一种间充质干细胞过滤灌流培养制备装置的制作方法

本实用新型涉及到一种临床应用大量制备扩增间充质干细胞MSC，特别涉及一种间充质干细胞过滤灌流培养制备装置。

背景技术：

21世纪是生命科学大发展的世纪，干细胞研究促进了再生医学的发展，这是继药物治疗、手术治疗之后的又一场医疗革命。-- 2009年11月3日.温家宝总理发表《让科技引领中国可持续发展》

间充质干细胞的临床研究已经在许多国家开展，日本韩国澳大利亚加拿大批准了干细胞药物上市，我国也批准了多项临床试验。除了用来促进恢复造血，间充质干细胞还用于肝硬化、糖尿病、退行性疾病、神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮等疾病的治疗研究

间充质干细胞具有治疗范围比较广泛，产业化容易，伦理问题较小，致瘤性较弱，不需要配型优势。

全球已注册的MSC临床试验更高达460余项，MSC已成为干细胞治疗主流。

尽管MSCs是再生医学的主力，他们却面临着一系列挑战，特别是经济成本。现在临床间充质干细胞多是用自体MSC经过体外扩增回输，由于个体差异及细胞状态不同，种子细胞不同，随后扩增及质量控制变量太多，导致产品成本过高；另外一些MSC细胞临床用量达5e8细胞/人，随着再生医学细胞治疗市场的发展MSC干细胞需求量不断攀升。

开发出符合cGMP制药生产标准，更具成本效益的制造方案扩增MSC装置，成为业内共识。

Corning公司开发出CELLCUBE，一种生物反应器控制的多层细胞工厂灌流培养装置，优点任何种类细胞都可培养，而且扩增生产潜力巨大。缺点是需要手工消化和收集扩增好的MSC，而且不能实时取细胞观察。

TERUMO BCT的QUANTUM，封闭自动化中空纤维MSC培养系统，封闭管道MSC培养系统，培养消化收集细胞实现自动化，最接近临床MSC扩增需求的培养方式，缺点是不能取细胞实时观察

Lonza使用Satorius 公司一次性200L细胞袋和微载体悬浮培养系统，将成熟的疫苗生产方式应用到MSC扩增。具有自动化控制，符合制药GMP标准，而且容易取样观察MSC细胞实时状态优势，而CELLCUBE和QUANTUM都不能直接取样，只能通过生化分析培养液，间接推测细胞状态。Lonza也有微载体悬浮培养通病，微载体上细胞接种不匀，导致悬浮的微载体上有部分空球和满球现象，细胞状态不均匀，另外无血清培养基导致MSC细胞贴壁较弱，在搅拌状态下有脱落现象。

技术实现要素：

通过对现有专利文献的检索，我们发现还没有间充质干细胞过滤灌流培养制备装置的相关报道。

为这解决现有微载体上细胞接种不匀，导致悬浮的微载体上有部分空球和满球现象，细胞状态不均匀，另外无血清培养基导致MSC细胞贴壁较弱，在搅拌状态下有脱落现象的问题，本实用新型的目的在于提供一种间充质干细胞过滤灌流培养制备装置，控制溶氧解决MSC培养过程中易分化丢失干性，不用驯化细胞，使微载体上均匀分布贴壁种子细胞，无血清培养时过滤灌流培养能防止细胞脱落，过滤方式高效分离消化好的干细胞与微载体，清洗收获MSC，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本实用新型提供如下技术方案：一种间充质干细胞过滤灌流培养制备装置，包括用于过滤收集干细胞的过滤器、用于培养的生物反应器以及起核心控制作用的电脑监控系统，所述过滤器由罐体、滤网、滤板、进液口、出液口和万向轮组成，罐体的内部自上而下排列有安装在出液口连接的管道上的滤网，所述滤网的下方设有滤板，罐体的底部设有出液口和万向轮，所述过滤器的进液口和出液口通过管道分别连接在生物反应器的出口和进口上，所述过滤器的进液口和生物反应器的出口的连接管道上安装有三通阀和双泵头泵，所述生物反应器上安装有搅拌器和温度计，所述生物反应器上还设有收集口，所述生物反应器还连接PH检测口和数据输出接口，生物反应器上还安装加入碱口，所述生物反应器和气体交换器的连接管道上设有蠕动泵，所述气体交换器和加热器之间设置数据输出接口，所述加热器和生物反应器之间设有营养物加入口。

