林可链霉菌（Streptomyceslincolnensis）及培养方法和应用与流程

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种林可链霉菌(streptomyceslincolnensis)及培养方法和应用。

背景技术：

林可霉素属于林可酰胺类抗生素，为林可链霉菌的次级代谢产物。林可霉素是一类广谱性抗生素，对大部分革兰氏阳性菌及部分革兰氏阴性菌有抗性，广泛用于临床治疗。林可霉素是由两个部分组成，分别为糖基部分(甲基硫林可糖胺mtl)和氨基部分(反式-n-甲基-4-正丙基脯氨酸pha)通过一个肽键连接而成。林可霉素主要成分又分为林可霉素a、b、c、d及s，各结构式见表1。林可霉素a为主要抗菌组分，而b组分抗菌活性只有a组分的25％，且具有毒性，《欧洲药典》规定成品中林可霉素b的含量低于5％，其含量作为衡量发酵工艺好坏的重要生产指标。

国内外已有大量研究来提高林可霉素a产量及降低b组分含量，主要方向有定向改造菌株、优化培养基、控制发酵工艺、调控代谢流等。大量研究关于培养基优化，包括发酵过程中直接添加前体、氨基酸、甲基化试剂等来提高林可霉素a产量及降低b组分含量，但通过添加nacl提高发酵液渗透压是否会降低林可霉素b含量未有报道。大多数微生物都有合适的渗透压范围，一旦超出范围，会影响细胞功能，进而影响一系列生理过程。微生物对于高渗应激有特定的响应机制。当溶质浓度提高引起渗透压提高，且溶质无法通过细胞膜，则微生物可能更多的合成胞内可溶性溶质来提高胞内渗透压，使胞内外渗透压达到平衡。林可霉素是林可链霉菌的次级代谢产物，与初级代谢关系密不可分，高渗环境下可能使胞内积累更多前体用于林可霉素的合成。

表1林可霉素分子结构

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，而提供一种林可链霉菌(streptomyceslincolnensis)及培养方法和应用。

本发明采用如下技术方案：

林可链霉菌(streptomyceslincolnensis)，该菌株保藏编号为cctccno:m2019016。

本发明还提供所述林可链霉菌(streptomyceslincolnensis)的培养方法，步骤如下：从活化的斜面切取1cm²的菌苔接入装有种子培养基的三角瓶中，进行培养。

更进一步地，所述种子培养基包括按照质量百分比计的如下组分：葡萄糖1.0％，黄豆饼粉1.0％，淀粉2.0％，玉米浆3.0％，硫酸铵0.15％，碳酸钙0.5％，ph7.0-7.5。

更进一步地，将所述菌苔接入装有25ml一级种子培养基的250ml三角瓶中，转速200-250r/min、温度30±1℃培养46-50h。

本发明还提供所述的林可链霉菌(streptomyceslincolnensis)在生产林可霉素中的应用，步骤如下：在发酵培养基中添加渗透压调节剂和渗透压保护剂中的至少一种，进行发酵，所述发酵培养基包括按照质量百分比计的如下组分：葡萄糖10.0％，黄豆饼粉2.5％，磷酸氢二钾0.02％，硝酸钠0.8％，玉米浆0.2％，硫酸铵0.8％，碳酸钙0.8％，ph7.0-7.2；且以10％的接种量将所述种子培养得到的菌种接种转入装有25ml发酵培养基的250ml三角瓶中转速200-250r/min、温度30±1℃，发酵7天。

更进一步地，在所述发酵培养基中添加渗透压调节剂5-15g/lnacl或5-15g/lkcl。

更进一步地，在所述发酵培养基中添加不同渗透压保护剂包括甘油、甜菜碱或甘露醇终浓度为1-5g/l，进行发酵；或添加渗透压保护类氨基酸：脯氨酸、甘氨酸或半胱氨酸，终浓度为10-200mg/l，进行发酵。

更进一步地，在所述发酵培养基中添加葡萄糖酸钙或葡萄糖酸钠，其终浓度为2-10g/l，进行组合发酵。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明通过调节渗透压及添加甜菜碱、甘油、甘露醇、脯氨酸、甘氨酸等不同渗透压保护剂、添加抗氧化剂半胱氨酸及添加hmp途径的激活剂葡萄糖酸钙来达到提高林可霉素a的效价及降低杂质林可霉素b的含量。

