一种龙眼多糖提取及分离纯化方法，特别涉及一种使用微波超声波辅助法对龙眼多糖提取及分离纯化方法。
背景技术：
目前,国际上对糖类的研究内容涉及到糖生物学、糖工程等,有关“糖生物学和糖工程”的专题会议相继召开。在新型学科“糖生物学”和“糖工程学”形成后,糖科学和糖技术得到了飞速的发展,成果令人瞩目,但与蛋白质和核酸研究层次与水平相比,还是需要继续加强深入的。比如提高结构测定方法的自动化、微量化合标准化以及多糖晶体结构的认识；构效关系的认识与体内机制的研究等都将有利于指导发现新的功能性多糖。虽然,多糖研究中还存在上述需要改进深入的地方,这也正是多糖的应用研究前景所在。
申请内容
为解决上述技术问题：本申请提出一种龙眼多糖提取方法，包括如下步骤：1、预处理；2、提取，准确称取一定质量的龙眼果肉碎于三口瓶中，加入一定体积的蒸馏水,然后在微波功率为500w、一定的超声波功率的处理条件下，用微波超声波仪处理一定时间；3、过滤，提取液进行真空抽滤，取上层清液；4、酶解，在龙眼多糖溶液中加入0.2g的木瓜蛋白酶，搅拌均匀，然后将烧杯置于60℃的水浴中酶解3小时；5、离心；6、脱蛋白；7、分离；8、浓缩；9、醇沉；10、离心并干燥。
所述的龙眼多糖提取方法，其中，所述步骤1具体包括：将鲜龙眼去皮去核，取果肉，用95％乙醇浸泡48h，35℃热泵干燥后冷冻保存备用；称取一定质量的龙眼肉于打浆机中，按龙眼肉质量：水质量＝3：1的比例将龙眼肉捣碎成米粒大小，备用。
所述的龙眼多糖提取方法，其中，所述步骤1中将龙眼肉捣碎成米粒大小之后还包括煮沸，灭酶活，漂洗除色素，干燥，然后浸泡，调ph。
所述的龙眼多糖提取方法，其中，所述步骤5具体包括：取两只干净的离心管，将上述酶解液均匀的分装到两只离心管中，用蒸馏水洗烧杯并将洗液移至两支离心管中，重复2～3次，使两只管的质量相等或非常接近，然后对称地放入离心机中在转速为10000r/min条件下离心10min，取上清液。
所述的龙眼多糖提取方法，其中，所述步骤6具体包括：在上清液中加入1/4体积的正丁醇-氯仿混合液和一颗磁力搅拌子，然后把烧杯放在磁力搅拌器上高速搅拌10min；所述步骤7具体包括：将试液和搅拌子的洗液转移到分液漏斗中，静置5min，小心地将下层溶液从下口排出，收集上层溶液；所述步骤8具体包括：将收集来的溶液按浓缩比为4:1进行真空浓缩，浓缩温度为65℃；所述步骤9具体包括：将冷却的真空浓缩液，缓慢倒入其4倍体积的95％乙醇中，边倒边用玻璃棒搅拌，密封后，于4℃冰箱静置保存12h；所述步骤10具体包括：将醇沉后的试液及沉淀分到两支离心管中，直到两支离心管的质量相等或非常接近，对称放入离心机离心，按照10000r/min离心7min，取沉淀，并回收上清液。
所述的龙眼多糖提取方法，其中，所述正丁醇-氯仿混合液为正丁醇：氯仿＝1:4。
所述的龙眼多糖提取及分离纯化方法，其中，所述分离纯化包括如下步骤：a)、deae-cellulose-52的预处理；b)、湿法装柱；c)、上样。
所述的龙眼多糖提取方法，其中，所述步骤a)具体包括：称取一定量的deae-cellulose-52离子交换树脂于洁净的大烧杯中,按1:15(m：v)的比例加入超纯水搅拌均匀,浸泡2h后倾去上层悬浮颗粒与水,换水冲洗三次,放入0.5mol/l的naoh中浸泡1h,并不时搅拌。真空抽滤后,用蒸馏水将树脂洗至中性；再将纤维素浸泡在0.5mol/l的hc1中约1h,并不断搅拌,抽滤,用蒸馏水洗至中性,并放在蒸馏水中备用。
