一种可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法与流程

本发明涉及一种人来源血凝调节蛋白的制备方法，特别涉及一种可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的大规模制备新方法。

背景技术：

血凝调节蛋白(thrombomodulin，tm)又称凝血酶调节蛋白，是存在于血管内皮细胞膜上的单链跨膜糖蛋白，完整分子的相对分子质量为75,000da，降解二硫键后相对分子质量为105,000da，由575个氨基酸组成。tm最初由n.l.esmon等于1981年在实验中发现，其结构包括一个氨基端的植物凝集样结构域，6个重复排列的内皮生长因子(endothelialgrowthfactor，egf)样结构域，一个丝氨酸/苏氨酸富集区(疏水区域)，一个跨膜区和一个短的细胞内尾端。凝血酶调节蛋白的结构如图3所示。

tm因具有强力的血液凝固阻断作用而为人所知，其通过与凝血酶特异性结合来阻断凝血酶的血液凝固活性，同时tm能够显著促进凝血酶的蛋白质c(proteinc，pc)的活化，是pc抗凝途径的重要辅因子。临床上tm能够预防与治疗冠状动脉综合症(acs)、血栓症、外周血管阻塞、闭塞性动脉硬化、血管炎、心脏手术后的功能性障碍、器官移植、心绞痛、短暂性脑缺血引起的并发症、妊娠毒血症、糖尿病、肝静脉阻塞病(livervod)、深静脉血栓(dvt)，急性呼吸窘迫综合症(ards)等。目前，主要是用于凝血系统紊乱而致的弥散性血管内凝血(dic)。

tm不仅是重要的抗凝辅助因子，也是反映血管内皮细胞损伤的分子标志，多种累及血管内皮损伤的疾病，如系统性红斑狼疮、糖尿病、白血病等，tm都有增高；越来越多的研究表明，tm可作为一种具有实际应用价值新的肿瘤标志物。因此，tm具有很高的临床应用价值。

tm有两种存在形式：固定型(膜型)和溶解型(血液型)。前者存在于细胞表面，后者游离于血浆和尿液中。溶解型tm(solublethrombomodulin，stm)由557个氨基酸残基构成，分子量约为60,300d，等电点约为3.8，其结构是固定型tm去除部分或全部的跨膜区域，stm与天然tm具有相同的功效和理化性质。研究显示在人血浆中tm含量为292±60ng/ml，人尿中tm含量为102±38ng/ml。

据报道，tm已经能从胎盘、肺和血液中提取出来，但是他们不适于大规模生产，除此之外，制备tm的原料在处理过程中常常需要外源加入表面活性剂、去污剂等物质，处理过程较为复杂，且容易带入污染物，为后续纯化增加难度。以考虑到tm在药品中的应用为前提，需要大量地且以更低成本来获得可溶性血栓调节蛋白，目前有市售的日本旭化成公司的重组可溶性tm，但tm是一种糖蛋白，通过基因工程技术无法制备与天然结构具有相同糖链的目标蛋白，糖链的差异可能导致蛋白具有截然相反的生物功能，导致蛋白药物具有负面效应。

另有多个文献报道人尿适于用作分离天然型tm的起始原料，例如yamamoto等纯化tm的过程使用了qae交联葡聚糖，抗tm单克隆抗体柱，凝血酶作为配体的亲和柱和交联葡聚糖g-200，但由于此方法需要制备单克隆抗体，过程较为复杂。再如d.e.jackson等纯化tm时结合使用了deae琼脂糖凝胶，凝血酶作为配体的亲和柱和反向hplc，此方法中反向hplc产量低且不适于大规模纯化，另外，aoki等(日本专利申请公开no.sho-63-30423)和kunihiro等(日本专利申请公开no.sho-63-218399)报道了从新鲜尿液中纯化tm的方法，使用了离子交换色谱，凝血酶结合的亲和柱和凝胶渗透，结果证明当tm含量很低时，此方法不适用。综上可以看出目前从人尿中提取tm的各种纯化方法均表现为产量低且不适于大规模工业化生产。

技术实现要素：

发明目的：为了能够简单方便、成本低、收率高的大规模工业化生产得到无异源蛋白污染、更安全可靠、生物活性高、无免疫原性、质量稳定的纯人源性血凝调节蛋白，本发明提供了一种可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法。

