本申请要求2016年8月19日提交的第62/376,941号美国临时专利申请，及2016年3月28日提交的第62/313,977号美国临时专利申请的优先权，这些专利申请都以全文引用的方式并入本文中用于所有目的。本发明大体上涉及荧光聚合物偶联物及其在分析物检测方法中的用途。
背景技术：
：荧光探针是用于分析和分离分子和细胞以及用于检测和定量其它材料的有用试剂。极少数的荧光分子可以在最佳情况下检测。barak和webb使用sit摄像机观测到不到50种与细胞接收ldl有关的荧光脂质类似物，《细胞生物学杂志(j.cellbiol.)》,90,595-604(1981)。可以使用流式细胞术检测不到10,000个与粒子或某些细胞相关联的荧光素分子(muirhead,horan及poste,《生物技术(biotechnology)》,3,337-356(1985))。荧光探针应用的一些具体实例有(1)利用荧光流式细胞术、荧光活化细胞分选及荧光显微镜检查技术鉴别和分离细胞混合物中的细胞亚群；(2)在荧光免疫分析技术中测定结合至第二物种(例如抗原-抗体反应)的物质的浓度；(3)利用荧光染色技术定位凝胶和其它不溶性载体中的物质。这些技术描述于herzenberg等人,“细胞免疫学(cellularimmunology)”,第3版,第22章；blackwellpublications(1978)；以及goldman,“荧光抗体方法(fluorescenceantibodymethods)”,academicpress,纽约(newyork)(1968)；和taylor等人,《荧光在生物医学中的应用(applicationsoffluorescenceinthebiomedicalsciences)》,alanlissinc.(1986)中。当将荧光聚合物用于以上目的时，对于荧光聚合物的选择有许多限制。一个限制是荧光聚合物的吸收和发射特征，因为受测试样品，例如血液、尿液、脑脊髓液中的许多配体、受体和材料会发荧光并且干扰荧光标记的荧光的准确测定。这一现象称为自身荧光或背景荧光。另一个考虑因素是荧光聚合物与配体和受体以及其它生物和非生物材料偶联的能力以及此类偶联对荧光聚合物的影响。在许多情况下，与另一分子偶联可能引起荧光聚合物的荧光特征的显著变化，并且在一些情况下，可能显著地破坏或降低荧光聚合物的量子效率。与荧光聚合物偶联还可能使被标记分子的功能失活。第三个考虑因素是荧光聚合物的量子效率，所述量子效率应当高到实现灵敏检测。第四个考虑因素是荧光聚合物的光吸收能力或消光系数，这些也应当尽可能的大。荧光分子当极为接近时是否会彼此相互作用而引起自猝灭也是需要考虑的。还需要考虑是否存在荧光聚合物自身或荧光聚合物和荧光聚合物所偶联的化合物的组合与其它化合物或容器壁的非特异性结合。上述方法的适用性和价值与适合荧光化合物的可获得性密切相关。确切地说，需要在405nm具有较强吸收并且以较大斯托克位移(stokesshift)发射荧光的荧光物质，因为激发这些荧光团会产生较少自身荧光，而且如果能利用光谱的整个可见光和近红外区，则可以同时分析发射不同波长荧光的多个发色团。近年来，紫光激光器(405nm)由于产生的发射波长范围远大于其它激光器(例如488nm的氩气激光器和633nm的he-ne激光器)，已经愈来愈多地被安装在商购的荧光仪器中。藻胆蛋白因其高消光系数和高量子产率而作出重要贡献。这些含荧光团的蛋白质可以共价连接至许多蛋白质并且用于显微镜检查和流式细胞术中进行荧光抗体分析。然而，藻胆蛋白的几个缺点限制了其生物应用，例如(1)藻胆蛋白相对较复杂并且在极稀溶液中往往会解离；(2)这些蛋白质极不稳定并且在照射时会迅速褪色；(3)藻胆蛋白在405nm下具有极弱的吸收。明亮的荧光聚合物允许以较高灵敏度检测或定位所附接的材料。某些聚芴聚合物已展示出作为免疫应用的标记试剂的效用，例如gaylord等人的美国专利第8,158,444号、美国专利第8,455,613号、美国专利第8,354,239号、美国专利第8,362,193号及美国专利第8,575,303号；以及chiu等人的wo2013/101902。聚芴聚合物的其它生物应用完整记录于thomasiii等人(《化学评论(chem.rev.)》2007,107,1339)；zhu等人(《化学评论》2012,112,4687)及zhu等人(《化学会评论(chem.soc.rev.)》,2011,40,3509)中。然而，所有现有的水溶性聚芴聚合物都是基于未取代的芴，因为所需要的关键中间物无法商购得到。尚无有关被取代的芴聚合物的生物应用的研究。已知未取代的聚芴聚合物共有某些缺点，例如(1)现有聚芴聚合物的发射波长接近可见光波长的uv边缘(400-800nm)；(2)现有聚芴聚合物还具有极强的自聚集(即，堆叠)倾向，可能显著降低荧光量子产率，如mishra等人,《化学评论》,100,1973(2000)的详细评述所描述；及(3)现有聚芴聚合物的两个苯单元绕中间单键自由旋转/振动，使聚合物线性和平面度显著减小。这一现象称为‘松紧带效应(loosebelteffect)’，如nicholasj.turro所著的“现代分子光化学(modernmolecularphotochemistry)”,第5和6章,加利福尼亚州索萨利托(sausalito,ca)的universitysciencebooks,(1991)中所描述。因此，仍需要具有改良的荧光特征的荧光聚合物。技术实现要素：本发明解决了这一需求并且是基于发现可以通过使两个苯环交联来消除所谓的‘松紧带效应’。已意外地发现，基于芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯的聚合物出乎意料地产生所希望的生物特性。这些聚合物偶联物具有(1)高荧光量子产率；(2)红移发射；(3)高水溶性；(4)高线性；(5)高平面度；(6)当第二染料偶合至所述聚合物时的高荧光共振能量转移(fret)效率；以及(7)较高的光稳定性。核心芴结构显示于下，其中碳编号如所示。本说明书通篇采用此编号。芴芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯单体单元的基础结构是：芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯这些单体可用于本发明中并定义本发明的一个方面。本发明也涉及包含至少一个芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯单体单元的聚合物。本发明还涉及附接至生物基质的包含至少一个芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯单体单元的聚合物及使用此类聚合物的方法。本公开提供了一种聚合物，所述聚合物包含一个或多个选自由以下组成的组的单体：式a的单体其中x是聚合物中单体a单元的数量，其中所述单体单元是连续或不连续的，并且其中x是6至100；式b的单体其中y是聚合物中单体b单元的数量，其中所述单体单元是连续或不连续的，并且其中y是0至99；及式c的单体其中z是聚合物中单体c单元的数量，其中所述单体单元是连续或不连续的并且其中z是0至99；其中x与y+z的比率>1，其中x+y+z的总和>10，其中r1至r6独立地是氢、烷基、聚乙二醇(peg)、芳基、杂芳基或通过连接基团偶联的生物基质(l-bs)；其中sg1至sg6独立地是烷基、水溶性基团或l-bs；并且其中所述聚合物包括端基hg1和hg2，其中hg1和hg2独立地是氢、烷基、卤素、硼羰基、芳基、杂芳基或l-bs。在一些实施例中，水溶性基团选自peg基团、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基。生物基质(bs)可以是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物。连接基团包含烷基、peg、羧酰胺、硫醚、酯、亚胺、肼、肟、烷基胺、醚、芳基胺、硼酸酯、n-酰基脲或酸酐、铂络合物、氨基三嗪、三嗪醚、脒、脲、氨基甲酸酯、硫脲、亚磷酸酯、硅烷基醚、磺酰胺、磺酸酯、1,2,3-三唑、哒嗪、噻唑烷、2-二苯基膦酰基-苯甲酰胺、异噁唑或琥珀酰亚胺基。在特定实施例中，本文所描述的聚合物没有生物基质附接。实际上，在特定实施例中，没有生物基质的本文所描述的聚合物可以被修饰成在以下一个或多个处包括偶联或以其它方式添加的一种或多种生物基质：r1、r2、r3、r4、r5、r6、sg1、sg2、sg3、sg4、sg5、sg6、hg1或hg2。在聚合物包含l-bs的特定实施例中，bs与聚合物的比率是0.2-3。本公开提供了一种聚合物，所述聚合物包含一个或多个选自由以下组成的组的单体：式d的单体其中w是聚合物中单体d单元的数量，其中所述单体单元是连续或不连续的并且其中w是6至100；式e的单体其中x是聚合物中单体e单元的数量，其中所述单体单元是连续或不连续的并且其中x是0至98；式f的单体其中y是聚合物中单体f单元的数量，其中所述单体单元是连续或不连续的并且其中y是1至20，荧光团(fp)是荧光染料，并且示例性荧光染料具有比450nm长的最大吸收及比500nm长的最大发射，并且荧光量子产率大于5％；及式g的单体其中z是聚合物中单体g单元的数量，其中所述单体单元是连续或不连续的并且其中z是0至98，并且其中w与x+y+z的比率>1，其中w+x+y+z的总和>10，其中fp是具有比450nm长的最大吸收及比500nm长的最大发射并且荧光量子产率大于5％的荧光团或荧光染料，其中r1至r6独立地是氢、烷基、聚乙二醇(peg)、芳基、杂芳基或通过连接基团偶联的生物基质(l-bs)，其中sg1至sg7独立地是烷基、水溶性基团或l-bs，并且其中所述聚合物包括端基hg1和hg2，其中hg1和hg2独立地是氢、烷基、卤素、硼羰基、芳基、杂芳基或l-bs。在一些实施例中，水溶性基团选自peg基团、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基。生物基质(bs)可以是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物。连接基团包含烷基、peg、羧酰胺及fp基团、硫醚、酯、亚胺、肼、肟、烷基胺、醚、芳基胺、硼酸酯、n-酰基脲或酸酐、铂络合物、氨基三嗪、三嗪醚、脒、脲、氨基甲酸酯、硫脲、亚磷酸酯、硅烷基醚、磺酰胺、磺酸酯、1,2,3-三唑、哒嗪、噻唑烷、2-二苯基膦酰基-苯甲酰胺、异噁唑或琥珀酰亚胺基。在特定实施例中，本文所描述的聚合物没有生物基质附接。实际上，在特定实施例中，没有生物基质的本文所描述的聚合物可以被修饰成在以下一个或多个处包括偶联或以其它方式添加的一种或多种生物基质：r1、r2、r3、r4、r5、r6、sg1、sg2、sg3、sg4、sg5、sg6、sg7、hg1或hg2。在聚合物包含l-bs的具体实施例中，bs与聚合物的比率是0.2-3。本公开提供一种聚合物，所述聚合物包含一个或多个选自由以下组成的组的单体：式h的单体其中x是聚合物中单体h单元的数量，其中所述单体单元是连续或不连续的并且其中x是0至100；式i的单体其中y是聚合物中单体i单元的数量，其中所述单体单元是连续或不连续的并且其中y是0至100；及式j的单体其中z是聚合物中单体j单元的数量，其中所述单体单元是连续或不连续的并且其中z是0至100；其中x+y+z的总和>10，其中r1至r4独立地是氢、烷基、聚乙二醇(peg)、芳基、杂芳基或通过连接基团偶联的生物基质(l-bs)；其中sg1至sg6独立地是烷基、水溶性基团或l-bs；并且其中所述聚合物包括端基hg1和hg2，其中hg1和hg2独立地是氢、烷基、卤素、硼羰基、芳基、杂芳基或l-bs。在一些实施例中，水溶性基团选自peg基团、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基。生物基质(bs)可以是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物。连接基团包含烷基、peg、羧酰胺、硫醚、酯、亚胺、肼、肟、烷基胺、醚、芳基胺、硼酸酯、n-酰基脲或酸酐、铂络合物、氨基三嗪、三嗪醚、脒、脲、氨基甲酸酯、硫脲、亚磷酸酯、硅烷基醚、磺酰胺、磺酸酯、1,2,3-三唑、哒嗪、噻唑烷、2二苯基膦酰基-苯甲酰胺、异噁唑或琥珀酰亚胺基。在特定实施例中，本文所描述的聚合物没有生物基质附接。实际上，在特定实施例中，没有生物基质的本文所描述的聚合物可以被修饰成在以下一个或多个处包括偶联或以其它方式添加的一种或多种生物基质：r1、r2、r3、r4、sg1、sg2、sg3、sg4、sg5、sg6、hg1或hg2。在聚合物包含l-bs的特定实施例中，bs与聚合物的比率是0.2-3。本公开提供一种聚合物，所述聚合物包含一个或多个选自由以下组成的组的单体：式k的单体其中w是聚合物中单体k单元的数量，其中所述单体单元是连续或不连续的并且其中w是0至100；式l的单体其中x是聚合物中单体l单元的数量，其中所述单体单元是连续或不连续的并且其中x是0至100；式m的单体其中y是聚合物中单体m单元的数量，其中所述单体单元是连续或不连续的并且其中y是1至20，荧光团(fp)是荧光染料，并且示例性荧光染料具有比450nm长的最大吸收及比500nm长的最大发射，并且荧光量子产率大于5％；及式n的单体其中z是聚合物中单体n单元的数量，其中所述单体单元是连续或不连续的并且其中z是0至100，其中w+x+y+z的总和>10，其中荧光团(fp)是具有比450nm长的最大吸收及比500nm长的最大发射并且荧光量子产率大于5％的荧光染料，其中r1至r4独立地是氢、烷基、聚乙二醇(peg)、芳基、杂芳基或提高连接基团偶联的生物基质(l-bs)，其中sg1至sg7独立地是烷基、水溶性基团或l-bs，并且其中所述聚合物包括端基hg1和hg2，其中hg1和hg2独立地是氢、烷基卤素、硼羰基、芳基、杂芳基或l-bs。在一些实施例中，水溶性基团选自peg基团、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基。生物基质(bs)可以是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物。连接基团包含烷基、peg、羧酰胺、fp基团、硫醚、酯、亚胺、肼、肟、烷基胺、醚、芳基胺、硼酸酯、n-酰基脲或酸酐、铂络合物、氨基三嗪、三嗪醚、脒、脲、氨基甲酸酯、硫脲、亚磷酸酯、硅烷基醚、磺酰胺、磺酸酯、1,2,3-三唑、哒嗪、噻唑烷、2二苯基膦酰基-苯甲酰胺、异噁唑或琥珀酰亚胺基。在特定实施例中，本文所描述的聚合物没有生物基质附接。实际上，在特定实施例中，没有生物基质的本文所描述的聚合物可以被修饰成在以下一个或多个处包括偶联或以其它方式添加的一种或多种生物基质：r1、r2、r3、r4、sg1、sg2、sg3、sg4、sg5、sg6、sg7、hg1或hg2。在聚合物包含l-bs的特定实施例中，bs与聚合物的比率是0.2-3。本公开提供一种式i的聚合物偶联物：其中所述聚合物偶联物包含由a、b和c表示的三个单体单元，所述单体单元沿聚合物主链随机地分布；其中r1至r6独立地表示氢、烷基、聚乙二醇(peg)、芳基、杂芳基或通过连接基团偶联的生物基质(l-bs)；其中sg1至sg6独立地表示烷基、水溶性基团或l-bs；其中hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基、芳基、杂芳基或l-bs；并且其中x是6-100的整数并且y和z各自是独立地选自0-99的整数，条件是(1)当生物基质存在于式i内的一个或多个位置时，bs/聚合物的比率是0.2-3，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和>10。在根据所有相关方面的优选实施例中，单体单元b和单体单元c是不同单体单元并因此是不相同的。在特定实施例中，至少一个sg1、sg2、sg3、sg4、sg5及sg6取代基不同于其余sg1、sg2、sg3、sg4、sg5或sg6取代基。在根据所有相关方面的特定实施例中，选自a-c的单体单元彼此以任何单体单元顺序直接连接(如本文中别处所描述)。在特定实施例中，连接基团包含烷基、peg、羧酰胺、硫醚、酯、亚胺、肼、肟、烷基胺、醚、芳基胺、硼酸酯、n-酰基脲或酸酐、铂络合物、氨基三嗪、三嗪基醚、脒、脲、氨基甲酸酯、硫脲、亚磷酸酯、硅烷基醚、磺酰胺、磺酸酯、1,2,3-三唑、哒嗪、噻唑烷、哒嗪、噻唑烷、2-二苯基膦酰基-苯甲酰胺、异噁唑或琥珀酰亚胺基。在优选实施例中，连接基团包含或是烷基或peg基团。对于包含多个连接基团的实施例，连接基团可以相同或不同。在特定实施例中，r1至r6独立地表示氢、甲基或乙基。在具体实施例中，r1至r6各自表示氢。在一些实施例中，水溶性基团选自peg基团、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基。因此，在特定实施例中，sg1至sg6独立地表示peg基团、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs。在其它实施例中，sg1和sg2都是peg基团并且sg3至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs。在一些实施例中，生物基质(bs)是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物。对于聚合物偶联物包含多于一个bs的实施例，各bs可以独立地选自抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物。在特定实施例中，hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基。在其它实施例中，x是11-80的整数并且y和z各自是独立地选自0-80的整数。在特定实施例中，x+y+z的总和>20。在其它实施例中，y和z各自是独立地选自0-80的整数。在其它实施例中，bs/聚合物的比率是1-2。因此，在特定实施例中，r1至r6独立地表示氢、甲基或乙基；其中sg1至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；其中l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；并且其中x是11-80的整数并且y和z是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和>20。在其它实施例中，本公开提供式i的聚合物偶联物，其中r1至r6是氢；其中sg1和sg2是peg；其中sg3至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；其中l包含或是烷基链或peg链；其中bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；并且其中x是11-80的整数并且y和z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和>20。在一些实施例中，sg3至sg6独立地表示peg基团、烷基、羧基烷基或l-bs。在其它实施例中，sg3至sg6独立地表示peg基团、烷基、氨基烷基或l-bs。在一些实施例中，sg1和sg2独立地是peg6至peg18。在一些实施例中，bs/聚合物的比率是1；并且x+y+z的总和是30-80。因此，在这些实施例中，适当时，x是16-80的整数并且y和z各自是独立地选自0-64的整数。在特定实施例中，sg3至sg6独立地表示peg、甲基、羧基烷基或l-bs。在特定实施例中，sg3至sg6独立地表示peg、甲基、氨基烷基或l-bs。因此，在其它实施例中，本公开提供式i的聚合物偶联物，其中r1至r6是氢；其中sg1至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；其中hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或l-bs；其中l包含或是烷基链或peg链；其中bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；并且其中x是11-80的整数并且y和z各自是选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和>20。在一些实施例中，hg1和hg2独立地表示氢、羧基芳基或l-bs。在其它实施例中，hg1和hg2独立地表示卤素、硼羰基、羧基芳基或l-bs。为避免疑问，上文所描述的r1至r6、sg1至sg6、hg1、hg2、l及bs的实施例加以必要修改可适用于如本文中所描述的聚合物偶联物ii-iv并且明确地涵盖在内。这些实施例也适用于关于单体组分所定义的本发明的聚合物。仅出于简洁考虑，以下未必重复所有以上描述的实施例。