一株富硒细菌及其分离方法与流程

本发明属于微生物领域，涉及一种富硒细菌，尤其涉及一种富硒细菌及其分离方法。

背景技术：

硒(se)是自然界中普遍存在的一种微量元素，广泛分布于地壳、土壤和湖泊等环境中。硒污染主要来自于石油炼制、电子及光电产业、玻璃、橡胶及各种合金制造业。硒主要以4种价态存在：负二价硒、零价硒、四价硒、和六价硒，其中，四价硒以亚硒酸盐的形式存在于环境中。由于亚硒酸盐具有高度可溶性，易于在环境中发生转移和转化，同时亚硒酸盐能灭活蛋白质，阻碍dna修复，干扰细胞的呼吸作用和抗氧化防御系统的正常运行，因而相对于其他价态的硒具有更强的毒性。单质硒不溶于水，具有较低的生物利用率和毒性，因此，将亚硒酸盐还原为单质硒可有效去除亚硒酸盐污染。由于化学法还原亚硒酸盐成本高，且会导致二次污染，研究者常选择安全性好和成本低的生物法。微生物在硒污染修复方面具有广阔的应用前景。许多微生物可以耐受毒性较高的seo3²-，并将其转化为不溶性低毒的红色纳米硒，或同化还原为硒蛋白，或甲基化为具有高挥发性的硒甲基化合物，有些微生物还可以将低价态的硒氧化为高价态的硒。因此，微生物对硒的转化是有效解决硒引起的环境和健康问题的有效手段之一。

目前研究较多的是富硒微生物大多是利用传统的食用菌或者已经驯化的真菌资源，进行人工补硒诱导培养以获得具有高耐受力、强富硒力的菌株。如现有的天然富硒菌株大多是从湖北恩施的富硒环境中筛选的菌株，如袁林喜在2015年申请发明公布的苏云金芽孢杆菌bacillusthuringiensisylx-4及其应用(cn105199979a)

但目前人工培育菌株大多存在稳定性较差、富硒能力有限、生成成本较高等问题。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一株富硒细菌，具有嗜硒微生物特征，可在硒的生物转化、纳米硒的微生物合成、硒污染环境修复中具有潜在的应用价值。

本发明还提供上述富硒细菌的分离方法，该分离方法培养的微生物菌剂中菌株种属可鉴、菌株的品种较为单一、制备细菌菌剂的操作简单且能显著富集硒。

为实现上述目的，本发明提供一株富硒细菌，该富硒细菌为丛毛单胞菌(comamonassp.)w41，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2018年5月24日，保藏登记号：cgmccno.15803。

该菌菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，直径2～3mm，灰白色，半透明，易挑起，质地湿润。

本发明还提供上述富硒细菌的分离方法，包括如下步骤：

1)富集：将土壤样品10g加于带有10g玻璃珠的90ml无菌水中震荡摇匀，制成土壤悬液，然后取1ml土壤悬液加入到50ml肉膏蛋白胨液体培养基中25℃，摇床100rmp培养24h得到菌悬液；

2)初筛：将步骤1)中得到的菌悬液按照5％菌悬液体积加入到含硒浓度为100mg/l的含硒肉膏蛋白胨液体培养基中，在25℃，摇床100rmp培养24h，此步骤重复三次；将最后一次获得的培养物在含亚硒酸钠分别为0，120mg/l，320mg/l，600mg/l，1000mg/l的无菌的肉膏蛋白胨固体培养基的培养皿上划线，25℃培养箱中倒置培养48h，观察生长情况；

3)分离纯化：挑取在含硒1000mg/l的肉膏蛋白胨固体培养基上仍有生长的深红色菌株在无菌的肉膏蛋白胨固体培养基的培养皿上平板划线，然后在25℃培养箱中倒置培养48h，挑取红色菌落重复划线三次，再分离出红色单菌落，将最后的单菌落接种至肉膏蛋白胨液体培养基中培养，得到单菌悬液；

4)梯度稀释平板法复筛：配制浓度计分别为lg/l、800mg/l、400mg/l、200mg/l、0mg/l的亚硒酸钠溶液，分别倒入10ml融化的不加硒肉膏蛋白胨固体培养基中，将培养皿倾斜大约5mm，等待冷凝后，置于水平，再倒入等体积融化的加硒琼脂培养基，室温放置3h制成线性梯度平板；取步骤3)得到的单菌悬液1ml加入到9ml无菌水中混合均匀，然后再稀释到10^-3、10^-4、10^-5不同的稀释倍数，分别取100μl稀释后的单菌悬液涂布于线性梯度平板上，观察菌株在平板上的生长状态，挑选富硒效果最好且生长最好的菌株，鉴定。