所述的龙眼多糖提取方法，其中，所述步骤b)具体包括：关闭层析柱出口,加入少量超纯水,将处理好的deae-cellulose-52阴离子交换树脂沿管壁缓慢倒入柱中,防止气泡生成；同时拧开螺旋夹,使树脂自然沉降,轻轻敲击柱壁驱赶气泡。柱子装好后依次用3倍柱体积的超纯水、3倍柱体积0.5m的nacl和3倍柱体积的蒸馏水进行平衡,直至出柱溶液不含氯离子,再用1m的naac，将ph调至中性，洗脱液平衡一天。
所述的龙眼多糖提取方法，其中，所述步骤c)具体包括：称取龙眼多糖60mg,溶于少量蒸馏水中,过夜使其充分溶解；离心后无沉淀上样于平衡好的deae-cellulose-52层析柱(2x22cm),流速0.7ml/min,自动收集器收集,毎13rnin收集一管；先用ph值7.0的的naac溶液洗脱,然后采用梯度洗脱,母液为400ml1m的醋酸盐缓冲液(naac+naoh,ph＝7.0),梯度液为400ml1mol/l的naci溶液,采用蒽酮硫酸法跟踪检测,620nm处测吸光值。以吸光度值为纵坐标,以管数为横坐标,绘制洗脱曲线。分别按相关峰收集酸性多糖洗脱峰,用蒸馏水透析除盐,冷冻干燥,即为纯化后的龙眼多糖。
本申请首次联合微波超声波辅助法提取龙眼多糖，并在单因素基础上使用响应面法优化工艺条件，采用一种新型提取多糖方法—微波超声波联合辅助提取法，此法结合了超声波辅助提取法和微波辅助提取法，在超声波辅助提取的同时外加微波场，以提高提取效率。。
附图说明
图1为本申请提取工艺的示意图。
图2为超声波功率对龙眼多糖得率的影响示意图。
图3为液料比对龙眼多糖得率的影响示意图。
图4为微波温度对龙眼多糖得率的影响示意图。
图5为提取时间对龙眼多糖得率的影响示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
如图1所示，为本申请提取工艺的示意图，具体包括如下步骤：
1、预处理：
将鲜龙眼去皮去核，取果肉，用95％乙醇浸泡48h，35℃热泵干燥后冷冻保存备用。
称取一定质量的龙眼肉于打浆机中，按龙眼肉质量：水质量＝3：1的比例将龙眼肉捣碎成米粒大小，备用。
2、提取：
准确称取一定质量的龙眼果肉碎于三口瓶中，加入一定体积的蒸馏水,然后在微波功率为500w、一定的超声波功率的处理条件下，用微波超声波仪处理一定时间。
3、过滤：
提取液进行真空抽滤，取上层清液。再用旋转蒸发仪将过滤好的样液按浓缩比为4:1真空浓缩，浓缩温度为60℃。
4、酶解：
在龙眼多糖溶液中加入0.2g的木瓜蛋白酶，搅拌均匀。然后将烧杯置于60℃的水浴中酶解3小时。
5、离心：取两只干净的离心管，将上述酶解液均匀的分装到两只离心管中，用蒸馏水洗烧杯并将洗液移至两支离心管中，重复2～3次，使两只管的质量相等或非常接近，然后对称地放入离心机中在转速为10000r/min条件下离心10min，取上清液。
6、脱蛋白：在上清液中加入1/4体积的正丁醇-氯仿混合液(正丁醇：氯仿＝1:4)和一颗磁力搅拌子，然后把烧杯放在磁力搅拌器上高速搅拌10min。
7、分离：将试液和搅拌子的洗液转移到分液漏斗中，静置5min。小心地将下层溶液从下口排出，收集上层溶液。
8、浓缩：将收集来的溶液真空浓缩(按浓缩比为4:1)，浓缩温度为65℃
9、醇沉：
将冷却的真空浓缩液，缓慢倒入其4倍体积的95％乙醇中，边倒边用玻璃棒搅拌，密封后，于4℃冰箱静置保存12h。