因此，在另一方面，本公开提供一种式ii的聚合物偶联物：其中所述聚合物偶联物包含由d、e、f及g表示的四个单体单元，所述单体单元沿聚合物主链随机地分布；其中荧光团(fp)是具有比450nm长的最大吸收及比500nm长的最大发射并且荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中r1至r6独立地表示氢、烷基、peg、芳基、杂芳基或l-bs(如上文所定义)；其中sg1至sg7独立地表示烷基、水溶性基团或l-bs；其中hg1和hg2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基或l-bs；其中w是6-100的整数，x和z各自是独立地选自0-98的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)当生物基质存在于式ii内的一个或多个位置时，bs/聚合物的比率是0.2-3，(2)w/(x+y+z)的比率>1，及(3)w+x+y+z的总和>10。在根据所有相关方面的优选实施例中，单体单元e和单体单元g是不同单体单元并因此是不相同的。在特定实施例中，至少一个sg1、sg2、sg3、sg4、sg5、sg6及sg7取代基不同于其余sg1、sg2、sg3、sg4、sg5、sg6或sg7取代基。在根据所有相关方面的特定实施例中，选自d-g的单体单元彼此以任何单体单元顺序直接连接(如本文中别处所描述)。在特定实施例中，连接基团包含烷基、peg、fp、羧酰胺、硫醚、酯、亚胺、肼、肟、烷基胺、醚、芳基胺、硼酸酯、n-酰基脲或酸酐、铂络合物、氨基三嗪、三嗪基醚、脒、脲、氨基甲酸酯、硫脲、亚磷酸酯、硅烷基醚、磺酰胺、磺酸酯、1,2,3-三唑、哒嗪、噻唑烷、哒嗪、噻唑烷、2-二苯基膦酰基-苯甲酰胺、异噁唑或琥珀酰亚胺基。在优选实施例中，连接基团包含或是烷基、peg基团或fp。对于包含多个连接基团的实施例，连接基团可以相同或不同。在一些实施例中，fp是荧光素、罗丹明(rhodamine)、对甲氨基酚、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺(perylenediimide)、二酮基吡咯并吡咯、卟啉或酞菁。对于聚合物偶联物包含多于一种fp的实施例，各fp可以独立地选自荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯、卟啉或酞菁。在一些实施例中，r1至r6独立地表示氢、甲基或乙基。在一些实施例中，水溶性基团选自peg基团、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基。因此，在特定实施例中，sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs。在一些实施例中，bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物。对于聚合物偶联物包含多于一个bs的实施例，各bs可以独立地选自抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物。在一些实施例中，hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基。在一些实施例中，w是11-80的整数并且x和z各自是独立地选自0-80的整数。在特定实施例中，w+x+y+z的总和>20。在其它实施例中，x和z各自是独立地选自0-80的整数。在其它实施例中，y是1至10的整数。在其它实施例中，bs/聚合物的比率是1-2。因此，在特定实施例中，本公开提供式ii的聚合物偶联物，其中fp是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；其中r1至r6独立地表示氢、甲基或乙基；其中sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；其中l包含或是烷基链、fp或peg链；其中bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；其中w是11-80的整数，x和z各自是选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)w/(x+y+z)的比率>1，及(3)w+x+y+z的总和>20。在一些实施例中，r1至r6是氢。在其它实施例中，bs/聚合物的比率是1。在其它实施例中，w+x+y+z的总和是30-80。在特定实施例中，当bs/聚合物的比率是1时，w+x+y+z的总和是30-80。因此，在这些实施例中，适当时，w是16-79的整数，并且x和z各自是独立地选自0-63的整数。在特定实施例中，fp是荧光素、罗丹明、花青、氟硼荧、方酸、苝二酰亚胺或酞菁。对于聚合物偶联物包含多于一种fp的实施例，各fp可以独立地选自荧光素、罗丹明、花青、氟硼荧、方酸、苝二酰亚胺或酞菁。在具体实施例中，fp是罗丹明，包括罗丹明110、罗丹明123、罗丹明6g、罗丹明b、罗丹明绿(rhodaminegreen)及罗丹明红(rhodaminered)。在其它实施例中，fp是花青，包括cy2、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5及cy7。在特定实施例中，fp是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；r1至r6是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或l-bs；其中l包含或是烷基链、fp或peg链；其中bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中w是11-80的整数，x和z各自是选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)w/(x+y+z)的比率>1，及(3)w+x+y+z的总和>20。在其它实施例中，bs/聚合物的比率是1，并且x+y+z的总和是30-80。在其它实施例中，hg1和hg2独立地表示氢、羧基芳基或l-bs。在其它实施例中，hg1和hg2独立地表示卤素、硼羰基、羧基芳基或l-bs。在另一方面，本公开提供一种式iii的聚合物偶联物：其中所述聚合物偶联物包含由h、i和j表示的三个单体单元，所述单体单元沿聚合物主链随机地分布；其中r1至r4独立地表示氢、烷基、聚乙二醇(peg)、芳基、杂芳基或通过连接基团偶联的生物基质(l-bs)；其中sg1至sg6独立地表示烷基、水溶性基团或l-bs；其中hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基、芳基、杂芳基或l-bs；并且其中x、y及z各自是独立地选自0-100的整数，条件是(1)当生物基质存在于式iii内的一个或多个位置时，bs/聚合物的比率是0.2-3，及(2)x+y+z的总和>10。在根据所有相关方面的优选实施例中，单体单元h-j是不同单体单元并因此是不相同的。在特定实施例中，至少一个sg1、sg2、sg3、sg4、sg5及sg6取代基不同于其余sg1、sg2、sg3、sg4、sg5或sg6取代基。在根据所有相关方面的特定实施例中，选自h-j的单体单元彼此以任何单体单元顺序直接连接(如本文中别处所描述)。在特定实施例中，连接基团包含烷基、peg、羧酰胺、硫醚、酯、亚胺、肼、肟、烷基胺、醚、芳基胺、硼酸酯、n-酰基脲或酸酐、铂络合物、氨基三嗪、三嗪基醚、脒、脲、氨基甲酸酯、硫脲、亚磷酸酯、硅烷基醚、磺酰胺、磺酸酯、1,2,3-三唑、哒嗪、噻唑烷、哒嗪、噻唑烷、2-二苯基膦酰基-苯甲酰胺、异噁唑或琥珀酰亚胺基。在优选实施例中，连接基团包含或是烷基或peg基团。对于包含多个连接基团的实施例，连接基团可以相同或不同。在一些实施例中，r1至r4独立地表示氢、甲基或乙基。在一些实施例中，水溶性基团选自peg基团、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基。因此，在特定实施例中，sg1至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs。在其它实施例中，bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物。对于聚合物偶联物包含多于一个bs的实施例，各bs可以独立地选自抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物。在其它实施例中，hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基。在其它实施例中，x、y及z各自是独立地选自0-80的整数。在特定实施例中，x+y+z的总和>20。在其它实施例中，bs/聚合物的比率是1-2。因此，在特定实施例中，本公开提供式iii的聚合物偶联物，其中r1至r4独立地表示氢、甲基或乙基；其中sg1至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；其中l包含或是烷基链或peg链；其中bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；并且其中x、y及z是0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)x+y+z的总和>20。在其它实施例中，r1至r4是氢。在其它实施例中，sg1和sg2是peg。因此，在特定实施例中，当sg1和sg2是peg时，sg3至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs。因此，在特定实施例中，本公开提供式iii的聚合物偶联物，其中r1至r4是氢；其中sg1和sg2是peg；其中sg3至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；其中l包含或是烷基链或peg链；其中bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；并且其中x、y及z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)x+y+z的总和>20。在其它实施例中，sg3至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基或l-bs。在其它实施例中，sg3至sg6独立地表示peg、烷基、氨基烷基或l-bs。在其它实施例中，bs/聚合物的比率是1。在又其它实施例中，x+y+z的总和是30-80。在其它实施例中，sg3至sg6独立地表示peg、甲基、羧基烷基或l-bs。在其它实施例中，sg3至sg6独立地表示peg、甲基、氨基烷基或l-bs。在其它实施例中，r1至r4是氢；其中sg1至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；其中hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或l-bs；其中l包含或是烷基链或peg链；其中bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；并且其中x是选自11-80的整数并且y和z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和>20。在其它实施例中，bs/聚合物的比率是1，并且x+y+z的总和是30-80。在又其它实施例中，hg1和hg2独立地表示氢、羧基芳基或l-bs。在其它实施例中，hg1和hg2独立地表示卤素、硼羰基、羧基芳基或l-bs。在另一方面，本公开提供一种式iv的聚合物偶联物：其中所述聚合物偶联物包含由k、l、m及n表示的四个单体单元，所述单体单元沿聚合物主链随机地分布；其中荧光团(fp)是具有比450nm长的最大吸收及比500nm长的最大发射并且荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中r1至r4独立地表示氢、烷基、peg、芳基、杂芳基或l-bs(如上文所定义)；其中sg1至sg7独立地表示烷基、水溶性基团或l-bs；其中hg1和hg2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基或l-bs；其中w、x及z各自是独立地选自0-100的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)当生物基质存在于式iv内的一个或多个位置时，bs/聚合物的比率是0.2-3，及(2)w+x+y+z的总和>10。在根据所有相关方面的优选实施例中，单体单元k、l及n是不同单体单元并因此是不相同的。在特定实施例中，至少一个sg1、sg2、sg3、sg4、sg5、sg6及sg7取代基不同于其余sg1、sg2、sg3、sg4、sg5、sg6或sg7取代基。在根据所有相关方面的特定实施例中，选自k-n的单体单元彼此以任何单体单元顺序直接连接(如本文中别处所描述)。在特定实施例中，连接基团包含烷基、peg、fp、羧酰胺、硫醚、酯、亚胺、肼、肟、烷基胺、醚、芳基胺、硼酸酯、n-酰基脲或酸酐、铂络合物、氨基三嗪、三嗪基醚、脒、脲、氨基甲酸酯、硫脲、亚磷酸酯、硅烷基醚、磺酰胺、磺酸酯、1,2,3-三唑、哒嗪、噻唑烷、哒嗪、噻唑烷、2-二苯基膦酰基-苯甲酰胺、异噁唑或琥珀酰亚胺基。在优选实施例中，连接基团包含或是烷基、peg基团或fp。对于包含多个连接基团的实施例，连接基团可以相同或不同。在一些实施例中，fp是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯、卟啉或酞菁。对于聚合物偶联物包含多于一种fp的实施例，各fp可以独立地选自荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯、卟啉或酞菁。在其它实施例中，r1至r4独立地表示氢、甲基或乙基。在一些实施例中，水溶性基团选自peg基团、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基。因此，在特定实施例中，sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs。在其它实施例中，bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物。对于聚合物偶联物包含多于一个bs的实施例，各bs可以独立地选自抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物。在其它实施例中，hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基。在其它实施例中，w、x及z各自是独立地选自0-80的整数。在特定实施例中，w+x+y+z的总和>20。在其它实施例中，y是1至10的整数。在又其它实施例中，bs/聚合物的比率是1-2。在特定实施例中，bs/聚合物的比率是1。因此，在特定实施例中，本公开提供式iv的聚合物偶联物，其中fp是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；其中r1至r4独立地表示氢、甲基或乙基；其中sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；其中l包含或是烷基链、fp或peg链；其中bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；其中w、x及z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)w+x+y+z的总和>20。在其它实施例中，r1至r4是氢。在其它实施例中，w+x+y+z的总和是30-80。在特定实施例中，当bs/聚合物的比率是1时，w+x+y+z的总和是30-80。在此类实施例中，w、x及z各自是独立地选自0-80的整数。在其它实施例中，fp是荧光素、罗丹明、花青、氟硼荧、方酸、苝二酰亚胺或酞菁。对于聚合物偶联物包含多于一种fp的实施例，各fp可以独立地选自荧光素、罗丹明、花青、氟硼荧、方酸、苝二酰亚胺或酞菁。在特定实施例中，fp是罗丹明，包括罗丹明110、罗丹明123、罗丹明6g、罗丹明b、罗丹明绿及罗丹明红。在一些实施例中，fp是花青，包括cy2、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5及cy7。因此，在特定实施例中，本公开提供式iv的聚合物偶联物，其中fp是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；其中r1至r4是氢；其中sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；其中hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或l-bs；其中l包含或是烷基链、fp或peg链；其中bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中w、x及z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)w+x+y+z的总和>20。在其它实施例中，bs/聚合物的比率是1，并且x+y+z的总和是30-80。在其它实施例中，hg1和hg2独立地表示氢、羧基芳基或l-bs。在替代性实施例中，hg1和hg2独立地表示卤素、硼羰基、羧基芳基或l-bs。除非上下文另外清楚说明，否则上文和本文所述的所有特征和实施例是可组合的。明确阐述的有关本文所描述的根据式i-iv的聚合物偶联物的特征和实施例的所有可能组合被涵盖在内且被认为是对相关的其它式的聚合物偶联物及关于单体组分所定义的本发明聚合物的公开。仅为简洁起见，并未明确陈述所有可能的组合，但这些组合对于本领域技术人员将是清楚且明显易于了解的。在另一方面，本公开提供一种检测样品中的分析物的方法，所述方法包括a)将所述样品与检测试剂在使所述检测试剂结合所述分析物的条件下组合，所述检测试剂包含本发明的聚合物偶联物或聚合物，确切地说，具有如本文所描述且进一步定义的式i-iv中任一个的结构的聚合物偶联物，或关于如本文所描述且进一步定义的单体组分所定义的聚合物；以及b)通过荧光检测所述检测试剂结合的分析物。本公开提供一种检测样品中的分析物的方法，所述方法包括a)将所述样品与包含具有式i结构的聚合物偶联物的检测试剂在使所述检测试剂结合所述分析物的条件下组合；以及b)通过荧光检测所述检测试剂结合的分析物，其中所述聚合物偶联物包含由a、b和c表示的三个单体单元，所述单体单元沿聚合物主链随机地分布；其中r1至r6独立地表示氢、烷基、聚乙二醇(peg)、芳基、杂芳基或通过连接基团偶联的生物基质(l-bs)；其中sg1至sg6独立地表示烷基、水溶性基团或l-bs；其中hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基、芳基、杂芳基或l-bs；并且其中x是6-100的整数并且y和z各自是独立地选自0-99的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是0.2-3，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和>10。另一方面，本公开提供一种检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：a)将所述样品与包含具有式ii结构的聚合物偶联物的检测试剂在使所述检测试剂结合所述分析物的条件下组合；以及b)通过荧光检测所述检测试剂结合的分析物，其中所述聚合物偶联物包含由d、e、f及g表示的四个单体单元，所述单体单元沿聚合物主链随机地分布；其中荧光团(fp)是具有比450nm长的最大吸收及比500nm长的最大发射并且荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中r1至r6独立地表示氢、烷基、peg、芳基、杂芳基或l-bs(如本文所定义)；其中sg1至sg7独立地表示烷基、水溶性基团或l-bs；其中hg1和hg2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基或l-bs；其中w是6-100的整数，x和z各自是独立地选自0-98的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是0.2-3，(2)w/(x+y+z)的比率>1，及(3)w+x+y+z的总和>10。另一方面，本公开另外提供一种检测样品中的分析物的方法，，所述方法包括a)将所述样品与包含具有式iii结构的聚合物偶联物的检测试剂在使所述检测试剂结合所述分析物的条件下组合；以及b)通过荧光检测所述检测试剂结合的分析物，其中所述聚合物偶联物包含由h、i和j表示的三个单体单元，所述单体单元沿聚合物主链随机地分布；其中r1至r4独立地表示氢、烷基、聚乙二醇(peg)、芳基、杂芳基或通过连接基团偶联的生物基质(l-bs)；其中sg1至sg6独立地表示烷基、水溶性基团或l-bs；其中hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基、芳基、杂芳基或l-bs；并且其中x、y及z各自是独立地选自0-100的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是0.2-3，及(2)x+y+z的总和>10。另一方面，本公开提供一种检测样品中的分析物的方法，所述方法包括a)将所述样品与包含具有式iv结构的聚合物偶联物的检测试剂在使所述检测试剂结合所述分析物的条件下组合；以及b)通过荧光检测所述检测试剂结合的分析物，其中所述聚合物偶联物包含由k、l、m及n表示的四个单体单元，所述单体单元沿聚合物主链随机地分布；其中荧光团(fp)是具有比450nm长的最大吸收及比500nm长的最大发射并且荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中r1至r4独立地表示氢、烷基、peg、芳基、杂芳基或l-bs(如本文所定义)；其中sg1至sg7独立地表示烷基、水溶性基团或l-bs；其中hg1和hg2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基或l-bs；其中w、x及z各自是独立地选自0-100的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是0.2-3，及(2)w+x+y+z的总和>10。对于本发明的所有聚合物偶联物和聚合物，各单体与所述单体构成的主聚合物链之间的连接的位置显示为从相关单体位置延伸的键结。在特定实施例中，单体单元彼此可以直接连接。因此，就单体单元之间的连接来说，如果所述连接是在两个芴单体之间(例如在式i的单体b与单体c之间)，则如以下实例中所示，所述连接是在一个单体的c7与另一单体的c2之间。如果连接是在两个芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯单体之间(例如在式iii的单体h与单体i之间)，则如以下实例中所示，所述连接是在一个单体的c2与另一单体的c8之间。在芴单体连接至芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯单体(例如式ii的单体d与单体e)的情况下，取决于单体顺序相对于hg1至hg2轴的取向，可能存在两种类型的连接。在一种取向上，连接是在芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯单体的c8与芴的c7之间进行，例如在单体顺序d-e中(从hg1末端至hg2末端)，如下文所示。同样，在另一取向上，芴单体与芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯单体之间的连接将在芴的c2与芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯的c2之间，例如在单体顺序e-d中(从hg1末端至hg2末端)，如以下实例中所示。出于参考目的，在本申请的
