本发明涉及血液制品领域，具体而言，涉及一种洗涤液以及人凝血因子viii的制备方法和人凝血因子viii制品。
背景技术：
人凝血因子viii(humancogulationfactorviii，简称ahf)，对缺乏人凝血因子viii所致的凝血机能障碍具有纠正作用，为甲型血友病患者的终身用药和急诊病患的抢救用药。在全球近40万甲型血友病患者中，我国的患者约有6～10万人，然而接受治疗的只有8000人左右，从提高甲型血友病患者的治疗率和保障急诊用药计，国内人凝血因子viii的缺口为现有产量的约20倍。目前国内仅有少数几家具有ahf的生产批文，供应严重紧缺，无法满足患者基本用药需求。现有ahf制备主要利用聚乙二醇沉淀、氢氧化铝吸附等方法进行制备，存在比活性低、收率低等缺点，面对国内ahf市场供应不足的现状，开发一种收率高、比活高的ahf制备方法，具有积极意义。
鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种人凝血因子viii的制备方法，采用该制备方法制备人凝血因子viii成品可以提高收率和产品的比活。
本发明的另一目的在于提供一种用于在纯化人凝血因子viii过程中使用的平衡液。
本发明的另一目的在于提供一种用于在纯化人凝血因子viii过程中使用的洗涤液。
本发明的另一目的在于提供一种用于在纯化人凝血因子viii过程中使用的洗脱液。
本发明的另一目的在于提供一种用于在纯化人凝血因子viii过程中使用的透析液。
本发明的另一目的在于提供一种人凝血因子viii制品，该人凝血因子viii制品的比活高，且富含vwf因子，具有良好的稳定性和耐热性。
本发明是这样实现的：
一种人凝血因子viii的制备方法，其包括：冷沉淀处理步骤；
冷沉淀溶解步骤包括：用氨丁三醇溶液溶解从血浆中分离得到的冷沉淀，得冷沉淀溶解液；
其中，氨丁三醇溶液与冷沉淀的质量比为3-5:1，氨丁三醇溶液浓度为0.015-0.025mol/l。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，制备方法还包括：聚乙二醇沉淀步骤；
聚乙二醇沉淀步骤包括：往冷沉淀溶解液中加入聚乙二醇溶液，得第二混合溶液；
第二混合溶液中的聚乙二醇的终浓度控制为2-5％，第二混合溶液的ph调节至6.3-6.6。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，聚乙二醇溶液含有30-32％的聚乙二醇。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，用醋酸调节第二混合溶液的ph调节至6.3-6.6。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在聚乙二醇沉淀步骤中，将第二混合溶液搅拌05-1h后，静置1.5-2h。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，制备方法还包括：s/d灭活步骤；
s/d灭活步骤包括：取由聚乙二醇沉淀步骤得到的上清液，将上清液与s/d病毒灭活溶液混合，得到第三混合溶液，置于24-26℃条件下，搅拌灭活6小时；
其中，s/d病毒灭活溶液含有：聚山梨酯80和磷酸三丁酯；
在第三混合溶液中：聚山梨酯80的含量控制为1％，磷酸三丁酯的含量控制为0.3％。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在s/d灭活步骤之后，制备方法还包括：纯化步骤；
纯化步骤包括如下步骤：
平衡步骤、吸附步骤、洗涤步骤以及洗脱步骤；
其中，平衡步骤包括：用4-5倍柱体积平衡液平衡层析柱，平衡液含有：氨丁三醇16-24mmol/l、氯化钠为80-120mmol/l、甘氨酸为100-140mmol/l以及氯化钙为35-45μmol/l，ph6.80-7.20。
吸附步骤包括：将经s/d灭活步骤处理得到的第三混合溶液上经平衡步骤处理后的层析柱进行吸附。
在纯化过程中，平衡液的主要功能是平衡凝胶介质，使其与纯化的样品溶液的条件一致，避免其与样品溶液条件不一致对目的蛋白即人凝血因子viii产生影响，减少人凝血因子viii的活性损失，提高人凝血因子viii收率。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，洗涤步骤包括：用1-2倍柱体积洗涤液洗涤层析柱，洗涤液含有：氨丁三醇16-24mmol/l、氯化钠140-180mmol/l、甘氨酸100-140mmol/l、氯化钙35-45μmol/l以及聚山梨酯8040-80mmol/l，ph6.80-7.20。
