本属于多肽药物制备技术领域，特别涉及一种固相合成胸腺肽α1的新方法。
背景技术：
中文名称：胸腺肽α1；
英文名称：thymosinα1；
结构式为：
ac-ser-asp-ala-ala-val-asp-thr-ser-ser-glu-ile-thr-thr-lys-asp-leu-lys-glu-lys-lys-glu-val-val-glu-val-val-glu-glu-ala-glu-asn-oh；
分子式：c129h215n33o55；
分子量：3108.37
胸腺肽α1(thymosinα1)是一种治疗慢性乙型肝炎和增强免疫系统反应性的药物肽。胸腺肽α1通过刺激外周血液淋巴细胞丝裂原来促进t淋巴细胞的成熟，增加抗原或丝裂原激活后t细胞分泌的干扰素α、干扰素γ以及白介素2、白介素3等淋巴因子水平，同时增加t细胞表面淋巴因子受体水平。还可通过对cd4细胞的激活，增强异体和自体的人类混合淋巴细胞反应。胸腺肽α1可能增加前nk细胞的聚集，而干扰素可使其细胞毒性增强。体内试验显示，胸腺肽α1可以提高经刀豆蛋白a激活后小鼠淋巴细胞白介素2受体的表达水平，同时提高白介素2的分泌水平。
目前市场上的胸腺肽α1合成制备方法，合成周期长，生产成本高，不利于比伐卢定的大规模生产。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种固相合成胸腺肽α1的新方法，该制备方法反应条件温和、反应效率高、成本低、具有生产胸腺肽α1的广泛应用前景。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种固相合成胸腺肽α1的新方法，包括以下步骤：
s1、胸腺肽α1前体肽ⅰ-树脂的合成：
以树脂为载体，通过固相合成法，添加保护酸、缩合剂和活化剂到多肽合成反应器中，依次对胸腺肽α1序列中的氨基酸进行活化、缩合、微波反应、脱保护反应和洗涤，依次连接胸腺肽α1序列中的氨基酸，即得到如下的胸腺肽α1前体肽ⅰ-树脂：
fmoc-ser(tbu)-asp(otbu)-ala-ala-val-asp(otbu)-thr(tbu)-ser(tbu)-ser(tbu)-glu(otbu)-ile-thr(tbu)-thr(tbu)-lys(boc)-asp(otbu)-leu-lys(boc)-glu(otbu)-lys(boc)-lys(boc)-glu(otbu)-val-val-glu(otbu)-val-val-glu(otbu)-glu(otbu)-ala-glu(otbu)-asn(trt)-树脂；
s2、胸腺肽α1前体肽ⅱ-树脂的合成：
往胸腺肽α1前体肽ⅰ-树脂中加入乙酰化试剂进行n端乙酰化封头反应，得到如下的胸腺肽α1前体肽ⅱ-树脂：
ac-ser(tbu)-asp(otbu)-ala-ala-val-asp(otbu)-thr(tbu)-ser(tbu)-ser(tbu)-glu(otbu)-ile-thr(tbu)-thr(tbu)-lys(boc)-asp(otbu)-leu-lys(boc)-glu(otbu)-lys(boc)-lys(boc)-glu(otbu)-val-val-glu(otbu)-val-val-glu(otbu)-glu(otbu)-ala-glu(otbu)-asn(trt)-树脂；
s3、胸腺肽α1粗肽ⅲ的合成：
往胸腺肽α1前体肽ⅱ-树脂中加入切割试剂进行切割反应，接着沉降，得到了胸腺肽α1粗肽ⅲ；
s4、胸腺肽α1的合成：
胸腺肽α1粗肽ⅲ经纯化并冻干纯化冻干即得到如下的胸腺肽α1：
ac-ser-asp-ala-ala-val-asp-thr-ser-ser-glu-ile-thr-thr-lys-asp-leu-lys-glu-lys-lys-glu-val-val-glu-val-val-glu-glu-ala-glu-asn-oh。
进一步，步骤s1中所述的树脂为wangresin树脂，wangresin树脂的取代度为0.45mmol/g，所述的缩合剂和活化剂为hbtu/diea。