发明内容中提供了此处及通篇论述的芴核心结构和芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯基础结构的碳编号。本文所公开的聚合物偶联物的所有具体实施例加以必要修正可适用于本发明的方法。在一些实施例中，所述方法包括使用式i、ii、iii或iv的聚合物偶联物，或关于如本文所描述且进一步定义的单体组分所定义的聚合物，其中所述聚合物偶联物或聚合物中存在的一个或多个，乃至所有bs都是抗体。在特定实施例中，聚合物偶联物或聚合物中存在的一个或多个，乃至所有bs都是抗地高辛抗体。在替代性实施例中，所述聚合物偶联物或聚合物中存在的一个或多个，乃至所有bs独立地选自山羊抗小鼠igg抗体、山羊抗兔igg抗体、山羊抗人igg抗体、驴抗小鼠igg抗体、驴抗兔igg抗体、驴抗人igg抗体、鸡抗小鼠igg抗体、鸡抗兔igg抗体或鸡抗人igg抗体。在又其它实施例中，所述方法包括使用式i、ii、iii或iv的聚合物偶联物，或关于如本文所描述且进一步定义的单体组分所定义的聚合物，其中所述聚合物偶联物或聚合物中存在的一个或多个，乃至所有bs独立地选自抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、中性抗生物素蛋白、抗生物素蛋白dn或抗生物素蛋白d分子。在又其它实施例中，利用本文所公开的方法检测的分析物是在细胞表面上表达的靶蛋白。应注意，在本公开中并且特别是在权利要求书和/或段落中，术语如“包含(comprises/comprised/comprising)”等可以具有其在美国专利法中的含义；例如，这些术语可以指“包括(includes/included/including)”等；并且术语如“主要由…组成(consistingessentiallyof/consistsessentiallyof)”具有其在美国专利法中的含义，例如，这些术语允许存在未明确陈述的要素，但不包括现有技术中所发现或影响本发明的基本或新颖特征的要素。这些和其它实施例是通过以下详细描述公开或自以下详细描述显而易见且涵盖于以下详细描述中。附图说明从结合附图进行的说明性实施例的以下详细描述将更全面地理解本发明的实施例的前述和其它特征和优点，在附图中：图1.在pbs缓冲液(ph＝7.4)中的聚芴(虚线)和聚芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯(pfo，实线)的归一化吸收谱。pfo的吸收(消光系数＝3,500,000cm-1m-1)比聚芴(消光系数＝2,100,000cm-1m-1)强。pfo的吸收波长也比聚芴长。图2.在pbs缓冲液(ph＝7.4)中的聚芴(虚线)和聚芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯(pfo，实线)的归一化荧光谱。pfo的发射波长要长于聚芴的发射波长。图3.聚芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯偶联物的典型合成方法(参见实例1-66)。bs是生物基质。w、x、y及z表示主聚合物偶联物链内包含的单体单元的数量。fg是如表2中所列的用于偶联的官能团。fp是如表1中所列的荧光团。l是连接基团。图4.用鬼笔环肽和聚芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯的偶联物染色的细胞f-肌动蛋白(参见实例53)。在室温下，用含3-4％甲醛的pbs固定hela细胞10-30分钟。用pbs缓冲液洗涤固定的细胞3次。将0.1％triton添加至固定的细胞中以增加偶联物渗透性，保持10分钟。用pbs冲洗细胞3次。将5μlpfo-鬼笔环肽偶联物溶液(10μg/ml)添加至固定的细胞(100微升/孔，96孔板)中。在室温下培育细胞20至90分钟，并用pbs轻轻地冲洗3次以去除过量的鬼笔环肽偶联物，随后使其在荧光显微镜下显像。图5.superdex200sec纯化cy3.5-pfo串联物mcd8a抗体偶联物(参见实例64和65)。收集第一洗脱峰作为纯化的产物，约13ml的较大od280峰是游离抗体。图6.在s200sec纯化之后对cy3.5-pfo串联物-mcd8a抗体偶联物再进行蛋白质g亲和纯化(参见实例64)。游离聚合物，即未与mcd8a抗体偶联的聚合物，在前几个柱体积中洗脱，并且偶联物在较低ph条件下从约12ml开始洗脱。图7.用抗小鼠cd8a(克隆53-6.7)抗体与pfo的偶联物对小鼠脾细胞染色并通过流式细胞术分析。在相同条件下，分别用cy3.5-pfo串联物与大鼠抗小鼠cd8a(克隆53-6.7)抗体的偶联物或用bdhorizontmbv605大鼠抗小鼠cd8(克隆53-6.7，购自bdbioscience)对单细胞悬浮液染色。cy3.5-pfo串联物与大鼠抗小鼠cd8a的偶联物是如实例64中所描述制备。在2-8℃下对细胞悬浮液染色30分钟，洗涤一次，接着如实例67和68中所描述，使用405nm激光线激发和605/40带通滤光器，通过流式细胞术进行分析。cy3.5-pfo串联物与大鼠抗小鼠cd8a的偶联物(图7：标记b)展示的信号比基于聚芴的bdhorizontmbv605大鼠抗小鼠cd8(图7：标记a)的信号强。图8.利用山羊抗小鼠igg与聚芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯的偶联物使hela细胞中的微管蛋白荧光显像(参见实例59)。用4％甲醛固定hela细胞。将小鼠抗微管蛋白与固定的细胞一起培育。在一次培育之后，用5体积染色缓冲液冲洗细胞并短暂离心3-5分钟。接着，将细胞与浓度在10-500nm范围内的山羊抗小鼠igg-pfo聚合物偶联物一起培育30-60分钟。在二次培育之后，用3-5体积染色缓冲液冲洗细胞并短暂离心3-5分钟。用olympus荧光显微镜使细胞显像。具体实施方式所有现有的水溶性聚芴聚合物都是基于未取代的芴，因为所需要的关键中间物无法商购得到。尚无有关被取代的芴聚合物的生物应用的研究。美国专利第8,598,306号(marymckiernan和jonathanpillow)公开了假定的芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯单体。然而，由于几个原因，所述单体与此发明不相关。(1).本领域技术人员不能使用marymckiernan和jonathanpillow描述的单体制备有用的生物聚合物。marymckiernan和jonathanpillow专门设计用于电子装置(例如oled)的聚合物具有极高疏水性。由假定的芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯单体产生的聚合物不可溶于水中，因此不能被用于始终需要含水环境的生物系统中。(2).显而易见的是，利用marymckiernan和jonathanpillow公开的方法甚至无法制备出假定的芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯单体。美国专利第8,598,306号公开了由alcl3和bf3催化的合成方法。在这些条件下，氧杂环庚三烯环将会被破坏。(3).marymckiernan和jonathanpillow未描述有关假定的芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯聚合物的光谱和生物研究。(4).marymckiernan和jonathanpillow的假定的芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯聚合物由于至少三个原因而无法与生物基质偶联。(a).marymckiernan和jonathanpillow的假定的聚合物没有供连接至生物基质的生物相容性官能团。(b).其极弱的水溶性使得由假定的芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯聚合物产生的任何生物偶联物毫无价值。(c).由于所有的生物偶联物都被用于含水系统中，故假定的芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯聚合物聚集使得不可能探究其生物应用。在更详细地描述本发明之前，应理解，本发明不限于所描述的特定方法、装置、溶液或设备，因此方法、装置、溶液或设备当然可以变化。还应理解，本文中所用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的，并不打算限制本发明的范围。除非本文中另外定义，否则结合本发明使用的科学与技术术语将具有所属领域的技术人员通常所理解的含义。术语的含义和范围应该是明确的；然而，如果存在任何潜在不明确性，则本文提供的定义优先于任何词典或外来定义。除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个(种)(a/an)”以及“所述”包括多个(种)指示物。因此，例如提到“一个探针”包括多个探针等等。此外，除非上下文另外明确规定，否则使用特定的复数形式，如“二”、“三”等应理解为较大数量的相同对象。除非上下文另外明确规定，否则术语如“连接”、“附接”、“偶联”及“键联(linked)”在本文中可互换地使用并且涵盖直接以及间接连接、附接、键联或偶联。如本文所使用，术语“聚合物偶联物”和“偶联的聚合物”是指与如本文所定义的生物基质直接或间接连接、附接、键联或偶联的本发明的聚合物。本文中提到的所有出版物都以引用的方式并入本文中以达到公开和描述所引用的参考文献所涉及的特定材料和方法的目的。本文中论述的出版物仅仅提供其在本申请的申请日之前的公开内容。不应将本文中的任何内容理解为承认本发明无权先于在先发明的这些公开内容。在创造本发明时，尝试了针对芴聚合物的多种化学修饰以便研究其生物检测应用。已经注意到，在1、2、3、6、7及8位处的任何取代会明显降低所得聚合物偶联物的荧光强度。此外，这些被取代的芴聚合物偶联物也具有较差水溶性。研究集中在4位和5位。最初有关在4位和5位处的不同取代和不同交联的研究未能产生所希望的聚合物。4位和5位的卤化、烷基化、氨基化以及4位和5位与5元、6元及8元基团的交联产生非所需的芴聚合物偶联物。然而，基于芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯的聚合物偶联物出乎意料地产生所希望的生物特性。已发现，这些聚合物偶联物具有以下有利特性：(1)高荧光量子产率；(2)红移发射；(3)高水溶性；(4)高线性；(5)高平面度；(6)当第二荧光团与聚合物偶合时的高荧光共振能量转移(fret)效率；以及(7)较高的光稳定性。已发现芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯聚合物出乎意料地缓解了
背景技术：
部分中论述的问题，并且当与蛋白质、核酸及其它生物聚合物偶联时，产生具有明显较高荧光度的荧光聚合物偶联物。本发明的聚合物-生物分子偶联物的荧光强度增强使得分析的灵敏度增大。此外，本公开提供的聚合物偶联物典型地展现约405nm的吸光度最大值，因此，可以选择这些聚合物偶联物匹配紫光激光器(405nm)的主要发射线。本发明的一些聚合物偶联物展现极长波长的发射，使其特别适用于对红外波长透明的样品。本公开提供了包含基于芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯的聚合物偶联物的聚合物偶联物。这些生物偶联物被用于定位或检测样品中分析物或配体的相互作用或存在。还涵盖并入此类聚合物或聚合物偶联物以用于本文所公开的方法中的试剂盒。因此，本公开提供了包含基于芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯的聚合物偶联物的聚合物偶联物，所述聚合物偶联物含有：1)聚芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯；以及任选地，2)生物基质(bs)。本发明的聚合物偶联物典型地具有式i的结构：其中所述聚合物偶联物包含由a、b和c表示的三个单体单元，所述单体单元沿聚合物主链随机地分布；其中r1至r6独立地表示氢、烷基、聚乙二醇(peg)、芳基、杂芳基或通过连接基团偶联的生物基质(l-bs)；其中sg1至sg6独立地表示烷基、水溶性基团或l-bs；其中hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基、芳基、杂芳基或l-bs；并且其中x是6-100的整数并且y和z各自是独立地选自0-99的整数，条件是(1)当生物基质存在于式i内的一个或多个位置时，bs/聚合物的比率是0.2-3，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和>10。如本文所使用，术语“烷基”(单独或与另一个或多个术语组合)意思指典型地含有1至15个碳原子，如1至10个、1至8个、1至6个或1至4个碳原子的直链或分支链饱和烃基取代基。“cn烷基”是指含有n个碳原子的脂肪族基团。举例来说，c1-c10烷基含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。与烷基的附接是通过碳原子实现。此类取代基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基(分支或非分支)、己基(分支或非分支)、庚基(分支或非分支)辛基(分支或非分支)、壬基(分支或非分支)及癸基(分支或非分支)。术语“烷基”还包括环烷基，意思是典型地含有3至14个碳环原子的饱和环状烃取代基。环烷基可以是典型地含有3至8个碳环原子并且更典型地含有3至6个环原子的单一碳环。应理解，与环烷基的附接是通过环烷基的环原子实现。单环环烷基的实例包括环丙基(环丙烷基)、环丁基(环丁烷基)、环戊基(环戊烷基)、环己基(环己烷基)。环烷基可以替代地为多环基团或含有多于一个环。多环环烷基的实例包括桥连、稠合及螺环环烷基。在螺环环烷基中，一个原子是两个不同环共用的。螺环环烷基的实例是螺戊烷基。在桥连环烷基中，环共有至少两个共用的不相邻原子。桥连环烷基的实例包括双环[2.2.1]庚基、双环[2.2.1]庚-2-烯基及金刚烷基。在稠环环烷基系统中，两个或更多个环可以稠合在一起，由此两个环共有一个共用键。双环或三环稠环环烷基的实例包括萘基、四氢萘基(萘满基)、茚基、茚满基(二氢茚基)、蒽基、菲基及十氢萘基。如本文所使用，“聚乙二醇(peg)”基团是本领域中众所周知的并且是由环氧乙烷单体单元构成的可变链长的聚合物，其基团可以由下式表示：-(o-ch2-ch2)n-oh。在特定实施例中，n＝8-20。在优选实施例中，n＝12。所述术语包括分支链peg、星形peg及梳状peg，这些都是本领域中已知的。用于本发明中的peg基团的具体实例是peg6-peg18。如本文所使用，术语“芳基”(单独或与另一个或多个术语组合)意思指含有6至14个碳环原子，或3至8个、3至6个或5至6个碳环原子的芳香族环烷基。芳基可以是单环或多环的(即，可以含有多于一个环)。就多环芳香环而言，需要多环系统中仅一个环是不饱和的，而其余环可以是饱和、部分饱和或不饱和的。与芳基的附接是通过环中所含的碳原子实现。芳基的实例包括苯基、萘基、茚基、茚满基及四氢萘基。如本文所使用，术语“杂芳基”(单独或与另一个或多个术语组合)意思指至少一个环原子是杂原子(即，氧、氮或硫)的芳基。杂芳基可以是单环或者2个或3个环稠合的环。杂芳基取代基的实例包括6元环取代基，如吡啶基、吡唑基、嘧啶基、哒嗪基及1,3,5-、1,2,4-或1,2,3-三嗪基；5元环取代基，如咪唑基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、1,2,3-、1,2,4-、1,2,5-或1,3,4-噁二唑基及异噻唑基；6/5元稠环取代基，如苯并硫代呋喃基、苯并异噁唑基、苯并噁唑基、嘌呤基；以及6/6元稠环，如苯并吡喃基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹唑啉基及苯并噁嗪基。如本文所使用，“hg1”和“hg2”表示聚合物偶联物的末端并且它们独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基、芳基、杂芳基或l-bs(如本文所定义)。“生物基质”如本文中别处所定义。如本文所使用，“水溶性基团”包括亲水性官能团。亲水性官能团被用于增加或增大聚合物于水中的溶解性。本文所描述的聚合物在如本文中所描述的一个或多个单体处包括一个或多个水溶性基团，即亲水性官能团，以便赋予聚合物足够的水溶性，由此有助于其在含水环境中发挥作用。可用于产生如本文中所描述的水溶性偶联聚合物的示例性水溶性基团以及如用于偶联聚合物的水溶性的概念描述于liu等人,《材料化学(chem.mater.)》,2004,16(23),第4467-4476页及feng等人,《化学评论》,2010,39,第2411-2419页中，这些文献各自以全文引用的方式并入本文中。“水溶性基团”或亲水性官能团的具体实例包括peg基团、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基。如本文所使用，术语“卤素”或“卤代”是指选自氯、氟、溴及碘的基团。如本文所使用，术语“磺酰基”或“磺基”意思指磺酸取代基(-s(o)2oh)或磺酸的盐(磺酸盐)。所述术语包括磺酸基团，其中磺酰基的oh被另一取代基置换。类似地，“羧基”意思指甲酸取代基或甲酸盐。如本文所使用，“膦酰基”意思指膦酸取代基并且包括膦酸盐。所述术语还包括膦酰基，如-p(o)(r1)r2，其中r1和r2各自是另一取代基，如烷基，其中r1和r2可以相同或不同。如本文所使用，“硼羰基”意思指硼酸并且包括硼酸盐。所述术语包括式-b(r)oh、-b(r1)or2或-b(r)2的基团，其中r1和r2各自是另一取代基，如烷基，其中r1和r2可以相同或不同。