洗涤液主要功能是去除杂质蛋白提高目的蛋白人凝血因子viii纯度，选择洗涤液成分的首要原则是在保证人凝血因子viii不被洗下的基础上尽可能去除杂质蛋白，洗涤液选择不当要么影响人凝血因子viii的收率要么影响人凝血因子viii纯度。
在洗涤液中加入一定含量的表面活性剂(聚山梨酯80)，在洗涤的过程中，需要严格控制操作条件，稍有不甚会造成目的蛋白人凝血因子viii变性析出，影响洗涤效果及凝胶介质使用寿命，加入一定量表面活性剂即聚山梨酯80)可以有效解决该问题，防止人凝血因子viii变形析出，提高其收率。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，洗脱步骤包括：用1-2倍柱体积洗脱液洗脱层析柱，洗脱液含有：组氨酸20-30mmol/l、氯化钙为180-220mmol/l、氯化钠140-180mmol/l以及甘氨酸100-140mmol/l，ph6.80-7.20。
洗脱液的主要功能在于保证人凝血因子viii纯度基础上尽可能将人凝血因子viii洗脱下，洗脱液的选择不当容易影响人凝血因子viii的收率与纯度，严重的可能影响人凝血因子viii的分子结构，造成人凝血因子viii变性，或导致其稳定性变差。
该制备方法所采用的洗脱液可以有效地克服上述问题，在使人凝血因子viii尽可能地完全洗脱下的基础上，提高其收率防止其结构改变，增强其稳定性。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在纯化步骤之后，制备方法还包括：超滤步骤；
超滤步骤包括：将由上述纯化步骤得到的流穿液进行浓缩，得浓缩液，浓缩液用透析液进行透析7-10次；
透析液含有：橼酸钠8-12mmol/l、组氨酸20-30mmol/l、甘氨酸100-140mmol/l以及氯化钙0.8-1.2mmol/l，ph6.80-7.20。
透析液中的小分子溶质为透析液成分，由于超滤对人凝血因子viii中的蛋白质分子是损伤性加工，采用上述透析液进行超滤，可以为人凝血因子viii提供稳定性的保护环境，同时选用的透析液配方也为人凝血因子viii制品的制剂处方，作为稳定剂和冻干保护剂，起到维护制品理化性质稳定的作用，避免人凝血因子viii在后续冻干、干热灭活去除病毒等步骤中的活性损失，提高人凝血因子viii的回收率和比活。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，层析柱为toyopearldeae650m离子交换凝胶层析柱。
一种平衡液，其适于在纯化人凝血因子viii的过程中用于平衡层析柱，平衡液含有：氨丁三醇16-24mmol/l、氯化钠80-120mmol/l、甘氨酸100-140mmol/l以及氯化钙35-45μmol/l，ph6.80-7.20。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，平衡液含有：氨丁三醇18-22mmol/l、氯化钠为90-110mmol/l、甘氨酸110-130mmol/l以及氯化钙38-42μmol/l。
一种人凝血因子viii的制备方法，其包括纯化步骤；纯化步骤包括：层析柱平衡步骤；
层析柱平衡步骤包括：用4-5倍柱体积如上任一项所述的平衡液平衡层析柱。
一种洗涤液，其适于在纯化人凝血因子viii的过程中用于洗涤层析柱，洗涤液含有：氨丁三醇16-24mmol/l、氯化钠140-180mmol/l、甘氨酸100-140mmol/l、氯化钙35-45μmol/l以及聚山梨酯8040-80mmol/l，ph6.80-7.20。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，洗涤液含有：氨丁三醇18-22mmol/l、氯化钠150-170mmol/l、甘氨酸110-130mmol/l、氯化钙38-42μmol/l以及聚山梨酯8050-70mmol/l。
一种人凝血因子viii的制备方法，其包括纯化步骤；纯化步骤包括：洗涤层析柱步骤；
层析柱洗涤步骤包括：用1-2倍柱体积如上任一项所述的洗涤液洗涤层析柱。
一种洗脱液，其适于在纯化人凝血因子viii的过程中用于洗脱层析柱，洗脱液含有：组氨酸20-30mmol/l、氯化钙为180-200mmol/l、氯化钠140-180mmol/l以及甘氨酸100-140mmol/l，ph6.80-7.20。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，洗脱液含有：组氨酸22-28mmol/l、氯化钙为190-210mmol/l、氯化钠150-170mmol/l以及甘氨酸110-130mmol/l。