其中，所述肉膏蛋白胨液体培养基，配方为：牛肉膏0.5g，蛋白胨1.0g，nacl0.5g，水100ml，ph为7.2。

所述肉膏蛋白胨固体培养基：配方为：牛肉膏0.5g，蛋白胨1.0g，nacl0.5g，2％的琼脂，水100ml，ph为7.2。

所述含硒肉膏蛋白胨液体培养基，配方为：牛肉膏0.5g，蛋白胨1.0g，nacl0.5g，硒100mg/l，水100ml，ph为7.2。

当硒浓度为本发明中其他浓度时即为含相应浓度的硒的肉膏蛋白胨液体培养基，当上述培养基中含有2％琼脂时即为含相应浓度的硒的肉膏蛋白胨固体培养基。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一株富硒细菌，该富硒细菌具有嗜硒微生物特征，可在硒的生物转化、纳米硒的微生物合成、硒污染环境修复中具有潜在的应用价值。同时，本发明还提供上述富硒细菌的分离方法，该分离方法培养的微生物菌剂中菌株种属可鉴、菌株的品种较为单一、制备细菌菌剂的操作简单且能显著富集硒。经实验证明，本发明所提供富硒细菌可富集硒浓度达所处环境中硒浓度的4倍以上。

附图说明

图1为本发明实施例1中土壤中微生物的培养情况。

图2为本发明实施例1中菌株牛2在800mg/l的梯度稀释平板中的生长情况。

图3为本发明实施例1中五株菌在梯度稀释平板中的生长情况，a、b、c、d、e分别为菌株牛2、牛1和土1、土2和土12。

图4为本发明所提供实施例2中w41生长曲线。

具体实施方式

材料：

1.肉膏蛋白胨液体培养基

配方如下：牛肉膏0.5g，蛋白胨1.0g，nacl0.5g，水100ml，ph为7.2，如配置固体培养基，再加入2％的琼脂，即2g琼脂，于121℃灭菌20min。

2.肉膏蛋白胨固体培养基

配方如下：牛肉膏0.5g，蛋白胨1.0g，nacl0.5g，2％的琼脂，即2g琼脂，水100ml，ph为7.2，于121℃灭菌20min。

3.含硒肉膏蛋白胨液体培养基

配方如下：牛肉膏0.5g，蛋白胨1.0g，nacl0.5g，硒100mg/l，水100ml，ph为7.2，于121℃灭菌20min

4.5mm玻璃珠

实施例1

本发明所分离的富硒细菌来自陕西安康农田的土壤。

1.富集

配制肉膏蛋白胨培养基以及含有10g玻璃珠的无菌水90ml，于121℃灭菌20min。待冷却至常温，取陕西安康土壤样品10g加于无菌水中震荡摇匀，制成土壤悬液，取1ml土壤悬液转移至50ml肉膏蛋白胨液体培养基中于摇床中25℃温度，100rmp转速富集培养24h得到菌悬液后备用。

2.初筛

富集培养后，按照5％菌液体积，用灭菌后的移液枪取富集好的菌悬液加入亚硒酸钠浓度为100mg/l的肉膏蛋白胨液体培养基中继续富集培养，培养后可见出现浑浊、球状、絮状等现象，如图1所示。

按此步骤重复培养三次后，在加不同量的亚硒酸钠(0，120mg/l，320mg/l，600mg/l，1000mg/l)的无菌肉膏蛋白胨培养基的培养皿上平板划线，置于25℃培养箱中倒置培养48h。选取在含亚硒酸钠1000mg/l培养基中生长较好，菌落较大，颜色清晰且是深红色的菌株，经三次划线分离之后得到5株较纯的菌株。将他们接种至液体培养基中培养，配置成菌悬液。

3.分离纯化：将步骤2获得的5个菌株分别在无菌肉膏蛋白胨固体培养皿上平板划线，然后在25℃培养箱中倒置培养48h，挑取单菌落，重复划线三次；将最后的单菌落接种至液体培养基中培养，得到菌悬液。

4.梯度稀释平板法复筛

事先配制亚硒酸钠溶液，浓度计分别为lg/l、800mg/l、400mg/l、200mg/l、0mg/l，在无菌条件下，倒入约10ml融化的不加硒琼脂培养基，将培养皿倾斜大约5mm，等待冷凝后，置于水平，再倒入等体积融化的加硒琼脂培养基，超净工作台内室温放置3h即成线性梯度平板，每个平板在底部用记号笔标清高低浓度侧。

