一种可视的连续空间定向进化方法与流程

本发明涉及定向进化筛选领域，具体而言，涉及一种可视的连续空间定向进化方法。

背景技术：

定向进化(也称实验室进化)是一种强有力的技术方法，它可以通过驾驭生物进化过程，产生具有指定功能的生物分子。所产生的生物分子已广泛应用于工业生产、生物工程、医药开发等诸多领域。哈佛大学davidrliu实验室开发了一种基于噬菌体生长的连续进化系统(噬菌体辅助持续进化，pace)。它主要包含lws、ccp、imp三个模块：噬菌体模块(lws)：噬菌体m13基因中包装以及侵染宿主菌所需的giii基因被切除，插入待进化生物分子的基因，其中噬菌体缺少giii后，无法侵染宿主产生子代噬菌体；诱变模块(imp)：利用阿拉伯糖作为诱导物诱导dnaq926、dam和seqa表达，使dna复制过程中聚合酶引入的错误碱基不能被切除，提高突变率，由阿拉伯糖诱导的imp使噬菌体的突变速率提高几百倍；辅助模块(ccp)：含有噬菌体侵染宿主细胞进行繁殖所需的giii基因，通过将ccp上giii的表达与lws上待进化目的基因的生物活性绑定在一起(比如要使某rna聚合酶向特定方向进化，则利用与进化方向一致的启动子来控制giii的表达)，来决定各突变lws能否产生具有感染活性的子代噬菌体lws。

在进化池中，携带待进化野生型目的基因的噬菌体侵染宿主细胞时，将其遗传物质野生型lws注入宿主菌，利用宿主菌内的复制系统进行遗传物质的复制。与此同时，在阿拉伯糖的诱导下，宿主细胞内imp上的dnaq926、dam和seqa表达，导致lws产生突变。若lws获得的突变(即lws上目的基因突变)可以启动giii蛋白的表达，则可以产生具有侵染性的子代噬菌体。这些新产生的子代噬菌体突变株lwse分泌到宿主菌外，去感染新的宿主菌，进行下一轮复制增殖。由此那些能够启动giii表达的lwse突变株就可以不断地增殖，提高自身数量，而那些野生型的lws和不能启动giii表达的突变lws则不能分泌子代噬菌体进行增殖，其数量不会提高。这时如果以一定的速度向进化池中不断添加新的宿主菌培养物并排出旧培养物，则那些不能启动giii表达或者表达能力低的野生型lws及其突变株很快就会被洗脱出去，而那些可以高效启动giii表达的lwse突变株则最终会被保留下来。

该系统较为庞大，需要一整套带高灵敏度的实时监测系统的自动流加培养设备，不停地进行流加培养。不同进化产物混合后被一起稀释到整个培养罐里，难以直接检测和分离。系统试剂消耗大，培养设备造价亦较高，进化操作较复杂。同时该系统每次只能进行一个目的基因的进化，通量较低。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

为了解决现有方法的样品难以检测和分离，通量低，成本较高，进化操作复杂的问题，本发明提供一种可视的连续空间定向进化方法，直接在固体培养空间如固体培养板表面上进行，不需要液体流加培养设备，同时进化效果通过进化中形成的感染斑在空间上的形态与分布进行肉眼观察，不需要实时监测设备，操作简单，通量高，一次可以进行多组进化实验。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种可视的连续空间定向进化方法，宿主在固体培养空间上进行生长与运动，所述宿主中携带有外来的待进化目的基因，所述宿主自身包含辅助目的基因进化的基因元件，所述目的基因与所述宿主生长运动关联；

通过所述宿主生长运动过程中，在所述固体培养空间上形成不同的空间分布形态进行筛选得到进化产物。

本发明提供的一种可视的连续空间定向进化方法(spatialphage-assistedcontinuousevolution，space)，该系统中包含待进化的目的基因和宿主，宿主中含有辅助目的基因进化的基因元件，并且目的基因与宿主关联。目的基因随着宿主在固体培养空间上的生长运动进化，进化后形成肉眼可见的不同的空间分布形态，通过该状态对进化产物进行挑选。

整个进化与筛选过程在二维平面或三维空间上伸展开来，不同进化产物分布于平面的不同区域，不会相互混杂。并且各产物根据其活性的不同，在局部形成肉眼可见的不同空间分布形态图像。随着进化的连续进行，这一图像会被不断放大。只要进化产物一出现就可以在相应位置直接形成图像，即使产物量很少，这个图像也不会被稀释或掩盖。可以直接根据图像的状态分离挑选符合需求的进化产物。系统操作简便，成本低，不要求特殊仪器设备，单人一次就可以进行多组的进化实验，可以高通量的进行目的基因的定向进化。

进一步地，所述目的基因位于所述宿主基因组或质粒或与所述宿主相应的寄生生物中。目的基因可以通过基因重组插入到宿主基因组，也可以通过在宿主中转入质粒或寄生生物侵入宿主中即可实现宿主中含有待进化的目的基因。

进一步地，所述寄生生物包括噬菌体、噬藻体、动植物病毒、真菌病毒、支原体、衣原体和细菌中的任一种。

进一步地，所述寄生生物为噬菌体；

所述宿主为以下中的任一种：

所述噬菌体的非缺陷株的天然宿主菌；

所述噬菌体的非缺陷株的天然宿主菌经过遗传改造后获得的菌株；

经过遗传改造后才获得易感性的非天然宿主菌。

进一步地，所述宿主包括大肠杆菌、巴斯德菌、痢疾杆菌、假单胞菌、黄单胞菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及基因改造改变其易感性的改造菌株。

优选地，所述宿主为携带f因子的大肠杆菌。

进一步地，所述噬菌体为温和噬菌体、烈性噬菌体或慢性感染噬菌体。

进一步地，所述噬菌体包括丝状噬菌体、t4噬菌体、t7噬菌体、λ噬菌体、p1噬菌体、p2噬菌体、p22噬菌体、噬菌体、sp6噬菌体。

优选地，所述丝状噬菌体包括m13丝状噬菌体、f1丝状噬菌体。

作为本发明的优选方案，所述噬菌体为m13噬菌体，其中包装及侵染宿主菌所需的giii基因被切除；相应地，辅助目的基因进化的基因元件如辅助质粒包含上述giii基因。噬菌体可以正常侵入宿主菌，并进行dna复制。但在没有相关辅助质粒存在下，不能包装出具有感染活性的子代。

进一步地，所述目的基因为一种或几种蛋白的编码基因和非编码基因的组合。

进一步地，所述目的基因选自t7rna聚合酶基因、蛋白酶基因、纤维素酶基因、荧光蛋白基因、密度感应基因中的一种或几种。

进一步地，所述辅助目的基因进化的基因元件为诱导突变的质粒，所述诱导突变的质粒由进化前后的目的基因分别启动表达或诱导表达。

作为优选，所述诱导突变的质粒包含诱变基因，所述诱变基因选自第12和14位氨基酸被突变为ala的dnaq基因突变体dnaq926基因、脱氧腺苷甲基化酶dam基因、半甲基化gatc结合蛋白seqa基因、活化诱导的胞嘧啶脱氨基酶基因aid、噬菌体pbs2中的尿嘧啶dna糖基化酶抑制基因ugi、转录抑制因子emrr中的至少一种。

诱变基因能够提高遗传信息在复制和转录等传递过程中的突变率。其中诱导突变的质粒imp可以通过相同的方法进行诱导表达(如通过psp启动子进行诱导控制)，在不同的实施例中，若存在多个诱导突变的质粒imp如imp1、imp2、imp3等，这几种诱导突变的质粒可相同；也可以直接由进化前后的目的基因分别启动表达，此时，imp1与imp2代表不同的imp。

进一步地，所述固体培养空间包括二维平面培养结构和三维空间培养结构。

进一步地，所述固体培养空间在垂直方向上运动进化通过定时组成浇注固体培养体系来维持连续性。

进一步地，所述定向进化为高通量进化。

进一步地，所述高通量进化选用多组固体培养空间或在固体培养空间的不同位置来实现。

进一步地，所述目的基因与所述宿主生长运动通过辅助质粒关联，所述辅助质粒至少含有第一辅助质粒，所述第一辅助质粒为辅助质粒ccp1或辅助质粒ccp2，辅助质粒ccp1的核酸序列如seqidno：3所示，辅助质粒ccp2的核酸序列如seqidno：4所示。

所述辅助质粒ccp1或辅助质粒ccp2支持噬菌体进化前低水平复制增殖，目的基因进化后活性升高使得辅助质粒ccp1或辅助质粒ccp2支持噬菌体进化向更高水平复制增殖。

进一步地，所述辅助质粒还包括第二辅助质粒，所述第二辅助质粒为辅助质粒ccp3或辅助质粒ccp4；辅助质粒ccp3的核酸序列如seqidno：5所示。

所述辅助质粒ccp3和辅助质粒ccp4具有功能缺陷进而使其不能支持进化前噬菌体的增殖。

具体地，宿主菌s1携带imp1和ccp1，在培养平板上进行生长与运动。宿主菌s1在运动过程中接触到噬菌体lws，并带着lws进行进化，直至产生携带进化后的目的基因的噬菌体lwse。其中噬菌体lws具有增殖缺陷，进化前lws利用ccp1的本底表达，可以进型低水平的感染与增殖。进化后的目的基因的功能至少部分与ccp2上支持进化后噬菌体lwse增殖的基因元件的功能关联。因此，lwse可以在s1中利用ccp1进行高效的感染复制。噬菌体的高效感染复制会抑制宿主菌的生长，使得lwse感染区域出现一个细菌较少的肉眼可见透明感染斑。通过这个感染斑可以直接分析进化效果。