技术方案：本发明所述的可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法，包括将从人尿中提取的尿蛋白浓缩液依次经金属螯合亲和层析柱、阴离子层析柱、凝血酶亲和层析柱、疏水层析柱层析，得到血凝调节蛋白。

所述的尿蛋白浓缩液由以下步骤制备得到：利用离子交换树脂作为吸附剂吸附尿液中的尿蛋白，清洗、解吸附，超滤浓缩，即得尿蛋白浓缩液。其中，所述的离子交换树脂优选为大孔径离子交换树脂。

所述的尿蛋白浓缩液由以下更具体的步骤制备得到：将离子交换树脂作为吸附剂放置在尿池或尿斗中，吸附流经尿液或稀释尿液中的尿蛋白；收集已吸附尿蛋白的树脂，集中进行清洗，解吸附，超滤浓缩，即得尿蛋白浓缩液。

所述的解吸附为利用0.5～1.5mol/l的nacl水溶液进行尿蛋白的解吸附。

所述的离子交换树脂为阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、阴阳离子混合树脂或者同时具有阳离子交换基团和阴离子交换基团的两性树脂。

采用平衡液平衡好的金属螯合亲和层析柱层析，上样尿蛋白浓缩液，经洗脱液洗脱后收集洗脱峰；尿蛋白浓缩液上样金属鳌合亲和层析柱之前需要调节ph与电导，调节ph为5.0-8.0，电导0.5-10ms/cm。所述的金属鳌合亲和层析柱的鳌合金属离子是cu²⁺、zn²⁺、ni²⁺、fe³⁺中的任意一种，优选为cu²⁺，其层析时所用的平衡液为0.02-0.2mol/l醋酸盐或磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含0.05-0.5mol/lnh4ac；洗脱液为0.02-0.2mol/l磷酸盐水溶液，所述水溶液含0.05-0.5mol/lnh4ac和0.02-0.2mol/l咪唑，ph为6.0-8.0。平衡液优选0.1mol/l磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含0.1mol/lnh4ac，ph为6.0；洗脱液优选0.1mol/l磷酸盐水溶液，所述水溶液含0.1mol/lnh4ac和0.1mol/l咪唑，ph为7.0。

在洗脱金属螯合亲和层析柱之前加入冲洗步骤，冲洗液为0.02-0.2mol/l磷酸盐或者醋酸盐水溶液，所述水溶液含0.1-0.5mol/lnh4ac，ph为5.0-8.0。冲洗液优选0.1mol/l磷酸盐水溶液，所述水溶液含0.2mol/lnh4ac，ph为6.0。

采用平衡好的阴离子层析柱层析，上样金属螯合亲和层析的洗脱峰样品，该洗脱峰样品上样前，超滤浓缩，调节ph为5-8，电导0.2-2ms/cm。所述的阴离子层析柱优选为deae-琼脂糖凝胶柱。所述的阴离子层析柱平衡洗脱液为0.02-0.2mol/l磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，所述缓冲液ph为5-8。平衡洗脱液优选0.02mol/l磷酸盐缓冲液，ph为7.0。

采用平衡好的凝血酶亲和层析柱层析，上样离子交换层析的冲洗穿透峰，调节ph为5-7，电导0.5-5ms/cm。所述的凝血酶亲和层析柱平衡液为0.02-0.2mol/l磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含0.1-0.8mol/lnacl，ph为5-7；洗脱液为0.02-0.2mol/l磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含0.5-1.5mol/lnacl，ph为5-7。平衡液优选0.02mol/l磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含0.2mol/lnacl，ph为6.0；洗脱液优选0.02mol/l磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含1.0mol/lnacl，ph为6.0。

所述的凝血酶亲和层析和疏水层析之间还包括去病毒步骤，所述的去病毒步骤具体为调节凝血酶亲和层析洗脱液蛋白质质量分数至10-20％，加入葡萄糖、甘露醇、作为保护剂，60℃加热10小时。

采用平衡好的疏水层析柱层析，上样加热后样品，经洗脱液洗脱后收集洗脱峰；洗脱峰上样前，调节电导高于疏水平衡液电导。所述的疏水层析柱的疏水介质为phenyl-琼脂糖凝胶。所述的疏水层析柱平衡液为0.02-0.2mol/l磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含0.5-2.0mol/l(nh4)2so4，ph为6-8；洗脱液为0.02-0.2mol/l磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含0.2-1.0mol/l(nh4)2so4，ph为6-8。平衡液优选0.02mol/l磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含1.5mol/l(nh4)2so4，ph为7.0；洗脱液优选0.02mol/l磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含0.5mol/l(nh4)2so4，ph为7.0。