附图说明

图1为添加不同浓度的nacl对林可霉素发酵结果的影响示意图；

图2为添加不同浓度的kcl及nacl对林可霉素发酵结果的影响示意图；

图3为最优渗透压条件下添加不同保护剂(甜菜碱、甘油、甘露醇)对林可霉素发酵结果的影响示意图；

图4为最优渗透压条件下添加不同浓度的甘露醇对林可霉素发酵结果的影响示意图；

图5为最优渗透压条件下添加甘露醇与葡萄糖酸钙复配组合对林可霉素发酵结果的影响示意图

图6为最优渗透压条件下添加不同浓度的脯氨酸对林可霉素发酵结果的影响示意图；

图7为最优渗透压条件下添加不同浓度的甘氨酸对林可霉素发酵结果的影响示意图；

图8为最优渗透压条件下添加不同浓度的半胱氨酸对林可霉素发酵结果的影响示意图。

图9为在含有0g/l氯化钠低盐活化平板上生长的zlw0306菌落图；

图10为在含有10g/l氯化钠筛选平板上生长的zlw0306菌落图；

图11为在含有20g/l氯化钠筛选平板上生长的zlw0306菌落图；

图12为在含有50g/l氯化钠筛选平板上生长的zlw0306菌落图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

以下为实施例所用原料的说明。

本发明所用材料与试剂：

林可链霉菌zlw0306(streptomyceslincolnensiszlw0306)，已于2019年1月4日提交于武汉大学（中国，武汉）的中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏号为cctccno:m2019016。

林可链霉菌zlw0306为紫外诱变后经过多轮高渗平板筛选得到的耐高渗菌株，高渗平板为含有0-50g/l氯化钠的斜面配方。平板及斜面培养条件为温度30±1℃，生长7-9天。将保藏的菌株稀释涂布于多个含0-10g/l氯化钠低盐活化平板上，筛选产孢较好的菌落，稀释涂布于含20-50g/l高盐平板上，筛选出生长较好的菌落，再转接至斜面进行培养。对斜面进行挖块，分别接种于含有10-20g/l高盐摇瓶进行发酵，选取林可霉素a产量最高的菌落进行保藏。重复筛选过程10轮，最后得到耐高渗菌株送至cctcc保藏。培养过程参见图9至图12。

葡萄糖、可溶性淀粉、硝酸钾、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、琼脂粉(均为分析纯)。黄豆饼粉与玉米浆来源于河南天方药业股份有限公司，甲醇为色谱级。

培养基：

斜面培养基(wt％)：可溶性淀粉1.5，黄豆饼粉0.5，硝酸钠0.1，磷酸氢二钾0.05，硫酸镁0.05，硫酸亚铁0.001，琼脂粉1.8，ph7.0-7.5。

种子培养基(wt％)：葡萄糖1.0，黄豆饼粉1.0，淀粉2.0，玉米浆3.0，硫酸铵0.15，碳酸钙0.5，ph7.0-7.5。

发酵培养基(wt％)：葡萄糖10.0，黄豆饼粉2.5，磷酸氢二钾0.02，硝酸钠0.8，玉米浆0.2，硫酸铵0.8，碳酸钙0.8，ph7.0。

本发明所使用的分析方法如下：

1、高效液相色谱(hplc)法测定林可霉素效价

仪器：高效液相色谱仪agilenttechnologies1260infinity(安捷伦科技有限公司)。

样品的处理：取发酵液1ml，10000r/min离心5min，取上清液用流动相稀释至1000u/ml左右，经0.22μm的滤膜过滤后，备用进样。

色谱柱及测试条件：diamonsilplusc18-a色谱柱(北京迪马科技有限公司)，250×4.6mm，5μm，流动相：50mmol/l乙酸铵溶液：甲醇＝2:3；流速0.4ml/min，柱温30℃，检测波长210nm，进样量20μl，外标法测定lina效价，linb含量计算如下：

2、渗透压测定

仪器：fm-8p全自动冰点渗透压计(上海医大仪器厂)。

取发酵液1ml，10000r/min离心5min，取上清液用去离子水稀释至检测范围，通过fm-8pauto.f.p.渗透压仪进行检测。

使用摇瓶培养方法如下：

1、种子培养

从活化的斜面切取1cm²大小的菌苔接入装有25ml一级种子培养基的250ml三角瓶中，转速220r/min、温度30℃培养48h。

2、发酵培养

以10％的接种量转入装有25ml发酵培养基的250ml三角瓶中转速220r/min、温度30℃，发酵7天。

实施例1

在发酵培养基中分别添加0、5、10、15、25、50g/lnacl，进行发酵，实验结果见图1，由图可见，摇瓶发酵合适的渗透压范围在0.860-1.355osm/kg(即0-15g/lnacl)，当渗透压超过1.355osm/kg时，对菌生长抑制显著，且效价大幅度降低。添加0-25g/lnacl时，随着渗透压的提高，林可霉素a的效价先提高后下降，林可霉素b含量可降至2.5％以下。综上，氯化钠添加量在5-15g/l时，发酵结果较好，最优条件为10g/l。

实施例2

在发酵培养基中初始添加0、5、10、15g/lnacl渗透压水平为0.904-1.364osm/kg)，与在发酵培养基中初始添加0、5、10、15g/lkcl(渗透压水平为0.904-1.252osm/kg)作对比，研究在同一渗透压水平下，钠离子与钾离子对发酵的影响是否不同。结果见图2，由图可知，通过nacl或kcl调节渗透压均能降低linb含量，nacl效果相比kcl更好。