进一步地，宿主菌还包括宿主菌s2或宿主菌s3在培养平板上进行生长与运动。宿主菌s2在运动过程中接触到初步进化的噬菌体lwse，并带着lwse进行进化，直至产生携带更进一步进化后的目的基因的噬菌体lwsen。其中所述宿主菌s2包含支持进化后噬菌体lwse或lwsen增殖的辅助质粒ccp2，抑制进化前噬菌体lws增殖的辅助质粒ccp3和诱导突变的质粒imp2。进化后的目的基因的功能至少部分和ccp2上支持进化后噬菌体lwse或lwsen增殖的基因元件的功能关联。ccp3和ccp4上的基因元件的功能与进化前的目的基因的功能关联，同时ccp3和ccp4携带的基因元件具有功能缺陷，不能支持进化前噬菌体lws增殖。这一步可以降低噬菌体lwsen上目的基因的野生型活性。因此当噬菌体lwsen中目的基因的野生型活性降到足够低时，可以在s2中利用ccp2进行高效的感染复制。噬菌体的高效感染复制会抑制宿主菌的生长，使得噬菌体lwsen感染区域出现一个细菌较少的肉眼可见透明感染斑。通过这个感染斑可以直接分析进化效果。其中所述宿主菌s3包含支持进化后噬菌体lwse或lwsen增殖的辅助质粒ccp2，抑制进化前噬菌体lws增殖的辅助质粒ccp4和诱导突变的质粒imp2。ccp4是高拷贝质粒，表达缺陷基因元件水平更高。因此ccp4是ccp3的增强型。s3细菌用于接替s2细菌，对噬菌体lwse进行进一步的进化。同理ccp2质粒拷贝数比ccp1更低，低拷贝ccp2本底表达较低，无法支持进化前的噬菌体lws噬菌体复制，可以提供更强的进化选择压力。

进一步地，所述方法还包括：当宿主菌运动到平板边缘时将宿主菌与进化后的噬菌体转接到下一个平板上继续进行进化。

进一步地，所述定向进化采用不同宿主接替进行，并且后一个宿主含有的支持噬菌体增殖的基因元件包括具有支持进化后的噬菌体增殖的辅助质粒，并且抑制进化前的噬菌体增殖的辅助质粒。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的一种可视的连续空间定向进化方法，具有空间属性，整个进化过程在二维平面空间或三维立体空间上展开，空间既是支撑平台也是进化的选择压力，只要少量进化产物出现就可以在相应位置直接形成空间分布形态如噬菌斑，通过进化中形成的感染斑大小、噬菌斑计数或者报告基因实时监测以显示目的基因活性和噬菌体的增殖活性，进而可直接识别分离进化产物，不需要液体流加培养设备，不需要实时监测设备。

(2)本发明提供的一种可视的连续空间定向进化方法，不同空间位置出现的进化结果会被固定在该位置，而不会被其他成分稀释混杂，可直接分离，不同空间位置出现的进化结果其信号会被沿着进化的方向被放大，进化效果会被增强，提供更高的检出灵敏度。

(3)本发明提供的一种可视的连续空间定向进化方法，进化操作简单，通量高，一次可以进行多组进化实验。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例中宿主菌的运动与感染斑效果示意图；

图2为本发明实施例中连续空间定向进化原理示意图；

图3为本发明实施例中连续空间定向进化模型示意图；

图4为本发明实施例4中第一轮space正筛选进化结果图；

图5为本发明实施例5和6中多轮space进化结果图；

图6为本发明实验例1中imp3诱导space进化效果图以及不同的噬菌体的个数柱形图；

图7为本发明实验例2中t7噬菌体感染运动效果图以及噬菌体个数柱形图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供的一种可视的连续空间定向进化方法，将噬菌体与宿主菌混合涂布到平板上时，由于被m13噬菌体感染的宿主菌与未感染宿主菌之间的生长差异，会形成肉眼可见的噬菌斑。考虑到报告基因存在着特异性、灵敏度和操作性的问题。本发明没有采用报告基因，而是直接使用感染过程中形成的斑来作为space的指示信号，从而使space可视化。

和噬菌斑形成实验一样。把宿主菌接种在培养板中央，并在宿主菌周围的三角接种野生噬菌体(如图1a)，此时宿主菌在平板上生长，同时向平板边缘运动。运动中的宿主菌接触噬菌体、被感染并产生子代噬菌体，同时继续向外缘运动。由于被感染宿主菌生长较慢，而未感染区域的宿主菌则维持原状态。因此可以在感染区域看到一个细菌较少v形的感染斑块(图1b)。这个透明感染斑的存在，可以用来说明存在噬菌体的感染，透明斑的透明度和大小则代表着噬菌体的感染活性。

基于发明人前期对空间进化系统研究的启发，space的核心设计原理如图2、图3所示：当携带目的基因的噬菌体lws感染含诱变质粒imp和辅助质粒ccp的宿主菌时，噬菌体基因组进行复制和突变。若突变子代lws能够激活ccp上的giii基因表达，则产生有感染活性的子代噬菌体lwse，开始下一轮感染进化；否则产生无感染活性的缺陷子代噬菌体。随着进化进行lwse会不断增加，而野生型lws噬菌体和感染活性缺陷子代噬菌体则不会增加或增加很少。图中lws上的goi(geneofinterest)代表待进化的目的基因。

把含ccp和imp宿主菌接种在培养板中央，并在宿主菌周围的三角接种噬菌体lws。此时宿主菌在平板上进行生长分裂，同时利用自身的鞭毛向平板边缘运动，并在特定位置接触到预先接种在该处的噬菌体lws。噬菌体lws侵入宿主菌，并被宿主菌携带者向前运动。开始时噬菌体lws不能启动ccp上的giii表达，只能利用ccp的本底表达进行低水平的增殖。此时噬菌体增殖水平很低，对宿主菌的影响较小。被感染宿主菌与未感染宿主菌以几乎相同的速度进行生长分裂，在形态上看不出差别。同时由于噬菌体lws的低水平增殖速度比不上宿主菌的生长运动速度，这些低效的噬菌体lws很快会被运动的宿主菌甩在后面。

噬菌体lws在增殖时，同时还会利用imp进行突变进化，直到进化出能够高效启动ccp表达的噬菌体lwse。此时噬菌体lwse直接启动ccp，使自身进行高效增殖不断产生子代噬菌体，继续感染运动中的细菌。噬菌体lwse的高效增殖会破坏宿主菌的生长，使得细菌生长变慢。所以在进化出噬菌体lwse后，相应位置会出现一个宿主菌生长变慢，细菌较少的透明区域。随着进化的进行与被噬菌体lwse感染的细菌的继续运动，这个透明区域会不断向着运动方向扩大，并最终在平板上形成一个肉眼可见的v形感染斑。越靠近感染斑外侧，进化时间越长，进化效果也越明显。我们可以直接在感染斑中得到所需的进化后噬菌体lwse。

如图2、3所示，本发明一个实施方案的噬菌体辅助连续空间定向进化系统包括正筛选(a)与负筛选(b)两个部分。需要说明的是，从本发明实现的角度，只需要正筛选(a)部分即可实现将待进化目的基因进化成进化后的目的基因的目的。因此，负筛选(b)部分可以看作是本发明的定向进化系统的进一步改进的技术方案。事实上，正筛选(a)部分实现了从“待进化目的基因”到“进化后的目的基因”的质变，而负筛选(b)部分实现了“进化后的目的基因”的功能进一步增强的量变。

本发明中，所谓“待进化目的基因”(goi)，可以等同于“进化前的目的基因”，即尚未通过本发明的系统和方法发生进化性突变的目的基因，在一些情况下可以称为“野生型基因”。所谓“进化后的目的基因”，是相对于“待进化目的基因”而言的，它具有进化出来的新功能，然而“进化后的目的基因”还可能具有原来的功能。当然，也可能原来的功能彻底消失。简言之，本发明中，只要目的基因具有进化出来的新功能，即可称为“进化后的目的基因”，而不论原来的功能是否还存在。

需要说明的是，本发明中的符号，比如lws、ccp、imp以及s等仅是示例性的符号表示。这些符号所表示的对象完全可以转换成其它表述方式。例如，噬菌lws，可以称为进化前的噬菌体；噬菌体lwse，可以称为进化后的噬菌体，也被用所有进化后噬菌体的统称；噬菌体lwsen，可以称为进一步进化后的噬菌体，其中编号n(例如1、2、3或其它字母与数字的组合等)表示传代培养的代数或者进化的次数，亦或者不同条件下的进化等；宿主菌s1，可以称为第一宿主菌；宿主菌s2，可以称为第二宿主菌；宿主菌s3可以称为第三宿主菌；辅助质粒ccp1，可以称为第一辅助质粒；辅助质粒ccp2，可以称为第二辅助质粒；辅助质粒ccp3，可以称为第三辅助质粒；辅助质粒ccp4，可以称为第四辅助质粒；诱导突变的质粒imp1，可以称为第一诱导突变质粒；诱导突变的质粒imp2，可以称为第二诱导突变质粒。诱导突变的质粒imp3，可以称为第三诱导突变质粒。其中支持进化后的噬菌体lwse增殖的质粒ccp1、ccp2亦统称为正筛ccp。同样抑制进化前噬菌体lws增殖的质粒ccp3、ccp4亦统称为负筛ccp。imp1、imp2和imp3这些用于产生突变的质粒统称imp。

此外，本发明中的宿主菌，除了以上宿主菌s1、s2、s3以外，还可以包括其它宿主菌。还需要说明，本发明中宿主菌s1、s2、s3并非表示“菌种”的不同，而是表示菌株中携带的辅助质粒或诱变质粒不同。在本发明中，宿主菌s1、s2、s3可以是对同一菌种分别导入不同的质粒而得到的，如携带f因子的大肠杆菌。

如图2、3所示，本发明一个实施方案的噬菌体辅助的连续空间定向进化系统，包括携带待进化目的基因的噬菌体lws，其中上述噬菌体lws具有增殖缺陷，所谓“增殖缺陷”一般是指噬菌体生命周期中某些必需的功能出现缺陷，如包装和/或侵染宿主菌的功能缺陷，可能是由于相关基因的突变造成的。在不同噬菌体中，负责包装和/或侵染宿主菌等必需功能的基因不同。例如，在本发明一个实施例中，噬菌体lws为m13噬菌体，其中包装及侵染宿主菌所需的giii基因被切除，导致不能正常包装及侵染宿主菌。本领域的技术人员应当理解，任何类似的噬菌体均可作为本发明中的噬菌体lws，而不限定于m13噬菌体。