优选的，所述过滤器的出液口和生物反应器的进口的连接管道上安装有三通阀。

优选的，所述气体交换器的上下端分别设有氧气进口和二氧化碳出口。

优选的，所述生物反应器和气体交换器内部安装传感器，传感器电连接数据输出接口，数据输出接口电连接电脑监控系统。

优选的，所述过滤器还带有用于调整监控滤器干细胞溶氧的双溶氧检测器。

优选的，所述出液口连接的管道和滤网的接触面设置有小孔。

优选的，所述滤网的孔径大小为100um，滤板的小孔直径为10-30um。

与现有技术相比，本实用新型的有益效果是：本间充质干细胞过滤灌流培养制备装置，控制溶氧解决MSC培养过程中易分化丢失干性，不用驯化细胞，使用原工艺血清培养基，通过控制接种细胞与微载体比例，使微载体上均匀分布贴壁种子细胞，无血清培养时过滤灌流培养能防止细胞脱落，培养过程中可随时取样，观察微载体上的干细胞状态，过滤方式高效分离消化好的干细胞与微载体，清洗收获MSC，灌流培养不断加入新鲜培养基，随时清除细胞代谢产物，维持细胞最佳状态，可使用无血清或化学成分确定的CD培养基，减少动物源物质污染，提高MSC安全性，消除培养基中动物源成分，提高MSC质量，减低成本。

附图说明

图1为本实用新型的过滤器和生物反应器的系统连接图；

图2为本实用新型的过滤器的结构示意图；

图3为本实用新型的系统原理图。

图中：1过滤器、2生物反应器、3电脑监控系统、4罐体、5滤网、6滤板、7进液口、8出液口、9万向轮、10出口、11进口、12三通阀、13双泵头泵、14搅拌器、15温度计、16收集口、17 PH检测口、18数据输出接口、19加入碱口、20气体交换器、201氧气进口、202二氧化碳出口、21蠕动泵、22加热器、23营养物加入口。

具体实施方式

下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。

请参阅图1-3，一种间充质干细胞过滤灌流培养制备装置，包括用于过滤收集干细胞的过滤器1、用于培养的生物反应器2以及起核心控制作用的电脑监控系统3，过滤器1由罐体4、滤网5、滤板6、进液口7、出液口8和万向轮9组成，罐体4的内部自上而下排列有安装在出液口8连接的管道上的滤网5，出液口8连接的管道和滤网5的接触面设置有小孔，含有干细胞的液体经进液口7进入，经过滤网5过滤后，进入出液口8流出，滤网5的孔径大小为100um，收集干细胞，滤板6的小孔直径为10-30um，截留微载体，无菌注射器取样口随时取出微载体观察细胞，滤网5的下方设有滤板6，罐体4的底部设有出液口8和万向轮9，过滤器1还带有用于调整监控滤器干细胞溶氧的双溶氧检测器，通过过滤器1进液口7和出液口8溶氧差，调整监控滤器干细胞溶氧，防止MSC在>3%溶氧环境发生分化，丢失干细胞特性，过滤器1的进液口7和出液口8通过管道分别连接在生物反应器2的出口10和进口11上，2MSC和微载体过滤截留在培养过滤器1中，通过蠕动泵21从生物反应器2中循环营养供应和代谢产物去除，一次性并联注射器装置接种微载体：一个注射器装微载体培养基悬浊液，一个装种子MSC细胞，三通连培养滤器，并联推动注射器使微载体与确定个数的细胞混合，并在滤板6上堆积，确保种子MSC与微载体持续接触并伸展贴壁。贴壁以及培养过程中通过蠕动泵持续泵入新鲜培养基灌流，保障MSC细胞培养条件，生物反应器2控制培养温度，过滤器1的进液口7和生物反应器2的出口10的连接管道上安装有三通阀12和双泵头泵13，过滤器1的出液口8和生物反应器2的进口11的连接管道上安装有三通阀12，生物反应器2上安装有搅拌器14和温度计15，搅拌器14充分搅拌反应，温度计15可以监控内部反应温度，生物反应器2上还设有收集口16，生物反应器2还连接PH检测口17和数据输出接口18，通过PH检测口17进行生物反应器2内PH检测，生物反应器2上还安装加入碱口19，生物反应器2和气体交换器20的连接管道上设有蠕动泵21，气体交换器20的上下端分别设有氧气进口201和二氧化碳出口202，气体交换器20和加热器22之间设置数据输出接口18，生物反应器2和气体交换器20内部安装传感器，传感器电连接数据输出接口18，数据输出接口18电连接电脑监控系统3，通过内部传感器，电脑监控系统3可以对内部反应情况和交换情况实时数据监控，1-3%溶氧等培养参数监控，加热器22和生物反应器2之间设有营养物加入口23，为生物反应器2内加入营养物质，有利于培养。