实施例3

高渗环境可能给菌造成生长和代谢的压力，微生物通过在胞内积累特定的可溶性溶质提高胞内渗透压，使胞内胞外渗透压平衡。这类可溶性溶质一般不会干扰胞内酶的活性和功能。由于zlw0306在高渗环境下菌浓下降显著，故考虑外源添加常见价廉的可溶性溶质甘油、甜菜碱和甘露醇，来缓解菌在高渗环境下的不适。

甘油、甜菜碱和甘露醇均为初始添加于含有10g/lnacl的培养基中，终浓度为1g/l。实验结果见图3，添加甘露醇效果最好，10g/lnacl的pmv为39％±1％，而在10g/lnacl基础上添加甘露醇的pmv为47％±1％与ck(pmv为48％±2％)达到同一水平，且与10g/lnacl结果相比linb降低58％，效价增长6％。

实施例4

在含有10g/lnacl的摇瓶分别初始添加终浓度为1.0、2.5、5、15g/l的甘露醇进行发酵实验，结果如图4所示。摇瓶上甘露醇添加浓度在1g/l时，林可霉素a效价达到4895u/ml，相比对照(4399u/ml)提高10％，b组分含量降低至1.8％相比ck(3.13％)降低42％。

实施例5

基于实验室过往的研究成果，可以发现添加葡萄糖酸钙可以显著提高林可霉素a效价，但会提高b组分含量，会对发酵后续提取分离造成负面影响(庄智慧,高淑红,何岫峰,等.响应面法优化林可霉素产量与组分[j].中国抗生素杂志,2018,43(8):1049-1054)。提高培养基渗透压以及添加甘露醇可以降低b组分含量，故考虑将葡萄糖酸钙和甘露醇进行组合。在含有10g/lnacl摇瓶发酵培养基中添加终浓度为4g/l的葡萄糖酸钙、1g/l的甘露醇，实验结果见图5。结果表明，在高渗条件下添加4g/l葡萄糖酸钙可以提高林可霉素a的产量，但会提高林可霉素b的含量，而添加1g/l甘露醇可以降低林可霉素b含量，通过甘露醇和葡萄糖酸钙的组合，林可霉素a效价达到4910u/ml，相比ck(4252u/ml)提高15％，b组分含量降低至1.20％相比ck(2.91％)降低59％。

实施例6

氨基酸是一类最常见的渗透保护剂，其中甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸等作为渗透压保护剂常用于高渗发酵体系。氨基酸等可以作为相容性溶质，提高蛋白稳定性，维持细胞膜完整性。多种微生物可以在体内积累大量的脯氨酸，且不影响正常的代谢活动，所以脯氨酸是最常用的渗透压保护剂。微生物在高渗环境下也会发生氧化胁迫响应，细胞需要合成更多atp用于抵抗环境胁迫对细胞产生的破坏，半胱氨酸可以作为一种常见的抗氧化剂。故以zlw0306为起始株，在最优培养基中添加不同浓度的脯氨酸和甘氨酸作为渗透压保护剂，以及添加不同浓度的半胱氨酸作为抗氧化剂。实验结果见图6、7、8。

由图6得到，在高渗培养基中添加脯氨酸可以提高林可霉素a的产量，减少林可霉素b的含量，添加25mg/l脯氨酸的效果最佳，林可霉素a(4805u/ml)与ck(4074u/ml)相比提高了15％，林可霉素b减少了41％。

由图7得到，在高渗培养基中添加甘氨酸可以提高林可霉素a的产量，减少林可霉素b的含量，添加25mg/l甘氨酸的效果最佳，林可霉素a(4919u/ml)与ck(4074u/ml)相比提高了20％，林可霉素b减少了30％。在高渗环境下(10g/lnacl)添加甘氨酸的效果比添加脯氨酸更好。猜测在高渗环境下，菌体合成更多的氨基酸用于抵御高渗胁迫，外源添加的脯氨酸、甘氨酸也能被转运至胞内，则有更多的氨基酸可以用于合成次级代谢产物林可霉素a。随着氨基酸浓度的进一步提高，林可霉素a产量出现轻微下降。可能的原因是外源添加的氨基酸促进菌体生长过于旺盛，更多的碳源被用于菌体的有氧呼吸，导致了产量没有进一步提高。

由图8得到，在高渗培养基中添加半胱氨酸可以提高林可霉素a的产量，减少林可霉素b的含量，添加25mg/l半胱氨酸的效果最佳，林可霉素a(4919u/ml)与ck(4074u/ml)相比提高了17％，林可霉素b减少了34％。半胱氨酸可能作为抗氧化剂提升细胞活性，减少氧化应激的副作用。

上述实施例对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。