本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及一种鼻咽癌患病风险检测试剂盒及人atf1rs11169571单核苷酸多态性的测试方法。
背景技术：
鼻咽癌(npc)是我国南方常见的恶性肿瘤，广东为高发区。鼻咽癌是指鼻咽粘膜上皮发生的癌肿，大多为低分化鳞癌，其恶性度高，发病部位隐蔽，特别是在咽隐窝和鼻咽顶部者，早期症状不明显，因而难以早期发现，误诊误治率较高，可达12.2％，因而在确诊的鼻咽癌中，其5年生存率长期徘徊在50％～60％左右。对鼻咽癌进行早期诊断以便早期治疗，提高患者的生存率一直是npc临床研究的重要课题之一。
目前对鼻咽癌早期的检测方法有多种，包括有：eb病毒血清学标记物如病毒壳抗原一免疫球蛋白、eb病毒潜伏膜蛋白、eb病毒早期复合抗原的抗体检测，鼻咽癌相关肿瘤标记物如白细胞介素、肿瘤坏死因子、细胞间黏附分子、cyfra2121以及端粒酶等的检测。虽然这些指标的单独或联合应用为鼻咽癌的诊断提供了有用的信息，然而它们均缺乏足够的灵敏度与特异性。建立一种能对鼻咽癌患者进行筛查、诊断的无创性检测方法，对鼻咽癌的早期筛查、诊断、预防及治疗等具有重要意义。
技术实现要素：
本发明公开了一种鼻咽癌患病风险检测试剂盒及人atf1rs11169571单核苷酸多态性的测试方法，通过使用本发明的检测试剂盒，实现了对人atf1rs11169571单核苷酸多态性的检测，根据所得的人atf1rs11169571位点t/c突变结果作为鼻咽癌患病风险的评价指标。
本发明的第一方面公开了一种鼻咽癌患病风险检测试剂盒，用于检测人atf1rs11169571位点t/c突变，所述试剂盒包括：蛋白酶k、缓冲液gb、缓冲液gd、漂洗液pw、超纯水、atf1上游引物，atf1下游引物，gotaqgreenmastermix2x，rnasefreeh2o，hindiii酶，buffer10x，tbe缓冲液，琼脂糖，溴化乙锭，溴酚蓝指示剂；所述atf1上游引物为5’-cgcacgatatctagtgacagagg-3’，所述atf1下游引物为5’-tgcaaacctgtagggtaaatgg-3’。
本发明的第二方面公开了一种人atf1rs11169571单核苷酸多态性的测试方法，其特征在于使用权利要求1所述的鼻咽癌患病风险检测试剂盒，包括以下步骤：
(1)血液基因组dna的提取；
(2)将步骤1提取的dna，atf1上游引物，atf1下游引物，gotaqgreenmastermix2x，rnasefreeh2o加入pcr管中，在pcr仪中进行pcr反应；
(3)将步骤2得到的pcr产物，rnasefreeh2o，hindiii酶，buffer10x进行酶切实验；
(4)通过水平式琼脂糖凝胶电泳法检测步骤3中的酶切产物；
(5)采用卡方检验，logistics回归分析对步骤4的实验结果进行分析。
进一步地，所述步骤2中pcr仪的反应条件为：依次95℃5min，95℃40s，58℃40s，72℃40s，72℃5min进行45个循环。
发明的有益效果
本发明通过使用本发明的检测试剂盒，实现了对人atf1rs11169571单核苷酸多态性的快速检测，并根据卡方检验，logistics回归分析等统计学结果分析人atf1rs11169571位点t/c突变情况作为鼻咽癌患病风险的评价指标，从而实现了快速、便捷的对具有高鼻咽癌患病风险的人群筛选，起到了提高、提前的预防作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例
1病例采集和分组
本实验收集鼻咽癌病人和健康者血液标本，血液收集在抗凝管，-80℃保存，直到提取dna。按照病例对照研究，选择2014年9月至2015年10月广东医科大学附属医院收治的336例和2010年9月至2011年12月广东省南方医院收治的397例鼻咽癌患者血液为病例组，均经病理组织学诊断为鼻咽癌。对照组895例是在2014年9月至2015年10月广东医科大学附属医院收集的年龄和性别相匹配的常规体格检查健康者的血液。所有受试者均是居住在中国广东省，所有参与本实验的受试者均经同意并签于知情同意书，该课题经广东医科大学伦理委员会审核并通过。
2血液基因组dna的提取
(1)室温解冻冻在-80℃抗凝管的全血，取200μl的血液于1.5ml的离心管中；
(2)加入20μl的蛋白酶k(proteinasek)，充分混匀；
(3)加入200μl的缓冲液gb，充分颠倒混匀，水浴箱70℃放置10min，溶液变清凉，短暂离心，以除去离心管盖和内壁上的水珠；
(4)加入200μl无水乙醇，充分振荡摇匀15s，短暂离心，以除去离心管盖和内壁上的水珠；
(5)将上一步所得的溶液转移到吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱cb3放回收集管中；