10、离心、干燥：将醇沉后的试液及沉淀分到两支离心管中，直到两支离心管的质量相等或非常接近，对称放入离心机离心(10000r/min,7min)，取沉淀，并回收上清液。取一小烧杯，加入少量水将沉淀溶解充分溶解，然后在加了石棉网的炉上加热稍煮沸一会，停止加热，冷却。将烧杯中的溶液转移到表面皿中，再加入少量蒸馏水洗涤烧杯，将洗液转移到表面皿中，重复2～3次。最后将表面皿放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥。收集粗多糖粉，封装保存，并计算龙眼粗多糖的提取率。
按上述步骤操作，在干燥过程，称量表面皿干燥至恒重时的质量，记m1；称量冷冻干燥后表面皿与龙眼粗多糖的质量，记m2。龙眼粗多糖的提取率用干燥至恒重的粗多糖质量占龙眼样品质量的百分比来计算，如下：
其中m1——干燥至恒重的表面皿质量，g；
m2——干燥至恒重的表面皿和龙眼粗多糖的质量，g；
m0——已称取龙眼果肉样品的质量，g。
二、多糖含量的测定：
1、溶解、定容：将提取到的多糖样品用蒸馏水在沸水浴中完全溶解并转移到250ml的容量瓶中，定容到250ml，摇匀备用。
2、样品处理：将待测液适当稀释。吸取1ml样液于试管中，加入5％(5g/100ml)苯酚液0.5ml，边震荡边加浓硫酸2.5ml，摇匀放置5min，沸水浴加热15min，迅速冷却至室温。
3、样品吸光值的测量：于490nm波长处测定吸光值，以蒸馏水为参比溶液。平行做3组，取平均值，求出多糖含量。
三、单因素实验
2.1超声波功率对龙眼多糖提取率的影响
分别精确称取一定量的龙眼肉颗粒于3个三口平底烧瓶，分别按1：15的比例(w/v)加入蒸馏水，微波预热(温度为50℃，1min，500w)，在一定的超声功波率(0、10％、12％、14％、16％、18％)条件下，微波60℃，加热30min,考察料液比对龙眼多糖提取率的影响。分别准确称取一定量的龙眼果肉于打浆机内，加入少量蒸馏水，将其捣碎成米粒大小，然后转移到三口瓶中，按液料比为15:1的比例(w/v)加入蒸馏水，在60℃、微波功率为500w、处理时间为8min的条件下，分别考察不同超声功波率(50、100、150、200、250、300w)对微波超声波联合辅助提取龙眼多糖的影响，每个水平平行做三组，结果取三个平行组的平均值。
如图2所示，为超声波功率对龙眼多糖得率的影响示意图。由图2可见，超声波功率在0％至25％范围内，随着超声波功率表的不断提高，龙眼粗多糖的提取率也在不断增加，并且在25％的时候出现了峰值，随后图像又程下降趋势，其原因可能是随着超声波功率过大，使得多糖分子在提取过程中发生了降解，导致粗多糖提取率降低，因此本实验选择超声波功率为25％。
2.2料液比对龙眼多糖提取率的影响
分别准确称取一定量的龙眼果肉于打浆机内，加入少量蒸馏水，将其捣碎成米粒大小，然后转移到三口瓶中，分别按料液比为5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1的比例(v/w)加入蒸馏水，在超声波功率采用上述所选、微波温度为60℃、微波功率为500w、处理时间为8min的条件下，分别考察不同液料比对微波超声波联合辅助提取龙眼多糖的影响，每个水平平行做三组，结果取三个平行组的平均值。。
实验在超声波功率为25％、微波温度为60℃、微波功率为500w、处理时间为8min的条件下，测得不同液料比下的龙眼粗多糖提取率，其结果如图3所示，为液料比对龙眼多糖得率的影响示意图。由图3可见，液料比—粗多糖提取率曲线总体上的变化趋势是先升后降，其中在液料比为10:1时，龙眼粗多糖的提取率最高，随后开始下降，这说明在液料比增加的同时，细胞内部与细胞外部的多糖浓度差加大，有利于龙眼组织细胞内部的多糖成分向提取剂中扩散[橘皮多糖微波提取工艺优化及分离纯化研究，谭莉]，从而提高了龙眼粗多糖的提取率；而液料比过高时，会使得单位体积的提取剂吸收的微波能降低，因此粗多糖的提取率开始降低。因此实验的液料比确定10:1。
