本发明涉及组织鉴定技术领域，尤其涉及一种恶性肿瘤组织特定个体归属的判断方法及其应用。
背景技术：
恶性肿瘤组织的法医学鉴定是指应用恶性肿瘤组织进行个体识别和亲权鉴定的法医学鉴定案件，在某些案件中恶性肿瘤组织可能成为唯一可提供证据的参照或者检验样本。如：家属怀疑医院病理科混淆恶性肿瘤组织蜡块，导致误诊；癌症病人死亡，尸体火化，家属要进行亲子鉴定；保险公司怀疑患者所提供恶性肿瘤组织的来源；海啸、地震等群体灾难性事件进行亲子鉴定；执法部分怀疑保外就医的罪犯所提供恶性肿瘤组织的来源真实性；医院为了进行精准医疗对恶性肿瘤组织蜡块进行测序以寻找特异性变异位点前，需要对恶性肿瘤组织进行个体识别鉴定等。恶性肿瘤组织的法医学鉴定是目前法医物证鉴定的难题之一。在恶性肿瘤组织中，由于错配修复基因突变或被修饰，无法发挥错配修复功能，使肿瘤基因在复制增殖过程中，更容易发生错误，出现突变。短串联重复序列(strs)是目前法医物证鉴定应用最广泛的dna遗传标记，在各国dna数据库建设、个体识别和亲权鉴定等司法鉴定实践中发挥重要作用。然而恶性肿瘤组织的strs存在显著突变，表现为增加等位基因、出现新等位基因、完全杂合性丢失和不完全杂合性丢失现象，突变率高，结果复杂，不适用于恶性肿瘤组织的法医学鉴定。此外还有利用单核苷酸多态性(snps)的鉴定方法。关于snps的检测方法，目前已有的检测技术有单碱基延伸(snapshot检测)、taqman方法、芯片检测法。snapshot检测法能够同时检测50多个snps，但是由于受到检测窗和标记荧光染料的限制使得同一个复合体系内无法检测更多的snps；taqman方法和芯片检测法虽然能够同时检测几百个snps，但是这些方法通常需要将探针提前固定到玻片或者芯片上，存在操作复杂、检测灵敏度较低、需要的起始dna量多、重复性差的问题，不适合在实际检案中使用。sanger法测序作为测序的金标准，也能够检测snps，由于sanger测序一次只能检测一条dna序列，测序通量低，不适合应用于同时检测更多的snps。
技术实现要素：
针对恶性肿瘤组织的strs存在显著突变、snps的检测方法操作复杂、测序通量低的问题，本发明提供一种恶性肿瘤组织特定个体归属的判断方法。
以及，本发明还提供一种上述恶性肿瘤组织特定个体归属的判断方法在恶性肿瘤组织的法医学鉴定方面的应用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下技术方案：
一种恶性肿瘤组织特定个体归属的判断方法，包括以下操作步骤：
步骤a、分别提取待测恶性肿瘤组织的细胞dna和特定个体正常组织的细胞dna；将所述dna进行定量、稀释后，用下一代测序技术进行基因组测序，得到原始基因组数据；
步骤b、根据原始基因组数据对所述待测恶性肿瘤组织的细胞dna和所述特定个体正常组织的细胞dna的单核苷酸多态性进行判型；
步骤c、根据所述待测恶性肿瘤组织的细胞dna和所述特定个体正常组织的细胞dna的判型结果判断所述恶性肿瘤组织与所述特定个体的归属性。
本发明采用单核苷酸多态性(snps)的检测方法，检测片段短、突变率低、遗传稳定、检测方法操作简便，采用的下一代测序技术(ngs)具有通量高、准确性高、扩展性强、快速灵活等特点，能够检测恶性肿瘤组织的特异性突变位点，在本发明中可以准确地判断出肿瘤组织与特定个体的归属关系。
以及，本发明实施例还提供一种上述恶性肿瘤组织特定个体归属的判断方法在恶性肿瘤组织的法医学鉴定方面的应用。
本发明通过对恶性肿瘤组织的法医学鉴定，可以明确判断待测恶性肿瘤组织是否来源于特定个体，特别是针对恶性肿瘤组织作为唯一可提供证据的参照或检验样本的情况。
附图说明
图1为实施例1的各步骤流程图；