(6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱cb3放入收集管中；
(7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱cb3放入收集管中；
(8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱cb3放入收集管中；
(9)重复步骤8；
(10)离心2min，弃废液，把吸附柱cb3放回收集管中，室温放置5分钟，彻底晾干吸附材料上残余的漂洗液；
(11)把吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附柱膜的中间部分悬空滴加50μl的超纯水，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；
(12)将离心管中收集的溶液再加入吸附膜中间部分，室温放置2min，12000rpm离心2min，将所得溶液收集到离心管中，测得浓度，并保存于-20℃。
3限制性片段长度多态性(rflp)方法
(1)普通pcr
①pcr管内加入下列物质，总体积：15μl
dna1μl
atf1上游引物：5’-cgcacgatatctagtgacagagg-3’0.5μl
atf1下游引物：5’-tgcaaacctgtagggtaaatgg-3’0.5μl
gotaqgreenmastermix2x0.5μl
rnasefreeh2o2.5μl
②将上述混合物短暂离心，放入pcr仪，反应条件：依次按95℃5min,95℃40s，58℃40s，72℃40s，72℃5min进行45个循环，4℃保存。
③将pcr产物放入-20℃保存。
(2)酶切实验
①pcr管中加入下列物质，总体积10μl，包括：pcr产物2μl，hindiii酶0.5μl，buffer10x1μl，rnasefreeh2o6.5μl。
②将上述试剂混匀后，短暂离心，置37℃水浴3h后，-20℃保存。
(3)水平式琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物
①安装水平式电泳槽，检查稳压电源与正负极的线路；
②选择配套的25孔点样梳子，对准电泳槽插梳子位置，垂直架在电泳胶模的一端，使梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm；
③将10xtbe缓冲液稀释成1xtbe缓冲液，可在室温保存备用；
④称取3g琼脂糖，放入1000ml的锥形瓶内，加入100ml的1xtbe缓冲液，制备成3％琼脂糖凝胶，100℃微波加热至琼脂糖融化均匀；
⑤待琼脂糖凝胶冷却约60℃左右时，加入5μl溴化乙锭，轻轻摇匀，避免起泡；
⑥将琼脂糖胶轻轻倒入电泳胶模中，轻轻插入梳子，室温放置约20分钟左右，见胶凝固后，小心拔掉梳子和电泳胶模两端的挡板，保证上样孔的完好。
⑦小心将琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入1xtbe电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1～2mm；
⑧将15ml酶切产物与溴酚蓝指示剂缓冲液混合，短暂离心，用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录好样品上样顺序；
⑨盖上电泳槽，开启电源开关，150v恒压，25min；
⑩电泳完毕后，关闭电源，取出凝胶，在254nm波长的紫外透射显影仪下观察，读取并记录条带位置。
4采用卡方检验，logistics回归分析对实验结果进行分析。
将实验结果采用卡方检验，logistics回归分析等统计学方法分析，结果如表1所示。卡方检验结论得出，病例组与正常组tt,tc,cc三种基因型存在显著差异(p<0.0001)，说明atf1rs11169571该位点t/c突变在鼻咽癌病人中存在显著差异，可能与鼻咽癌发病相关。logistic回归分析提示，病例组与正常组中ccvs.tt、tcvs.tt、(cc+tc)vs.ttp值均<0.05，or值分别为0.639,0.404,0.435，由此可得出人atf1rs11169571该位点t/c突变在鼻咽癌病人中存在显著差异，t突变为鼻咽癌患病危险因素，tt型较tc型，cc型患病风险更高。由此可以将位点的突变检测作为鼻咽癌患病风险的评价指标。
表1
本发明通过使用本发明的检测试剂盒，实现了对人atf1rs11169571单核苷酸多态性的快速检测，并根据卡方检验，logistics回归分析等统计学结果分析人atf1rs11169571位点t/c突变情况作为鼻咽癌患病风险的评价指标，从而实现了快速、便捷的对具有高鼻咽癌患病风险的人群筛选，起到了提高、提前的预防作用。