2.3微波温度对龙眼多糖提取率的影响
分别准确称取一定量的龙眼果肉与打浆机内，加入少量蒸馏水，将其捣碎成米粒大小，然后转移到三口瓶中，按上述所选的液料比加入蒸馏水，在超声波功率采用上述所选、微波功率为500w、处理时间为8min的条件下，分别考察不同微波温度(40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)对微波超声波联合辅助提取龙眼多糖的影响，每个水平平行做三组，结果取三个平行组的平均值。。
实验在超声波功率为25％、液料比为10:1、微波功率为500w、处理时间为8min的条件下，测得不同微波温度下的龙眼粗多糖提取率，其结果如图4所示。
由图4可见，随着微波提取温度的不断升高，龙眼粗多糖提取率呈现先上升后下降的趋势，并且在温度为60℃时，取到的龙眼粗多糖提取率最高，这说明随着温度的升高，多糖的溶解速度及向细胞外扩散的速度增加，有利于多糖提取，然而当温度过高时，可能会使多糖结构被破坏，发生降解，不利于多糖的提取，因此本实验的温度确定为60℃。
2.4微波加热时间对龙眼多糖提取率的影响
分别准确称取一定量的龙眼果肉与打浆机内，加入少量蒸馏水，将其捣碎成米粒大小，然后转移到三口瓶中，在液料比、超声波功率、微波温度采用上述所选，微波功率为500w的条件下，分别考察不同处理时间(8、13、18、23、28min)对微波超声波联合辅助提取龙眼多糖的影响，每个水平平行做三组，结果取三个平行组的平均值。
实验在超声波功率为25％、液料比为10:1、微波温度为60℃、微波功率为500w的条件下，测得不同微波加热时间下的龙眼粗多糖提取率，其结果如图5所示。由图5可见，随着提取时间的增加，龙眼粗多糖提取率先是不断上升，然后在18min之后趋于平缓，在23min时有最大值，随后提取率开始降低。这说明随着提取时间的增加，在超声波和微波的联合作用下，龙眼组织细胞迅速破裂，多糖分子快速、充分地被提取剂萃取。但是当提取时间过长时，超声波和微波的大量直接作用在龙眼多糖分子上，会促使龙眼多糖发生降解，降低提取率，再者长时间的超声波和微波处理耗费大量的能量，综合耗能和提取效率等因素，本实验提取时间确定为18min。
根据单因素的试验结果，微波超声波联合辅助提取法提取龙眼粗多糖最佳的各个因素分别是：超声波功率25％、液料比10:1、提取温度60℃、提取时间18min。对上述的结果进行分析，发现超声波功率对提取率的影响程度明显不及其他因素，因此，综合各种因素，不对超声波功率进行优化，而超声波功率默认25％。实验对液料比(a)、提取温度(b)、提取时间(c)进行三因素三水响应面优化实验，以龙眼粗多糖(y)为响应值。由表1、表2、表3分别为试验结果。将自变量编码如下：
表1试验因素水平及编码
表2试验设计及果胶多糖提取率的试验值
表3提取率二次多项模型方程回归系数显著性检验
表4二次多项模型回归方程方差分析
由显著性分析可知，当p值，即prob>f小于0.05时，表示该指标对模型的影响显著，相反则影响不显著，而当p值小于0.01时，则表示该指标对模型的影响极为显著。由提取率二次多项模型方程回归系数显著性检验结果可知，模型的p值<0.0001，表明二次多项模型显著；液料比(p值<0.0001)、提取温度(p值为0.0013)、提取时间(p值<0.0001)的影响均显著。影响胶质多糖提取率的3个影响因素的主次顺序为：提取时间＞液料比＞提取温度。在单因素实验及响应面的基础上，利用designexpert8.0.6软件对工艺条件进行优化，即可得到最佳工艺为：液料比11.14：1，提取温度61.22℃，提取时间19.08min时，龙眼粗多糖的提取率可达2.06％。
