肝再生相关lncRNA及其筛选方法、抑制剂和应用与流程

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肝再生相关长链非编码rna及其抑制剂，以及在制备调节肝细胞增殖的制剂中的应用。

背景技术：

肝是人和动物体内最重要的器官之一，承担着多种生理功能。肝参与糖类、脂类、蛋白质等物质的代谢过程。肝创伤、手术、毒物、感染等因素导致肝损伤后肝细胞的重新修复，即通过细胞增殖及分化等生理活动恢复肝原有结构和功能的过程为肝再生。肝再生涉及细胞激活、细胞去分化、细胞增殖、细胞凋亡和组织结构重建等多个生理生化过程，包括micrornas在内的多种因素与肝结构、功能、疾病发生等密切相关。因此，阐明肝再生的分子机理，对肝创伤的修复、肝移植、肝病药物开发、肝病治疗及预防等均有重要意义。

长链非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)是指核苷酸数大于200nt的非编码rna转录本。lncrna种类丰富，功能复杂，位于不同的亚细胞核区域，在不同物种间序列保守性低，有组织与发育阶段特异性，同时又是具有快速进化潜力的非编码rna分子。lncrna可转录自基因与非基因区域，包括基因的上游区域、基因间区域、基因内含子区域等，大多数的lncrna被确定是转录和翻译中的关键调节因子，在细胞正常功能发挥中有着重要的影响。比如参与染色质重塑、转录及转录后调节、细胞内物质运输、细胞核亚结构形成、干细胞多能性、体细胞重编程、发育调节和疾病发生等。在发挥这些功能时，lncrna通过不同的作用途径及方式实现对基因表达的调节，包括顺式调节与反式调节方式。另外，lncrna可以借助蛋白质与microrna网络这两种不同途径来发挥具体的作用。

lncrna虽没有编码蛋白质的能力，但已有研究证明其参与细胞增殖、细胞生长、细胞分化、凋亡等多种生理活动。并且已证实多种疾病尤其是癌症如肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌等都涉及到lncrna的异常表达。以rna为靶点的药物研究新方向已得到越来越多的重视，通过设计小分子药物、反义寡核苷酸、核糖酶等方法作用于rna，这应当是未来药物研发的新方向。

技术实现要素：

本发明的目的提供一种长链非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)tcons_00027980的应用方法，具体是利用lncrnatcons_00027980为靶点调节肝细胞增殖。

一种筛选肝再生相关长链非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)的方法，所述方法包括：

1)构建肝再生大鼠模型；

2)采用大鼠lncrnaarrayv2.0芯片筛选，获得出肝再生过程中差异表达的lncrna；

3)通过关联推定法预测步骤2)中差异表达的lncrna的功能，筛选出了肝再生相关的lncrna。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)中所述大鼠为成年健康雄性sprague-dawley大鼠，所述肝再生大鼠模型为将大鼠肝脏切除2/3。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)中所述差异表达的lncrna为监测肝切除处理后0、2和6h时差异表达的lncrna。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤3)中所述的关联推定法是通过将每条lncrna的表达值与所有差异表达基因的表达值进行共表达分析，找到每条lncrna对应的共表达靶基因集合，对每一条lncrna的靶基因集合进行go和kegg功能富集分析，以预测每条lncrna的功能。

在根据本发明的一个实施方案中，所述每条lncrna对应的共表达靶基因为与特定lncrna表达值相关系数绝对值大于0.8，且相关性检验的p值小于0.05的基因。

本发明还提供了一种肝再生相关长链非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)，所述lncrna是通过上述方法筛选得到的；优选地，所述肝再生相关长链非编码rna为lncrnatcons_00027980。

本发明进一步提供了一种用于调节肝细胞增殖的抑制剂，所述抑制剂是用于调节lncrnatcons_00027980转录本核苷酸序列表达水平的dna或rna；优选地，所述抑制剂是基于lncrnatcons_00027980转录本核苷酸序列设计的sirna，所述lncrnatcons_00027980转录本核苷酸序列为seqidno.1。