如本文所使用，除非另外说明，否则取代基如烷基、烷氧基、芳基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、三烷基铵(-n+(r1)(r2)(r3)，其中r1-r3各自是相同或不同的烷基)或全氟烷基的烷基部分任选地是饱和、不饱和、直链或分支链的，并且所有烷基、烷氧基、烷基氨基及二烷基氨基取代基本身任选地被羧基、磺基、氨基或羟基进一步取代。如本文所使用，术语“氨基”是指-nh2基团。氨基可以任选地被一个或多个相同或不同的取代基取代(“被取代的氨基”)。氨基取代基可以是但不限于烷基、芳基和/或杂环基。如本文所使用，术语“烷氧基”是指-o-烷基。烷氧基可以指直链、分支链或环状饱和或不饱和烃链，包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基及戊氧基。烷氧基可以任选地一个或多个取代基被取代(“被取代的烷氧基”)。术语“羟基”是指-oh基团。在根据所有相关方面的特定实施例中，选自a-c的单体单元彼此以任何单体单元顺序直接连接(如本文中别处所描述)。在特定实施例中，连接基团包含烷基、peg、羧酰胺、硫醚、酯、亚胺、肼、肟、烷基胺、醚、芳基胺、硼酸酯、n-酰基脲或酸酐、铂络合物、氨基三嗪、三嗪基醚、脒、脲、氨基甲酸酯、硫脲、亚磷酸酯、硅烷基醚、磺酰胺、磺酸酯、1,2,3-三唑、哒嗪、噻唑烷、2-二苯基膦酰基-苯甲酰胺、异噁唑或琥珀酰亚胺基。在优选实施例中，连接基团包含或是烷基或peg基团。对于包含多个连接基团的实施例，连接基团可以相同或不同。在优选实施例中，r1至r6独立地表示氢、甲基或乙基；sg1至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；x是11-80的整数并且y和z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，r1至r6是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；x是11-80的整数并且y和z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，r1至r6是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；x是11-80的整数并且y和z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，r1至r6是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基，或l-bs；x是11-80的整数并且y和z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，r1至r6是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、磺酰基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基或l-bs；x是11-80的整数并且y和z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，r1至r6是氢；其中sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、膦酰基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基，或l-bs；x是11-80的整数并且y和z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，r1至r6是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基，或l-bs；x是11-80的整数并且y和z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，r1至r6是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基，或l-bs；x是16-80的整数并且y和z各自是独立地选自0-64的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和是30-80。在其它优选实施例中，r1至r6是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、磺酰基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基或l-bs；x是16-80的整数并且y和z各自是独立地选自0-64的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和是30-80。在其它优选实施例中，r1至r6是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、膦酰基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基，或l-bs；x是16-80的整数并且y和z各自是独立地选自0-64的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和是30-80。在其它优选实施例中，r1至r6是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基，或l-bs；x是16-80的整数并且y和z各自是独立地选自0-64的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1，(2)x/(y+z)的比率>1，及(3)x+y+z的总和是30-80。一个优选实施例是式ii的化合物：其中所述聚合物偶联物包含由d、e、f及g表示的四个单体单元，所述单体单元沿聚合物主链随机地分布；其中荧光团(fp)是具有比450nm长的最大吸收及比500nm长的最大发射并且荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中r1至r6独立地表示氢、烷基、peg、芳基、杂芳基或l-bs(如本文所定义)；其中sg1至sg7独立地表示烷基、水溶性基团或l-bs；其中hg1和hg2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基或l-bs；其中w是6-100的整数并且x和z各自是独立地选自0-98的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)当生物基质存在于式ii内的一个或多个位置时，bs/聚合物的比率是0.2-3，(2)w/(x+y+z)的比率>1，及(3)w+x+y+z的总和>10。在根据所有相关方面的特定实施例中，选自d-g的单体单元彼此以任何单体单元顺序直接连接(如本文中别处所描述)。在特定实施例中，连接基团包含烷基、peg、fp、羧酰胺、硫醚、酯、亚胺、肼、肟、烷基胺、醚、芳基胺、硼酸酯、n-酰基脲或酸酐、铂络合物、氨基三嗪、三嗪基醚、脒、脲、氨基甲酸酯、硫脲、亚磷酸酯、硅烷基醚、磺酰胺、磺酸酯、1,2,3-三唑、哒嗪、噻唑烷、2-二苯基膦酰基-苯甲酰胺、异噁唑或琥珀酰亚胺基。在优选实施例中，连接基团包含或是烷基、peg基团或fp。对于包含多个连接基团的实施例，连接基团可以相同或不同。在优选实施例中，fp是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；r1至r6独立地表示氢、甲基或乙基；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；w是11-80的整数并且x和z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)w/(x+y+z)的比率>1，及(3)w+x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，fp是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；r1至r6独立地表示氢、甲基或乙基；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；w是11-80的整数并且x和z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)w/(x+y+z)的比率>1，及(3)w+x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，fp是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；r1至r6是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；w是11-80的整数并且x和z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)w/(x+y+z)的比率>1，及(3)w+x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，fp是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；r1至r6是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；w是11-80的整数并且x和z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)w/(x+y+z)的比率>1，及(3)w+x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，fp是荧光素、罗丹明、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯或酞菁；r1至r6是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；w是11-80的整数并且x和z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)w/(x+y+z)的比率>1，及(3)w+x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，fp是荧光素、罗丹明、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯或酞菁；r1至r6是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；w是11-80的整数并且x和z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，(2)w/(x+y+z)的比率>1，及(3)w+x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，fp是荧光素、罗丹明、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯或酞菁；r1至r6是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；w是16-79的整数并且x和z各自是独立地选自0-63的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1，(2)w/(x+y+z)的比率>1，及(3)w+x+y+z的总和是30-80。在其它优选实施例中，fp是荧光素、罗丹明、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯或酞菁；r1至r6是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；w是16-79的整数并且x和z各自是独立地选自0-63的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1，(2)w/(x+y+z)的比率>1，及(3)w+x+y+z的总和是30-80。在其它优选实施例中，fp是选自表1的荧光染料；r1至r6是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；w是16-79的整数并且x和z各自是独立地选自0-63的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1，(2)w/(x+y+z)的比率>1，及(3)w+x+y+z的总和是30-80。在其它优选实施例中，fp是选自表1的荧光染料；r1至r6是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；w是16-79的整数并且x和z各自是独立地选自0-63的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1，(2)w/(x+y+z)的比率>1，及(3)w+x+y+z的总和是30-80。一个优选实施例是式iii的化合物：其中所述聚合物偶联物包含由h、i和j表示的三个单体单元，所述单体单元沿聚合物主链随机地分布；其中r1至r4独立地表示氢、烷基、聚乙二醇(peg)、芳基、杂芳基或通过连接基团偶联的生物基质(l-bs)；其中sg1至sg6独立地表示烷基、水溶性基团或l-bs；其中hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基、芳基、杂芳基或l-bs；并且其中x、y及z各自是独立地选自0-100的整数，条件是(1)当生物基质存在于式iii内的一个或多个位置时，bs/聚合物的比率是0.2-3，及(2)x+y+z的总和>10。在根据所有相关方面的特定实施例中，选自h-j的单体单元彼此以任何单体单元顺序直接连接(如本文中别处所描述)。在特定实施例中，连接基团包含烷基、peg、羧酰胺、硫醚、酯、亚胺、肼、肟、烷基胺、醚、芳基胺、硼酸酯、n-酰基脲或酸酐、铂络合物、氨基三嗪、三嗪基醚、脒、脲、氨基甲酸酯、硫脲、亚磷酸酯、硅烷基醚、磺酰胺、磺酸酯、1,2,3-三唑、哒嗪、噻唑烷、2-二苯基膦酰基-苯甲酰胺、异噁唑或琥珀酰亚胺基。在优选实施例中，连接基团包含或是烷基或peg基团。对于包含多个连接基团的实施例，连接基团可以相同或不同。在优选实施例中，r1至r4独立地表示氢、甲基或乙基；sg1至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；并且x、y及z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，r1至r4是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；并且x、y及z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，r1至r4是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；并且x、y及z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，r1至r4是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基，或l-bs；并且x、y及z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，r1至r4是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、磺酰基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基，或l-bs；并且x、y及z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，r1至r4是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、膦酰基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基，或l-bs；并且x、y及z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，r1至r4是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基，或l-bs；并且x、y及z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，r1至r4是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、羧基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基，或l-bs；并且x、y及z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1，及(2)x+y+z的总和是30-80。在其它优选实施例中，r1至r4是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、磺酰基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基，或l-bs；并且x、y及z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1，及(2)x+y+z的总和是30-80。在其它优选实施例中，r1至r4是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、膦酰基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基，或l-bs；并且x、y及z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1，及(2)x+y+z的总和是30-80。在其它优选实施例中，r1至r4是氢；sg1和sg2是peg；sg3至sg6独立地表示peg、烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基，或l-bs；并且x、y及z各自是独立地选自0-80的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1，及(2)x+y+z的总和是30-80。一个优选实施例是式iv的化合物：其中所述聚合物偶联物包含由k、l、m及n表示的四个单体单元，所述单体单元沿聚合物主链随机地分布；其中荧光团(fp)是具有比450nm长的最大吸收及比500nm长的最大发射并且荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中r1至r4独立地表示氢、烷基、peg、芳基、杂芳基或l-bs(如本文所定义)；其中sg1至sg7独立地表示烷基、水溶性基团或l-bs；其中hg1和hg2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基或l-bs；其中w、x及z各自是独立地选自0-100的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)当生物基质存在于式iv内的一个或多个位置时，bs/聚合物的比率是0.2-3，及(2)w+x+y+z的总和>10。在根据所有相关方面的具体实施例中，选自k-n的单体单元彼此以任何单体单元顺序直接连接(如本文中别处所描述)。在特定实施例中，连接基团包含烷基、peg、fp、羧酰胺、硫醚、酯、亚胺、肼、肟、烷基胺、醚、芳基胺、硼酸酯、n-酰基脲或酸酐、铂络合物、氨基三嗪、三嗪基醚、脒、脲、氨基甲酸酯、硫脲、亚磷酸酯、硅烷基醚、磺酰胺、磺酸酯、1,2,3-三唑、哒嗪、噻唑烷、2-二苯基膦酰基-苯甲酰胺、异噁唑或琥珀酰亚胺基。在优选实施例中，连接基团包含或是烷基、peg基团或fp。对于包含多个连接基团的实施例，连接基团可以相同或不同。式i-iv的聚合物偶联物的单体单元沿聚合物主链随机地分布。因此，这些单体单元可以按任何顺序存在于整个聚合物主链中。在特定实施例中，单体单元还可以彼此直接连接。也就是说，以式i为例，尽管聚合物主链被描绘为单体单元顺序是a-b-c(沿hg1末端至hg2末端的方向)，但这只是出于说明的目的，并且单体单元的顺序可以按任何次序。这是因为根据本发明的聚合物中组分单体的顺序实际上是完全随机的(例如，沿hg1末端至hg2末端的方向，特定的三个单体顺序实际上可以是如a-b-c、a-c-b、c-b-a、c-a-b、b-a-c、b-c-a等中的任一个)。各单体与主聚合物链之间连接的位置显示为从相关单体位置延伸的键结。因此，如果连接是在两个芴单体(例如式i的单体b与c)之间，则所述连接是在一个单体的c7与另一单体的c2之间。如果连接是在两个芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯单体(例如式iii的单体h与i)之间，则所述连接是在一个单体的c2与另一单体的c8之间。在芴单体连接至芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯单体(例如式ii的单体d与单体e)的情况下，取决于单体顺序相对于hg1至hg2轴的取向，可能存在两种类型的连接。在一种取向上，连接是在芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯单体的c8与芴的c7之间进行，例如在单体顺序d-e中(从hg1末端至hg2末端)。同样，在另一取向上，芴单体与芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯单体之间的连接将在芴的c2与芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯的c2之间，例如在单体顺序e-d中(从hg1末端至hg2末端)。出于参考目的，在本申请的