图2为实施例1正常组织(a)和肿瘤组织(b)的主要等位基因频率(fmar)分布。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种恶性肿瘤组织特定个体归属的判断方法，包括以下操作步骤：
步骤a、分别提取待测恶性肿瘤组织的细胞dna和特定个体正常组织的细胞dna；将所述dna进行定量、稀释后，用下一代测序技术进行基因组测序，得到原始基因组数据；
步骤b、根据原始基因组数据对所述待测恶性肿瘤组织的细胞dna和所述特定个体正常组织的细胞dna的单核苷酸多态性进行判型；
步骤c、根据所述待测恶性肿瘤组织的细胞dna和所述特定个体正常组织的细胞dna的判型结果判断所述恶性肿瘤组织与所述特定个体的归属性。
本发明采用对单核苷酸多态性(snps)判型的检测方法，snps与strs相比具有数量多、检测片段短、突变率低、遗传稳定等特点，在108代发生一次突变。但是，由于snps多为二等位基因，遗传多态性较strs低，要达到与strs同等的法医学效能，需要检测较多的snps位点，故本发明还采用了下一代测序技术(ngs)，能够同时检测多个样本的几百个snps，也称大规模平行测序，具有通量高、准确性高、扩展性强、快速灵活等特点，能够检测恶性肿瘤组织的特异性突变位点，在本发明中，可以用于恶性肿瘤组织的法医学鉴定。
优选地，所述恶性肿瘤组织的间质细胞数量比例＞10％。恶性肿瘤组织由肿瘤细胞和间质细胞组成，因此检测的恶性肿瘤组织dna是肿瘤细胞dna和正常间质细胞dna的混合，肿瘤细胞发生突变并且存在异质性，正常间质细胞无突变，所以恶性肿瘤组织的基因分型由肿瘤细胞和间质细胞的比例、发生突变的肿瘤细胞的数目决定。恶性肿瘤组织基因型可以看作是该基因座等位基因的纯合子(肿瘤细胞)与杂合子(间质细胞)的混合。根据我们前期研究结果，恶性肿瘤组织的法医学应用的个体识别snps只存在杂合性丢失一种突变形式，当正常组织细胞较少时，恶性肿瘤组织的基因分型偏向于肿瘤细胞的分型，表现为杂合性丢失，因此可以通过检测肿瘤组织中的间质细胞的基因分型，以弥补由于肿瘤细胞的突变而丢失的等位基因。对发生突变的snp位点来说，当纯合子与杂合子的混合比例达到4：1时，理论主要等位基因频率(fmar)为0.9000。如表1所示。
表1肿瘤细胞与间质细胞混合比例的fmar理论值及计算公式
当间质细胞比例≥20％时，fmar≤0.9000，可将恶性肿瘤组织dna分型结果直接用于恶性肿瘤组织的法医学鉴定；当间质细胞比例>10％且<20％时，fmar＜0.9500，可能会检测出reads数百分比>5％且<10％的碱基，增加测序深度，进行重复测序，reads数百分比<5％，则认为是背景噪音；reads数百分比>5％，则认为是等位基因。当间质细胞百分比≤10％时，fmar≥0.9500，由于间质细胞数目少，可能无法有效地检测到次要等位基因，导致恶性肿瘤组织的snps分型与正常组织的snps分型不一致，判定结果为否定的时候不能直接得出确定性结论。
上述步骤a中，所述基因组为与疾病无关的个体识别单核苷酸多态性的基因片段，该基因片段不含疾病相关基因，可避免疾病有可能产生的突变对判型结果产生干扰。
步骤a还包括对所述原始基因组数据进行sanger测序验证。进行sanger测序验证后，可排除恶性肿瘤组织的突变对snps判型结果的影响，从而可以进行法医学鉴定。
上述步骤b中，所述判型的方法为：将所述恶性肿瘤组织的细胞dna和所述特定个体正常组织的细胞dna的原始基因组数据分别与标准人类基因组数据进行对比，得到所述待测恶性肿瘤组织的细胞dna和所述特定个体正常组织的细胞dna的单核苷酸多态性的基因型。