进一步，步骤s1中所述的保护酸为fmoc-保护酸，缩合的fmoc-保护氨基酸包括fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-val-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-ile-oh和fmoc-ser(tbu)-oh，所述缩合反应中氨基酸与树脂投料量为1.5:1，所述的缩合反应温度为25℃，缩合反应时间为20-30min。
进一步，步骤s1中所述的微波反应时间为20s-25s。
进一步，步骤s1中所述的脱保护反应选用20％pip/dmf为脱保护剂，脱保护剂的加入量为多肽合成反应器体积的1/3～1/2。
进一步，步骤s2中所述的乙酰化试剂为体积比为醋酐：diea：dmf＝1:1:4的混合液，乙酰化反应时间为20-30min。
进一步，步骤s3中所述的切割试剂为体积比为tfa：水＝95:5的混合液，切割试剂的加入量为多肽合成反应器体积的1/3～1/2，切割反应温度为25℃，所述的沉降为用-20℃低温预冷的无水乙醚进行胸腺肽α1粗肽ⅲ的沉降。
进一步，步骤s4中所述的纯化采用反相高效液相色谱法制备纯化。
进一步，所述的反相高效液相色谱法制备纯化的条件为：色谱柱选用粒径为10um的c18制备柱，以a相：0.1％乙酸水溶液，b相：0.1％乙酸乙腈溶液为流动相，按照如下的梯度程序进行多肽的分离提纯：
本发明的有益效果：
本发明利用fmoc固相合成原理，开发了固相高效合成技术，采用常见易得、低成本的原料试剂来合成制备，通过工艺优化以及特有的微波反应技术处理，胸腺肽α1粗品收率高达85％，其纯品得率达到60％，大大提高了胸腺肽α1的得率；纯化选用乙酸替换常用的三氟乙酸为流动相，大大降低了纯品中三氟乙酸盐的含量，彻底清除了三氟乙酸对生物体的毒性；该制备方法操作简单，合成周期短，生产成本低，副产物少，产品收率高，利于快速地大规模生产。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、树脂的溶胀
称量取代度为0.45mmol/g的wangresin(王树脂)0.2g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取dcm试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在dcm溶剂中，与溶剂充分接触，溶胀2h；
2、胸腺肽α1前体肽ⅰ-树脂的合成
胸腺肽α1前体肽ⅰ-树脂如下：
fmoc-ser(tbu)-asp(otbu)-ala-ala-val-asp(otbu)-thr(tbu)-ser(tbu)-ser(tbu)-glu(otbu)-ile-thr(tbu)-thr(tbu)-lys(boc)-asp(otbu)-leu-lys(boc)-glu(otbu)-lys(boc)-lys(boc)-glu(otbu)-val-val-glu(otbu)-val-val-glu(otbu)-glu(otbu)-ala-glu(otbu)-asn(trt)-树脂；
(1)、保护氨基酸的活化
使用的保护酸从树脂端起算第1～31个氨基酸相对应的保护酸及分子量如下表1所示，以fmoc-asn(trt)-wang树脂的缩合为例，按照计算的理论酸投料量称取52mgfmoc-asn(trt)-oh和40mghbtu于离心管中，加入2mldmf将其溶解，再用移液枪取10uldiea加入到离心管中，混合均匀得到活化的保护酸溶液；
(2)、树脂的脱保护及洗涤