发明内容中提供了此处及通篇论述的芴核心结构和芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯基础结构的碳编号。各单体之间的直接连接保持了聚合物偶联物的紫光激光器可激发功能。在优选实施例中，fp是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；r1至r4独立地表示氢、甲基或乙基；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；其中w、x及z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)w+x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，fp是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；r1至r4独立地表示氢、甲基或乙基；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中w、x及z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)w+x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，fp是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；r1至r4是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；w、x及z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)w+x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，fp是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；r1至r4是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；w、x及z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)w+x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，fp是荧光素、罗丹明、花青、氟硼荧、方酸、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯或酞菁；r1至r4是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；w、x及z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)w+x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，fp是荧光素、罗丹明、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯或酞菁；r1至r4是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；w、x及z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1-2，及(2)w+x+y+z的总和>20。在其它优选实施例中，fp是荧光素、罗丹明、花青、氟硼荧、方酸、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯或酞菁；r1至r4是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；w、x及z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1，及(2)w+x+y+z的总和是30-80。在其它优选实施例中，fp是荧光素、罗丹明、花青、氟硼荧、方酸、香豆素、苝二酰亚胺、二酮基吡咯并吡咯或酞菁；r1至r4是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；w、x及z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1，及(2)w+x+y+z的总和是30-80。在其它优选实施例中，fp是选自表1的荧光染料；r1至r4是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；w、x及z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1，及(2)w+x+y+z的总和是30-80。在其它优选实施例中，fp是选自表1的荧光染料；r1至r4是氢；sg1至sg7独立地表示peg、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；hg1和hg2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或l-bs；l包含或是烷基链、fp或peg链；bs是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；w、x及z各自是独立地选自0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)bs/聚合物的比率是1，及(2)w+x+y+z的总和是30-80。连接至本发明聚合物的荧光团(fp)典型地是具有比450nm长的最大吸收及比500nm长的最大发射并且荧光量子产率大于10％的荧光染料。它们典型地选自香豆素、荧光素、罗丹明、花青、氟硼荧或其它多环芳香族化合物。其中有许多是可商购的，如表1中作为一些非限制性实例选择性列出的那些。表1.可以连接至pfo聚合物的典型荧光团在本发明的一个方面，烷基羧基是由式v表示：-(ch2)ncoow式v其中n是1-20，w是氢、碱金属离子、铵或其它生物相容性平衡离子。在本发明的一个方面，烷基磺酸酯是由式vi表示：-(ch2)ns(＝o)2ow式vi其中n是2-10，w是氢、碱金属离子、铵或其它生物相容性平衡离子。在本发明的一个方面，烷基膦酸酯是由式vii表示：-(ch2)np(＝o)o2w2式vii其中n是2-10，w是氢、碱金属离子、铵或其它生物相容性平衡离子。在本发明的一个方面，烷基铵是由式viii表示：-(ch2)n-n(r3)x式viii其中n是1-20，r是短链烷基(例如c1-c12烷基)；x是生物相容性阴离子，如f-、cl-、br-或i-。在本发明的一个方面，连接基团l是由式ix表示：-(ch2)n-式ix其中n是1-20。在本发明的一个方面，连接基团l是由式x表示：-(och2ch2o)n-式x其中n是2-20。本发明化合物的许多实施例具有总体电子电荷。应理解，当显示存在此类电子电荷时，这些电子电荷是通过适当抗衡离子的存在来平衡，所述抗衡离子可以或可以不明确标识。一些应用中优选的生物相容性相对离子在生物应用中是无毒的，并且对于生物分子基本上无有害作用。当本发明化合物带正电时，抗衡离子典型地选自但不限于氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、烷烃磺酸根、芳基磺酸根、磷酸根、过氯酸根、四氟硼酸根、四芳基硼离子、硝酸根及芳香族或脂肪族羧酸的阴离子。当本发明化合物带负电时，抗衡离子典型地选自但不限于碱金属离子、碱土金属离子、过渡金属离子、铵或被取代的铵或吡啶鎓离子。优选的是，任何所需的抗衡离子都具有生物相容性，在使用时无毒并且对生物分子基本上无有害作用。抗衡离子容易通过本领域中众所周知的方法，如离子交换色谱法或选择性沉淀来改变。应理解，已经以一种或另一种特定的电子共振结构描绘本发明的聚合物偶联物。本发明的每一方面同等地适用于形式上以其它容许的共振结构绘制的聚合物偶联物，因为主题聚合物偶联物上的电子电荷在整个聚合物偶联物本身中是离域的。在本发明的特定实施例中，聚合物偶联物含有至少一个l-bs，由此涵盖l-fp-bs，其中bs通过任何适合的反应附接至聚合物。根据本发明，bs典型地通过共价键联偶联至聚合物。一些此类众所周知的反应例如列于表2中。在某些实施例中，将聚合物附接至bs的共价键联含有充当连接基团(l)的多个中间原子。在一些实施例中，连接基团可以并入fp，由此产生l-fp-bs。聚合物可以用于标记多种生物、有机或无机物质，这些物质含有或被修饰成含有具有适合反应性的官能团，由此引起偶联物质的化学附接。表2.用于制备l-bs或fp-bs的共价键联的官能团的实例用于将聚合物附接至欲偶联的生物基质的键联的选择典型地取决于欲偶联的生物基质上的官能团及所希望的共价键联的类型或长度。典型地存在于有机或无机生物基质上的官能团的类型包括但不限于：胺、酰胺、硫醇、醇、酚、醛、酮、膦酸酯、咪唑、肼、羟胺、双取代的胺、卤化物、环氧化物、羧酸酯、磺酸酯、嘌呤、嘧啶、羧酸、烯系键、叠氮化合物、炔烃、四嗪或这些基团的组合。生物基质上可能存在单一类型的反应性位点(典型地，对于多糖而言)，或者典型地对于蛋白质而言，可能存在多个位点(例如胺、硫醇、醇、酚)。偶联的生物基质可以偶联至多于一种相同或不同的聚合物偶联物，或偶联至另外通过半抗原如生物素修饰的生物基质。或者，可以将多种基质偶联至单一聚合物。尽管通过小心地控制反应条件可以获得一定选择性，但标记选择性最佳通过选择适当的反应性聚合物偶联物获得。典型地，本发明的聚合物将与作为例如生物基质的取代基或一部分的胺、硫醇、醇、醛或酮反应。优选本发明的聚合物能够与胺、硫醇官能团或可点击基团(clickablegroup)反应。在一些实施例中，聚合物的官能团是丙烯酰胺、反应性胺(包括尸胺或乙二胺)、羧酸的活性酯(典型地，羧酸的琥珀酰亚胺酯)、酰基叠氮化物、酰基腈、醛、烷基卤化物、酸酐、苯胺、芳基卤化物、叠氮化物、氮丙啶、硼酸酯、羧酸、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼(包括酰肼)、酰亚胺酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、顺丁烯二酰亚胺、氨基磷酸酯、反应性铂络合物、磺酰基卤化物、四嗪、叠氮化物、炔烃或硫醇基。“反应性铂络合物”特指化学反应性铂络合物，如美国专利第5,580,990号、第5,714,327号及美国专利第5,985,566号。当聚合物的官能团是光可活化基团，如叠氮化物、二氮杂环丙烯基、叠氮基芳基或补骨脂素衍生物时，聚合物只有在用适当波长的光照射之后才具有化学反应性。当聚合物的官能团是羧酸的活性酯时，反应性聚合物特别适用于制备蛋白质、核苷酸、寡核苷酸或半抗原的聚合物偶联物。当聚合物的官能团是顺丁烯二酰亚胺或卤代乙酰胺时，反应性聚合物特别适用于偶联至含硫醇的生物基质。当聚合物的官能团是酰肼时，反应性聚合物特别适用于偶联至高碘酸盐氧化的碳水化合物及糖蛋白，并且还是细胞显微注射的醛固定性极性示踪剂。当聚合物的官能团是可点击基团时，反应性聚合物特别适用于偶联至互补的可点击基质。优选的是，聚合物的官能团是羧酸、羧酸的琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰胺、肼、异硫氰酸酯、顺丁烯二酰亚胺基、脂肪族胺、全氟苯甲酰胺基、叠氮基全氟苯甲酰胺基或补骨脂素。更优选的是，聚合物的官能团是羧酸的琥珀酰亚胺酯、顺丁烯二酰亚胺、碘代乙酰胺或反应性铂络合物。基于以上所提到的属性，本发明的适当反应性聚合物被选择用于制备所希望的聚合物偶联物，其有利特性使其适用于多种应用。特别有用的聚合物偶联物尤其包括生物基质是肽、核苷酸、抗原、类固醇、维生素、药物、半抗原、代谢物、毒素、环境污染物、氨基酸、蛋白质、核酸、核酸聚合物(如寡核苷酸)、碳水化合物、脂质或离子络合部分的偶联物。或者，生物基质是细胞、细胞系统、细胞片段或亚细胞粒子(例如尤其)、病毒粒子、细菌粒子、病毒组分、生物细胞(如动物细胞、植物细胞、细菌、酵母或原生生物)或细胞组分。反应性聚合物典型地标记在细胞表面处、在细胞膜、细胞器或细胞质中的官能团。典型地，生物基质是氨基酸、肽、蛋白质、酪胺、多糖、离子络合部分、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组装物(lipidassembly)、聚合物、聚合物微粒、生物细胞或病毒。更典型地，生物基质是肽、蛋白质、核苷酸、寡核苷酸或核酸。当将本发明的聚合物偶联物偶联至此类生物聚合物时，每分子可并入较多聚合物以增大荧光信号。对于聚合物-抗体偶联物，优选一个聚合物/抗体。在特定实施例中，生物基质是氨基酸(包括受保护或被膦酸酯、碳水化合物或c1至c25羧酸取代的那些)或是氨基酸聚合物，如肽或蛋白质。优选肽偶联物含有至少五个氨基酸，更优选含有5至36个氨基酸。优选肽包括但不限于神经肽、细胞因子、毒素、蛋白酶底物及蛋白激酶底物。优选的蛋白质偶联物包括酶、抗体、凝集素、糖蛋白、组蛋白、白蛋白、脂蛋白、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、蛋白质a、蛋白质g、藻胆蛋白及其它荧光蛋白、激素、毒素、趋化因子及生长因子。在一个优选方面，偶联的蛋白质是聚合物抗体偶联物。在本发明的一个方面，偶联的生物基质可以是抗体(包括完整抗体、抗体片段及抗体血清等)、氨基酸、血管生长抑素或内皮抑制素、抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素、生物素(例如酰胺基生物素、生胞素(biocytin)、脱硫生物素等)、血液成分蛋白质(例如白蛋白、血纤维蛋白原、纤维蛋白溶酶原等)、葡聚糖、酶、酶抑制剂、igg结合蛋白(例如蛋白质a、蛋白质g、蛋白质a/g等)、荧光蛋白质(例如藻胆蛋白、水母发光蛋白、绿色荧光蛋白等)、生长因子、激素、凝集素(例如麦胚凝集素、刀豆素a等)、脂多糖、金属结合蛋白(例如钙调蛋白等)、微生物或其部分(例如细菌、病毒、酵母等)、神经肽及其它生物活性因子(例如皮啡肽、deltropin、内吗啡肽、内啡肽、肿瘤坏死因子等)、非生物微粒(例如铁磁流体、金、聚苯乙烯等)、核苷酸、寡核苷酸、肽毒素(例如蜂毒明肽、金环蛇毒、鬼笔环肽等)、磷脂结合蛋白(例如膜联蛋白等)、小分子药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)等)、结构蛋白(例如肌动蛋白、纤维结合蛋白、层粘连蛋白、微管相关蛋白、微管蛋白等)或酪酰胺。另一方面，生物基质可以是核酸碱基、核苷、核苷酸或核酸聚合物，包括被修饰成具有额外连接基团或间隔基以附接本发明的聚合物偶联物的那些，所述连接基团或间隔基如炔基键联(美国专利第5,047,519号)、氨基烯丙基键联(美国专利第4,711955号)或杂原子取代的连接基团(美国专利第5,684,142号)或其它键联。在其它实施例中，偶联的生物基质是核苷或核苷酸类似物，其通过非环状间隔基将嘌呤或嘧啶碱基连接至磷酸酯或聚磷酸酯部分。在其它实施例中，聚合物偶联物典型地通过羟基，而且另外通过硫醇或氨基偶联至核苷酸或核苷的碳水化合物部分(美国专利第5,659,025号、第5,668,268号、第5,679,785号)。典型地，偶联的核苷酸是三磷酸核苷或三磷酸脱氧核苷或三磷酸双脱氧核苷。在磷酸酯或聚磷酸酯部分中并入亚甲基部分或者氮或硫杂原子也是有用的。非嘌呤和非嘧啶碱基如7-脱氮嘌呤(美国专利第6,150,510号)及含有此类碱基的核酸也可以偶合至本发明的聚合物偶联物。通过使脱嘌呤的核酸与胺、酰肼或羟胺衍生物反应制备的核酸加合物提供了另外一种标记和检测核酸的手段，例如“用于检测活细胞中的无碱基位点的方法：碱基切除修复的年龄依赖性变化(amethodfordetectingabasicsitesinlivingcells:age-dependentchangesinbaseexcisionrepair.)”,atamnah,cheungi,amesbn.《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)》97,686-691(2000)。优选核酸聚合物偶联物是标记的单链或多链、天然或合成dna或rna、dna或rna寡核苷酸，或dna/rna杂交链，或并入不常见的连接基团如吗啉衍生化的磷酸酯，或肽核酸如n-(2-氨基乙基)甘氨酸单元。当核酸合成寡核苷酸时，它典型地含有不到50个核苷酸，更典型地含有不到25个核苷酸。肽核酸(pna)偶联物(nielsen等人美国专利第5,539,082号)因其通常较快的杂交速率而可能特别适于一些应用。在特定实施例中，本发明的偶联寡核苷酸是如代谢物、聚合物偶联物、半抗原或蛋白质等特定靶分子的适配体。也就是说，选择的这些寡核苷酸优先结合至靶分子。制备和筛选给定靶分子的适配体的方法先前已有描述并且是本领域中已知的[例如gold的美国专利第5,567,588号(1996)]。在其它实施例中，生物基质是碳水化合物，典型地是多糖，如葡聚糖、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊寡糖、淀粉、琼脂糖及纤维素。或者，碳水化合物是多糖，即脂多糖。优选多糖偶联物是葡聚糖或脂多糖偶联物。具有离子络合部分的偶联物充当钙、钠、镁、锌、钾或其它在生物学上很重要的金属离子的指示剂。优选的离子络合部分是冠醚(美国专利第5,405,975号)；1,2-双-(2-氨基苯氧基乙烷)-n,n,n',n'-四乙酸的衍生物(bapta螯合剂；美国专利第5,453,517号、第5,516,911号及第5,049,673号)；2-羧基甲氧基苯胺-n,n-二乙酸的衍生物(aptra螯合剂；《美国生理学杂志(am.j.physiol.)》,256,c540(1989))；或基于吡啶和基于菲咯啉的金属离子螯合剂(美国专利第5,648,270号)；或氮基三乙酸的衍生物，参见例如“作为检测固定于硝化纤维素上的组氨酸标记蛋白质的特有试剂的生物素化氮基三乙酸的单步骤合成及表征(single-stepsynthesisandcharacterizationofbiotinylatednitrilotriaceticacid,auniquereagentforthedetectionofhistidine-taggedproteinsimmobilizedonnitrocellulose)”,mcmahansa和burgessrr,《分析生物化学(anal.biochem.)》,236,101-106(1996)。优选的是，离子络合部分是冠醚螯合剂、bapta螯合剂、aptra螯合剂或氮基三乙酸衍生物。在根据本发明所有方面的某些实施例中，当生物基质是生物聚合物，如肽、蛋白质、寡核苷酸或核酸聚合物时，所述生物基质还标记有至少一种第二荧光染料偶联物以形成能量转移对，所述第二荧光染料偶联物任选地是本发明的另外的聚合物偶联物。根据本公开的能量转移对大致包括能够在其间转移能量的感光分子，如发色团或荧光团。举例来说，供体发色团/荧光团可以通过第一波长的光激发至其电子激发态，接着可以例如通过非辐射偶极子-偶极子耦合将能量转移至受体发色团/荧光团。一个发色团/荧光团可以吸收第一波长的能量，能量被转移至第二发色团/荧光团，并且从第二发色团/荧光团发射不同的第二波长的能量。能量转移的效率与两个发色团荧光团之间的距离成反比。根据某些方面，第一发色团/荧光团可以定位于本文所描述的聚合物的第一单体上，并且第二发色团/荧光团可以定位于聚合物的第二单体上但足够接近以使第一与第二发色团/荧光团构成能量转移对。或者，第一发色团/荧光团可以定位于本文所描述的聚合物的第一单体上并且第二发色团/荧光团可以定位于系统内足够接近第一发色团/荧光团的位置以使第一和第二发色团/荧光团构成能量转移对，也就是说，能量从第一发色团/荧光团转移至第二发色团/荧光团。或者，能量转移对的两个成员可以作为荧光蛋白质的部分，所述荧光蛋白质可以与其它分子连接或融合。当荧光蛋白质的部分彼此足够接近时，其形成荧光团。在本发明的一些方面中，标记的偶联物或生物基质充当酶底物，并且酶水解将破坏能量转移。