进一步的，所述判型通过二代测序平台插件进行，判型原则为最小reads数≥50，最小等位基因频率>10％，该参数范围下的实验结果中干扰更小，结果更可信。
进一步的，步骤b还包括在通过二代测序平台进行判型后，对显示为“nn”的基因座用integrativegenomeviewer进行可视化分析，再次判型，判型原则是最小reads数≥50，最小等位基因频率>10％。通过再次判型，可以将二代测序平台插件自动判型认为表现不佳的基因座进行再次筛选，以免遗漏而影响判型结果的准确性。
本发明实施例还提供了上述恶性肿瘤组织特定个体归属的判断方法在恶性肿瘤组织的法医学鉴定方面的应用。
为了更好的说明本发明实施方式，下面通过实施例做进一步的举例说明。
实施例1
本实施例提供了一种恶性肿瘤组织特定个体归属的判断方法：一位癌症患者在手术切除肿瘤后怀疑医院调错肿瘤组织蜡块，导致误诊，要求鉴定存档的肿瘤组织蜡块是否来自于自身包括以下步骤：
1.参照样本
取患者的外周血0.5ml制成血卡作为参照样本，晾干备用。
2.处理肿瘤组织样本，确定间质细胞百分比
用肿瘤组织蜡块制作5μm厚的切片，苏木素伊蓝(he)染色，切片置于显微镜下观察，先用40×放大倍数找到肿瘤组织浸润最丰富的区域，然后改用100×放大倍数评估肿瘤细胞在视野内所占的面积百分比，剩余即为间质百分比(如肿瘤组织为30％，则间质为70％)。选取2-3个视野，取最小的肿瘤细胞面积百分比作为最终取值，由两位专家进行双盲阅片。肿瘤组织中间质细胞比为50％。
3.dna提取
连续从肿瘤组织蜡块切8-10张切片，放入1.5mlep管中，用石蜡包埋组织快速提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取肿瘤组织切片dna。用qiaampdnainvestigatorkit(qiagen)提取患者血卡的dna。具体过程按说明书操作。
4.dna定量
采用qubitdsdnahsassaykit(thermofisherscientific)在qubitqubitfluorometer定量仪(thermofisherscientific)上对上述提取的dna进行定量。具体过程按说明书操作。
5.稀释dna至1ng/μl。
6.应用下一代测序技术检测snp
6.1构建文库，用precisionididentitypanel和ionampliseqlibrarykit进行文库构建，并对文库进行定量，按照说明书操作。
6.2制备模板，用ionpgmhi-qviewot2kit在iononetouch2仪器上进行模板制备，按照说明书操作。
6.3模板富集，将制备的模板在iononetouches仪器上进行富集，按照说明书操作。
6.4测序，在ionpgm上测序，按照说明书操作。
6.5数据处理，原始的测序数据经过iontorrentsuiteserverv5.0.2处理，进行信号处理、碱基判型和条形码比对，序列以hg19作为参照基因组进行比对。用hid_snp_genotyperv4.3.2插件结合目标区域bed文件和热点bed文件对检测的snps进行判型。
7.检查肿瘤组织和患者外周血液样本的snp判型，(1)在分型结果中出现“nn”，表示插件对测序数据进行综合检测后，无法判型。将测序数据分析后生成的bam和bai文件下载，导入igv软件中进行可视化分析，根据min_snp_coverage≥50，min_allele_frequency>10％的原则，对该位点进行手动判型；(2)所有杂合子基因座的主要等位基因频率都在50％-90％之间，所有纯合子的主要等位基因频率均>95％，认为判型准确，可确定肿瘤组织和外周血液样本的snp基因型；