图2、3所示的定向进化系统还中，宿主菌s1包含支持进化后lwse增殖的辅助质粒ccp1和诱导突变的质粒imp1。进化前lws利用ccp1的本底表达，可以进行低水平的感染增殖。辅助质粒ccp1和ccp2对进化后lwse增殖的支持，是通过进化后的目的基因的功能至少部分与ccp1和ccp2上支持进化后lwse增殖的基因元件的功能关联来实现的。所谓“至少部分”意指，进化后的目的基因的功能，除了有一部分功能与进化后lwse增殖的基因元件的功能关联以外，还可能有一部分功能与进化前lws增殖的基因元件的功能关联。例如，在本发明的一个实施例中，进化前的目的基因是指t7rna聚合酶基因，进化后的目的基因是指具有t3rna聚合酶功能的基因(还包括t7rna聚合酶功能)，ccp2上的基因元件是指t3启动子，它控制下游的giii基因基因表达，以辅助giii功能性缺陷的噬菌体lwse的增殖。如此一来，t7rna聚合酶基因与t7启动子功能关联，而t3rna聚合酶基因与t3启动子功能关联。此外，本发明一个实施例中，imp1由进化前lws携带的目的基因表达的t7rna聚合酶启动，并诱导lws突变进化。imp2由进化后lwse携带的目的基因表达的t3rna聚合酶启动，并诱导lwse继续突变进化。

本领域的技术人员应当理解，本发明并不局限于上述以“t7rna聚合酶基因”作为进化前的目的基因的实施例，而是包括任何类似的技术方案。具体地，针对不同的目的基因，如蛋白酶基因、纤维素酶基因、荧光蛋白基因、密度感应基因、抗体基因，可以通过不同的原理将它们的功能与辅助质粒的功能关联起来。

为便于理解，本发明简要介绍将其它几种目的基因活性与ccp上giii关联起来的方法。需要说明的是将目的基因活性与giii关联起来的方法很多，并不局限于这几种方法。针对蛋白酶基因：(1)把目的蛋白酶的降解序列作为连接片段，将giii基因与一个能够封闭结合giii蛋白的辅助蛋白(如m13噬菌体的g6蛋白)进行融合表达。此时融合蛋白的giii部分被封闭，没有活性。只有目的蛋白酶进化出特定活性，降解指定的降解序列，才能释放出有活性的giii。(2)利用t7聚合酶作为中介，将目的蛋白酶降解序列作为连接片段，对t7聚合酶与t7溶菌酶融合表达，形成新的聚合酶。该新的聚合酶活性被t7溶菌酶所封闭。只有进化出的蛋白酶能够识别设定的降解序列并切除溶菌酶部分，得到的聚合酶才有活性。针对纤维素酶基因：可以使用受纤维素的酶解产物葡萄糖抑制的乳糖操纵子来控制giii基因表达。针对荧光蛋白基因：可以使用对目的荧光蛋白发射的荧光敏感的光诱导启动子来启动giii基因表达。对密度感应基因：可以使用密度感应系统来控制giii基因表达。对抗体基因：可以将抗体与控制giii表达的转录因子融合表达，而抗体结合位点与转录酶融合表达。

图2中的负筛选(b)部分示出了本发明的一个进一步改进的技术方案。该系统还包括宿主菌s2或s3，该宿主菌s2包含支持进化后lwse增殖的辅助质粒ccp2和诱导突变的质粒imp2，以及辅助质粒ccp3。该宿主菌s3包含支持进化后lwse增殖的辅助质粒ccp2和诱导突变的质粒imp2，以及辅助质粒ccp4。其中辅助质粒ccp2与诱导突变的质粒imp2与正筛选(a)部分中相似，不同之处在于ccp1是高拷贝质粒，ccp2是低拷贝质粒；imp1和imp2分别由进化前与进化后的目的基因启动表达。然而ccp3和ccp4上的基因元件的功能与进化前的目的基因的功能关联，同时ccp3和ccp4具有功能缺陷，不能支持进化前lws增殖。在本发明的一个实施例中，辅助质粒ccp3、ccp4上的基因元件为t7启动子，该t7启动子控制表达giii-neg基因，giii-neg为缺陷型giii，它缺失了giii基因aa280～aa350之间约70个氨基酸，不能支持lws增殖进化。giii-neg与giii一起表达时会竞争性地抑制lws增殖。本领域的技术人员应当理解，giii-neg也是示例性的，根据不同噬菌体可以采用不同的基因，同一个基因中也可以采取不同的突变。此外，本发明一个实施例中imp2由进化后lwse携带的进化后的目的基因表达的t3rna聚合酶启动，并诱导lwse突变进化。实际上imp1、imp2可以通过同样的方法进行诱导表达(如通过psp启动子进行诱导控制)，此时imp1、imp2由同一个imp3质粒替代。psp启动子能够感应m13噬菌体对细菌的感染。psp启动子平时处于自我抑制状态，受其控制的基因基本不表达，当感染发生时psp启动子被激活，受其控制的基因高效表达。由于ipm3的启动表达与噬菌体lws上携带的目的基因与否无关，所以使用ipm3代替ipm1和ipm2时正负筛选中可以不需要更换imp质粒。imp1、imp2和imp3这些用于产生突变的质粒统称imp。

在本发明的一个优选的实施例中，诱导突变的质粒imp包含诱变基因，该诱变基因选自第12和14位氨基酸被突变为ala的dnaq基因突变体dnaq926基因、脱氧腺苷甲基化酶dam基因、半甲基化gatc结合蛋白seqa基因、活化诱导的胞嘧啶脱氨基酶基因aid、噬菌体pbs2中的尿嘧啶dna糖基化酶抑制基因ugi、转录抑制因子emrr中的至少一种。它们能够干扰dna的复制过程，导致突变频率提高。事实上，任何能够提高突变效率的基因均可用于本发明中作为诱变基因。

本发明提供的定向进化方法，包括：携带imp1和ccp1的宿主菌s1在培养平板上进行生长与运动；宿主菌s1在运动过程中接触到噬菌体lws，并带着lws进行进化，直至产生携带进化后的目的基因的噬菌体lwse。其中所述噬菌体lws具有增殖缺陷，进化前lws利用ccp1的本底表达，可以进型低水平的感染与增殖。进化后的目的基因的功能至少部分与ccp2上支持进化后lwse增殖的基因元件的功能关联。因此，lwse可以在s1中利用ccp1进行高效的感染增殖。噬菌体的高效感染增殖会抑制宿主菌的生长，使得lwse感染区域出现一个细菌较少的肉眼可见透明感染斑。通过这个感染斑可以直接分析进化效果。

作为上述方法的进一步改进的方案，还包括：宿主菌s2或s3分别在培养平板上进行生长与运动。宿主菌s2在运动过程中接触到初步进化的噬菌体lwse，并带着lwse继续进行进化，直至产生携带更进一步进化后的目的基因的噬菌体lwsen。其中所述宿主菌s2包含支持进化后lwse增殖的辅助质粒ccp2，抑制进化前lws增殖的辅助质粒ccp3和诱导突变的质粒imp2。其中所述宿主菌s3包含支持进化后lwse增殖的辅助质粒ccp2，抑制进化前lws增殖的辅助质粒ccp4和诱导突变的质粒imp2。进化后的目的基因的功能至少部分和ccp2上支持进化后lws增殖的基因元件的功能关联。ccp3和ccp4上的基因元件的功能与进化前的目的基因的功能关联，同时ccp3和ccp4携带的基因元件具有功能缺陷，不能支持进化前lws增殖。这一步可以降低lwsen上目的基因的野生型活性。因此当lwsen中目的基因的野生型活性降到足够低时，可以在s2中利用ccp2进行高效的感染复制。噬菌体的高效感染复制会抑制宿主菌的生长，使得lwsen感染区域出现一个细菌较少的肉眼可见透明感染斑。通过这个感染斑可以直接分析进化效果。ccp4是高拷贝质粒，表达缺陷基因元件水平更高。因此ccp4是ccp3的增强型。s3宿主菌用于接替s2宿主菌，对在s2宿主菌中进化后的噬菌体进行更进一步的进化。同理ccp2质粒拷贝数比ccp1更低，低拷贝ccp2本底表达较低，无法支持进化前的lws噬菌体复制，可以提供更强的进化选择压力。

另外，通过宿主菌在不断向外运动过程中可以将增值效率较低、含量较少的携带野生型目的基因活性的噬菌体洗脱掉。此外，通过观察进化感染斑大小、噬菌斑计数或者报告基因实时监测，能够显示目的基因活性和噬菌体的增殖活性。

ccp2.1通过将ccp2上控制giii基因的t3改造为t7启动子获得。宿主菌s4携带ccp2，宿主菌s5携带ccp2.1。本发明通过进化后噬菌体lwsen分别在s4、s5宿主形成噬菌斑数目的差异来对比lwsen上进化后的目的基因的t7和t3聚合酶活性。

以下将以识别t7启动子(seqidno：1)的t7rna聚合酶基因t7rnap进化为识别t3启动子(seqidno：2)的t3聚合酶基因t3rnap为例，对本发明进行详细说明，但本发明的保护并不限于t7rna聚合酶基因的进化。这里所说的t3聚合酶是指通过进化试验获得的在功能上能够识别t3启动子的聚合酶，但不表示该聚合酶与天然t3rna聚合酶具有相同的基因序列。噬菌体lws上携带的待进化目的基因为t7rna聚合酶基因；辅助质粒ccp1(seqidno：3)上giii基因由t3启动子控制表达；辅助质粒ccp2(seqidno：4)上giii基因由t3启动子控制表达；辅助质粒ccp2.1(seqidno：6)上giii基因由t7启动子控制表达；辅助质粒ccp3(seqidno：5)上giii-neg由t7启动子控制表达；辅助质粒ccp4上giii-neg由t7启动子控制表达。其中giii-neg为缺陷型giii，它缺失了giii基因aa280～aa350之间约70个氨基酸，不能支持lws增殖进化。giii-neg与giii一起表达时会竞争性地抑制lws增殖。