用移液枪及无菌枪头取筛选的5株菌的1ml菌悬液加入9ml无菌水试管里，重复操作，得到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5等不同稀释倍数，每次分别量取100μl均匀涂布于上述平板，25℃倒置恒温培养48h后，观察结果并记录。如图2所示为牛2菌稀释度为10^-5时在800mg/l硒浓度的梯度稀释平板图，以该平板为例：“+”侧是加硒侧为红色，“-”是不加硒侧为淡黄色。明显看出不加硒一侧的菌落更多更大。如图3所示分别为牛2、牛1、土1、土2、土12五种菌的梯度稀释平板图：每一组是三个平行，三个平行无大差异，牛1和牛2两种菌在稀释度为10^-5时菌落数不可数，而土1、土2、土12菌在稀释度10^-4时较牛和牛2菌菌落数少。在高浓度硒含量(800mg/l，1g/l)的梯度稀释平板中，牛2较牛1菌落数多且菌落大，因此选择牛2做后续实验，并将其称为w41。

5.菌株w41的鉴定

将菌株w41进行纯化后利用pcr技术扩增16srdna鉴定菌株的种属，具体的过程为：挑取单菌落溶于100ul超纯水中，在沸水中煮10min裂解菌体，吸取1ul裂解后的菌液作为pcr反应的模板，扩增16srdna基因，将扩增的16srdna基因序列与genebank中16srdna的数据库进行同源性比对，确定菌株的种属为comamonassp.

6..富硒菌株w41保藏

将菌株comamonassp.w41保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2018年7月19日，保藏登记号：cgmccno：15803。

7.保存

从液体培养基中取1ml体积的w41菌液与1毫升体积百分比80％的灭菌甘油混合，置于-20℃冰箱中冷冻保存待用。

实施例2

1.富硒菌株w41的生长曲线

分别配置数个肉膏蛋白胨液体培养基，按照一定的时间顺序标记好后，置于摇床中25℃温度，100rmp转速培养。按照安排好的时间顺序，先后取出后在紫外可见分光光度计600nm处测吸光值，用于菌株w41生长曲线的绘制，结果如图4所示。

从图4的菌株生长曲线可以看出，该菌株w41从4小时到48小时属于对数生长期，菌株w41的生长量不断增大，迅速增长，在该期间菌株的代谢非常旺盛，转化率较高；在48至144小时内处于较为稳定增长的阶段，生长较为缓慢，但仍然在生长。在144小时之后呈下降趋势，属于衰亡期，此期间代谢缓慢，该菌株发生自身溶解，并且转化率很低，综上考虑，该菌株的最佳富硒时间为48小时左右。

2富硒菌株w41的富硒效果

配制液体肉膏蛋白胨培养基，将生长良好的菌株w41从固体斜面接种至液体培养基中进行预培养，而后将其接种至硒含量不同的肉膏蛋白胨液体培养基中，置于摇床中，25℃温度，100rmp转速培养48h。在紫外可见分光光度计600nm处测吸光值，将液体菌液4000rmp转速离心30min后，将菌液的沉淀物转移至无菌的培养皿中，烘干后用酸消解，最后用原子荧光法测硒含量。

表1不同加硒浓度对菌株的硒含量和生物量的影响

从表1可以看出，本发明提供的菌株w41的硒含量明显都高于加入的硒浓度，菌株的硒含量和生物量随着加硒浓度的增高先增加后减少。在加硒浓度为80mg/l时，测得的生物量和硒含量最高，分别为0.80mg和665.8mg/g，说明该实验筛选出的菌株的适宜硒浓度为80mg/l左右，此时菌株的富硒效果最好。

本发明提供的富硒菌株具有如下特点：

1、本菌株从陕西安康的富硒土壤中筛选出来，是从含高浓度硒的天然环境中筛选出的菌株，它的遗传特性稳定。

2、本发明首次披露了经含硒的培养基培养并初筛的菌株，再经过梯度稀释平板法挑选具有指示特征的菌comamonassp.w41。筛选程序与现有的技术不同，现有筛选富硒菌的步骤为对富硒土壤中分离筛选得到富硒菌。如彭祚全在2012年申请发明公布的：一种利用超耐硒微生物制备红色单质硒的方法(cn102703513a)和帅超群等在《化学与生物工程》上刊出的“恩施州鱼塘坝硒矿区天然高硒微生物的筛选与鉴定”(2016年33卷4期)。

3、本发明筛选出的comamonassp.w41富硒效果显著。在培养基加硒量(100mg/l的亚硒酸钠)相同的情况下，comamonassp.w41富硒量为590.58mg/g，较李卫红(富硒米曲霉发酵工艺优化、硒种态分析及富硒机理的初步研究，合肥工业大学硕士学位论文，2015年4月)研究的富硒米曲霉的富硒效果2.22mg/g高。

从上述实施例可以看出，本发明提供一株富硒细菌(comamonassp.w41)及其分离方法，该富硒细菌具有良好的富硒效果，在硒浓度富硒效果可达到硒浓度的4倍以上。