8.比对肿瘤组织与患者外周血的基因分型，按照以下原则判断归属：(1)肿瘤组织的间质细胞比>10％，基因分型完全一致，则支持该肿瘤组织与血液样本来源于同一个体；若存在分型不一致的基因座，则不支持肿瘤组织与血液样本来源于同一个体。(2)肿瘤组织的间质细胞百分比≤10％，基因分型完全一致，则支持该肿瘤组织与血液样本来源于同一个体；若存在分型不一致的基因座，则不能确定肿瘤组织与血液样本是否来源于同一个体。
该例中肿瘤组织的间质细胞比例>10％，两个基因型完全一致，倾向于支持该肿瘤组织来源于此患者，结果如表2所示。
实施例2
本实施例提供了一种恶性肿瘤组织特定个体归属的判断方法：一位癌症患者在手术切除肿瘤后怀疑医院调错肿瘤组织蜡块，导致误诊，要求鉴定存档的肿瘤组织蜡块是否来自于自身包括以下步骤：
1～6步操作同实施例1，其中肿瘤组织中间质细胞比为30％。
7.检查肿瘤组织和患者外周血液样本的snp判型，(1)在分型结果中出现“nn”，表示插件对测序数据进行综合检测后，无法判型。将测序数据分析后生成的bam和bai文件下载，导入igv软件中进行可视化分析，根据min_snp_coverage≥50，min_allele_frequency>10％的原则，对该位点进行手动判型；(2)所有杂合子基因座的主要等位基因频率都在50％-90％之间，所有纯合子的主要等位基因频率均>95％，认为判型准确，可确定肿瘤组织和外周血液样本的snp基因型；
8.比对肿瘤组织与患者外周血的基因分型，两个样本在58个snps位点存在基因型不一致，排除该肿瘤组织来源于此患者。结果如表2所示。
实施例3
本实施例提供了一种恶性肿瘤组织特定个体归属的判断方法：一位癌症患者在手术切除肿瘤后怀疑医院调错肿瘤组织蜡块，导致误诊，要求鉴定存档的肿瘤组织蜡块是否来自于自身包括以下步骤：
1～6步操作同实施例1，其中肿瘤组织中间质细胞比为10％～20％。
7.检查肿瘤组织的snp判型，(1)在分型结果中出现“nn”，表示插件对测序数据进行综合检测后，无法判型。将测序数据分析后生成的bam和bai文件下载，导入igv软件中进行可视化分析，根据min_snp_coverage≥50，min_allele_frequency>10％的原则，对该位点进行手动判型；(2)在肿瘤组织的分型结果中，所有杂合子基因座的主要等位基因频率都在50％-90％之间，有1个纯合子基因座的主要等位基因频率在两次测序中都在90-95％，对该位点进行sanger测序，结果显示该位点为杂合子，判定该位点的基因型，最终确定肿瘤组织的snp分型。
8.检查外周血液样本的snp基因型，(1)在分型结果中出现“nn”，表示插件对测序数据进行综合检测后，无法判型。将测序数据分析后生成的bam和bai文件下载，导入igv软件中进行可视化分析，根据min_snp_coverage≥50，min_allele_frequency>10％的原则，对该位点进行手动判型。
9.比对肿瘤组织与患者外周血的基因分型，按照以下原则判断归属：(1)肿瘤组织的间质细胞比>10％，基因分型完全一致，则支持该肿瘤组织与血液样本来源于同一个体；若存在分型不一致的基因座，则不支持肿瘤组织与血液样本来源于同一个体。(2)肿瘤组织的间质细胞百分比≤10％，基因分型完全一致，则支持该肿瘤组织与血液样本来源于同一个体；若存在分型不一致的基因座，则不能确定肿瘤组织与血液样本是否来源于同一个体。
该案例肿瘤组织中的间质细胞比例>10％，肿瘤组织与患者外周血的snp基因分型完全一致，倾向于支持该肿瘤组织来自于此患者。结果如表2所示。
实施例4
本实施例提供了一种恶性肿瘤组织特定个体归属的判断方法：一位癌症患者在手术切除肿瘤后怀疑医院调错肿瘤组织蜡块，导致误诊，要求鉴定存档的肿瘤组织蜡块是否来自于自身包括以下步骤：