通过这种方式，能量转移对之间能量转移的破坏以及由此引起的荧光破坏用以指示具有标记的偶联物或生物基质作为酶底物的靶酶的活性。本领域技术人员已知可以用于降解或以其它方式干扰生物基质如氨基酸、肽、蛋白质、酪胺、多糖、离子络合部分、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组装物、聚合物、聚合物微粒、生物细胞或病毒的酶。因此，例如，水解探针(如探针)可以依赖于聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性来破坏荧光供体部分的猝灭。在本发明的其它实施例中，并入本发明的聚合物偶联物的能量转移对偶联至寡核苷酸，所述寡核苷酸以其发夹构造呈现高效荧光猝灭[所谓的“分子信标”，tyagi等人,《自然生物技术(naturebiotechnology)》,16,49(1998)]或呈现荧光能量转移。利用生物方法破坏荧光能量转移可以用于监测生物过程。使用反应性聚合物偶联物制备聚合物偶联物在文献中有充分记载，例如gaylord等人的美国专利第8,158,444号、美国专利第8,455,613号、美国专利第8,354,239号、美国专利第8,362,193号、及美国专利第8,575,303号；以及chiu等人的wo2013/101902。聚芴聚合物的其它生物应用完整记录于thomasiii等人(《化学评论》2007,107,1339)；zhu等人(《化学评论》2012,112,4687)及zhu等人(《化学会评论》,2011,40,3509)中。偶联物典型地通过将在适合溶剂中适当反应性聚合物与欲偶联的生物基质混合于能溶解这两者的适合溶剂中得到。本发明的聚合物偶联物易溶于水溶液中，由此有助于与大部分生物材料的偶联反应。对于光活化的反应性聚合物偶联物，偶联需要照射反应混合物以使反应性聚合物偶联物活化。反应性聚合物的合成如图3中所示，本发明反应性聚合物的合成取决于某些关键中间物的初始制备。为简单起见，除少数可能取代基外其余均显示为氢。这些基础结构任选地在合成期间或之后进一步被取代，得到如上文所定义的相应聚合物偶联物取代基。应认识到，许多可能的变化形式可以得到等效的结果。用于合成含有多个反应性官能团如表2中描述的官能团的聚合物的方法在本领域有充分记载。特别有用的是胺反应性聚合物偶联物，如羧酸的“活性酯”，这些活性酯典型地通过使羧酸与相对呈酸性的“离去基团”偶合来合成。其它优选的胺反应性基团包括使用如pcl5或pocl3等卤化剂由磺酸制备的磺酰基卤化物；通过使氰尿酰卤化物与胺反应而制备的卤代三嗪；以及由胺分别与光气或硫光气制备的异氰酸酯或异硫氰酸酯。含有叠氮化物、炔烃及四嗪的聚合物特别适用于偶联至点击基团修饰的基质，如由含点击基团的活性酯修饰的抗体。含有胺和酰肼的聚合物特别适用于偶联至羧酸、醛及酮。这些聚合物中大部分通常是通过使羧酸的活性酯或磺酰基卤化物与二胺如尸胺，或与肼反应而合成。或者，芳香族胺通常是通过化学还原硝基芳香族化合物合成。胺和肼是通过标准方法合成硫醇反应性卤代乙酰胺或顺丁烯二酰亚胺的特别有用的前体。应用及使用方法在一种应用中，使用了本发明的聚合物偶联物直接染色或标记样品以使得样品可以被鉴别或定量。此类用途可以是体外应用。举例来说，此类聚合物偶联物可以添加作为有关生物靶分析物的分析的一部分、作为生物或非生物流体中的可检测示踪成分；或用于如作为肿瘤的光动力疗法的目的，其中偶联聚合物的样品被照射以选择性破坏肿瘤细胞和组织；或通常通过光敏化产生单线态氧而光烧蚀动脉斑块或细胞。在一个优选实施例中，聚合物偶联物被用于对包含配体的样品染色，对于所述配体来说，偶联的生物基质是特异性结合对的互补成员。可根据本发明使用的代表性结合对陈述于表3中。典型地，样品是从液体源直接获得，或作为洗涤液从固体材料(有机或无机固体材料)或已经引入细胞进行培养的生长培养基获得，或直接从放入细胞进行评价的缓冲溶液获得。当样品包含细胞时，细胞任选地是单一细胞，包括微生物，或是与其它细胞呈二维或三维层缔合的多个细胞，包括多细胞生物、胚胎、组织、活组织切片、长丝、生物膜等。或者，样品是固体，任选是涂片或刮片或通过过滤从液体或蒸气取出的阻留物。在本发明的一个方面，样品是从生物流体获得，包括分离或未经过滤的生物流体如尿液、脑脊髓液、血液、淋巴液、组织匀浆、间质液、细胞提取物、粘液、唾液、痰液、大便、生理分泌物或其它类似流体。或者，样品是从环境源获得，如土壤、水或空气；或从工业源获得，如从废料流、水源、供应管线或制造批料取得。表3.代表性特异性结合对抗原抗体生物素抗生物素或抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素或中性抗生物素蛋白igg*蛋白质a或蛋白质g或抗igg抗体药物药物受体毒素毒素受体碳水化合物凝集素或碳水化合物受体肽肽受体核苷酸互补核苷酸蛋白质蛋白质受体酶底物酶dna(rna)adna(arna)**激素激素受体补骨脂素核酸靶分子rna或dna适配体离子离子螯合剂*igg是免疫球蛋白；**adna和arna是用于杂交的反义(互补)链在又其它实施例中，样品可以存在于固体或半固体基质上或其中。在本发明的一个方面，所述基质是膜。另一方面，基质是电泳凝胶，如被用于分离和表征核酸或蛋白质，或是通过从电泳凝胶转印至膜上而制备的印迹。另一方面，基质是硅芯片或玻璃载片，并且所关注分析物以阵列形式固定于所述芯片或载片上(例如样品包含呈微阵列形式的蛋白质或核酸聚合物)。在又另一方面，基质是微孔板或微流体芯片，并且样品是通过自动方法，典型地通过各种高通量筛选方法，如药物筛选方法进行分析。一般利用本发明的聚合物偶联物，通过将如上文所描述的本发明的聚合物偶联物与所关注样品在选定的条件下组合以产生可检测的光学反应。术语“聚合物偶联物”在本文中用以指所要求的聚合物偶联物的所有方面。所述聚合物偶联物典型地与样品的成分形成共价缔合或络合物，或仅仅存在于样品的边界或样品的一部分内。接着，在所选引起光学反应的波长下照射样品。典型地，使用样品染色，通过进一步比较所述光学反应与标准或期望的反应来确定样品的指定特征。可检测的光学反应意思指通过观察或仪器可检测的光学信号的改变或出现。典型地，可检测反应是荧光的改变，如荧光的强度、激发或发射波长分布、荧光寿命、荧光偏振或其组合的改变。将染色的程度和/或位置与标准或期望的反应相比较将指示样品是否具有给定特征及样品具有何种程度的给定特征。对于生物应用，本发明的聚合物偶联物典型地被用于根据本领域中一般已知的方法制备的含水、主要含水或可与水混溶的溶液中。聚合物偶联物的确切浓度取决于实验条件及所希望的结果。最佳浓度是通过系统性变化直至实现具有极小背景荧光的令人满意的结果来确定。聚合物偶联物最适宜用于对具有生物组分的样品染色。样品可以包含多种组分的不均匀混合物(包括完整细胞、细胞提取物、细菌、病毒、细胞器及其混合物)，或单一组分，或多种组分的均匀组合(例如天然或合成氨基酸、核酸或碳水化合物聚合物，或脂膜复合物)。这些聚合物偶联物在使用浓度内一般对活细胞和其它生物组分无毒。聚合物偶联物是以有助于聚合物偶联物与所关注样品组分之间接触的任何方式与样品组合。典型地，仅将聚合物偶联物或含有聚合物偶联物的溶液添加至样品中。本发明的某些聚合物偶联物往往不能渗透生物细胞膜，而一旦进入细胞内部，典型地会在活细胞中留下孔。可以使用使质膜透性化的处理，如电穿孔、冲击处理或高细胞外atp，以将选择的聚合物偶联物引入细胞中。或者，选择的聚合物偶联物可以通过物理方式，例如通过加压显微注射、刮棒装载、膜片钳法或吞噬作用插入细胞中。并入脂肪族胺或肼残基的聚合物偶联物可以被显微注射至细胞中，在细胞中，这些聚合物偶联物可以通过如甲醛或戊二醛等醛固定剂固定在适当位置。这种固定使得这些聚合物偶联物可用于细胞内应用，如神经元跟踪。具有亲脂性取代基，如磷脂的聚合物偶联物将非共价并入脂质组装物中，例如用作膜结构的探针；或用于并入脂质体、脂蛋白、膜、塑料、亲油性微球或类似材料中；或用于跟踪。亲脂性聚合物偶联物可用作膜结构的荧光探针。使用聚合物偶联物标记细胞表面上、细胞膜中或细胞内隔室如细胞器中，或细胞质中的活性位点，允许测定样品中其存在或量、可接近性或其空间和时间分布。光反应性聚合物偶联物可以按类似方式用于生物细胞外膜的光标记组分或用作细胞的光固定性极性示踪剂。任选地，在染色之后，洗涤样品以去除残留、过量或未结合的聚合物偶联物。在染色过程中，任选将样品与一种或多种其它溶液，包括溶液、透性化和/或固定溶液及含有另外的检测试剂的溶液组合。根据本领域中一般已知的方法，另外的检测试剂典型地由于特定细胞组分的存在、细胞内生物基质或细胞状况而产生可检测反应。当所述另外的检测试剂具有与主题聚合物偶联物不同的光谱特性，或产生具有与主题聚合物偶联物不同的光谱特性的产物时，多色应用是可能的。这在所述另外的检测试剂是具有与染色的聚合物偶联物明显不同的光谱特性的聚合物偶联物或本发明的聚合物偶联物-偶联物情况下是特别有用的。本发明的聚合物偶联物是根据本领域中充分了解的方法使用；例如抗体偶联物用于显微镜检查和免疫荧光分析中；以及核苷酸或寡核苷酸偶联物用于核酸杂交分析和核酸测序(例如prober等人的美国专利第5,332,666号(1994)；smith等人的美国专利第5,171,534号(1992)；hobbs的美国专利第4,997,928号(1991)；及menchen等人的wo申请94/05688)。包含多个独立的本发明聚合物偶联物的偶联物具有适于多色应用的效用。在染色之后或期间的任何时间，用所选可得到可检测光学反应的波长照射样品，并且用适于检测光学反应的手段进行观察。可用于照射本发明的聚合物偶联物的设备包括但不限于，手持式紫外灯、汞弧灯、氙灯、激光器及激光二极管。这些照射源任选地整合于激光扫描仪、荧光微量盘读取器、标准或微型荧光计，或色谱检测器中。本发明的优选实施例是在405nm波长下或附近可激发的聚合物偶联物。任选地通过目视检查，或通过使用以下装置中的任一种检测光学反应：ccd相机、摄像机、摄影胶片、激光扫描装置、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞仪、荧光微量盘读取器，或用于放大信号的构件，如光电倍增管。当使用流式细胞仪检查样品时，样品的检查任选地包括根据荧光反应分选样品的各部分。本发明的一个方面是试剂盒的配制物，所述试剂盒有助于实践使用任何本发明聚合物偶联物的各种分析，如上文所描述。本发明的试剂盒典型地包含本发明的荧光聚合物偶联物，其中偶联的生物基质是特异性结合对成员，或是核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、肽或蛋白质。在其它实施例中，试剂盒包含未偶联的聚合物和供与其偶联的生物基质。在偶联之后，产生的荧光聚合物偶联物是如本文中所描述的本发明的聚合物偶联物。试剂盒任选还包含典型地以水溶液形式存在的一种或多种缓冲剂。本发明的试剂盒任选还包含另外的检测试剂、用于纯化所得到的标记生物基质的纯化介质、发光标准品、酶、酶抑制剂、有机溶剂和/或有关进行本发明的分析的说明书。实例以下实例中提供了有关所选本发明聚合物偶联物的一些合成策略的实例，以及其表征、合成前体、偶联物及使用方法。其它修改及置换对于本领域技术人员将是显而易见的。提供以下实例是为了说明本发明的实务。这些实例并不打算限制或限定本发明的整个范围。应理解，本发明不限于所描述的特定方面，因此是可以变化的。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定方面的目的，而不打算作为限制，原因是本发明的范围仅由所附权利要求书限定。当提供值的范围时，应理解，在所述范围的上限与下限之间的的每一中间值(除非上下文另外明确规定，否则精确到下限单位的十分之一)以及在所述范围内的任何其它所述值或中间值都涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内并且也涵盖于本发明内，从属于在所陈述的范围内的任何明确排除的界限。当所陈述的范围包括限值中的一个或两个时，排除所包括的那些限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。尽管类似或等效于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料也可以被用于本发明的实践或测试，但现将描述代表性的说明性方法和材料。实例1.制备3,3'-(2-溴-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊-2-基)-8,10-二氢-4h-芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯-4,4-二基)双(丙-1-醇)(化合物2)在氩气下，向3-[2-溴-4-(3-羟丙基)-6-碘-8,10-二氢-4h-9-氧杂环庚三烯并[def]芴-4-基]-丙-1-醇(化合物1)(3g，5.67mmol)于dmf(30ml)中的溶液中添加双(频哪醇)二硼(2g，8mmol)、pd(dppf)cl2(0.2g，0.28mmol)及乙酸钾(2.23g，22.7mmol)。将混合物在60℃下加热2小时。在室温下，添加乙酸乙酯(200ml)并用水(100ml)、盐水(100ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥并过滤。去除溶剂并且粗产物通过柱色谱法(己烷-乙酸乙酯)纯化，得到浅褐色泡沫状物(1.5g，50％)。实例2.制备(2-溴-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊-2-基)-8,10-二氢-4h-芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯-4,4-二基)双(丙烷-3,1-二基)双(4-甲基苯磺酸酯)(化合物3)在室温下，在氩气下向化合物2(5.84g，11mmol)于二氯甲烷(20ml)中的溶液中添加三乙胺(9.2ml，66mmol)，随后添加对甲苯磺酰氯(6.3g，33mmol)。在室温下搅拌混合物过夜。浓缩混合物。添加乙酸乙酯(200ml)并用水(200ml)、盐水(100ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥并过滤。去除溶剂并且粗产物通过柱色谱法(己烷-乙酸乙酯)纯化，得到白色固体(5.2g，70％)。实例3.制备2-(6-溴-4,4-二(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十八烷-38-基)-8,10-二氢-4h-芴并[4,5-cde]氧杂环庚三烯-2-基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(化合物4)在氩气下，在0℃下向氢化钠(0.24g，5.95mmol)于无水thf(20ml)中的混合物中添加mpeg11醇(3.08g，5.95mmol)。在0℃下10分钟之后，逐滴添加化合物3(1g，1.19mmol)于无水thf(20ml)中的溶液。在室温下搅拌混合物过夜。添加饱和氯化铵溶液(100ml)以淬灭所述溶液并用二氯甲烷(2100ml)萃取粗产物。浓缩合并的有机层并通过柱色谱法，利用二氯甲烷/异丙醇梯度纯化，得到无色油状物(1.0g，55％)。实例4.制备不对称pfo聚合物(化合物7)在氩气下，在舒伦克瓶(schlenkflask)中向化合物4(0.6g，0.4mmol)和化合物5(0.023g，0.04mmol)于dmf(6ml)中的溶液中添加k2co3的水溶液(2m，4ml)，随后添加四(三苯基膦)钯(14mg，0.012mol)。通过三个冷冻-抽吸-解冻循环使混合物脱气，接着将其加热至80℃，保持12小时。在室温下，向反应混合物中添加含edta(100mg，0.33mmol)的20％etoh/h2o(20ml)并在室温下搅拌1小时。所得混合物接着通过0.45μm杯式过滤器过滤。使用20％etoh/h2o将过滤后的溶液稀释至2mg/ml浓度。接着，使用切向流过滤系统，用分子量截断值为30,000kd的膜将所得稀释液透析至20％etoh/h2o中，直至洗脱物中存在少于0.1mg/ml的聚合物。浓缩溶液并冻干，得到黄色纤维状固体(0.41g)。利用sec分析，相对于聚苯乙烯标准物(mw＝85,000，mw＝170,000，d＝2.0)测定分子量。在室温下，向化合物6(410mg)于二氯甲烷(20ml)中的溶液中添加三氟乙酸(5ml)。在室温下搅拌反应混合物2小时。去除溶剂并在高真空下干燥过夜，得到淡黄色油状物。实例5.制备不对称pfo聚合物琥珀酰亚胺酯(化合物8)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加二(n-琥珀酰亚胺基)戊二酸酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物2小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙醚洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的二(n-琥珀酰亚胺基)戊二酸酯。将残余物迅速溶解于冷的酸性水(ph＝5)中，并用乙醚萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物琥珀酰亚胺基酯。实例6.制备不对称pfo聚合物顺丁烯二酰亚胺(化合物9)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加3-顺丁烯二酰亚胺基丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物2小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于酸性水(ph＝5)中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物顺丁烯二酰亚胺。实例7.制备不对称pfo聚合物二氯三嗪(化合物10)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加氰尿酰氯(1mg，sigma)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的氰尿酰氯。将残余物迅速溶解于冷水(ph＝6)中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物二氯三嗪。实例8.制备不对称pfo聚合物dbco(化合物11)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加dbco-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的dbco-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物dbco。实例9.制备不对称pfo聚合物tco(化合物12)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加tco-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的tco-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物tco。实例10.制备不对称pfo聚合物甲基四嗪(化合物13)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加甲基四嗪-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的甲基四嗪-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物甲基四嗪。实例11.制备不对称pfo聚合物叠氮化物(化合物14)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加叠氮基-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的叠氮基-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物叠氮化物。实例12.制备不对称pfo聚合物炔(化合物15)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加炔基-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的炔基-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物炔。实例13.制备cy3.5标记的不对称pfo聚合物(化合物16)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加cy3.5单琥珀酰亚胺基酯(10mg，aatbioquest)于1mldmf中的溶液和20μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水中，使用切向流过滤系统，用分子量截断值为30,000kd的膜将其透析至20％etoh/h2o中，直至洗脱物中存在少于0.1mg/ml的聚合物。