金属螯合亲和层析柱作用将尿蛋白浓缩液中的目标蛋白-tm进行捕获纯化，去除与金属离子结合力低的杂蛋白，制得tm粗制品用于后续纯化；阴离子层析柱用于吸附大部分等电点偏酸性的杂蛋白，目标蛋白tm穿透；凝血酶亲和层析柱用于特异性吸附纯化tm，一步纯化大大提高比活性；疏水层析柱层析用于tm样品中痕量杂蛋白的去除，同时保证前一步加热样品中葡萄糖、甘露醇等试剂的去除。

该纯化工艺中金属螯合亲和层析和阴离子交换层析两步是用于目标蛋白的捕获和粗提取，后期的凝血酶亲和层析和疏水层析则是针对样品中与tm性质相近的杂蛋白采取的精细纯化步骤，以此保证最终样品的纯度，该纯化工艺易于放大，工艺衔接顺畅，得到的产品收率高。

有益效果：相比于现有技术，本发明具有以下优点：

(1)本发明以人尿中提取的尿蛋白浓缩液为原料，通过应用现代层析技术成功实现tm的纯化，操作简单方便，成本低，收率高，且制备得到的血凝调节蛋白属纯人源性产品，无异源蛋白污染，更安全可靠，生物活性高，无免疫原性，质量稳定，适合大规模生产操作，为tm的来源开辟了一条全新的渠道。

(2)本发明以尿蛋白在线吸附技术为基础，从人尿中大规模制备血凝调节蛋白，通过与人尿激肽原酶、人白蛋白等尿蛋白进行联产，保证质量的前提下大幅度降低成本，可供应量更大，更加具有产业化基础。

附图说明

图1为本发明制备血凝调节蛋白流程图；

图2为本发明实施例1制得的血凝调节蛋白纯品sds-page图；

图3为凝血酶调节蛋白的结构图。

具体实施方式

实施例1

收集吸附尿蛋白的树脂100公斤，用水冲洗干净，装柱；用0.5mol/l的nacl水溶液进行洗脱，收集洗脱峰，测得其中的血凝调节蛋白含量为11mg。

a、金属螯合亲和层析

用截留分子量30k的超滤膜进行超滤浓缩，将超滤浓缩液调节ph至5.0，电导至0.5ms/cm，上已经平衡好的金属离子为cu²⁺的金属螯合亲和层析柱(chelatingsepharoseff)；再用平衡液(平衡液配方：0.2mol/l醋酸盐缓冲液，含0.05mol/lnh4ac，ph为5.0)冲洗金属螯合亲和层析柱，收集上样穿透液和冲洗穿透液，用冲洗液(0.2mol/l的醋酸盐缓冲液，含0.1mol/lnh4ac，ph为5.0)冲洗，用洗脱液(0.2mol/l磷酸盐水溶液，含0.5mol/lnh4ac和0.02mol/l咪唑，ph为6.0)洗脱金属螯合亲和层析柱，收集洗脱峰(a液)。

b、阴离子交换层析

a液上样deae-琼脂糖凝胶柱，结合洗脱缓冲浓度为0.2mol/l磷酸盐缓冲液，ph为8.0。

其中，步骤a中a液超滤浓缩调节ph和电导，ph调至8.0，电导1.0ms/cm，上阴离子交换柱，平衡液冲洗，收集穿透峰(b液)。

c、凝血酶亲和层析

b液调节蛋白浓度为10wt％，加入0.01mol/l葡萄糖，60℃加热处理10小时，调节电导至1.0ms/cm，ph至5.0，上样已平衡好的凝血酶亲和层析柱(平衡液配方：0.02mol/l磷酸盐缓冲液，含0.1mol/lnacl，ph为5.0)，平衡液冲洗，洗脱液洗脱(洗脱液配方：0.02mol/l磷酸盐缓冲液，含0.5mol/lnacl，ph为5.0)，收集洗脱液(c液)。

d、加热处理

将c液超滤浓缩至蛋白含量为12wt％，加入葡萄糖5g/l、甘露醇50g/l作为保护剂，60℃加热10小时，得到d液。

e、疏水层析柱

d液调节电导高于疏水平衡液电导，上样已平衡好的疏水层析柱，平衡液冲洗，洗脱液洗脱。平衡液为0.02mol/l磷酸盐缓冲液，含0.5mol/l(nh4)2so4，ph为6。洗脱液为0.02mol/l磷酸盐缓冲液，含0.2mol/l(nh4)2so4，ph为6.0。收集洗脱液，得到血凝调节蛋白2.5mg，纯度为95％，其sds-page图见图2。