1g Cytodex1微载体100ml无钙镁离子磷酸盐缓冲液浸泡过夜，上清倾倒换液；121度30分钟高压灭菌后，超净台中倾倒PB上清，使用无钙镁离子ThermoFisher 无血清MSC培养基浸泡过夜；超净台中总数2e7 MSC种子细胞悬浮于50-60ml 原工艺血清培养基中（含10-20%胎牛血清DMEM培养基），高压消毒后浸泡好1g微载体约4.3e6个微球悬浮于50-60ml无血清培养基中，细胞接种：使用两只60ml注射器分别吸取微载体和细胞三通混合入过滤器1，实现3-10个细胞接种一个微载体。由于微载体过滤堆积过程不限制体积，所以接种比例可以任意调节，从1个细胞/球到20细胞/球。由于微载体细胞堆积效应，细胞与微载体挤压包埋在一起，形成良好贴壁环境，细胞接种后小流速循环持续过滤灌流培养；生物反应器2四气配比和过滤培养进出口的溶氧探头控制灌流培养基溶氧1-3%，防止MSC分化丢失干性；每天取微载体和细胞观察细胞培养状态，和监测葡萄糖和乳酸，通过补料三通补加无血清培养基和含糖及0.4mM谷氨酰胺DMEM/F12培养基；清洗残留血清和换液：通过双泵头泵13，过滤器1的进液口7前三通阀12一路泵新鲜无血清培养基持续补料，过滤器1之后三通阀12一路抽出代谢液，间歇启动换液40ml/天，经过循环过滤灌流培养3-4天，细胞密度达到1-4e6/ml, 透气储液袋中的培养基营养成分消耗，乳酸和氨堆积，通过双泵头泵13持续向储液透气袋中补充无血清培养基和DMEM/F12混合培养基比例1:1～1：3速度100ml/天；补液期间的培养液环抽到废液袋中。通过无血清培养基不断淋洗去除原细胞培养体系中的血清，为下一步MSC细胞收集准备；MSC消化、收集：6-7天取样观察微载体上细胞接近汇合，泵入无菌空气排干滤器中无血清培养基，随后从取样孔，注射器推入50ml重组胰酶（ThermoFisher TrypLE SELECT）浸泡微载体10分钟，晃动帮助细胞脱落。更换循环泵流向，从滤器底部向顶部持续泵入无血清培养基，同时轻轻晃动滤器，脱落的MSC细胞透过滤器顶部100um滤网，从收集口泵入MSC透气收集袋中。

综上所述，本实用新型提出的间充质干细胞过滤灌流培养制备装置，实现间充质干细胞维持干性扩增，提高MSC细胞质量，通过过滤器1进液口7和出液口8溶氧差，调整监控滤器干细胞溶氧，防止MSC在>3%溶氧环境发生分化，丢失干细胞特性；在线混合种子MSC细胞与微载体，保证每个微载体与确定数目种子细胞接触，并在过滤器1中堆积，实现种子细胞与微载体紧密接触，同时持续培养基淋洗，保证培养环境，过滤灌流培养方式避免了微载体悬浮接种时，间歇搅拌，细胞与微载体接触时间少，细胞贴壁微载体不均，连续搅拌悬浮培养时，MSC从微载体上脱落的风险；微载体堆积过滤灌流培养，变平面2D培养为立体3D培养，接种均匀贴壁牢固，过滤灌流培养细胞与微载体没有相对运动，相当于MSC在组织时的培养状态；接种贴壁阶段使用原工艺含血清培养基，不用驯化细胞，通过微载体堆积包埋方式，易于MSC贴壁，过滤灌流培养阶段使用ThermoFisher 无血清培养基持续淋洗去除前期的血清，实现无动物源培养基培养，提高MSC质量和安全性；细胞培养条件易于控制和重复，根据取样分析培养状态和观察细胞状态，灌流培养不断加入新鲜培养基，随时清除细胞代谢产物，维持细胞最佳状态，可使用无血清或化学成分确定的CD培养基，减少动物源物质污染，提高MSC安全性（无血清培养基微载体悬浮培养，容易导致MSC脱落死亡）；使用疫苗生产使用的Cytodex1微载体，技术成熟同时降低了成本，Cytodex1微载体在显微镜下透明特性观察其表面贴附细胞特性，便于随时取样监测细胞状态和培养条件，过滤灌流滤器上有注射器取样口，随时取样观察细胞贴壁微载体状态和每天取样监控培养液葡萄糖消耗、乳酸堆积，细胞数和细胞状态；选用ThermoFisher 无血清杂交瘤培养基和基础培养基DMEM/F12混合过滤灌流培养，消除培养基中动物源成分，提高MSC质量，减低成本。

以上所述，仅为本实用新型较佳的具体实施方式，但本实用新型的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本实用新型揭露的技术范围内，根据本实用新型的技术方案及其实用新型构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。