1～6步操作同实施例1，其中肿瘤组织中间质细胞比＜10％。
7.检查肿瘤组织的snp判型，(1)在分型结果中出现“nn”，表示插件对测序数据进行综合检测后，无法判型。将测序数据分析后生成的bam和bai文件下载，导入igv软件中进行可视化分析，根据min_snp_coverage≥50，min_allele_frequency>10％的原则，对该位点进行手动判型；(2)在肿瘤组织的分型结果中，所有杂合子基因座的主要等位基因频率都在50％-90％之间，所有纯合子基因座的主要等位基因频率>95％，判定肿瘤组织分型准确。
8.检查外周血液样本的snp基因型，(1)在分型结果中出现“nn”，表示插件对测序数据进行综合检测后，无法判型。将测序数据分析后生成的bam和bai文件下载，导入igv软件中进行可视化分析，根据min_snp_coverage≥50，min_allele_frequency>10％的原则，对该位点进行手动判型。
9.比对肿瘤组织与患者外周血的基因分型，按照以下原则判断归属：(1)肿瘤组织的间质细胞比>10％，基因分型完全一致，则支持该肿瘤组织与血液样本来源于同一个体；若存在分型不一致的基因座，则不支持肿瘤组织与血液样本来源于同一个体。(2)肿瘤组织的间质细胞百分比≤10％，基因分型完全一致，则支持该肿瘤组织与血液样本来源于同一个体；若存在分型不一致的基因座，则不能确定肿瘤组织与血液样本是否来源于同一个体。
该案例肿瘤组织中的间质细胞比例<10％，肿瘤组织与患者外周血的snp基因分型完全一致，倾向于支持该肿瘤组织来自于此患者。结果如表2所示。
实施例5
本实施例提供了一种恶性肿瘤组织特定个体归属的判断方法：一位癌症患者在手术切除肿瘤后怀疑医院调错肿瘤组织蜡块，导致误诊，要求鉴定存档的肿瘤组织蜡块是否来自于自身包括以下步骤：
1～6步操作同实施例1，其中肿瘤组织中间质细胞比＜10％。
7.检查肿瘤组织的snp判型，(1)在分型结果中出现“nn”，表示插件对测序数据进行综合检测后，无法判型。将测序数据分析后生成的bam和bai文件下载，导入igv软件中进行可视化分析，根据min_snp_coverage≥50，min_allele_frequency>10％的原则，对该位点进行手动判型；(2)在肿瘤组织的分型结果中，所有杂合子基因座的主要等位基因频率都在50％-90％之间，所有纯合子基因座的主要等位基因频率>95％。
8.检查外周血液样本的snp基因型，(1)在分型结果中出现“nn”，表示插件对测序数据进行综合检测后，无法判型。将测序数据分析后生成的bam和bai文件下载，导入igv软件中进行可视化分析，根据min_snp_coverage≥50，min_allele_frequency>10％的原则，对该位点进行手动判型；(2)在分型结果中，所有杂合子基因座的主要等位基因频率都在50％-90％之间，所有纯合子基因座的主要等位基因频率均>90％，所有位点判型准确。
9.比对肿瘤组织与患者外周血液样本的基因分型，按照以下原则判断归属：(1)肿瘤组织的间质细胞比>10％，基因分型完全一致，则支持该肿瘤组织与血液样本来源于同一个体；若存在分型不一致的基因座，则不支持肿瘤组织与血液样本来源于同一个体。(2)肿瘤组织的间质细胞百分比≤10％，基因分型完全一致，则支持该肿瘤组织与血液样本来源于同一个体；若存在分型不一致的基因座，则不能确定肿瘤组织与血液样本是否来源于同一个体。
该案例肿瘤组织中的间质细胞比例<10％，肿瘤组织与患者外周血的基因型在3个位点不一致，不能确定该肿瘤组织来自于此患者。结果如表2所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。