实施例2

收集吸附尿蛋白的树脂100公斤，用水冲洗干净，装柱；用1.5mol/l的nacl水溶液进行洗脱，收集洗脱峰，测得其中的血凝调节蛋白含量为10mg。

a、金属螯合亲和层析

用截留分子量30k的超滤膜进行超滤浓缩，将超滤浓缩液调节ph至8.0，电导至10ms/cm，上已经平衡好的金属离子为zn²⁺的金属螯合亲和层析柱(chelatingsepharoseff)，再用平衡液(平衡液配方：0.02mol/l磷酸盐缓冲液，含0.5mol/lnh4ac，ph为8.0)冲洗金属螯合亲和层析柱，收集上样穿透液和冲洗穿透液，用冲洗液(0.02mol/l的磷酸盐缓冲液，含0.5mol/lnh4ac，ph为8.0)冲洗，用洗脱液(0.02mol/l磷酸盐水溶液，含0.5mol/lnh4ac，ph为8.0)洗脱金属螯合亲和层析柱，收集洗脱峰(a液)。

b、阴离子交换层析

以deae-琼脂糖凝胶柱为例，对血栓调节蛋白的纯化条件进行优化。血栓调节蛋白的结合洗脱缓冲浓度为0.02mol/l磷酸盐缓冲液，ph为5.0。步骤a中，a液超滤浓缩调节ph和电导，ph调至5.0，电导0.2ms/cm，上阴离子交换柱，平衡液冲洗，收集穿透峰(b液)。

c、凝血酶亲和层析

溶液b超滤后调节蛋白浓度为12wt％，加入0.01mol/l葡萄糖，60℃加热处理10小时，调节电导至5.0ms/cm，ph至7.0，上样已平衡好的凝血酶亲和层析柱(平衡液配方：0.2mol/l磷酸盐缓冲液，含0.8mol/lnacl，ph为7.0)，平衡液冲洗，洗脱液洗脱(洗脱液配方：0.2mol/l磷酸盐缓冲液，含1.5mol/lnacl，ph为7.0)，收集洗脱峰(c液)。

d、加热处理

将c液超滤浓缩至蛋白含量为15wt％，加入葡萄糖5g/l、甘露醇50g/l作为保护剂，60℃加热10小时，得到d液。

e、疏水层析柱

d液调节电导高于疏水平衡液电导，上样已平衡好的疏水层析柱，平衡液冲洗，洗脱液洗脱，平衡液为0.2mol/l磷酸盐缓冲液，含2.0mol/l(nh4)2so4，ph为8.0。洗脱液为0.2mol/l磷酸盐缓冲液，含1.0mol/l(nh4)2so4，ph为8.0。收集洗脱液，得到血凝调节蛋白2.1mg，纯度为97％。

实施例3：

收集吸附尿蛋白的树脂5吨，用水冲洗干净，装柱；用0.8mol/l的nacl水溶液进行洗脱，收集洗脱峰，测得其中的血凝调节蛋白含量为500mg。

a、金属螯合亲和层析

用截留分子量30k的超滤膜进行超滤浓缩，将超滤浓缩液调节ph至6.0，电导至5.0ms/cm，上已经平衡好的金属离子为cu²⁺的金属螯合亲和层析柱(chelatingsepharoseff)；再用平衡液(平衡液配方：0.1mol/l磷酸盐缓冲液，含0.1mol/lnh4ac，ph为6.0)冲洗金属螯合亲和层析柱，收集上样穿透液和冲洗穿透液，用冲洗液(0.1mol/l的磷酸盐缓冲液，含0.2mol/lnh4ac，ph为6.0)冲洗，用洗脱液(0.1mol/l磷酸盐，含0.1mol/lnh4ac，ph为7.0)洗脱金属螯合亲和层析柱，收集洗脱峰(a液)。

