本发明属于生物发酵工程领域，涉及一种以凝结芽孢杆菌发酵处理南极磷虾获得富含益生菌的抗氧化肽的方法，具体涉及一种南极磷虾抗氧化肽及其制备方法与应用。
背景技术：
南极磷虾(Euphausia Superba)是地球上生物量最大、繁衍最成功的的生物之一，是一种重要的海洋新资源。我国对南极磷虾的开发尚处于初级阶段，主要体现在对磷虾油或虾青素的提取上，对于磷虾蛋白的回收利用相对较少。目前，南极磷虾粗蛋白多用作低值鱼饲料，且提取时多采用强酸强碱法，得率低，蛋白质结构被破坏，营养价值低；而由磷虾蛋白制得的磷虾肽具有多种生物活性，例如抗氧化、抑菌、抗疲劳等，在功能食品和化妆品领域拥有巨大的应用潜力。由于南极磷虾含有多种挥发性物质，其中含氮类化合物(例如二甲胺、三甲胺等)是南极磷虾腥味的主要来源，在制备磷虾肽的过程中往往伴随着很浓重的虾腥味，限制了其后续的开发和应用。因此，寻找合适的工艺方法对磷虾蛋白进行加工和去腥是提高磷虾资源综合利用的关键。
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)是近年来益生菌领域的后起之秀，除了具有乳酸菌和双歧杆菌等的保健功效外，还具有丰富的酶系统以及耐高温、耐酸和耐胆盐等高抗逆性能，且具有较强的抑制肠道致病菌能力。在国外已经广泛应用于医药、食品、保健、畜牧和水产等行业。
本发明利用凝结芽孢杆菌的生物发酵去除南极磷虾粉的虾腥味，并利用发酵过程中产生的蛋白酶将磷虾蛋白降解为具有抗氧化活性的磷虾肽。此举不仅可以大大提高磷虾蛋白的附加值，为保健品行业提供大量优质的原料，还可以为磷虾蛋白的深加工开辟一条新的途径。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用凝结芽孢杆菌发酵去除南极磷虾粉的腥味，并制备富含益生菌的磷虾抗氧化肽的方法，从而提高南极磷虾蛋白质的综合利用率和磷虾蛋白产品的附加值。
本发明的另一目的在于提供由上述方法制备得到的南极磷虾抗氧化肽。
本发明的再一目的在于提供上述南极磷虾抗氧化肽的应用。所述南极磷虾抗氧化肽应用于保健品和/或功能性食品领域；用于制备保健品和/或功能性食品。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种南极磷虾抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将脱脂南极磷虾粉、水和碳源混匀，调节溶液pH为6.5～7.5，灭菌，得到南极磷虾粉溶液；
(2)将凝结芽孢杆菌接种于液体培养基，35～45℃条件下摇床培养20～24h，调节孢子的浓度，得到凝结芽孢杆菌种子液；
(3)将凝结芽孢杆菌种子液与南极磷虾粉溶液进行混合，在35～45℃条件下摇床发酵35～45小时，离心，将上清液浓缩，干燥，得到南极磷虾抗氧化肽。
步骤(1)中所述脱脂南极磷虾粉与水的质量比为1:5～1:10；所述碳源的用量为脱脂南极磷虾粉与水的总质量的4％～8％；脱脂磷虾粉为磷虾粉经提取磷虾油后剩余的下脚料。
步骤(1)中所述碳源为麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉中一种以上；
步骤(1)中所述灭菌是指110～130℃条件下湿热灭菌25～45min，灭菌后降温到35-45℃；
步骤(2)中所述液体培养基通过以下方法得到：称取蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，氯化钠5.0g，加水定容至1000mL，调节pH至6.5～7.5，灭菌，即得液体培养基；所述灭菌是指110～130℃条件下湿热灭菌25～45min，灭菌后降温到35～45℃；
步骤(2)中所述凝结芽孢杆菌种子液中孢子的浓度为106～109个/mL；
步骤(2)中所述摇床培养的转速为100～200rpm；
步骤(3)中所述凝结芽孢杆菌种子液的用量为南极磷虾粉溶液体积的5％～10％；
步骤(3)中所述摇床培养的转速为100～150rpm；
步骤(3)中所述离心转速为2500～4000r/min所述浓缩为30～45℃旋转浓缩到30～45Bx(可溶性固形物含量为30-45％)，所述干燥为喷雾干燥。
所述凝结芽孢杆菌保藏号CCTCCM2017054，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
本发明所采用的南极磷虾粉丰富易得，本发明的方法能够去除虾腥味并制备出富含益生菌的抗氧化南极磷虾肽产品，解决了南极磷虾粉综合利用率低的问题，同时也大大提高了产品的附加值。利用凝结芽孢杆菌进行发酵，制备的南极磷虾肽无虾腥味，产品中多肽分子量为3000-9000Da，含量为40-60％，产品的TEAC抗氧化能力为60-120μM Trolox/mg，ORAC抗氧化能力为40-90μM Trolox/mg，且富含益生菌凝结芽孢杆菌，活菌数量达到1×106-108CFUs/g。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明的方法简单，环保；所制备的南极磷虾抗氧化肽中多肽分子量为3000-9000Da，含量为40-60％，其抗氧化活性好，没有虾腥味，产品口感好、无异味，且富含益生菌凝结芽孢杆菌，活菌数量达到1×106-108CFUs/g，与益生菌有协同效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明采用的菌株凝结芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌保藏号CCTCCM2017054，单位：中国典型培养物保藏中心。