在根据本发明的一个实施方案中，所述抑制剂为6种sirna中的一种或多种；

1)sirna-1：seqidno：6atgatgtgggatgtacaag

2)sirna-2：seqidno：7tgcttgatgatgtaggtcc

3)sirna-3：seqidno：8tcattgttgatttgtcagc

4)sirna-4：seqidno：9agccatgatgtgggatgtac

5)sirna-5：seqidno：10cctccttccttcatgtggac

6)sirna-6：seqidno：11ccctcctcgtgtgattgcag。

本发明还提供了一种用于调节肝细胞增殖的制剂，所述制剂包含如权利要求8或9所述的抑制剂。该制剂可以是医疗药物组合物，也可以是用于实验目的的试剂，例如加入药学上可接受的辅料，或是实验技术中的溶剂等。

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

本发明成功筛选出lncrnatcons_00027980，其可作为调节肝细胞增殖的靶点，lncrnatcons_00027980的抑制剂可进一步用于制备促进肝细胞增殖的制，本发明可为肝移植预后辅助治疗提供强有力的分子生物学工具，具有重要的临床意义和应用前景。

附图说明

图1为用mtt法检测lncrnatcons_00027980的抑制剂对brl-3a细胞增殖活性的影响；

图2a、图2b和图2c展示了lncrnatcons_00027980的抑制剂对brl-3a细胞周期的影响；其中图2a为对照组的流式细胞仪结果、图2b为试验组的流式细胞仪结果，图2c为对照组和试验组的细胞周期对比的柱形图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1：大鼠肝再生模型制备与取材

实验大鼠为成年健康雄性sprague-dawley大鼠，体重230±20g，由河南师范大学实验动物中心提供。饲养温度为21±2℃，相对湿度为60±10％，光照时间12h/d(8:00-20:00)，自由饮水、摄食。取114只上述大鼠，随机分为19组，每组6只。其中，正常对照(0h)1组，2/3肝切除(partialhepatectomy，ph)与假手术对照(shamoperation，so)各9组。ph组按higgins和anderson方法进行，so组除不切除肝叶外，其他同ph。手术后2、6h时，取肝右叶置于组织储存试剂(例如rnalater)中，于-20℃保存备用。

实施例2：lncrnas的高通量测序

取适量上述保存于-20℃的肝组织置于装有液氮的研钵中研磨，按总rna提取试剂盒(ambion，美国)操作指南提取和纯化总rnas。用琼脂糖凝胶电泳(180v，0.5h)检测总rna质量，28srrna∶18srrna约为2∶1，分别测定od260和od280，在od260/od280≥2.0，视为rna合格。mirnas的定性和定量分析由上海伯豪生物技术公司进行，用单端solexamicrorna-seq高通量测序法，从实验组(ph)和假手术组(so)的0、2和6h等3个时间点的大鼠再生肝中检测。

实施例3：lncrna和mrna表达丰度以及差异表达lncrna的筛选

利用cuffdiff软件对mrna在三个样本中的表达量进行分析，采用经典的rpkm(readsperkilobasespermillionreads)公式计算表达量。将从样本中重建的所有转录本(或见基因座)整体进行差异表达分析，结果无分子类型的偏好。对于无生物学重复样的项目设计，我们采用deseq进行差异表达分析，并将表达值差异倍数为log2(fc)绝对值大于1且p-value小于0.05的基因或转录本定义为肝再生相关lncrna。高通量测序结果表明，在ph后2h，检测到911条lncrna，其中522条与肝再生相关；在ph后6h，检测到908条lncrna，其中680条与肝再生相关(表1)。

表1大鼠肝再生中lncrna转录本表达变化数目统计

实施例4：lncrna的功能预测

利用0、2和6h三个样本，可以将每条lncrna的表达值与所有差异表达基因的表达值进行共表达分析，确定每条lncrna与哪些差异表达基因存在共表达关系。在具体分析中，将共表达关系定义为：特定lncrna与特定基因表达值相关系数绝对值大于0.8，且相关性检验的p值小于0.05。通过该定义，找到每条lncrna对应的共表达靶基因集合，并利用go和kegg对靶基因进行功能富集分析，并以此结果作为对lncrna的功能预测结果。对每一条lncrna的靶基因集合进行go和kegg功能富集分析，以预测每条lncrna的功能。