取活化的保护酸溶液进行茚三酮显色检测，若无颜色反应，则氨基酸保护活化反应完全，用真空泵将多肽合成反应器中的溶剂抽干，接着将上述活化的保护酸溶液加到多肽合成反应器中，再将多肽合成反应器置于温度为25℃的恒温震荡器中震荡反应30min，震荡后加入0.5mldiea，然后将多肽合成反应器置于微波化学反应器中微波反应25s，反应完毕后，往多肽合成反应器中加入1/2反应器体积的20％pip/dmf脱保护溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇晃反应1min即可脱掉保护剂基asn，用真空泵抽干反应器中的溶剂后再加入dmf重复洗涤3次，最后再抽干洗涤溶剂即可；
采用上述同样方法，依次缩合第2～31个fmoc-保护氨基酸，最后脱掉ser保护基即得到胸腺肽α1前体肽ⅰ-树脂；
从树脂端起算第1～31个氨基酸相对应的保护酸及分子量如下表1所示：
表1
本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
fmoc:芴甲氧羰
dmf:n,n-二甲基甲酰胺
pip:六氢吡啶
tfa:三氟醋酸
tbu:叔丁基
otbu：氧叔丁基
trt：三苯甲基
boc：叔丁氧羰基
dic:n,n-二异丙基碳化二亚胺
diea:n,n-二异丙基乙胺
hobt:1-羟基苯并三唑
hbtu：2-(1h-苯并三唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐；
3、胸腺肽α1前体肽ⅱ-树脂的合成
在步骤2得到胸腺肽α1前体肽ⅰ-树脂后，用真空泵抽干多肽合成反应器中的溶剂；
乙酰化试剂的配置：按体积比醋酐：diea：dmf＝1:1:4配置，将容积为多肽合成反应器1/3～1/2的乙酰化试剂加入其中进行乙酰化反应，反应时间为30min，即得到胸腺肽α1前体肽ⅱ-树脂；
4、胸腺肽α1粗肽ⅲ的合成
在步骤3得到胸腺肽α1前体肽ⅱ-树脂后，用真空泵抽干多肽合成反应器中的溶剂；
切割试剂的配置：按体积比tfa：水＝95:5，混合均匀，将容积为多肽合成反应器1/3的切割试剂加入到多肽合成反应器中进行切割反应，反应温度为25℃，反应后将-20℃低温预冷的无水乙醚加入到多肽合成反应器中进行多肽粗品的沉降，即得到胸腺肽α1粗肽ⅲ；切割沉降后的胸腺肽α1粗肽ⅲ呈乳胶状态，其中含有较多的tfa盐和切割试剂，接着采用c18色谱柱进行除盐，用以计算粗品得率；将胸腺肽α1粗肽ⅲ溶解并过滤，采用流动相：a：0.1％乙酸水溶液，b：0.1％乙酸乙腈溶液，在波长为214nm下按照如下程序进样分析：
称量冻干后的胸腺肽α1粗肽ⅲ，质量为72mg，经计算粗品收率为85.8％，比现有技术仅60-70％的收率有大幅度提高；
5、胸腺肽α1的制备
将胸腺肽α1粗肽ⅲ溶解并过滤，采用反相高效液相色谱法制备纯化，制备条件为：色谱柱选用粒径为10um的c18制备柱，以a相：0.1％乙酸水溶液，b相：0.1％乙酸乙腈溶液为流动相，按照如下的梯度程序进行多肽的分离提纯：
收集提纯液冻干即得胸腺肽α1，经称量得到胸腺肽α1纯品34.2mg，纯度达到99.5％，纯品收率为61.2％。
实施例2
胸腺肽α1制备方法的对比实验：
根据现有技术正常缩合反应20～30min后洗涤，得到的胸腺肽α1粗品的收率为68.7％，经纯化制备得到胸腺肽α1纯品为22.1mg，纯品收率为49.8％；
而实施例1中经微波反应技术处理得到的胸腺肽α1的收率为85.8％，由此可见改进后的工艺胸腺肽α1的收率得到大大提高。
实施例3
为确定实验结果的稳定性，重复现有技术和改进方法合成胸腺肽α1的实验：
现有技术正常缩合反应20～30min后洗涤，得到的胸腺肽α1粗品的收率为69.1％，经纯化制备得到胸腺肽α1纯品为24.3mg，纯品收率为51.4％；
采用改进方法：正常缩合反应20～25min后，加0.5mldiea，微波树脂25s后洗涤，得到胸腺肽α1粗品的纯度达76％，粗品收率为86.4％，经纯化制备得到胸腺肽α1纯品为36.3mg，纯品收率61.7％；证实本发明实验数据的正确性和稳定性；
经上述实施例2和例3实验，得出在正常合成后再进一步的微波反应，制备得到的胸腺肽α1纯品的收率更高，效果较佳。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。