浓缩溶液并冻干，得到所希望的蓝色纤维状固体。实例14.制备cy3.5标记的不对称pfo聚合物dbco(化合物17)向化合物16(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加dbco-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的dbco-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物dbco。实例15.制备cy3.5标记的不对称pfo聚合物tco(化合物18)向化合物16(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加tco-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的tco-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物tco。实例16.制备cy3.5标记的不对称pfo聚合物甲基四嗪(化合物19)向化合物16(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加甲基四嗪-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的甲基四嗪-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物甲基四嗪。实例17.制备cy3.5标记的不对称pfo聚合物叠氮化物(化合物20)向化合物16(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加叠氮基-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的叠氮基-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物叠氮化物。实例18.制备cy3.5标记的不对称pfo聚合物炔(化合物21)向化合物16(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加炔基-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的炔基-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物炔。实例19.制备cy3.5标记的不对称pfo聚合物琥珀酰亚胺基酯(化合物22)向化合物16(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加二(n-琥珀酰亚胺基)戊二酸酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物2小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙醚洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的二(n-琥珀酰亚胺基)戊二酸酯。将残余物迅速溶解于冷水(ph＝6)中，并用乙醚萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物琥珀酰亚胺基酯。实例20.制备cy3.5标记的不对称pfo聚合物顺丁烯二酰亚胺(化合物23)向化合物16(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加3-顺丁烯二酰亚胺基丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物2小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水(ph＝6)中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物顺丁烯二酰亚胺。实例21.制备cy3.5标记的不对称pfo聚合物二氯三嗪(化合物24)向化合物16(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加氰尿酰氯(1mg，sigma)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的氰尿酰氯。将残余物迅速溶解于冷水(ph＝6)中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物二氯三嗪。实例22.制备cy5标记的不对称pfo聚合物dbco(化合物25)向化合物16(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加dbco-peg4cy5单琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水中，使用切向流过滤系统，用分子量截断值为30,000kd的膜将其透析至20％etoh/h2o中，直至洗脱物中存在少于0.1mg/ml的聚合物。浓缩溶液并冻干，得到所希望的蓝色纤维状固体。实例23.制备cy5标记的不对称pfo聚合物tco(化合物26)向化合物16(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加tco-peg4cy5单琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水中，使用切向流过滤系统，用分子量截断值为30,000kd的膜将其透析至20％etoh/h2o中，直至洗脱物中存在少于0.1mg/ml的聚合物。浓缩溶液并冻干，得到所希望的蓝色纤维状固体。实例24.制备cy5标记的不对称pfo聚合物甲基四嗪(化合物27)向化合物16(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加甲基四嗪-peg4cy5单琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和20μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水中，使用切向流过滤系统，用分子量截断值为30,000kd的膜将其透析至20％etoh/h2o中，直至洗脱物中存在少于0.1mg/ml的聚合物。浓缩溶液并冻干，得到所希望的蓝色纤维状固体。实例25.制备cy5标记的不对称pfo聚合物叠氮化物(化合物28)向化合物27(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加叠氮基-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水中，使用切向流过滤系统，用分子量截断值为30,000kd的膜将其透析至20％etoh/h2o中，直至洗脱物中存在少于0.1mg/ml的聚合物。浓缩溶液并冻干，得到所希望的蓝色纤维状固体。实例26.制备cy5标记的不对称pfo聚合物(化合物29)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加cy5单琥珀酰亚胺基酯(10mg，aatbioquest)于1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水中，使用切向流过滤系统，用分子量截断值为30,000kd的膜将其透析至20％etoh/h2o中，直至洗脱物中存在少于0.1mg/ml的聚合物。浓缩溶液并冻干，得到所希望的蓝色纤维状固体。实例27.制备cy5标记的不对称pfo聚合物琥珀酰亚胺基酯(化合物30)向化合物29(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加二(n-琥珀酰亚胺基)戊二酸酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物2小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙醚洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的二(n-琥珀酰亚胺基)戊二酸酯。将残余物迅速溶解于冷水(ph＝6)中，并用乙醚萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物琥珀酰亚胺基酯。实例28.制备cy5标记的不对称pfo聚合物顺丁烯二酰亚胺(化合物31)向化合物29(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加3-顺丁烯二酰亚胺基丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物2小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水(ph＝6)中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物顺丁烯二酰亚胺。实例29.制备cy5标记的不对称pfo聚合物二氯三嗪(化合物31)向化合物29(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加氰尿酰氯(1mg，sigma)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的氰尿酰氯。将残余物迅速溶解于冷水(ph＝6)中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物二氯三嗪。实例30.制备cy5标记的不对称pfo聚合物dbco(化合物32)向化合物29(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加dbco-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的dbco-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物dbco。实例31.制备cy5标记的不对称pfo聚合物tco(化合物33)向化合物29(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加tco-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的tco-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物tco。实例32.制备cy5标记的不对称pfo聚合物甲基四嗪(化合物34)向化合物29(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加甲基四嗪-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的甲基四嗪-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物甲基四嗪。实例33.制备cy5标记的不对称pfo聚合物叠氮化物(化合物35)向化合物29(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加叠氮基-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的叠氮基-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物叠氮化物。实例34.制备cy5标记的不对称pfo聚合物炔(化合物36)向化合物29(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加炔基-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的炔基-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物炔。实例35.制备tamra标记的不对称pfo聚合物(化合物37)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加5-tamra琥珀酰亚胺基酯(10mg，aatbioquest)于1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水中，使用切向流过滤系统，用分子量截断值为30,000kd的膜将其透析至20％etoh/h2o中，直至洗脱物中存在少于0.1mg/ml的聚合物。浓缩溶液并冻干，得到所希望的蓝色纤维状固体。实例36.制备tamra标记的不对称pfo聚合物dbco(化合物38)向化合物37(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加dbco-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的dbco-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物dbco。实例37.制备tamra标记的不对称pfo聚合物tco(化合物39)向化合物37(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加tco-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的tco-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物tco。实例38.制备tamra标记的不对称pfo聚合物甲基四嗪(化合物40)向化合物37(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加甲基四嗪-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的甲基四嗪-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物甲基四嗪。实例39.制备tamra标记的不对称pfo聚合物叠氮化物(化合物41)向化合物37(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加叠氮基-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的叠氮基-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物叠氮化物。实例40.制备tamra标记的不对称pfo聚合物炔(化合物42)向化合物37(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加炔基-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的炔基-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物炔。实例41.制备tamra标记的不对称pfo聚合物琥珀酰亚胺基酯(化合物43)向化合物37(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加二(n-琥珀酰亚胺基)戊二酸酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物2小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙醚洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的二(n-琥珀酰亚胺基)戊二酸酯。将残余物迅速溶解于冷水(ph＝6)中，并用乙醚萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物琥珀酰亚胺基酯。实例42.制备tamra标记的不对称pfo聚合物顺丁烯二酰亚胺(化合物44)向化合物37(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加3-顺丁烯二酰亚胺基丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物2小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水(ph＝6)中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物顺丁烯二酰亚胺。实例43.制备tamra标记的不对称pfo聚合物二氯三嗪(化合物45)向化合物37(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加氰尿酰氯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的氰尿酰氯。将残余物迅速溶解于冷水(ph＝6)中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称pfo聚合物二氯三嗪。实例44.制备德克萨斯红标记的不对称pfo聚合物dbco(化合物46)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加2-(德克萨斯红)磺酰胺基-6-(tco-peg4)甲酰胺基-赖氨酸单琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水中，使用切向流过滤系统，用分子量截断值为30,000kd的膜将其透析至20％etoh/h2o中，直至洗脱物中存在少于0.1mg/ml的聚合物。浓缩溶液并冻干，得到所希望的蓝色纤维状固体。实例45.制备德克萨斯红标记的不对称pfo聚合物tco(化合物47)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加2-(德克萨斯红)磺酰胺基-6-(tco-peg4)甲酰胺基-赖氨酸单琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水中，使用切向流过滤系统，用分子量截断值为30,000kd的膜将其透析至20％etoh/h2o中，直至洗脱物中存在少于0.1mg/ml的聚合物。浓缩溶液并冻干，得到所希望的蓝色纤维状固体。实例46.制备德克萨斯红标记的pfo聚合物甲基四嗪(化合物48)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加2-(德克萨斯红)磺酰胺基-6-(甲基四嗪-peg4)甲酰胺-赖氨酸单琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水中，使用切向流过滤系统，用分子量截断值为30,000kd的膜将其透析至20％etoh/h2o中，直至洗脱物中存在少于0.1mg/ml的聚合物。浓缩溶液并冻干，得到所希望的蓝色纤维状固体。实例47.制备德克萨斯红标记的不对称pfo聚合物叠氮化物(化合物49)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加2-(德克萨斯红)磺酰胺基-6-(叠氮基-peg4)甲酰胺基-赖氨酸单琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水中，使用切向流过滤系统，用分子量截断值为30,000kd的膜将其透析至20％etoh/h2o中，直至洗脱物中存在少于0.1mg/ml的聚合物。浓缩溶液并冻干，得到所希望的蓝色纤维状固体。实例48.制备不对称的tco官能化pfo聚合物(化合物50)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加tco-peg4琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的tco-peg4琥珀酰亚胺基酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称的tco官能化pfo聚合物。实例49.制备rox标记的不对称pfo聚合物tco(化合物51)向化合物50(10mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加6-rox琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水中，使用切向流过滤系统，用分子量截断值为30,000kd的膜将其透析至20％etoh/h2o中，直至洗脱物中存在少于0.1mg/ml的聚合物。浓缩溶液并冻干，得到所希望的蓝色纤维状固体。实例50.