图的一个分段截取图；图1b是实施例1中，文库构建完成后的片段分布图的另一个分段截取图；图2是实施例1中，分析评估得到的个性化指导用药方案。具体实施方式实施例1本实施例提供了肿瘤个体化化疗用药指导基因snp位点检测组合物，其用于肿瘤病人化疗用药基因突变位点检测并指导用药。一、实验材料1.本实验中涉及临床血液样本来自河北医科大学第四医院。样本采集后，立即放入-80度冰箱中保存。2.所有引物纯度应达到电泳级(page)或hplc级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如page电泳结果或hplc分析图谱，证明使用page或者hplc纯化后应有明显单峰page或者hplc纯化图谱，浓度为10ng/μl备用。3.所有试剂购买自正规厂家：多重pcr酶(kapa公司)、ampure磁珠(beckmancoulter公司)、贝瑞和康测序反应通用试剂盒(300循环)中通量、文库定量试剂盒(kapa公司)。二、主要仪器贝瑞和康nextseqcn500测序仪、steponeplus荧光定量pcr仪、qubit3.0荧光定量仪、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。三、实验设计检测肺癌患者个性化肿瘤化疗药物敏感snp位点，根据检测结果确定snp位点的突变类型。四、反应体系及程序1.根据实验室现有实验基础和经验研究，及参考nextseqcn500上机测试的操作规程和多重pcr扩增要求，制定的多重反应体系如下：mastermix11μl、包含xlno:1～xlno:114引物的引物panel8μl、待测基因4μl。mastermix组成为：pcrbuffer(5x)5μl、mgcl22μl、taq酶1.5μl、ddh2o4.5μl。2.根据以上反应体系进行多重pcr扩增反应程序：预热阶段：95℃预热变性3分钟；扩增阶段：95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸20s，并进行13个循环。实验完成后，对实验结果进行数据处理与分析。3.多重反应完成后进行文库构建和上机测试，模板文库构建过程为nextseqcn500使用通用引物进行第二轮模板扩增和纯化，所述反应体系中包含包括0.2-1u扩增taq酶、10～20μm测序接头通用引物、1-10xbuffer和0.2-1.8xampure纯化磁珠等试剂。文库构建过程中使用的ampure磁珠用量为：第一轮模板扩增后2次纯化进行片段筛选，第一次为15μl，第二次为18μl。第二轮模板扩增后的磁珠纯化为一次纯化，用量是24μl。第二轮pcr的具体步骤为：1、在体系中加入第一轮pcr产物纯化后的产物18μl，扩增taq酶混合物10μl，通用引物2μl进行pcr扩增。反应程序为95-98℃30s-3min预热变性；95-98℃10-15s，60-65℃20-40s，68-72℃20-45s循环8-12次扩增；68-72℃5-1mins，4℃保存。2、扩增后纯化：扩增产物中加入24μlampure磁珠进行吸附，80％乙醇洗两次后晾干加水溶解。图1a和图1b中，横坐标代表片段的长度，纵坐标代表片段的浓度(含量)。按照实验方案的设定，经引物panel多重扩增和文库构建后，目的产物应该是250-500bp左右；图1a和图1b所显示的结果表明，实际产物与实验设计的预期目标相符合。表3是样本上机测试数据分析表，是经过序列剪切、拼接以及位点分析等数据分析处理，而获得的初步的突变位点概况文件，经数据分析可得出肿瘤易感基因上的热点snp突变情况。表3包含以下信息：基因名是指被检测位点所在的基因，rs编号为ncbi网站snp数据库统一编号、突变类型是指这个snp位点突变的情况、染色体是指被检测位点所在的染色体位置、起始位置是指被检测位点所在染色体上的起始位置。表3肿瘤易感基因上的热点snp突变情况：基因名rs编号突变类型染色体起始位置mthfrrs1801133cc>tcchr111856378fdpsrs2297480tt>gtchr1155279482cyp2c8rs1934951cc>agchr1096798548slit1rs2784917aa>ccchr1098928942casp7rs7921977cc>tcchr10115439569gstp1rs1695aa>gachr1167352689rrm1rs9937aa>ctchr114159457cyp19a1rs4646aa>cachr1551502844tp53rs1042522cc>gcchr177579472ercc1rs11615tt>ccchr1945923653xrcc1rs1799782cc>tcchr1944057574ercc1rs3212986cc>tgchr1945912736aticrs4673993tt>ctchr2216212339ugt1a1*28rs8175347tt>ta7/ta7chr2234668881galnt14rs9679162gg>acchr231247514cbr3rs1056892gg>ttchr2137518706cyp2d6*10rs1065852gg>agchr2242526694xpcrs2228001cc>aachr314187449abcb1rs1045642tt>ctchr787138645abcb1rs2032582tt>gtchr787160618cyp3a4rs2740574gg>aachr799382096cyp3a5rs776746gg>agchr799270539c8orf34rs1517114cc>ggchr869389217五、实验结果与分析实验结束以后，对获得的测序数据进行分析，根据软件分析的结果，检测出与参考基因组hg19不同的位点。通过比对设计的引物panel和位点信息，检测出肿瘤个性化化疗易感基因上snp位点突变情况，再对突变情况进行人工解读，为癌症患者进行最科学的化疗药物疗效及毒副作用评估，辅助医生为患者制定个性化治疗方案。参考基因组hg19是人类(homosapiens)标准参考基因组(grch37/hg19)，是国际通用作为筛选目标序列突变位点或snp位点的参考基因序列，ncbigenbankassemblyaccession：gca_000001405.1。根据收集的样本检测情况，去除正常的snp位点，本例患者的46个肿瘤个性化指导用药基因的58个易感snp位点中，有23个位点发生了突变；对这23个突变位点进行人工解读，并做出用药指导。图2是通过人工解读，对各个位点突变情况进行系统性分析，以nccn指南等重要文献为指导，对癌症患者进行最科学的化疗药物疗效及毒副作用评估后，所制定的个性化指导用药方案概览。如图2所示，检测结果中氟尿嘧啶在第一推荐栏里，伊立替康显示毒副作用低，其余均落在了备选方案里，然后医生根据报告进行用药。用氟尿嘧啶化疗15天后,主治医生反馈效果不错，患者肺部肿瘤由5.8*6.2cm大小缩小为5.6*6.1cm，这很明显的表示本发明可以很好的对肿瘤患者进行化疗药物的用药指导，辅助医生为患者制定个性化治疗方案。