通过designexpert8.0软件对数据进行二次回归分析，得到提取率对编码自变量x1(液料比)、x2(提取温度)、x3(提取时间)的回归方程为：
多提取的龙眼多糖进行纯化具体包括如下步骤：
1、样品溶液的制备
取多糖粗品36mg溶于100ml超纯水中(质量浓度0.36g/l)，然后吸取多糖溶液100μl与0.6mol/lnaoh100μl置于5ml离心管中，再加入0.5mol/l甲醇溶液200μl，漩涡混匀。70℃水浴反应50min,冷却至室温10min后加0.3mol/lhcl溶液200μl中和。加水900μl,混匀,加入氯仿1.5ml,涡旋3min,静置,弃氯仿相,依法萃取3次。水相经0.45μm滤膜过滤后进样。
2、制备高效液相色谱仪
色谱柱为sinochromods-bp(10mm×250mm×10μm),流动相为0.05mol/l磷酸盐缓冲溶液(kh2po4-naoh,ph6.9)-乙腈,时间梯度为0min×10min×30min,相应浓度梯度为0×15％×30％(v/v),柱温为室温,检测波长250nm,流速为1ml/min,进样量100μl。
3、制备分离
在上述制备分离色谱条件下进样品溶液100μl，共进3ml样品溶液，根据色谱图手动收集不同主峰流出液，减压回收溶剂，即可得到不同组分物质。
deae-纤维素柱层析分离纯化
1、deae-cellulose-52的预处理
称取一定量的deae-cellulose-52离子交换树脂于洁净的大烧杯中,按1:15(m：v)的比例加入超纯水搅拌均匀,浸泡2h后倾去上层悬浮颗粒与水,换水冲洗三次,放入0.5mol/l的naoh中浸泡1h,并不时搅拌。真空抽滤后,用蒸馏水将树脂洗至中性。再将纤维素浸泡在0.5mol/l的hc1中约1h,并不断搅拌,抽滤,用蒸馏水洗至中性,并放在蒸馏水中备用。
2、装柱
采用湿法装柱。关闭层析柱出口,加入少量超纯水,将处理好的deae-cellulose-52阴离子交换树脂沿管壁缓慢倒入柱中,防止气泡生成。同时拧开螺旋夹,使树脂自然沉降,轻轻敲击柱壁驱赶气泡。柱子装好后依次用3倍柱体积的超纯水、3倍柱体积0.5m的nacl和3倍柱体积的蒸馏水进行平衡,直至出柱溶液不含氯离子,再用1m的naac(ph调至中性)洗脱液平衡一天。
3、上样
称取龙眼多糖60mg,溶于少量蒸馏水中,过夜使其充分溶解。离心后无沉淀上样于平衡好的deae-cellulose-52层析柱(2x22cm),流速0.7ml/min,自动收集器收集,毎13rnin收集一管。先用ph值7.0的的naac溶液洗脱,然后采用梯度洗脱,母液为400ml1m的醋酸盐缓冲液(naac+naoh,ph＝7.0),梯度液为400ml1mol/l的naci溶液,采用蒽酮硫酸法跟踪检测,620nm处测吸光值。以吸光度值为纵坐标,以管数为横坐标,绘制洗脱曲线。分别按相关峰收集酸性多糖洗脱峰,用蒸馏水透析除盐,冷冻干燥,即为纯化后的龙眼多糖。
本申请首次联合微波超声波辅助法提取龙眼多糖，并在单因素基础上使用响应面法优化工艺条件，采用一种新型提取多糖方法—微波超声波联合辅助提取法，此法结合了超声波辅助提取法和微波辅助提取法，在超声波辅助提取的同时外加微波场，以提高提取效率。。