本发明中，噬菌体lws、以及辅助质粒ccp4分别与申请号为201610349254.3公开的噬菌体sm、hp4是一样的。

诱变质粒imp1上诱变基因由t7启动子控制表达；诱变质粒imp2与诱变质粒imp1不同的是，诱变基因由t3启动子控制表达，诱变质粒imp2的基因序列如seqidno：7所示；与诱变质粒imp2不同的是，诱变质粒imp3上诱变基因由psp启动子控制表达。噬菌体m13-wt为对购自neb的m13ko7噬菌体去插入基因后获得的野生型噬菌体。相比噬菌体lws，m13-wt(ncbiaccession:v00604)与t7噬菌体(ncbiaccession:nc_001604)基因组与功能是完整的，可以在宿主菌中独自感染增殖。

本发明中的部分噬菌体、质粒由davidrliu实验室提供部分材料后，由发明人进一步改造后获得。已有相关文献报道其遗传信息(natchembiol.2014march；10(3):216–222)。其它质粒、菌株由申请人构造后获得。本发明中使用的宿主菌为e.colim15,e.colim15通过向e.colik12系列的e.colimg1655导入f质粒后获得，基因型为f′proa⁺b⁺laci^qδ(lacz)m15zzf::tn10(tet^r)/attb::aphtetr。

需要说明的是本发明中的宿主菌并不限于e.colim15，它可以是任何携带f因子的大肠杆菌。且本发明中的e.colim15和lws、ccp1、ccp2、ccp2.1、ccp3、ccp4、imp1，imp2、imp3均可以参照基因图谱和序列，通过pcr、酶切连接和基因重组等常规分子克隆的方法获得。基因重组、pcr与酶切连接等分子克隆方法是本领域公知的技术，并且确定能够获得相应的菌株、质粒和噬菌体。因此本发明的宿主菌、质粒和噬菌体具有可重复性的特征，本领域的技术人员只要按照常规方法即可得到。据此本领域的技术人员应当理解，本发明无需提供菌种保藏也能满足充分公开条件。

本发明将携带ccp1和imp1的宿主菌称为s1，将携带imp2、ccp2、ccp3的宿主菌称为s2，将携带imp2、ccp2、ccp4的宿主菌称为s3。在正筛选中，初始lws在s1菌中进行连续定向进化。初始lws携带t7rnap基因，只能在s1菌中利用ccp1的本底表达进行较低水平的增殖和突变进化。随着lws携带的t7rnap不断向着t3rnap进化，产生的能够启动ccp1上t3启动子控制的giii表达的lws突变株。该突变株能够在s1菌中进一步进行较高水平的增殖、进化，不断提高其对ccp1中t3启动子控制的giii的启动活性，得到突变噬菌体lwse和进化为pre-t3rnap的目的基因(图2a)，这一过程称为正筛选。

进化后lwse上的pre-t3rnap对t7、t3启动子都有较高的活性。为提高pre-t3rnap对t3启动子的特异性，需要进化筛选出对t7启动子识别启动能力较低的t3rnap。这个过程称为负筛选。

负筛需要使用ccp3或ccp4，当通过正筛选进化后的lwse感染s2菌时，lwse上进化后的目的基因pre-t3rnap能够启动giii-r5的表达，会使其增殖被抑制。这一状况会一直持续到lwse进化出一些新的噬菌体突变株。这些新的噬菌体突变株携带的目的基因，能高效启动ccp2上t3启动子控制的giii基因的表达而没有或很少启动ccp3或ccp4上t7启动子控制的的giii-r5基因表达。此时这些新的噬菌体突变株继续在s2或s3菌株中进行进一步的进化，并最终进化得到携带高特异性t3rna聚合酶基因t3rnap的噬菌体lwsen(图2b)。ccp4是高拷贝质粒，表达缺陷基因元件水平更高。因此ccp4是ccp3的增强型。s3宿主菌用于接替s2宿主菌，对在s2宿主菌中进化后的噬菌体可以转移到s3宿主菌中进行进一步的进化。

以下通过实施例说明本发明的可行性，需要说明的是，以下实施例仅是示例性的，并且其目的仅在于说明本发明的可行性，并不意在限制本发明的保护范围。

实施例1

进化实验前进行下列准备工作。

1)将携带ccp1和imp1质粒的宿主菌s1，在含50ug/ml四环素、50μg/ml壮观霉素和25μg/ml氯霉素的lb培养基中，以37℃，220rpm的条件培养至od600＝0.3。继续将s1稀释100被后，在相同培养条件下再次培养至od600＝0.3。经过两次培养好，宿主菌s1可以用于进化实验。

2)将携带ccp2、ccp3和imp2质粒的宿主菌s2，在含50μg/ml四环素、50μg/ml壮观霉素、50μg/ml羧苄青霉素和25μg/ml氯霉素的lb培养基中，以37℃，220rpm的条件培养至od600＝0.3。继续将s2稀释100被后，在相同培养条件下再次培养至od600＝0.3。经过两次培养好，宿主菌s2可以用于进化实验。

3)将携带ccp2、ccp4和imp2质粒的宿主菌s3，在含50μg/ml四环素、50μg/ml壮观霉素、50μg/ml羧苄青霉素和25μg/ml氯霉素的lb培养基中，以37℃，220rpm的条件培养至od600＝0.3。继续将s3稀释100被后，在相同培养条件下再次培养至od600＝0.3。经过两次培养好，宿主菌s3可以用于进化实验。

4)将携带ccp2的宿主菌s4，在含50μg/ml四环素和50μg/ml羧苄青霉素的lb培养基中，以37℃，220rpm的条件培养至od600＝0.3。继续将s4稀释100被后，在相同培养条件下再次培养至od600＝0.3。经过两次培养好，宿主菌s4可以用于实验。

5)将携带ccp2.1的宿主菌s5，在含50μg/ml四环素和50μg/ml羧苄青霉素的lb培养基中，以37℃，220rpm的条件培养至od600＝0.3。继续将s5稀释100被后，在相同培养条件下再次培养至od600＝0.3。经过两次培养好，宿主菌s5可以用于实验。

6)将携带ccp1的宿主菌s6，在含50μg/ml四环素和50μg/ml壮观霉素的lb培养基中，以37℃，220rpm的条件培养至od600＝0.3。继续将s6稀释100被后，在相同培养条件下再次培养至od600＝0.3。经过两次培养好，宿主菌s6可以用于进化实验。

7)将携带imp3和ccp1的宿主菌s7，在含50μg/ml四环素、50ug/ml壮观霉素和25μg/ml氯霉素的lb培养基中，以37℃，220rpm的条件培养至od600＝0.3。继续将s7稀释100被后，在相同培养条件下再次培养至od600＝0.3。经过两次培养好，宿主菌s7可以用于实验。

8)将e.colim15在含50μg/ml四环素的lb培养基中，以37℃，220rpm的条件培养至od600＝0.3。继续将e.colim15稀释100被后，在相同培养条件下再次培养至od600＝0.3。经过两次培养好，e.colim15可以用于实验。

9)将e.colimg1655在lb培养基中，以37℃，220rpm的条件培养至od600＝0.3。继续将e.colimg1655稀释100被后，在相同培养条件下再次培养至od600＝0.3。经过两次培养好，e.colimg1655可以用于实验。

实施例2

s4或s5宿主菌中lws噬菌斑观察方法

1)向10cm细菌培养板中，铺一层10ml的1.5％琼脂糖凝胶，室温放置20min,使其凝固。

2)当噬菌体lws浓度未知时，需要将lws按10^{1，2，3，4，5，6，7}倍的比例进行连续梯度稀释。

3)取若干组200μl的“实施例1”中准备的s4或s5宿主菌，每组分别加入“2)”中不同稀释梯度的lws10μl，再加入4ml保存于55℃含0.4％细菌学琼脂的lb培养基和终浓度50μg/ml羧苄青霉素。漩涡震荡混匀器上混匀后，样品铺到“1)”中准备的平板上。室温放置1h，使其凝固。

4)在37℃生化培养箱中过夜培养。

5)观察统计各梯度稀释样品形成的噬菌斑数目，计算出原始样品lws浓度。

s5携带的ccp2.1的giii基因由t7启动子启动，携带t7rnap目的基因的噬菌体lws可以在s5宿主菌中稀释噬菌斑。而s4携带的ccp2的giii基因由t3启动子启动，只有携带的目的基因进化出t3rnap活性的lwse才能在s4宿主菌中形成噬菌斑。对比lwse在s4、s5宿主菌中形成噬菌斑数目变化，可以直接分析出lwse的进化效果。

实施例3

宿主菌、噬菌体感染与运动测试

1)向10cm细菌培养板中，加入10ml含0.25％细菌学琼脂的lb培养基。培养基含50μg/ml四环素和50μg/ml羧苄青霉素。室温放置1h，使其凝固。

2)如图1a所示，将2μl“实施案例1”中准备的宿主菌s5接种在平板中央表面。在距离s5接种处1cm的外侧的三个角分别接种上2μl储存浓度为10⁶pfu/ml的lws噬菌体。

3)平板于37℃生化培养箱中过夜培养。之后可以观察到如图1b所示现象。宿主菌从中央向边缘运动，运动中的宿主菌接触噬菌体、被感染并产生子代噬菌体，同时继续向外缘运动。由于被感染宿主菌生长较慢，细菌数量相对较少；而未感染区域的宿主菌则维持原状态，细菌数量相对对较多。因此可以在感染区域看到一个细菌较少透明的v形感染斑块。这个透明感染斑的存在，可以用来说明存在噬菌体的感染，透明斑的透明度和大小则代表着噬菌体的感染活性。

实施例4

space正筛选进化

1)第一轮进化：准备3个10cm细菌培养板a,b,c向各培养板中，加入10ml含0.25％细菌学琼脂的lb培养基。培养基含50μg/ml四环素、50μg/ml壮观霉素。室温放置1h，使其凝固。

准备4个10cm细菌培养板d,e,f,g，向各培养板中，加入10ml含0.25％细菌学琼脂的lb培养基。培养基含50μg/ml四环素、50μg/ml壮观霉素和25μg/ml氯霉素。室温放置1h，使其凝固。