给予患者最适合的治疗方案。本发明的引物偏向性扩增程度低，各引物之间相互干扰性小，特异性强，扩增效果好，对46个肿瘤化疗指导用药基因的58个snp位点具有检测灵敏度高，特异性强，不易污染，安全性高的优点。检测结果具有很好的准确性和重复性，对需要进行化疗的肿瘤患者，特别是对于失去外科手术治疗意义的晚期癌症病人有一定的辅助诊断和指导用药的意义。虽然本发明以较佳实施例揭露如上，但并非用以限定本发明实施的范围。任何本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的发明范围内，当可作些许的改进，即凡是依照本发明所做的同等改进，应为本发明的范围所涵盖。序列表<110>中山拓普基因科技有限公司<120>肿瘤个体化化疗用药指导基因snp位点检测组合物<130>g266022.17cn<141>2017-11-29<160>116<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>1gtctcgatctcctgaccccat21<210>2<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>2acaatacattggagaggtttgagg24<210>3<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>3tccatatttgtcatggagtttcaa24<210>4<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>4tagatgacgggtttataggtgcag24<210>5<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>5tgagcgacaaatactgaagtctca24<210>6<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>6agggaagcaactaaactcaatcac24<210>7<211>22<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>7gctcaactttgtagagcgaggg22<210>8<211>23<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>8cctttagcgaaagcgaaactaaa23<210>9<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>9cagaattagctgatttggtcgtct24<210>10<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>10tcatcagactgagactcaaagtgc24<210>11<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>11actttctggtgctgtcttttgttc24<210>12<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>12tgactctaccactgttaccaccaa24<210>13<211>25<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>13gacaacttctgcagatttaaacgtc25<210>14<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>14gaagagcaaatattgcttcctgat24<210>15<211>23<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>15ctatctggcccaataatgatggt23<210>16<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>16actacttcatgcctttctcagcag24<210>17<211>22<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>17ctcctcctcacttcctacaccc22<210>18<211>23<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>18ctgagaggaggcattaagctctg23<210>19<211>21<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>19cggctggacaggaatgtattt21<210>20<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>20gtgttcctctccttctcttcttcc24<210>21<211>23<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>21atccccagtgactgtgtgttgat23<210>22<211>23<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>22acaagaagcccctttctttgttc23<210>23<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>23cagatgagaaagaggaggaagaaa24<210>24<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>24ggaggaaagaattcaaacatctca24<210>25<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>25ccaggtgtttcaattgcttgatag24<210>26<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>26caattattgcaaggtttcaggaca24<210>27<211>20<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>27gagatggtcagtctgctgcc20<210>28<211>24<212>dna<213>人工合成(artificialsequence)<400>28ggccatta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