一种人凝血因子viii的制备方法，其包括纯化步骤；纯化步骤包括：洗脱层析柱步骤；
洗脱层析柱步骤包括：用1-2倍柱体积如上任一项所述的洗脱液洗脱层析柱。
一种透析液，其适于在纯化人凝血因子viii的过程中用于透析含人凝血因子viii的溶液，透析液含有：橼酸钠8-12mmol/l、组氨酸20-30mmol/l、甘氨酸100-140mmol/l以及氯化钙0.8-1.2mmol/l，ph6.80-7.20。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，透析液含有：橼酸钠9-11mmol/l、组氨酸22-28mmol/l、甘氨酸110-130mmol/l以及氯化钙0.9-1.1mmol/l。
一种人凝血因子viii的制备方法，其包括超滤步骤：
超滤步骤包括：用如上任一项所述的透析液透析含人凝血因子viii的溶液。
一种人凝血因子viii制品，其由如上任一项所述的人凝血因子viii的制备方法制备制得。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，按《中华人民共和国药典》2015版三部“人凝血因子viii”方法检测，上述人凝血因子viii制品中：聚乙二醇残留量为0.03g/l、聚山梨酯80残留量为17μg/ml、磷酸三丁酯残留量为3μg/ml、vwf因子活性为15.7iu/ml以及人凝血因子viii比活性为104.8iu/mg。
当然，需要说明的是，按《中华人民共和国药典》2015版三部“人凝血因子viii”方法检测，具有上述点值误差范围内的人凝血因子viii制品均属于本发明的保护范围。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的人凝血因子viii的制备方法通过对冷沉淀的合理处理，以浓度为0.015-0.025mol/l的氨丁三醇溶液按质量比为3-5:1的比例溶解冷沉淀，通过对冷沉淀的合理处理，以浓度为0.015-0.025mol/l的氨丁三醇溶液按质量比为3-5:1的比例溶解冷沉淀，采用聚乙二醇沉淀法联合离子交换层析法分离提纯，可以有效提高人凝血因子viii的回收率和终产品的比活，收率达到180-240iu/l血浆，比活不低于100iu/mg蛋白，该制备方法所制得的人凝血因子viii制品中富含vwf因子，vwf因子与人凝血viii因子比例接近1:1，除用于甲型血友病患者的治疗，也可以用于血管性血友病患者的治疗。且采用的制剂处方使制品具有良好的稳定性和耐热性，经干热灭活(例如100℃、30min)病毒处理后，人凝血因子viii活性基本不损失。
本发明提供的平衡液含有氨丁三醇16-24mmol/l、氯化钠80-120mmol/l、甘氨酸100-140mmol/l以及氯化钙35-45μmol/l，ph6.80-7.20。采用该平衡液平衡层析柱使得层析柱上的凝胶介质与上样样品的条件一致，避免条件不一致对样品产生影响，有利于提高人凝血因子viii的回收率和终产品的比活。
本发明提供的洗涤液含有氨丁三醇16-24mmol/l、氯化钠140-180mmol/l、甘氨酸100-140mmol/l、氯化钙35-45μmol/l以及聚山梨酯8040-80mmol/l，ph6.80-7.20，采用该洗涤液可以尽可能地去除杂质蛋白，并保证目的蛋白即人凝血因子牢固地结合在层析柱上，并防止目的蛋白即人凝血因子viii变性析出，避免人凝血因子viii流失，有利于提高人凝血因子viii的回收率和比活。
本发明提供的洗脱液含有组氨酸22-28mmol/l、氯化钙为190-210mmol/l、氯化钠150-170mmol/l以及甘氨酸110-130mmol/l。该洗脱液可以确保目的蛋白即人凝血因子viii从层析柱尽可能地被洗脱，并避免人凝血因子viii变性或其稳定性降低，提高有利于提高人凝血因子viii的回收率和比活。
本发明提供的透析液含有：橼酸钠8-12mmol/l、组氨酸20-30mmol/l、甘氨酸100-140mmol/l以及氯化钙0.8-1.2mmol/l，ph6.80-7.20。由于超滤对人凝血因子viii中的蛋白质分子是损伤性加工，采用上述透析液进行超滤，可以为人凝血因子viii提供稳定性的保护环境，同时选用的透析液配方也为人凝血因子viii制品的制剂处方，作为稳定剂和冻干保护剂，起到维护制品理化性质稳定的作用，避免人凝血因子viii在后续冻干、干热灭活去除病毒等步骤中的活性损失，提高人凝血因子viii的回收率和比活。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的人凝血因子viii的制备方法，其包括如下步骤:
1、原料血浆采集步骤：
1.1血浆的采集和质量应符合现行版《中华人民共和国药典》三部中“血液制品生产用人血浆”的规定，采集后应在4小时以内冻结，-30℃保存不超过1年。
1.2血浆应无凝块、无纤维蛋白析出，非脂血，无溶血。
2、冷沉淀制备步骤：
称取2097kg冰冻血浆(计3495人份血浆)，经70％乙醇溶液(需要乙醇溶液控制在70％-75％)浸泡或擦拭表面消毒处理后，破袋、合并入罐后，于37℃以下水浴融化，控制融浆温度在4℃(融浆温度控制在0-4℃)。
采用低温高速离心机对融合后的血浆进行冷沉淀分离，控制每台离心机离心出液速度不超过3000ml/min，出液温度在4℃(其他的实施例中，出液温度控制在0-4℃)，离心结束后收集26kg冷沉淀，冻存于-35.0℃冷库。
3、冷沉淀溶解步骤：
冷沉淀自-35.0℃冷库出库后，于10-30℃环境中预化冻6小时后，采用飞利浦hr7629粉碎机将冷沉淀粉碎后，倒入3倍沉淀量的0.02mol/l氨丁三醇溶液(78l)中，搅拌溶解2小时，溶后体积为104l。
4、聚乙二醇(peg)沉淀步骤：
沉淀溶解结束后，加入配制好的31.56％peg溶液(其他的实施例中，peg溶液浓度控制在30-32％)12.97kg，使制品中peg最终浓度为3.5％(其他的实施例中，peg最终浓度控制在2-5％)；加入peg后用0.1mol/l醋酸溶液调ph至6.53，在将混合溶液的温度控制在20.0℃下搅拌0.5小时后(在其他的实施例中，混合溶液的温度控制在20-30℃)，静置1.5小时后，离心。
5、s/d灭活步骤：
收集步骤4制得的上清液，准确计量过滤后上清液体积108l，按1:10比例加入s/d病毒灭活溶液(聚山梨酯80含量为11％，磷酸三丁酯含量为3.3％)，使制品内聚山梨酯80的含量达到1％，磷酸三丁酯的含量达到0.3％，水浴升温至混合溶液为24.0℃时，开始计时灭活，保持混合溶液的温度在25℃条件下，搅拌灭活6小时。
6、离子交换层析：
灭活后溶液经澄清过滤后，精确计量过滤后溶液体积为119l，上toyopearldeae650m离子交换凝胶层析柱吸附；
随后，用4倍柱床体积平衡液平衡凝胶；
其中，平衡液含有：氨丁三醇20mmol/l、氯化钠120mmol/l、甘氨酸120mmol/l以及氯化钙40μmol/l，ph7.0；
用2倍柱床体积洗涤液洗涤凝胶；
其中，洗涤液含有：氨丁三醇20mmol/l、氯化钠160mmol/l、甘氨酸120mmol/l、氯化钙40μmol/l以及聚山梨酯8060mmol/l，ph7.0；
用2倍柱床体积洗脱液洗脱凝胶；
其中，洗脱液含有：组氨酸为25mmol/l，氯化钙为200mmol/l，氯化钠为160mmol/l，甘氨酸为120mmol/l，ph7.0。
并据峰形收集流穿液11l(洗脱起峰即开始收集，至峰回到基线停止收集)。
7、超滤步骤：将收集到的流穿液液先浓缩至4l，然后用透析液进行透析；
其中，透析液含有：枸橼酸钠10mmol/l、组氨酸25mmol/l、甘氨酸120mmol/l以及氯化钙为1mmol/l，ph7.0；
透析时的溶液温度20-30℃；
采用等倍体积超滤透析液透析8次，超滤透析后溶液体积为5.2l。
8、稀释配制及除菌过滤分装：
取超滤后溶液测效价(其检测结果见表3)，按分装规格加超滤透析液稀释至19l，人凝血因子viii效价为23iu/ml，除菌过滤，按10.5ml/瓶进行分装，共分装1790瓶，
9、冻干：
除菌过滤分装后，调整冷媒温度至-40℃以下冻结3小时，抽真空至20pa左右，按5℃/hr升温隔板温度至-10℃，冷媒-10℃保持15小时，按10℃/hr升温冷媒至34℃，冷媒34℃保持10小时，真空封口、轧盖；
10、干热灭活：
将冻干制品移入水浴灭菌柜内，温度控制在100±0.5℃，时间30min，干热结束，转入待检库，取样送检，即得到人凝血因子viii成品。
成品质量检测项目参照《中华人民共和国药典》2015版三部“人凝血因子viii”(p272-273页)进行检测，检测结果如表1所示。
表1人凝血因子viii成品质量检测结果