实施例5：实时荧光定量pcr检测

lncrna测序结果需要进一步验证结果的可靠性。实验中对挑选出来的差异表达lncrna，用rt-pcr检测在大鼠肝切除后不同时间点的表达变化。实验利用oligo6和primerpremier5.0软件设计了检测lncrna及内参的引物(表2)。引物由上海生物工程公司合成。按trigol试剂盒说明书提取大鼠肝中总rna。根据amv逆转录试剂盒(promega，美国)的操作说明进行反转录得到cdna。然后用该cdna作为模板，并筛选了pcr的最佳反应温度、时间和模板量。然后进行荧光定量pcr，荧光定量pcr的条件均为：95℃2min，95℃15sec，60℃20sec，72℃20sec，40个循环。每个样品重复检测三次，所得数据用2^-δδct法作相对定量处理。得到与高通量检测结果相符的lncrna，并把它们作为候选lncrna。

表2实时荧光定量pcr引物序列

实时荧光定量pcr检测lncrnatcons_00027980在肝再生的0、2和6h的表达情况。结果表明两种用不同方法检测lncrna的表达趋势一致，数据可信。

实施例6：lncrnatcons_00027980的抑制剂的设计及合成

本实施例依据lncrnatcons_00027980的转录本核苷酸序列，设计并合成了抑制剂(表3)。

表3lncrnatcons_00027980的抑制剂核苷酸序列

实施例7：大鼠肝细胞培养

实验所用大鼠正常肝细胞brl-3a购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，培养基为含10％胎牛血清(fbs)的dmem高糖培养基，细胞培养于37℃、饱和湿度、5％co2的培养箱里。取对数生长期细胞进行传代，5×10⁴个细胞/瓶。

实施例8：mtt法检测肝细胞增殖

取对数生长期的brl-3a细胞，0.25％胰酶(invitrogen，美国)消化，按1ml/孔、含5×10⁴个/ml细胞的细胞悬液接种于24孔细胞培养板中，在37℃、5％co2、饱和湿度下培养，细胞密度达到30-50％时进行转染，参照ribofect^tmcp(锐博，中国)转染试剂使用说明进行转染。每个实验设置3个复孔，同时设置空白对照和阴性对照。实验重复3次。

在含细胞和培养基的96孔板里加入10μl/孔mtt(geneview，美国)，使其最终浓度达0.5g/l，于37℃避光培养4h，彻底弃去培养液后，每孔加入100μl二甲基亚砜(geneview，美国)，轻轻震荡10min，充分溶解甲瓒晶体。最后，用酶标仪(biotek，美国)于490nm波长处检测各孔的吸光值。实验重复3次，每个实验组设置3个复孔。检测结果如图1所示，浓度为100nmlncrnatcons_00027980的抑制剂，转染细胞后48、72和96h时实验组吸光度值与对照组差异明显。

实施例9：细胞周期检测

为检测lncrnatcons_00027980对大鼠正常肝细胞brl-3a的细胞周期的影响，将细胞接种于24孔细胞培养板中，1×10⁵个细胞/孔，待细胞长到50～60％汇合度时，加入脂质体2000(invitrogen，美国)分别与模拟物、模拟物对照、抑制剂、抑制剂对照，抑制剂转染浓度为100nm/孔。在5％co2、37℃培养箱中培养48h后收集细胞。用70％乙醇于-20℃固定细胞过夜，用pbs洗涤和200目筛网过滤细胞后，再用碘化丙啶染液(50μg/mlpi，100μg/mlrnasea)室温避光染色30min，用流式细胞术检测细胞周期。流式细胞术检测结果显示(图2a、图2b和图2c)，流式细胞仪检测细胞周期结果表明，转染lncrnatcons_00027980抑制剂后48h，实验组(s+g2m％)细胞增殖率为(36.4±1.833)％，阴性对照组细胞增殖率为(23.92±1.931)％，两者s+g2m细胞数差异显著(p＜0.05)表明降低lncrnatcons_002798027980表达水平增加brl-3a细胞在s+g2m的比例。因此lncrnatcons_00027980对brl-3a细胞的增殖具有明显的抑制作用。

以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

序列表

<110>河南师范大学

<120>肝再生相关lncrna及其筛选方法、抑制剂和应用

<130>ey01pt011702323

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>7030

<212>dna

<213>sprague-dawley

<400>1

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