实施例1
一种南极磷虾抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)取脱脂南极磷虾粉100g，加入去离子水500g，添加脱脂南极磷虾粉和去离子水总质量4％的麦芽糖混匀，调节pH为6.5，在121℃条件下湿热灭菌30min，冷却至35℃，得到南极磷虾粉溶液；
(2)称取蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，氯化钠5.0g，加水定容至1000mL，调节pH至6.5，得液体培养基；取100mL液体培养基，121℃灭菌30min，冷却至35℃，接种凝结芽孢杆菌，在120rpm、35℃条件下摇床培养20小时，得到凝结芽孢杆菌种子液；凝结芽孢杆菌种子液中孢子的浓度为2.9×108个/ml；
(3)将凝结芽孢杆菌种子液按5％的接种量(凝结芽孢杆菌种子液的用量为南极磷虾粉溶液体积的5％)接种于南极磷虾粉溶液中，然后在120rpm、35℃条件下摇床发酵35小时，在3000r/min条件下离心10min，将上清液于40℃旋转浓缩至30Bx，喷雾干燥得到富含益生菌的南极磷虾抗氧化肽。
本实施例制备的南极磷虾抗氧化肽成品无虾腥味，三甲胺相对含量降低到3.07％，肽含量为41％，分子量分布在6000-9000Da之间，TEAC抗氧化能力为65.7μM Trolox/mg，ORAC抗氧化能力为42.1μM Trolox/mg，产品中凝结芽孢杆菌的数量达到2.3×106CFUs/g。
实施例2
一种制备南极磷虾抗氧化肽的方法，其步骤包括：
(1)取脱脂南极磷虾粉100g，加入去离子水800g，添加脱脂南极磷虾粉和去离子水总质量6％的麦芽糖混匀，调节pH为6.8，在121℃条件下湿热灭菌30min，冷却至40℃，得到南极磷虾粉溶液；
(2)称取蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，氯化钠5.0g，加水定容至1000mL，调节pH至6.8，得培养基；取100mL培养基，121℃灭菌30min，冷却至40℃，接种凝结芽孢杆菌，在130rpm、40℃条件下摇床培养24小时，得到枯草芽孢杆菌种子液和凝结芽孢杆菌种子液；凝结芽孢杆菌种子液中孢子的浓度为2.4×108个/ml；
(3)将凝结芽孢杆菌种子液按8％的接种量(凝结芽孢杆菌种子液的用量为南极磷虾粉溶液体积的8％)接种于磷虾粉水溶液中，然后在150rpm、40℃条件下摇床发酵40小时，在3000r/min条件下离心10min，将上清液于40℃旋转浓缩至40Bx，喷雾干燥得到富含益生菌的南极磷虾抗氧化肽。
本实施例制备的南极磷虾抗氧化肽成品无虾腥味，三甲胺相对含量降低到2.86％，肽含量为49％，分子量分布在5000-7000Da之间，TEAC抗氧化能力为92.2μM Trolox/mg，ORAC抗氧化能力为63.8μM Trolox/mg，产品中凝结芽孢杆菌的数量达到2.1×106CFUs/g。
实施例3
一种制备南极磷虾抗氧化肽的方法，其步骤包括：
(1)取南极磷虾粉100g，加入去离子水1000g，添加脱脂南极磷虾粉和去离子水总质量8％的麦芽糖混匀，调节pH为7.0，在121℃条件下湿热灭菌30min，冷却至45℃，得到南极磷虾粉溶液；
(2)称取蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，氯化钠5.0g，加水定容至1000mL，调节pH至7.0，得培养基；分别取100mL培养基，121℃灭菌30min，冷却至45℃，接种凝结芽孢杆菌，在150rpm、45℃条件下摇床培养24小时，得到凝结芽孢杆菌种子液；凝结芽孢杆菌种子液中孢子的浓度为2.7×108个/ml；
(3)将凝结芽孢杆菌种子液按10％的接种量(凝结芽孢杆菌种子液的用量为南极磷虾粉溶液体积的10％)接种于南极磷虾粉溶液中，然后在150rpm、45℃条件下摇床发酵45小时，在3000r/min条件下离心10min，将上清液于40℃旋转浓缩至45Bx，喷雾干燥得到富含益生菌的南极磷虾抗氧化肽。
本实施例制备的南极磷虾抗氧化肽成品无虾腥味，三甲胺含量降低到2.21％，肽含量为57％，分子量分布在3000-5000Da之间，TEAC抗氧化能力为113.6μM Trolox/mg，ORAC抗氧化能力为87.7μM Trolox/mg，产品中凝结芽孢杆菌的数量达到1.7×107CFUs/g。