从表1看出，人凝血因子viii成品各项指标均符合要求，尤其是人凝血因子viii成品比活达104.8iu/mg，远高于标准规定的10.0iu/mg蛋白质；聚乙二醇残留量仅为0.03g/l，远低于标准规定的含量；另外，需要注意的是，本发明制得的人凝血因子viii成品还具有vwf因子活性，其活性达到15.7iu/ml。
实施例2
本实施例提供的人凝血因子viii的制备方法与实施例1基本相同，不同的是，在本实施例中：
平衡液含有：氨丁三醇18mmol/l、氯化钠90mmol/l、甘氨酸110mmol/l以及氯化钙38μmol/l。
透析液含有：橼酸钠11mmol/l、组氨酸28mmol/l、甘氨酸130mmol/l以及氯化钙1.1mmol/l。
实施例3
本实施例提供的人凝血因子viii的制备方法与实施例1基本相同，不同的是，在本实施例中：
平衡液含有：氨丁三醇22mmol/l、氯化钠110mmol/l、甘氨酸130mmol/l以及氯化钙42μmol/l。
实施例4
本实施例提供的人凝血因子viii的制备方法与实施例1基本相同，不同的是，在本实施例中：
洗涤液含有：氨丁三醇18mmol/l、氯化钠150mmol/l、甘氨酸110mmol/l、氯化钙38μmol/l以及聚山梨酯8050mmol/l。
洗脱液含有：组氨酸28mmol/l、氯化钙为210mmol/l、氯化钠170mmol/l以及甘氨酸130mmol/l。
实施例5
本实施例提供的人凝血因子viii的制备方法与实施例1基本相同，不同的是，在本实施例中：
洗涤液含有：氨丁三醇22mmol/l、氯化钠170mmol/l、甘氨酸130mmol/l、氯化钙42μmol/l以及聚山梨酯8070mmol/l。
透析液含有：橼酸钠9mmol/l、组氨酸22mmol/l、甘氨酸110mmol/l以及氯化钙0.9mmol/l。
实施例6
本实施例提供的人凝血因子viii的制备方法与实施例1基本相同，不同的是，在本实施例中：
洗脱液含有：组氨酸22mmol/l、氯化钙为190mmol/l、氯化钠150mmol/l以及甘氨酸110mmol/l。
实验例1
为确定该制备工艺产品中vwf因子含量，对实施例1-实施例6的制备方法制备的产品中的vwf因子含量进行了考察，采用vwf:ag检测试剂盒(siemens,有效期2017/09/30)；standplasma(ssc/isth,有效期2020/12)，利用免疫比浊法测定。正常凝血质控血浆用稀释液作2：1、5：4、3：5、2：5、5：38的梯度稀释，样品根据人凝血因子viii活性标示数值稀释为1iu/ml，分别与乳胶试剂、反应缓冲液混合，于sysmexca-1500全自动血凝仪上测定凝固时间，将测得的结果与正常参比血浆测定结果的标准曲线比较，即可计算出vwf:ag含量。结果见表2。
表2人凝血因子viii成品中vwf因子含量的检测结果
从表2结果可知，本发明实施例1-6提供的人凝血因子viii制备方法生产的人凝血因子viii中vwf:ag含量与viii含量比值在0.69-0.79之间，较已上市的a企业和b企业的0.46和0.14相比，vwf因子与viii因子比例接近1:1，其除用于甲型血友病患者的治疗，也可以用于血管性血友病(vonwillebrand，简称vwd)患者的治疗。
目前，治疗血管性血友病的主要手段是输注人血浆来源的冷沉淀进行替代治疗，但冷沉淀因缺乏有效的病毒灭活工艺，具有极大的病毒传播危险性，其应用受到很大限制。
而通过本发明提供的人凝血因子viii制备方法生产的人凝血因子viii含有vwf因子，其应用可不受上述限制，可于血管性血友病患者的治疗，克服病毒传播危险性的潜在缺陷，具有良好的应用前景。
实验例2
检测人凝血因子viii产品的耐热性
取实施例1-6提供的制备方法所制备的人凝血因子viii产品，对比其在干热灭活前后的人凝血因子viii效价，具体结果如下表3。
表3.人凝血因子viii产品的耐热性检测结果
从表3结果可以看出，人凝血因子viii效价干热灭活前后的损失在0.88％-2.5％之间，与文献上报道的损失10％-25％相比；采用本发明的人凝血因子viii制备方法在干热灭活前后损失基本可以忽略；由此表明本发明提供的制剂处方例如透析液具有良好的稳定性，当然也说明本发明制备的人凝血因子viii产品的耐热性更好。
需要说明的是，本发明涉及的百分数除具体说明的以外，均为质量百分数。
需要说明的是，本发明所述制备方法中的数值不限于实施例中应用的具体数值，在实际生产中，在较小范围内的数值变化不影响试验结果，其也属于本发明的保护范围。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。