2)如图1a所示，将2μl“实施案例1”中准备的宿主菌s6接种在3个平板a,b,c的中央表面。在a平板距离s6接种处1cm的外侧的三个角分别接种上2μl储存浓度为10⁸pfu/ml的lws噬菌体。在b平板距离s6接种处1cm的外侧的三个角分别接种上2μl储存浓度为10⁹pfu/ml的lws噬菌体。在c平板距离s6接种处1cm的外侧的三个角分别接种上2μl储存浓度为10¹⁰pfu/ml的lws噬菌体。

将2μl“实施案例1”中准备的宿主菌s1接种在4个平板d,e,f,g的中央表面。在d平板距离s1接种处1cm的外侧的三个角分别接种上2μl储存浓度为10⁸pfu/ml的lws噬菌体。在e平板距离s1接种处1cm的外侧的三个角分别接种上2μl储存浓度为10⁹pfu/ml的lws噬菌体。在f平板距离s1接种处1cm的外侧的三个角分别接种上2μl储存浓度为10¹⁰pfu/ml的lws噬菌体。g平板不接种噬菌体。

d,e,f平板为加入不同量初始噬菌体的sapce进化组；a,b,c平板为不同噬菌体加入量下，不带诱变质粒imp1的对照组；g平板为无噬菌体的阴性对照组。

3)平板置于37℃生化培养箱中过夜培养。

4)a～g平板培养后的效果如图4a～g所示。a,b,c平板中s6宿主菌不带诱变质粒，噬菌体无法进行突变进化。a,b,c平板上，噬菌体lws只能依靠ccp1的本底表达，进行微弱增殖，很快就会被运动中的宿主菌甩脱，不足以形成可见的感染斑。最终结果和g组阴性对照一样。

d,e,f平板中宿主菌s1携带诱变质粒imp1。因此虽然噬菌体lws起初也只能利用ccp1的本底表达进行复制增殖。但噬菌体lws可以启动imp1上的诱导突变基因，帮助自身突变进化出t3rnap活性。所以d,e,f平板上很快就可以形成感染斑，并且初始加入噬菌体量越大，感染斑越明显。

在e平板中感染斑明显，且和e加入相同量初始噬菌体lws的b平板未见非特异性的感染斑。所以后续实施案例选择e平板进行实验分析。

在e平板进化出的感染斑中存在进化后的噬菌体lwse。在e平板感染斑的起点α(靠近平板中央)、中间点β、终点γ(远离平板中央)处分别取5μl样品，标记为lwseα、lwseβ、lwseγ。样品用lb液体培养基稀释100倍后，在漩涡振荡混匀器上混匀2min。混匀后的样品再用0.22μm小滤器过滤后按照“实施案例2”所述方法，分别检测样品lwseα、lwseβ、lwseγ在由t3启动子控制giii基因表达的s4宿主菌中的噬菌斑t3plaque的形成情况和在由t7启动子控制giii基因表达的s5宿主菌中的噬菌斑t7plaque的形成情况。

如图4h所示，进化前的噬菌体lws携带野生型的t7rnap基因，只能在宿主菌s5中形成t7plaque，无法在宿主菌s4中形成t3plaque。随着进化的进行，噬菌体lws变为噬菌体lwse。lwse上携带的目的基因不断突变，使得它开始具有t3rnap活性，能够识别t3启动子，并可以在宿主菌s4中形成t3plaque。而且离平板中央越远，进化的时间越长，进化的效果越好，lwse获得的t3rnap活性越明显。如图4h所示，从lws到lwseγ在s4中形成t3plaque的能力越来越强。因此后续的实施案例中都取每次进化后远离平板中央的感染斑终点处样品稀释100倍后，用0.22μm小滤器过滤处理，再进行分析或者继续进化。

为了和后续实施案例保持一致，后面将lwseγ样品重新标记为lwse1。其中”1”代表进化了1轮。所以在本发明中lwse1和lwseγ代表的是同一个样品在不同场景下的名称标记。

第二轮进化：在同样的平板上，将s1宿主菌接种在平板中央，再在距离s1接种处外侧1cm的三个角分别接种上2μl将过滤后的噬菌体lwse1，进行同样条件下的第二轮进化。

取第二轮进化感染斑终点处lwse2噬菌体样品5μl稀释100倍后，用0.22μm小滤器过滤，再分别检测样品在s4宿主菌中的噬菌斑t3plaque的形成情况和在s5宿主菌中的噬菌斑t7plaque的形成情况。如图5所示增加一轮进化后，lwse2在s4宿主菌中的噬菌斑t3plaque的形成能力比lwse1更强。

实施例5

s2或s3宿主菌下的space负筛选进化

1)第三轮进化：向10cm培养板中，加入10ml含0.25％细菌学琼脂的lb培养基。培养基含50μg/ml四环素、50μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml壮观霉素和25μg/ml氯霉素。室温放置1h，使其凝固。s2携带的ccp3和ccp4质粒上除了t7启动子外，还有一个受茶碱诱导的核糖开关。但该核糖开关并不严谨，不加入茶碱也有一定的giii-neg本底表达，抑制携带目的基因具有野生型t7rnap活性的噬菌体lwse的增殖。

向平板中央接种2μl宿主菌s2，再在距离s2接种处外侧1cm的三个角分别接种上2μl将过滤后的噬菌体lwse2，在37℃培养箱中过夜培养。进行的第三轮进化。

取第三轮进化感染斑终点处lwse3噬菌体样品5μl稀释100倍后，用0.22μm小滤器过滤，再分别检测样品在s4宿主菌中的噬菌斑t3plaque的形成情况和在s5宿主菌中的噬菌斑t7plaque的形成情况。

2)第四轮进化：用与本实施案例步骤”1)”中一样的条件对过滤后的lwse3样品进行第4轮进化。同样取第四轮进化感染斑终点处lwse4噬菌体样品5μl稀释100倍后，用0.22μm小滤器过滤，再分别检测样品在s4宿主菌中的噬菌斑t3plaque的形成情况和在s5宿主菌中的噬菌斑t7plaque的形成情况。

3)第五轮进化：向10cm培养板中，加入10ml含0.25％细菌学琼脂的lb培养基。培养基含50μg/ml四环素、50μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml壮观霉素、25μg/ml氯霉素和1mm茶碱。室温放置1h，使其凝固。加入茶碱可以提高ccp3和ccp4giii-neg表达，增强进化筛选压力。

向平板中央接种2μl宿主菌s2，再在距离s2接种处外侧1cm的三个角分别接种上2μl将过滤后的噬菌体lwse4，在37℃培养箱中过夜培养。进行的第五轮进化。

取第五轮进化感染斑终点处lwse5噬菌体样品5μl稀释100倍后，用0.22μm小滤器过滤，再分别检测样品在s4宿主菌中的噬菌斑t3plaque的形成情况和在s5宿主菌中的噬菌斑t7plaque的形成情况。

4)第六轮进化：向10cm培养板中，加入10ml含0.25％细菌学琼脂的lb培养基。培养基含50μg/ml四环素、50μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml壮观霉素和25μg/ml氯霉素。室温放置1h，使其凝固。

向平板中央接种2μl宿主菌s3，再在距离s3接种处外侧1cm的三个角分别接种上2μl将过滤后的噬菌体lwse5，在37℃培养箱中过夜培养。进行的第六轮进化。

取第六轮进化感染斑终点处lwse6噬菌体样品5μl稀释100倍后，用0.22μm小滤器过滤，再分别检测样品在s4宿主菌中的噬菌斑t3plaque的形成情况和在s5宿主菌中的噬菌斑t7plaque的形成情况。

5)第七轮进化：向10cm培养板中，加入10ml含0.25％细菌学琼脂的lb培养基。培养基含50μg/ml四环素、50μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml壮观霉素、25μg/ml氯霉素和1mm茶碱。室温放置1h，使其凝固。

向平板中央接种2μl宿主菌s3，再在距离s3接种处外侧1cm的三个角分别接种上2μl将过滤后的噬菌体lwse6，在37℃培养箱中过夜培养。进行的第六轮进化。

取第七轮进化感染斑终点处lwse7噬菌体样品5μl稀释100倍后，用0.22μm小滤器过滤，再分别检测样品在s4宿主菌中的噬菌斑t3plaque的形成情况和在s5宿主菌中的噬菌斑t7plaque的形成情况。

7轮进化效果如图5所示。其中图5a为不同ccp的拷贝数，拷贝数高低影响其基因表达水平的高低，影响进化过程中选择压力强弱。图5b为各轮在平板上的效果，其中进化压力一行用从浅到深填充色表示不同进化条件带来的从弱到强的进化选择压力。图5c各轮进化产物在s4、s5宿主菌中噬菌斑形成效果。如图所示随着进化轮数的增加，进化过程的选择压力越来越强，进化效果越来越明显。携带野生型t7rnap基因的lws噬菌体只能在由t7启动子控制giii基因表达的s5宿主菌中形成噬菌斑t7plaque，但是不能在由t3启动子控制giii基因表达的s4宿主菌中形成噬菌斑t3plaque。随着进化的进行，从lwse1到lwse7噬菌体，它们在s5宿主菌中形成噬菌斑t7plaque的能力整体上越来越弱，但在s4宿主菌中形成噬菌斑t3plaque的能力整体上则越来越强。

实施例6

space产物测序分析

对前两轮进化产物噬菌体lwse1，lwse2各纯化几个克隆进行目的基因的测序。如图5d所示，它们携带的目的基因均在n端第1～310氨基酸直接发生了相应突变。已有的报道表明这一个区域和t7rnap对启动子的识别有关。其中e222k突变被davidrliu报道影响t7rnap的特异性。

对比进化前后噬菌体在s5、s4宿主菌中形成噬菌斑能力和测序结果，可知lwse噬菌体携带的目的基因活性由t7rnap向t3rnap转变是由于sapce进化造成的突变引起的。

实验例1

imp3诱导space进化测试

1)准备3个10cm细菌培养板a,b,c向各培养板中，加入10ml含0.25％细菌学琼脂的lb培养基。培养基含50μg/ml四环素、50μg/ml壮观霉素和25μg/ml氯霉素。室温放置1h，使其凝固。