b、阴离子交换层析

a液上样deae-琼脂糖凝胶柱，结合洗脱缓冲浓度为0.1mol/l磷酸盐缓冲液，ph为7.0。其中，步骤a中a液超滤浓缩调节ph和电导，ph调至7.0，电导2.0ms/cm，上阴离子交换柱，平衡液冲洗，收集穿透峰(b液)。

c、凝血酶亲和层析

溶液b超滤后调节蛋白浓度为15wt％，0.02mol/l葡萄糖，60℃加热处理10小时，调节电导至0.5ms/cm，ph至6.0，上样已平衡好的凝血酶亲和层析柱(平衡液配方：0.1mol/l磷酸盐缓冲液，含0.2mol/lnacl，ph为6.0)，平衡液冲洗，洗脱液洗脱(洗脱液配方：0.1mol/l磷酸盐缓冲液，含1.0mol/lnacl，ph为6.0)，收集洗脱液(c液)。

d、加热处理

将c液超滤浓缩至蛋白含量为20wt％，加入葡萄糖5g/l、甘露醇50g/l作为保护剂，60℃加热10小时，得到d液。

e、疏水层析柱

d液调节电导高于疏水平衡液电导，上样已平衡好的疏水层析柱，平衡液冲洗，洗脱液洗脱，平衡液为0.02mol/l磷酸盐缓冲液，含1.5mol/l(nh4)2so4，ph为7.0。洗脱液为0.02mol/l磷酸盐缓冲液，含0.5mol/l(nh4)2so4，ph为7.0，收集洗脱液，得到血凝调节蛋白125mg，纯度为97％。

对比例1：

收集吸附尿蛋白的树脂5吨，用水冲洗干净，装柱；用0.8mol/l的nacl水溶液进行洗脱，收集洗脱峰，测得其中的血凝调节蛋白含量为500mg。

a、金属螯合亲和层析

用截留分子量30k的超滤膜进行超滤浓缩，将超滤浓缩液调节ph至6.0，电导至5.0ms/cm，上已经平衡好的金属离子为cu²⁺的金属螯合亲和层析柱(chelatingsepharoseff)；再用平衡液(平衡液配方：0.1mol/l磷酸盐缓冲液，含0.1mol/lnh4ac，ph为6.0)冲洗金属螯合亲和层析柱，收集上样穿透液和冲洗穿透液，用冲洗液(0.1mol/l的磷酸盐缓冲液，含0.2mol/lnh4ac，ph为6.0)冲洗，用洗脱液(0.1mol/l磷酸盐，含0.1mol/lnh4ac，ph为7.0)洗脱金属螯合亲和层析柱，收集洗脱峰(a液)。

b、凝血酶亲和层析

溶液a超滤后调节电导至0.5ms/cm，ph至6.0，上样已平衡好的凝血酶亲和层析柱(平衡液配方：0.1mol/l磷酸盐缓冲液，含0.2mol/lnacl，ph为6.0)，平衡液冲洗，洗脱液洗脱(洗脱液配方：0.1mol/l磷酸盐缓冲液，含1.0mol/lnacl，ph为6.0)，收集洗脱液(b液)。

c、阴离子交换层析

b液上样deae-琼脂糖凝胶柱，结合洗脱缓冲浓度为0.1mol/l磷酸盐缓冲液，ph为7.0。其中，步骤a中a液超滤浓缩调节ph和电导，ph调至7.0，电导2.0ms/cm，上阴离子交换柱，平衡液冲洗，收集穿透峰(c液)。

d、加热处理

将c液超滤浓缩至蛋白含量为20wt％，加入葡萄糖5g/l、甘露醇50g/l作为保护剂，60℃加热10小时，得到d液。

e、疏水层析柱

d液调节电导高于疏水平衡液电导，上样已平衡好的疏水层析柱，平衡液冲洗，洗脱液洗脱，平衡液为0.02mol/l磷酸盐缓冲液，含1.5mol/l(nh4)2so4，ph为7.0。洗脱液为0.02mol/l磷酸盐缓冲液，含0.5mol/l(nh4)2so4，ph为7.0，收集洗脱液，得到血凝调节蛋白48mg，纯度为83％。