制备不对称的顺丁烯二酰亚胺官能化pfo聚合物(化合物52)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加3-顺丁烯二酰亚胺基丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。用乙酸乙酯洗涤残余物多次，直至去除大部分未反应的3-顺丁烯二酰亚胺基丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯。将残余物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。冷冻并干燥水溶液，得到所希望的不对称的顺丁烯二酰亚胺官能化pfo聚合物。实例51.制备rox标记的不对称pfo聚合物顺丁烯二酰亚胺(化合物53)向化合物52(10mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加6-rox琥珀酰亚胺基酯(1mg，aatbioquest)于0.1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水中，使用切向流过滤系统，用分子量截断值为30,000kd的膜将其透析至20％etoh/h2o中，直至洗脱物中存在少于0.1mg/ml的聚合物。浓缩溶液并冻干，得到所希望的蓝色纤维状固体。实例52.制备cy7标记的不对称pfo聚合物顺丁烯二酰亚胺(化合物54)向化合物7(100mg)于dmf(10ml)中的溶液中添加cy7单顺丁烯二酰亚胺,单琥珀酰亚胺基酯(5mg，aatbioquest)于1mldmf中的溶液和10μl三乙胺。在室温下搅拌反应混合物3小时，并在高真空下浓缩以去除dmf。将残余物溶解于水中，使用切向流过滤系统，用分子量截断值为30,000kd的膜将其透析至20％etoh/h2o中，直至洗脱物中存在少于0.1mg/ml的聚合物。浓缩溶液并冻干，得到所希望的蓝色纤维状固体。以上有关所选本发明聚合物的一些合成策略的实例，以及其表征、合成前体、偶联物及使用方法是作为说明性实例提供。其进一步修改及置换对于本领域技术人员是显而易见的。举例来说，偶联至本发明聚合物的第二荧光团(如上述实例中的cy3.5、cy5、tamra及德克萨斯红)可以容易地被表1中所列的可商购的染料替代以使聚合物具有所希望的不同光谱特性。此外，本发明的聚合物可以用表2中所列的不同反应性官能团对进一步官能化。还可以将众所周知的可点击基团添加至本发明的聚合物中以实现基于双正交化学的偶联(参见p.agarwal和r.bertozzi,《生物偶联化学(bioconjugatechem.)》,2015,26,176-192；k.lang和j.chin,《化学评论》,2014,114,4764-4806；m.d.best,《生物化学(biochemistry)》,2009,48,6571-6584)。用于使聚合物官能化的一些其它替代方法完整描述于文献中(参见gaylord等人的美国专利第8,158,444号、美国专利第8,455,613号、美国专利第8,354,239号、美国专利第8,362,193号及美国专利第8,575,303号；以及chiu等人的wo2013/101902)。实例53.制备鬼笔环肽-pfo聚合物偶联物(化合物55)向dmf(0.5ml)中的氨基鬼笔环肽(1mg，aatbioquest)和琥珀酰亚胺基酯衍生物化合物8(10mg)中添加n,n-二异丙基乙胺(25μl)。在室温下搅拌混合物3小时。向此溶液中添加5mletoac。通过离心收集固体。粗产物在sephadexlh-20上纯化，用水洗脱，随后通过制备型hplc纯化，得到纯鬼笔环肽偶联物。实例54.用鬼笔环肽-pfo聚合物偶联物对f-肌动蛋白丝染色肌动蛋白是出现在几乎所有真核细胞中的约42kda的球状蛋白质。它还是最高度保守的蛋白质之一，在藻类和人类之类不同物种中的差异不超过20％。鬼笔环肽-pfo聚合物偶联物选择性结合至f-肌动蛋白。在甲醛固定并且透性化的组织切片、细胞培养物或无细胞实验中，可以使用纳摩尔浓度的鬼笔环肽-pfo聚合物偶联物(化合物55)标记、鉴别及定量f-肌动蛋白。细胞用甲醛固定，并在添加鬼笔环肽-pfo聚合物偶联物的dmso储备溶液之后进行培育。用pbs轻轻地冲洗细胞2至3次以去除过量的鬼笔环肽偶联物。将细胞涂板，密封并使其在荧光显微镜下显像(参见图4)。可以按类似方式，使用其它的鬼笔环肽-pfo聚合物偶联物将f肌动蛋白丝染上不同荧光色。实例55.制备氨基葡聚糖-pfo聚合物偶联物如以下使用70,000mw为例所描述，制备氨基葡聚糖-染料偶联物。氨基葡聚糖(50mg)被衍生化而具有平均13个氨基。将氨基葡聚糖(50mg)溶解于0.1mnahco3中达到10mg/ml。添加化合物8，得到约10-15的pfo聚合物/葡聚糖比率。6-12小时之后，利用离子交换色谱法纯化所得偶联物。将偶联混合物以低盐缓冲液[50mmmes缓冲液(ph＝5.0)]装载至unospheretms树脂(bio-rad)上，并在室温下温育10分钟，重复装载样品3次以得到最大结合。装载之后，用低盐缓冲液洗涤介质，并用递增的ph值和离子强度梯度[10mm磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)+1.0mnacl缓冲液/甲醇]操作。实例56.制备pfo聚合物标记的微球可以使用多种众所周知的方案中的任一种，利用本发明的pfo聚合物染料标记微球。化学修饰成在表面上具有如氨基、羧基或醛之类官能团的微球可以通过使表面基团与表2中所列的相应反应性染料共价偶联进行表面标记。举例来说，胺修饰的微球易于通过琥珀酰亚胺基酯，如化合物8或22偶联至本发明的染料。实例57.制备核苷酸-pfo聚合物偶联物本领域的普通技术人员遵循众所周知的公开程序，如m.nimmakayalu等人,《生物技术(biotechniques)》2000,28,518-522；muhlegger等人,《hoppeseyler生物化学(biolchemhoppeseyler)》1990,371,953-965；及giaid等人,《组织化学(histochemistry)》1989,93,191-196中所述的程序，可以容易地制备于本发明的pfo聚合物染料偶联的核苷酸。向2mg的5-(3-氨基烯丙基)-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸(sigma-aldrich)于100μl水中的溶液中添加化合物8或22(5mg)于100μldmf中的溶液和5μl三乙胺。3小时之后，蒸发溶液并通过hplc纯化残余物。将产物洗脱份冻干，得到荧光核苷酸偶联物。或者，由5-(3-氨基-1-丙炔基)-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸，或通过用本发明的硫醇反应性pfo聚合物染料(如顺丁烯二酰亚胺化合物9或23)处理硫醇化核苷酸或硫代磷酸核苷酸来制备脱氧尿苷5'-三磷酸的荧光染料偶联物。实例58.制备寡核苷酸-pfo聚合物染料偶联物将5'-胺修饰的18个碱基的m13引物序列(约100μg)溶解于4μl水中。向其中添加1mg化合物8或22于100μl的0.1m硼酸钠ph8.5中的溶液。16小时之后，添加10μl的5mnacl和3体积冷乙醇。将混合物冷却至-20℃，离心，倾析上清液，用乙醇冲洗沉淀，并且接着将沉淀溶解于100μl水中。利用hplc纯化经过标记的寡核苷酸。收集所希望的峰并蒸发，得到荧光寡核苷酸-染料偶联物。实例59.制备山羊抗小鼠igg-pfo聚合物染料偶联物将山羊抗小鼠igg(gam)溶解于10mmnahco3(ph8.2)缓冲液中，制备出5mg/ml溶液。向gam蛋白质水溶液中添加化合物8或22(20当量)的dmf溶液。在室温下旋转溶液3小时并将反应混合物转移至amiconultra过滤器(mwco＝10kda)中以去除dmf。用pbs缓冲液使蛋白质恢复成初始体积。使用阳离子交换色谱法去除游离聚合物。将偶联混合物以低盐缓冲液[50mmmes缓冲液(ph＝5.0)]装载至unospheretms树脂(bio-rad)上，并在室温下温育10分钟，重复装载样品3次以得到最大结合。装载之后，用低盐缓冲液将介质洗涤至基线(直至在414nm下的吸光度低于0.01)以去除所有游离聚合物。通过用高盐磷酸盐缓冲液[10mm磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)+1.0mnacl缓冲液/甲醇，90/10]提高ph值和离子强度，释放出阳离子交换树脂上截留的pfo聚合物染料-gam偶联物。也可以使用蛋白质a和蛋白质g亲和树脂去除游离聚合物，得到相当的结果。hitrap蛋白质ghp1ml柱(gelifesciences)用10mm磷酸盐缓冲液ph7.4预先平衡，并且以<1mg/ml缓慢注入sec纯化的产物并使其温育30分钟进行结合。用超过10个柱体积的10mm磷酸盐缓冲液洗涤柱以洗掉未结合的聚合材料，同时监测在280nm和414nm下洗脱物的吸收以确保所有过量的材料都被去除。通过用4个柱体积的0.1m甘氨酸ph2.3洗涤柱来洗脱偶联物。合并洗脱的部分并使用1mtrisph8将ph调回中性。去除游离聚合物之后，用amiconultra过滤器(mwco＝30kd)浓缩偶联物溶液并将其装载至尺寸排阻柱(superdex200，gelifesciences)上以分离偶联物与未偶联的抗体。用pbs缓冲液平衡柱，并且pfo聚合物-抗体偶联物是在游离抗体之前洗脱。为了有效标记，取代度(dos)对于大部分抗体应当在一摩尔抗体1-3摩尔pfo聚合物染料之间。生物基质与聚合物的比率(bs/聚合物)表示生物基质的取代度。举例来说，当使用聚合物标记生物基质时，可能存在未标记的游离聚合物。因此，平均取代度可能小于1。本领域中众所周知的是，最佳dos取决于待标记的抗体的特性。最佳标记dos是通过制备在一定dos范围内的一系列染料-偶联物并比较所希望的信号/背景，凭经验确定。在一些情况下，较高的德可以提供明亮的信号，而在其它情况下，较高的dos会降低待标记抗体的亲和力。实例60.制备山羊抗兔igg-pfo聚合物染料偶联物将山羊抗兔igg(gar)溶解于1mnahco3(ph＝8.6)中，达到10mg/ml浓度。向gar溶液中添加甲基四嗪-peg4-磺基-nhs酯(10mg/mldmso溶液，3当量)。在室温下，在管式旋转器上旋转混合物1-2小时，并用填充有p-6-dg凝胶介质(bio-rad)的脱盐柱纯化以去除游离的甲基四嗪-peg4-磺基-nhs酯。将甲基四嗪修饰的gar回收于pbs中。将修饰过的gar的溶液与化合物13(4mg/ml，5当量)的pbs储备溶液混合。在室温下旋转混合溶液1至3小时。将所得溶液装载至阳离子交换柱上，用于去除非反应性游离聚合物。如实例59中所描述，纯化pfo聚合物-gar溶液。汇集纯化的所希望pfo聚合物-gar偶联物，合并且用amiconultra过滤器(mwco＝30kd)浓缩至所希望的浓度。实例61.制备绵羊抗小鼠igg-pfo聚合物染料偶联物绵羊抗小鼠igg(sam)用mea、dtt或tcep还原(g.t.hermanson,《生物偶联技术(bioconjugatetechniques)》,1996,463-469)。将还原的gam溶解于50mmmes缓冲液(ph＝6.0)中，制得5mg/ml溶液。向sam蛋白质水溶液中添加化合物9或23(10当量)的dmf溶液。在室温下旋转溶液3小时并将反应混合物转移至amiconultra过滤器(mwco＝10kda)中以去除dmf。用pbs缓冲液使蛋白质恢复成初始体积。如实例59中所描述，纯化pfo聚合物-sam溶液。汇集纯化的所希望pfo聚合物-sam偶联物，合并且用amiconultra过滤器(mwco＝30kd)浓缩至所希望的测试浓度。实例62.制备山羊抗人igg-pfo聚合物染料偶联物将山羊抗兔igg(gah)溶解于1mnahco3(ph＝8.6)中，达到10mg/ml浓度。向gah溶液中添加叠氮基-peg4-磺基-nhs酯(10mg/mldmso溶液，3当量)。在室温下，在管式旋转器上旋转混合物1-2小时，并用填充有p-6-dg凝胶介质(bio-rad)的脱盐柱纯化以去除游离的叠氮基-peg4-磺基-nhs酯。将叠氮基修饰的gah回收于pbs中。将修饰过的gah的溶液与化合物11(4mg/ml，5当量)的pbs储备溶液混合。在室温下旋转混合溶液1至3小时。将所得溶液装载至阳离子交换柱上，用于去除非反应性游离聚合物。如实例59中所描述，纯化pfo聚合物-gah溶液。汇集纯化的所希望pfo聚合物-gah偶联物，合并且用amiconultra过滤器(mwco＝30kd)浓缩至所希望的浓度。实例63.制备驴抗小鼠igg-pfo聚合物染料偶联物将驴抗小鼠igg(dam)溶解于1mnahco3(ph＝8.6)中，达到10mg/ml浓度。向dam溶液中添加叠氮基-peg4-磺基-nhs酯(10mg/mldmso溶液，3当量)。在室温下，在管式旋转器上旋转混合物1-2小时，并用填充有p-6-dg凝胶介质(bio-rad)的脱盐柱纯化以去除游离的叠氮基-peg4-磺基-nhs酯。将叠氮基修饰的dam回收于pbs中。将修饰过的dam的溶液与化合物17(4mg/ml，5当量)的pbs储备溶液混合。在室温下旋转混合溶液1至3小时。将所得溶液装载至阳离子交换柱上，用于去除非反应性游离聚合物。如实例59中所描述，纯化pfo聚合物-dam溶液。汇集纯化的所希望pfo聚合物-dam偶联物，合并且用amiconultra过滤器(mwco＝30kd)浓缩至所希望的浓度。实例64.制备抗cd8抗体-pfo聚合物染料偶联物按与实例59-63中所描述类似的方法，使用在独立制剂中分别偶联至化合物8、9、11及12的对于抗小鼠cd8a(克隆53-6.7，ebioscience)和抗人cd8a(克隆sk1，ebioscience)具有特异性的抗体，在一定染料比蛋白质比率范围内制备pfo聚合物染料-cd抗体偶联物。通过superdex200尺寸排阻色谱法(sec)，使用bio-radngcfplc色谱系统将抗体-聚合物偶联物与游离抗体纯化分离。先以15krpm离心偶联物5分钟以使任何沉淀或交联的偶联物沉淀。接着将上清液以小于1.5％的体积比注射至superdex20010/300gl色谱柱(gelifesciences)上并用10mm磷酸盐缓冲液(ph7.4)以1.0ml/min洗脱。对于各pfo聚合物-抗体偶联，收集在280nm处的第一洗脱峰，该洗脱峰含有抗体-聚合物偶联物和任何游离聚合物，并丢弃任何后续峰。如果需要从偶联物溶液去除过量的聚合物，则使用蛋白质g亲和纯化将偶联物与游离聚合物分离。hitrap蛋白质ghp1ml柱(gelifesciences)用10mm磷酸盐缓冲液(ph7.4)预先平衡，并且以<1mg/ml缓慢注入sec纯化的产物并使其温育10分钟进行结合。用超过10个柱体积的10mm磷酸盐缓冲液洗涤柱以洗掉未结合的聚合材料，同时监测在280nm和414nm下洗脱物的吸收以确保所有过量的材料都被去除。通过用4个柱体积的0.1m甘氨酸ph2.3洗涤柱来洗脱偶联物。合并洗脱的部分并使用1mtris(ph8)将ph调回中性。接着，最终纯化产物在amiconultra-430k分子量离心浓缩器中，利用10mm磷酸盐、0.5mnacl、0.09％叠氮化钠(ph7.4)进行4次缓冲液交换，并在4℃下以0.1mg/ml抗体浓度储存待用。对于各抗体，三种染料各自的最佳pfo聚合物染料比蛋白质比率极其类似。一般而言，对于欲标记的各特异性抗体，最佳染料比蛋白质比率各自是凭经验确定(通过常规优化)。实例65.制备抗cd8抗体-pfo聚合物串联染料偶联物如实例59-63中所描述，使用在独立制剂中分别偶联至化合物17、18、22、23、25、32、36及38的对于抗小鼠cd8a(克隆53-6.7，ebioscience)和抗人cd8a(克隆sk1，ebioscience)具有特异性的抗体，在一定染料比蛋白质比率范围内制备pfo聚合物染料-cd抗体偶联物。如实例64中所描述，纯化抗体-聚合物偶联物。实例66.制备抗生蛋白链菌素-pfo聚合物偶联物将抗生蛋白链菌素溶解于10mmnahco3缓冲液(ph8.2)中，得到1mg/ml溶液。向抗生蛋白链菌素蛋白质水溶液中添加化合物8或22(20当量)的dmf溶液。在室温下振荡溶液3小时并将反应物转移至amiconultra过滤器(mwco＝10kda)中以去除dmf。用pbs缓冲液使蛋白质复原成初始体积。使用阳离子交换色谱法去除游离聚合物。将偶联混合物以低盐缓冲液[50mmmes缓冲液(ph＝5.0)]装载至unospheretms树脂(bio-rad)上，并在室温下温育10分钟，重复装载样品3次以得到最大结合。装载之后，用低盐缓冲液将介质洗涤至基线(直至在414nm下的吸光度低于0.01)以去除所有游离聚合物。通过用高盐磷酸盐缓冲液[10mm磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)+1.0mnacl缓冲液/甲醇，90/10]提高ph值和离子强度，释放出阳离子交换树脂上截留的pfo聚合物染料-抗生蛋白链菌素偶联物。合并洗脱的部分并浓缩至所希望的浓度。实例67.用于流式细胞术中的pfo聚合物偶联物本分析物特异性抗体与本发明的pfo聚合物染料的偶联物(即，标记的抗体)可用于通过流式细胞术分析血细胞(例如全血样品中)。使用标记的抗体对细胞蛋白质染色，并使用流式细胞仪检测标记的细胞。根据bdbiosciences对流式细胞仪的定义，利用染色指数评价pfo聚合物生物偶联物。参见例如h.maeker和j.trotter,bdbiosciences应用手册：“选择用于多色流式细胞术的试剂(selectingreagentsformulticolourflowcytometry)”,2009年9月。染色指数报导对聚合物的亮度、非特异性结合的度量。流式细胞术提供了一种测量特定微球上特定表型的细胞或所关注分析物的方法。这种方法可以通过一次抗体直接标记，或在需要放大信号时，通过二次抗体或抗生物素蛋白-生物素与抗生物素蛋白-聚合物偶联物的复合物标记来进行。溶解足量的所关注细胞，短暂离心，在dpbs+0.2％bsa和0.05％nan3中洗涤，接着使其再悬浮于含pfo聚合物偶联物的染色缓冲液中。对于一次培育，将细胞与对所关注抗原具有特异性的一次偶联物(例如实例64和65中的pfo聚合物-cd8抗体)一起培育，阴性细胞充当阴性非特异性结合参照物。对照群或确定的商购偶联物用作阳性对照。利用通过体积稀释的浓度为10-500nm的一次抗体-聚合物偶联物培育30分钟。对于二次抗体标记，利用1-50μg/ml或其它滴定量的针对所关注抗原的未标记的一次抗体进行培育。在一次培育之后，用5体积染色缓冲液冲洗细胞并短暂离心3-5分钟。利用通过体积稀释的浓度为10-500nm的物种反应性二次pfo聚合物偶联物(例如实例59-63)培育30-60分钟。在二次培育之后，用3-5体积染色缓冲液冲洗细胞并短暂离心3-5分钟。使细胞再悬浮于dpbs+0.2％bsa、0.05％叠氮化钠中进行测试。对于抗生蛋白链菌素-聚合物偶联物标记，如以上关于二次抗体标记所详述，将细胞与针对所关注标记物的生物素化一次抗体而非未标记的一次抗体一起培育。在一次洗涤之后，使细胞再悬浮并与1-100nm体积稀释的抗生蛋白链菌素-聚合物偶联物(实例66)一起培育30分钟。在二次培育之后，用5体积染色缓冲液冲洗细胞并短暂离心3-5分钟。使细胞再悬浮以进行测试。如果需要进一步放大信号，则可以将细胞与未标记的一次抗体一起培育且接着，在与抗生蛋白链菌素偶联物一起培育之前，与物种反应性生物素化二次抗体一起培育。实例68.用于分析血液样品的pfo聚合物-抗cd8偶联物大体上如实例67中所描述，进行细胞染色。使用pfo聚合物-cd8抗体偶联物分析全血样品中的淋巴细胞。典型地，在暗处，用每毫升血液1-20μg染料-偶联物浓度的抗体-pfo聚合物染料偶联物对全血(优选收集于edta中)样品(100μl)染色，保持30-60分钟。染色之后，将适量的细胞溶解溶液添加至细胞样品中。在涡流混合器上以中速混合处理过的样品，接着在室温下培育10min。以200-500g离心样品5分钟并倾析上清液。洗涤样品(再悬浮于2ml的0.5％bsa/pbs洗涤缓冲液中，混合并离心)两次，使其再悬浮于洗涤缓冲液中，并保持在4℃以待流式细胞测量分析。血液样品分析是使用流式细胞仪进行。染色细胞的样品的流式细胞测量分析是根据制造商的方案进行，并且使用本领域众所周知的标准技术分析数据以获得所关注细胞群的中值荧光强度。流式测试是使用流式设施工作人员每天用校准粒子校准细胞仪所确定的电压设置进行。通过前向散射对比侧向散射对未染色细胞样品进行淋巴细胞特异性选通作为背景对照。相对于宽度分布，对前向散射和侧向散射区域进行标准双重选通。在仅单一颜色情况下，无需补偿。收集所有前向和侧向散射参数的数据并使用bd的标准太平洋蓝(pacificblue)通道进行荧光测量。pfo-抗体偶联物数据利用了405nm紫光激光器激发和605/40bp滤光片(参见图7)。应理解，使用的特定抗体偶联物以及使用的特定反应组分和特定反应条件可能对获得的结果具有影响。应当进行常规实验以确定优选的反应组分如缓冲液或溶解溶液，和反应条件，包括染色次数和温度。这种针对分析条件的常规优化是免疫染色类分析领域中的标准实践。当前第1页12