2)如图1a所示，将2μl实施案例1中准备的宿主菌s7分别接种在平板a，c的中央表面。在距离平板a宿主菌s7接种处1cm的外侧的三个角分别接种上2μl储存浓度为10⁹pfu/ml的lws噬菌体。平板c作为negtive组不接种噬菌体。

将2μl实施案例1中准备的宿主菌s1接种在平板b的中央表面。在距离平板b宿主菌s1接种处1cm的外侧的三个角分别接种上2μl储存浓度为10⁹pfu/ml的lws噬菌体。

3)平板置于37℃生化培养箱中过夜培养。

4)a～c平板进化后的效果如图6a-c所示，携带ipm3的宿主菌s7与携带imp1的宿主菌s1出现相似的进化感染斑。在宿主菌s7组进化感染斑终点处取5μl进化后噬菌体样品lwsep1稀释100倍后，用0.22μm小滤器过滤。再分别检测样品在s4宿主菌中的噬菌斑t3plaque的形成情况和在s5宿主菌中的噬菌斑t7plaque的形成情况。

在宿主菌s1组进化感染斑终点处取5μl进化后噬菌体样品lwset1稀释100倍后，用0.22μm小滤器过滤。再分别检测样品在s4宿主菌中的噬菌斑t3plaque的形成情况和在s5宿主菌中的噬菌斑t7plaque的形成情况。

如图6d所示，lwset1与lwsep1的t3、t7plaque数目相似。说明psp操纵子控制的imp3与imp1对突变进化的促进效果相同。

由此可知imp3可以直接用于取代imp1和imp2，让imp的表达脱离目的基因的活性。此时不论进化合成目的基因，不管是正筛，还是负筛都可以使用同一个imp3。

实验例2

烈性噬菌体感染运动测试

1)以上实施例是在慢性感染m13噬菌体的基础上进行的。但本发明也可以在其它噬菌体上进行进化实验。这里利用烈性噬菌体t7噬菌体为例进行说明。

2)向10cm细菌培养板中，加入10ml含0.25％细菌学琼脂的lb培养基,室温放置1h，使其凝固。

3)如图1a所示，将2μl“实施案例1”中准备的宿主菌e.colimg1655接种在平板中央表面。在距离e.colimg1655接种处1cm的外侧的三个角分别接种上2μl储存浓度为10⁴，10⁵，10⁶pfu/ml的t7噬菌体。对照组用lb培养基代替噬菌体。

4)平板于37℃生化培养箱中过夜培养。之后可以观察到如图7b所示现象。宿主菌从中央向边缘运动，运动中的宿主菌接触噬菌体、被感染并产生子代噬菌体，同时继续向外缘运动。t7噬菌体为烈性噬菌体，被感染的宿主菌全部裂解死亡。所以在平板上形成v形透明感染斑。16a对照组没有噬菌体，则不形成v型感染斑，它的细菌均匀分布成一个圆形。对接种量为10⁶pfu/ml的组，在图7b感染区α点，未感染区β点和交汇区γ点分别取样，并按“实施例2”,用e.colimg1655进行噬菌斑计数。如图7c所示，在γ点测得10⁹pfu/ml数量级的t7噬菌体。可见t7烈性噬菌体也可以在平板上随着宿主菌进行运动感染，并形成肉眼可见的感染斑作为感染标志。基于此本发明在m13噬菌体上进行的实施例完全可以在t7噬菌体上进行。

以上实施例是以将识别t7启动子的t7rna聚合酶基因t7rnap进化为识别t3启动子的t3rna聚合酶基因t3rnhp为例对本发明进行说明。用其它目的基因(如蛋白酶基因、纤维素酶基因、荧光蛋白基因、密度感应基因等)替换lws中的t7rnhp基因，并对ccp1、ccp2、ccp3和ccp4质粒中的giii和giii-r5基因的表达调控和表达后的修饰方式进行相应的调整，使得giii和giii-r5的表达与lws上新的待进化目的基因的生物活性绑定在一起，就可以使用本系统对新的目的基因进行定向进化。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

sequencelisting

<110>深圳先进技术研究院

<120>一种可视的连续空间定向进化方法

<160>7

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

taatacgactcactataggg20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

attaaccctcactaaaggga20

<210>3

<211>3935

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ttgagatcctttttttctgcgcatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggta60

actgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatt120

taaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtga180

gttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcc240

ttgcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggct300

tcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccact360

tcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctg420

ctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggata480

aggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacga540

cctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaag600

ggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgaggg660

agcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgac720

ttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagca780

acgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctg840

cgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctc900

gccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaa960

tacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggt1020

ttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcgtcaagaggacatccggtcaaataaa1080

acgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttgctgaggagacttagggacccta1140

caattaaccctcactaaagggagaaagacctgcaggtgcagtaaggaggatatataaaaa1200

aaaatgaaaaaattattattcgcaattcctttagttgttcctttctattctcactccgct1260

gaaactgttcatcaccatcaccatcacgctgaaactgttgaaagttgtttagcaaaaccc1320

catacagaaaattcatttactaacgtctggaaagacgacaaaactttagatcgttacgct1380

aactatgagggctgtctgtggaatgctacaggcgttgtagtttgtactggtgacgaaact1440

cagtgttacggtacatgggttcctattgggcttgctatccctgaaaatgagggtggtggc1500

tctgagggtggcggttctgagggtggcggttctgagggtggcggtactaaacctcctgag1560

tacggtgatacacctattccgggctatacttatatcaaccctctcgacggcacttatccg1620

cctggtactgagcaaaaccccgctaatcctaatccttctcttgaggagtctcagcctctt1680

aatactttcatgtttcagaataataggttccgaaataggcagggggcattaactgtttat1740

acgggcactgttactcaaggcactgaccccgttaaaacttattaccagtacactcctgta1800

tcatcaaaagccatgtatgacgcttactggaacggtaaattcagagactgcgctttccat1860

tctggctttaatgaggatccattcgtttgtgaatatcaaggccaatcgtctgacctgcct1920

caacctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtggcggctctgagggt1980

ggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttccggtggt2040

ggctctggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatg2100

accgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtc2160

gctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaat2220

ggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgac2280

ggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcg2340

gttgaatgtcgcccttttgtctttggcgctggtaaaccttacgagttcagtatcgactgc2400

gataagatcaacctgttccgcggtgtctttgcgtttcttttatatgttgccacctttatg2460

tatgtattttctacgtttgctaacatactgcgtaataaggagtcttaatcatgaccatga2520

ttacggattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttaccc2580

aacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggccc2640

gcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctggt2700

ttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgata2760

ctgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacg2820

tgacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgtt2880

actcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgcgaattattt2940

ttgatggcgttaactcggcgtaaacttaattaacggcactcctcagcaaatataatgacc3000

ctcttgataacccaagagggcattttttaatgcccatggcgtttatttgccgactacctt3060

ggtgatctcgcctttcacgtagtggacaaattcttccaactgatctgcgcgcgaggccaa3120

gcgatcttcttcttgtccaagataagcctgtctagcttcaagtatgacgggctgatactg3180

ggccggcaggcgctccattgcccagtcggcagcgacatccttcggcgcgattttgccggt3240

tactgcgctgtaccaaatgcgggacaacgtaagcactacatttcgctcatcgccagccca3300

gtcgggcggcgagttccatagcgttaaggtttcatttagcgcctcaaatagatcctgttc3360

aggaaccggatcaaagagttcctccgccgctggacctaccaaggcaacgctatgttctct3420

tgcttttgtcagcaagatagccagatcaatgtcgatcgtggctggctcgaagatacctgc3480

aagaatgtcattgcgctgccattctccaaattgcagttcgcgcttagctggataacgcca3540

cggaatgatgtcgtcgtgcacaacaatggtgacttctacagcgcggagaatctcgctctc3600

tccaggggaagccgaagtttccaaaaggtcgttgatcaaagctcgccgcgttgtttcatc3660

aagccttacggtcaccgtaaccagcaaatcaatatcactgtgtggcttcaggccgccatc3720

cactgcggagccgtacaaatgtacggccagcaacgtcggttcgagatggcgctcgatgac3780

gccaactacctctgatagttgagtcgatacttcggcgatcaccgcttccctcatactctt3840

cctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatt3900

tgaatgtatttagaaaaataggccaaataggccgt3935

<210>4

<211>5320

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ttttgctgaggagacttagggaccctacaattaaccctcactaaagggagaaagacctgc60

aggtgcagtaaggaggaaaaaaaaatgaaaaaattattattcgcaattcctttagttgtt120

cctttctattctcactccgctgaaactgttcatcaccatcaccatcacgctgaaactgtt180

gaaagttgtttagcaaaaccccatacagaaaattcatttactaacgtctggaaagacgac240

aaaactttagatcgttacgctaactatgagggctgtctgtggaatgctacaggcgttgta300

gtttgtactggtgacgaaactcagtgttacggtacatgggttcctattgggcttgctatc360

cctgaaaatgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggttctgagggt420

ggcggtactaaacctcctgagtacggtgatacacctattccgggctatacttatatcaac480

cctctcgacggcacttatccgcctggtactgagcaaaaccccgctaatcctaatccttct540

cttgaggagtctcagcctcttaatactttcatgtttcagaataataggttccgaaatagg600

cagggggcattaactgtttatacgggcactgttactcaaggcactgaccccgttaaaact660

tattaccagtacactcctgtatcatcaaaagccatgtatgacgcttactggaacggtaaa720

ttcagagactgcgctttccattctggctttaatgaggatccattcgtttgtgaatatcaa780

ggccaatcgtctgacctgcctcaacctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggt840

tctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctct900

gagggaggcggttccggtggtggctctggttccggtgattttgattatgaaaagatggca960

aacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgct1020

aaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggt1080

gacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcc1140

caaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatat1200

ttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttggcgctggtaaacct1260

tacgagttcagtatcgactgcgataagatcaacctgttccgcggtgtctttgcgtttctt1320

ttatatgttgccacctttatgtatgtattttctacgtttgctaacatactgcgtaataag1380

gagtcttaatgaccatgattacggattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactggg1440

aaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggc1500

gtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcg1560

aatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcg1620

atcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatg1680

cgcccatctacaccaacgtgacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacgg1740

agaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaag1800

gccagacgcgaattatttttgatggcgttaactcggcgtaaaaagaggagaaatactaga1860

tgaccatgattacggattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctg1920

gcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcg1980

aagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgct2040

ttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctg2100

aggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatgcgcccatct2160

acaccaacgtgacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccga2220

cgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgc2280

gaattatttttgatggcgttaactcggcgtaatattgctgtcctttgaaccaatgaatga2340

tttgatgagccaaaaaaatgtaatcaatattgttgatgataatattaagaagtaccacac2400

ggaatatacctaaacttaattaacggcactcctcagcaaatataatgaccctcttgataa2460

cccaagagggcattttttaatgcccatggcgtttaccaatgcttaatcagtgaggcacct2520

atctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagata2580

actacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagaccca2640

cgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcaga2700

agtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctaga2760

gtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtg2820

gtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcga2880

gttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgtt2940

gtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattct3000

cttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtca3060

ttctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataat3120

accgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcga3180

aaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcaccc3240

aactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaagg3300

caaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttc3360

ctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatattt3420

gaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgcca3480

cctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacg3540

aggcccttaggccaaataggccgttcagatccttccgtatttagccagtatgttctctag3600

tgtggttcgttgtttttgcgtgagccatgagaacgaaccattgagatcatgcttactttg3660

catgtcactcaaaaattttgcctcaaaactggtgagctgaatttttgcagttaaagcatc3720

gtgtagtgtttttcttagtccgttacgtaggtaggaatctgatgtaatggttgttggtat3780

tttgtcaccattcatttttatctggttgttctcaagttcggttacgagatccatttgtct3840

atctagttcaacttggaaaatcaacgtatcagtcgggcggcctcgcttatcaaccaccaa3900

tttcatattgctgtaagtgtttaaatctttacttattggtttcaaaacccattggttaag3960

ccttttaaactcatggtagttattttcaagcattaacatgaacttaaattcatcaaggct4020

aatctctatatttgccttgtgagttttcttttgtgttagttcttttaataaccactcata4080

aatcctcatagagtatttgttttcaaaagacttaacatgttccagattatattttatgaa4140

tttttttaactggaaaagataaggcaatatctcttcactaaaaactaattctaatttttc4200

gcttgagaacttggcatagtttgtccactggaaaatctcaaagcctttaaccaaaggatt4260

cctgatttccacagttctcgtcatcagctctctggttgctttagctaatacaccataagc4320

attttccctactgatgttcatcatctgagcgtattggttataagtgaacgataccgtccg4380

ttctttccttgtagggttttcaatcgtggggttgagtagtgccacacagcataaaattag4440

cttggtttcatgctccgttaagtcatagcgactaatcgctagttcatttgctttgaaaac4500

aactaattcagacatacatctcaattggtctaggtgattttaatcactataccaattgag4560

atgggctagtcaatgataattactagtccttttcctttgagttgtgggtatctgtaaatt4620

ctgctagacctttgctggaaaacttgtaaattctgctagaccctctgtaaattccgctag4680

acctttgtgtgttttttttgtttatattcaagtggttataatttatagaataaagaaaga4740

ataaaaaaagataaaaagaatagatcccagccctgtgtataactcactactttagtcagt4800

tccgcagtattacaaaaggatgtcgcaaacgctgtttgctcctctacaaaacagacctta4860

aaaccctaaaggcttaagtagcaccctcgcaagctcgggcaaatcgctgaatattccttt4920

tgtctccgaccatcaggcacctgagtcgctgtctttttcgtgacattcagttcgctgcgc4980

tcacggctctggcagtgaatgggggtaaatggcactacaggcgccttttatggattcatg5040

caaggaaactacccataatacaagaaaagcccgtcacgggcttctcagggcgttttatgg5100

cgggtctgctatgtggtgctatctgactttttgctgttcagcagttcctgccctctgatt5160

ttccagtctgaccacttcggattatcccgtgacaggtcattcagactggctaatgcaccc5220

agtaaggcagcggtatcatcaacaggcttacccgtcttactgtcaagaggacatccggtc5280

aaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcg5320

<210>5

<211>4849

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ttttgctgaggagacttagggaccctacataatacgactcactataggggaaagacctgc60

aggtgcagtaaggaggaaaaaaaaatgaaaaaattattattcgcaattcctttagttgtt120

cctttctattctcactccgctgaaactgttcatcaccatcaccatcacgctgaaactgtt180

gaaagttgtttagcaaaaccccatacagaaaattcatttactaacgtctggaaagacgac240

aaaactttagatcgttacgctaactatgagggctgtctgtggaatgctacaggcgttgta300

gtttgtactggtgacgaaactcagtgttacggtacatgggttcctattgggcttgctatc360

cctgaaaatgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggttctgagggt420

ggcggtactaaacctcctgagtacggtgatacacctattccgggctatacttatatcaac480

cctctcgacggcacttatccgcctggtactgagcaaaaccccgctaatcctaatccttct540

cttgaggagtctcagcctcttaatactttcatgtttcagaataataggttccgaaatagg600

cagggggcattaactgtttatacgggcactgttactcaaggcactgaccccgttaaaact660

tattaccagtacactcctgtatcatcaaaagccatgtatgacgcttactggaacggtaaa720

ttcagagactgcgctttccattctggctttaatgaggatccattcgtttgtgaatatcaa780

ggccaatcgtctgacctgcctcaacctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggt840

tctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctct900

gagggaggcggttccggtggtggctctggttccggtgattttgattatgaaaagatggca960

aacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgct1020

aaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggt1080

gacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcc1140

caaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatat1200

ttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttggcgctggtaaacct1260

tacgagttcagtatcgactgcgataagatcaacctgttccgcggtgtctttgcgtttctt1320

ttatatgttgccacctttatgtatgtattttctacgtttgctaacatactgcgtaataag1380

gagtcttaatgaccatgattacggattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactggg1440

aaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggc1500

gtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcg1560

aatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcg1620

atcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatg1680

cgcccatctacaccaacgtgacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacgg1740

agaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaag1800

gccagacgcgaattatttttgatggcgttaactcggcgtaatattgctgtcctttgaacc1860

aatgaatgatttgatgagccaaaaaaatgtaatcaatattgttgatgataatattaagaa1920

gtaccacacggaatatacctaaacttaattaacggcactcctcagcaaatataatgaccc1980

tcttgataacccaagagggcattttttaatgcccatggcgtttaccaatgcttaatcagt2040

gaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtc2100

gtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccg2160

cgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggcc2220

gagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgg2280

gaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctaca2340

ggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacga2400

tcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcct2460

ccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactg2520

cataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactca2580

accaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaata2640

cgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttct2700

tcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccact2760

cgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaa2820

acaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactc2880

atactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcgga2940

tacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccga3000

aaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaatagg3060

cgtatcacgaggcccttaggccaaataggccgttcagatccttccgtatttagccagtat3120

gttctctagtgtggttcgttgtttttgcgtgagccatgagaacgaaccattgagatcatg3180

cttactttgcatgtcactcaaaaattttgcctcaaaactggtgagctgaatttttgcagt3240

taaagcatcgtgtagtgtttttcttagtccgttacgtaggtaggaatctgatgtaatggt3300

tgttggtattttgtcaccattcatttttatctggttgttctcaagttcggttacgagatc3360

catttgtctatctagttcaacttggaaaatcaacgtatcagtcgggcggcctcgcttatc3420

aaccaccaatttcatattgctgtaagtgtttaaatctttacttattggtttcaaaaccca3480

ttggttaagccttttaaactcatggtagttattttcaagcattaacatgaacttaaattc3540

atcaaggctaatctctatatttgccttgtgagttttcttttgtgttagttcttttaataa3600

ccactcataaatcctcatagagtatttgttttcaaaagacttaacatgttccagattata3660

ttttatgaatttttttaactggaaaagataaggcaatatctcttcactaaaaactaattc3720

taatttttcgcttgagaacttggcatagtttgtccactggaaaatctcaaagcctttaac3780

caaaggattcctgatttccacagttctcgtcatcagctctctggttgctttagctaatac3840

accataagcattttccctactgatgttcatcatctgagcgtattggttataagtgaacga3900

taccgtccgttctttccttgtagggttttcaatcgtggggttgagtagtgccacacagca3960

taaaattagcttggtttcatgctccgttaagtcatagcgactaatcgctagttcatttgc4020

tttgaaaacaactaattcagacatacatctcaattggtctaggtgattttaatcactata4080

ccaattgagatgggctagtcaatgataattactagtccttttcctttgagttgtgggtat4140

ctgtaaattctgctagacctttgctggaaaacttgtaaattctgctagaccctctgtaaa4200

ttccgctagacctttgtgtgttttttttgtttatattcaagtggttataatttatagaat4260

aaagaaagaataaaaaaagataaaaagaatagatcccagccctgtgtataactcactact4320

ttagtcagttccgcagtattacaaaaggatgtcgcaaacgctgtttgctcctctacaaaa4380

cagaccttaaaaccctaaaggcttaagtagcaccctcgcaagctcgggcaaatcgctgaa4440

tattccttttgtctccgaccatcaggcacctgagtcgctgtctttttcgtgacattcagt4500

tcgctgcgctcacggctctggcagtgaatgggggtaaatggcactacaggcgccttttat4560

ggattcatgcaaggaaactacccataatacaagaaaagcccgtcacgggcttctcagggc4620

gttttatggcgggtctgctatgtggtgctatctgactttttgctgttcagcagttcctgc4680

cctctgattttccagtctgaccacttcggattatcccgtgacaggtcattcagactggct4740

aatgcacccagtaaggcagcggtatcatcaacaggcttacccgtcttactgtcaagagga4800

catccggtcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcg4849

<210>6

<211>3601

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ttgagatcctttttttctgcgctttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacga60

aatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtt120

tccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcat180

tccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcag240

ttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttat300

ccggtaactatcgtcttgagtccagcccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcag360

ccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaact420

gaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagctg480

gtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaa540

gagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcctctgccagtg600

ttacaaccacacgatacgggttactgatgatgaacaagaggacatccggtcaaataaaac660

gaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttgctgaggagacttagggaccctact720

aatacgactcactatagggagaaaggctaataggtaccggtgataccagcatcgtcttga780

tgcccttggcagcaccctgctaaggtaacaacaagatgaaaaaattattattcgcaattc840

ctttagtggtgcctttctattctcactccgctgaaactgttcatcaccatcaccatcacg900

ctgaaactgttgaaagttgtttagcaaaaccccatacagaaaattcatttactaacgtct960

ggaaagacgacaaaactttagatcgttacgctaactatgagggctgtctgtggaatgcta1020

caggcgttgtagtttgtactggtgacgaaactcagtgttacggtacatgggttcctattg1080

ggcttgctatccctgaaaatgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcg1140

gttctgagggtggcggtactaaacctcctgagtacggtgatacacctattccgggctata1200

cttatatcaaccctctcgacggcacttatccgcctggtactgagcaaaaccccgctaatc1260

ctaatccttctcttgaggagtctcagcctcttaatactttcatgtttcagaataataggt1320

tccgaaataggcagggggcattaactgtttatacgggcactgttactcaaggcactgacc1380

ccgttaaaacttattaccagtacactcctgtatcatcaaaagccatgtatgacgcttact1440

ggaacggtaaattcagagactgcgctttccattctggctttaatgaggatccattcgttt1500

gtgaatatcaaggccaatcgtctgacctgcctcaacctcctgtcaatgctggcggcggct1560

ctggtggtggttctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagg1620

gtggcggctctgagggaggcggttccggtggtggctcttcccaaatggctcaagtcggtg1680

acggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaat1740

cggttgaatgtcgcccttttgtctttggcgctggtaaaccttacgagttcagtatcgact1800

gcgataagatcaacctgttccgcggtgtctttgcgtttcttttatatgttgccaccttta1860

tgtatgtattttctacgtttgctaacatactgcgtaataaggagtcttaatggtcagtaa1920

aggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaa1980

tgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttac2040

ccttaaactgatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactac2100

tctgggctatggtctgcaatgctttgccagatacccagatcatatgaaacagcatgactt2160

tttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatatttttcaaagatga2220

cgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaat2280

cgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattcttggacacaaattggaata2340

caactataactcacacaatgtatacatcaccgcagacaaacaaaagaatggaatcaaagc2400

caacttcaaaattagacacaacattgaagatggaggcgttcaactagcagaccattatca2460

acaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccta2520

ccaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagtt2580

tgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaataaacttaattaac2640

ggcactcctcagcaaatataatgaccctcttgataacccaagagggcattttttaatgcc2700

catggcgtttatttgccgactaccttggtgatctcgcctttcacgtagtggacaaattct2760

tccaactgatctgcgcgcgaggccaagcgatcttcttcttgtccaagataagcctgtcta2820

gcttcaagtatgacgggctgatactgggccggcaggcgctccattgcccagtcggcagcg2880

acatccttcggcgcgattttgccggttactgcgctgtaccaaatgcgggacaacgtaagc2940

actacatttcgctcatcgccagcccagtcgggcggcgagttccatagcgttaaggtttca3000

tttagcgcctcaaatagatcctgttcaggaaccggatcaaagagttcctccgccgctgga3060

cctaccaaggcaacgctatgttctcttgcttttgtcagcaagatagccagatcaatgtcg3120

atcgtggctggctcgaagatacctgcaagaatgtcattgcgctgccattctccaaattgc3180

agttcgcgcttagctggataacgccacggaatgatgtcgtcgtgcacaacaatggtgact3240

tctacagcgcggagaatctcgctctctccaggggaagccgaagtttccaaaaggtcgttg3300

atcaaagctcgccgcgttgtttcatcaagccttacggtcaccgtaaccagcaaatcaata3360

tcactgtgtggcttcaggccgccatccactgcggagccgtacaaatgtacggccagcaac3420

gtcggttcgagatggcgctcgatgacgccaactacctctgatagttgagtcgatacttcg3480

gcgatcaccgcttccctcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggt3540

tattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataggccaaataggccg3600

t3601

<210>7

<211>4021

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cactcggtcgctacgctccgggcgtgagactgcggcgggcgctgcggacacatacaaagt60

tacccacagattccgtggataagcaggggactaacatgtgaggcaaaacagcagggccgc120

gccggtggcgtttttccataggctccgccctcctgccagagttcacataaacagacgctt180

ttccggtgcatctgtgggagccgtgaggctcaaccatgaatctgacagtacgggcgaaac240

ccgacaggacttaaagatccccaccgtttccggcgggtcgctccctcttgcgctctcctg300

ttccgaccctgccgtttaccggatacctgttccgcctttctcccttacgggaagtgtggc360

gctttctcatagctcacacactggtatctcggctcggtgtaggtcgttcgctccaagctg420

ggctgtaagcaagaactccccgttcagcccgactgctgcgccttatccggtaactgttca480

cttgagtccaacccggaaaagcacggtaaaacgccactggcagcagccattggtaactgg540

gagttcgcagaggatttgtttagctaaacacgcggttgctcttgaagtgtgcgccaaagt600

ccggctacactggaaggacagatttggttgctgtgctctgcgaaagccagttaccacggt660

taagcagttccccaactgacttaaccttcgatcaaaccacctccccaggtggttttttcg720

tttacagggcaaaagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttt780

tctactgaaccgctctagatttcagtgcaatttatctcttcaaatgtagcacctgaagtc840

agcccaggaggaagaggacatccggtcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactggg900

cctttcgttttagacttagggaccctttatgacaacttgacggctacaattaaccctcac960

taaagggagaaagacctgcaggtgcagtaaggaggaaaaaaaaatgagcactgcaattac1020

acgccagatcgttctcgctaccgcaaccaccggtatgaaccagattggtgcgcactatga1080

aggccacaagatcattgagattggtgccgttgaagtggtgaaccgtcgcctgacgggcaa1140

taacttccatgtttatctcaaacccgatcggctggtggatccggaagcctttggcgtaca1200

tggtattgccgatgaatttttgctcgataagcccacgtttgccgaagtagccgatgagtt1260

catggactatattcgcggcgcggagttggtgatccataacgcagcgttcgatatcggctt1320

tatggactacgagttttcgttgcttaagcgcgatattccgaagaccaatactttctgtaa1380

ggtcaccgatagccttgcggtggcgaggaaaatgtttcccggtaagcgcaacagcctcga1440

tgcgttatgtgctcgctacgaaatagataacagtaaacgaacgctgcacggggcattact1500

cgatgcccagatccttgcggaagtttatctggcgatgaccggtggtcaaacgtcgatggc1560

ttttgcgatggaaggagagacacaacagcaacaaggtgaagcaacaattcagcgcattgt1620

acgtcaggcaagtaagttacgcgttgtttttgcgacagatgaagagattgcagctcatga1680

agcccgtctcgatctggtgcagaagaaaggcggaagttgcctctggcgagcataatttaa1740

tatcagtaaaccggacataacccatgaagaaaaatcgcgcttttttgaagtgggcagggg1800

gcaagtatcccctgcttgatgatattaaacggcatttgcccaagggcgaatgtctggttg1860

agccttttgtaggtgccgggtcggtgtttctcaacaccgacttttctcgttatatccttg1920

ccgatatcaatagcgacctgatcagtctctataacattgtgaagatgcgtactgatgagt1980

acgtacaggccgcacgcgagctgtttgttcccgaaacaaattgcgccgaggtttactatc2040

agttccgcgaagagttcaacaaaagccaggatccgttccgtcgggcggtactgtttttat2100

atttgaaccgctacggttacaacggcctgtgtcgttacaatctgcgcggtgagtttaacg2160

tgccgttcggccgctacaaaaaaccctatttcccggaagcagagttgtatcacttcgctg2220

aaaaagcgcagaatgcctttttctattgtgagtcttacgccgatagcatggcgcgcgcag2280

atgatgcatccgtcgtctattgcgatccgccttatgcaccgctgtctgcgaccgccaact2340

ttacggcgtatcacacaaacagttttacgcttgaacaacaagcgcatctggcggagatcg2400

ccgaaggtctggttgagcgccatattccagtgctgatctccaatcacgatacgatgttaa2460

cgcgtgagtggtatcagcgcgcaaaattgcatgtcgtcaaagttcgacgcagtataagca2520

gcaacggcggcacacgtaaaaaggtggacgaactgctggctttgtacaaaccaggagtcg2580

tttcacccgcgaaaaaataattcagctaagacactgcactggattaagatgaaaacgatt2640

gaagttgatgatgaactctacagctatattgccagccacactaagcatatcggcgagagc2700

gcatccgacattttacggcgtatgttgaaattttccgccgcatcacagcctgctgctccg2760

gtgacgaaagaggttcgcgttgcgtcacctgctatcgtcgaagcgaagccggtcaaaacg2820

attaaagacaaggttcgcgcaatgcgtgaacttctgctttcggatgaatacgcagagcaa2880

aagcgagcggtcaatcgctttatgctgctgttgtctacactatattctcttgacgcccag2940

gcgtttgccgaagcaacggaatcgttgcacggtcgtacacgcgtttactttgcggcagat3000

gaacaaacgctgctgaaaaatggtaatcagaccaagccgaaacatgtgccaggcacgccg3060

tattgggtgatcaccaacaccaacaccggccgtaaatgcagcatgatcgaacacatcatg3120

cagtcgatgcaattcccggcggaattgattgagaaggtttgcggaactatctaaacttaa3180

ttaacggcactcctcagccaagtcaaaagcctccgaccggaggcttttgactacatgccc3240

atggcgtttacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcattc3300

tgccgacatggaagccatcacaaacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagca3360

ccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatagtgaaaacgggggcgaagaagttgtcca3420

tattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaa3480

acatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacat3540

cttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatg3600

aaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatca3660

ccagctcaccgtctttcattgccatacggaactccggatgagcattcatcaggcgggcaa3720

gaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaagg3780

ccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattgagtaactgactgaaatgcct3840

caaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttt3900

tctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgataactcaaaaaatacgcccggta3960

gtgatcttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgccaagccaaataggccg4020

t4021