本发明涉及与肌球蛋白调节轻链多肽(myl)9结合的抗体或其myl9结合片段，以及包含所述抗体或其myl9结合片段的药物组合物。
背景技术：
cd69是一种属于c型凝集素家族的ii型跨膜蛋白。cd69作为淋巴细胞活化的指示物被广泛应用(非专利文献1)，并且迄今为止据报道参与诸如局部炎症、关节炎和过敏性气道症状等炎性疾病(非专利文献2和3)。
近年来，据报道cd69与作为构成肌球蛋白的亚单位之一的肌球蛋白调节轻链多肽(myl)9相互作用，并且由此带来了靶向myl9的炎症疾病治疗策略(专利文献1)。
免疫检查点抑制剂是一组最近开发的抗癌药物，它抑制在癌细胞和淋巴细胞(t细胞)中表达的阻碍免疫系统的蛋白质。这些蛋白质被称为免疫检查点。已知程序性细胞死亡蛋白-1(pd-1)、程序性死亡配体1(pd-l1)和细胞毒性t淋巴细胞相关抗原-4(ctla-4)等充当免疫检查点。几种免疫检查点抑制剂已被批准为药物，且其治疗用途包括恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、头颈癌和尿路上皮癌。此外，根据临床试验结果，单独或与其他抗癌药物组合的免疫检查点抑制剂对诸如结直肠癌、乳腺癌、肝细胞癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、小细胞肺癌、间皮瘤、子宫内膜癌等癌症的治疗是有效的。
引证文献清单
专利文献
[专利文献1]wo2014/192915
非专利文献
[非专利文献1]testi,r.等人，immunol.today[今日免疫学]15:479-483，1994。
[非专利文献2]murata,k.等人：cd69-nullmiceprotectedfromarthritisinducedwithanti-typeiicollagenantibodies[用抗ii型胶原抗体诱导的保护无cd69小鼠免患关节炎].int.immunol.[国际免疫学]15:987-992，2003
[非专利文献3]miki-hosokawa,t.等人：cd69controlsthepathogenesisofallergicairwayinflammation[cd69控制过敏性气道炎症的发病机理].j.immunol.[免疫学杂志]183；8203-8215，2009
技术实现要素：
技术问题
由于其所具有的结合特异性，抗体和抗原结合片段可成为理想的治疗药物。抗体和抗原结合片段可以用于通过仅靶向特定细胞或组织而使潜在的副作用最小化。需要鉴定用于靶向myl9的抗体以及用作药物的人源化抗体。
因此，本发明的目的是提供与myl9结合并且可以抑制人体中的myl9与cd69之间的相互作用的抗myl9抗体或其myl9结合片段，以及包含其的药物组合物。
问题的解决方案
作为解决上述问题的广泛研究的结果，诸位发明人成功获得了与人和小鼠myl9结合并且可以抑制与cd69的相互作用的小鼠抗小鼠/人myl9单克隆抗体。因此，诸位发明人通过鉴定所述小鼠抗小鼠/人myl9单克隆抗体的cdr获得了在重链和轻链的可变区中包含所述小鼠抗小鼠/人myl9单克隆抗体的互补决定区(cdr，(有时可称为“高变区”))序列的人源化或嵌合抗体。
换言之，本发明包括以下特征。
[1]一种抗肌球蛋白调节轻链多肽(myl)9抗体或其myl9结合片段，包含：
(a)由在seqidno.28中阐述的氨基酸序列表示的肽组成的重链cdr1；
(b)由在seqidno.30中阐述的氨基酸序列表示的肽组成的重链cdr2；
(c)由在seqidno.32中阐述的氨基酸序列表示的肽组成的重链cdr3；
(d)由在seqidno.33中阐述的氨基酸序列表示的肽组成的轻链cdr1；
(e)由在seqidno.34中阐述的氨基酸序列表示的肽组成的轻链cdr2；以及
(f)由在seqidno.35中阐述的氨基酸序列表示的肽组成的轻链cdr3。
[2]根据[1]所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其中所述抗体是人源化或嵌合抗体。
[3]根据[1]或[2]所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其中所述myl9是人myl9。
[4]根据[1]-[3]中任一项所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其抑制myl9与cd69之间的相互作用，其中
所述抗体包含重链和轻链，
所述重链的可变区包含由在seqidno.55、56、57、58、59、60、61、62、63或64中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且
所述轻链的可变区包含由在seqidno.65、66、67或68中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[5]根据[1]-[4]中任一项所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其中所述抗体选自下组，该组由以下抗体组成：
(1)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.64中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(2)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.63中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(3)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.56中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(4)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.57中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(5)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.55中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(6)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.58中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(7)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.59中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(8)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.60中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(9)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.61中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(10)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.64中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(11)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.63中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(12)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.56中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(13)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.57中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(14)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.55中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(15)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.58中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(16)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.59中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(17)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.60中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(18)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.61中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(19)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.62中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.65中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(20)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.62中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.67中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(21)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.62中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；以及
(22)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.62中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[6]根据[1]-[5]中任一项所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其包含重链和轻链，其中所述重链的恒定区是igg。
[7]根据[6]所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其中所述重链的恒定区是人igg2的恒定区。
[8]根据[7]所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其中人igg2的所述恒定区具有突变v234a和g237a。
[9]根据[7]或[8]所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其中所述恒定区具有c末端赖氨酸残基缺失。
[10]根据[6]所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其中所述轻链的恒定区包含人igκ的恒定区。
[11]根据[1]-[10]中任一项所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其中所述抗体或其myl9结合片段抑制myl12a或myl12b与cd69之间的相互作用。
[12]一种药物组合物，包含根据[1]-[11]中任一项所述的抗体或其myl9结合片段以及药学上可接受的载体或添加剂。
[13]根据[12]所述的药物组合物，其用于治疗过敏性气道炎症或炎性肠病。
[14]根据[13]所述的药物组合物，其中该炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩病。
[15]根据[12]所述的药物组合物，其用于治疗肿瘤，其中该药物组合物与免疫检查点抑制剂组合使用。
[16]根据[15]所述的药物组合物，其中该免疫检查点抑制剂是pd-1抑制剂。
[17]根据[16]所述的药物组合物，其中该pd-1抑制剂是抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体。
[18]根据[16]所述的药物组合物，其中该pd-1抑制剂是抗pd-1抗体。
[19]根据[15]-[18]中任一项所述的药物组合物，其中该肿瘤选自下组，该组由以下组成：结直肠癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌、肝细胞癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、小细胞肺癌、间皮瘤和子宫内膜癌。
[20]根据[19]所述的药物组合物，其中该肿瘤是结直肠癌。
此外，本发明包括以下特征。
[1']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.64中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[2']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.63中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[3']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.56中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[4']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.57中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[5']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.55中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[6']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.58中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[7']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.59中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[8']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.60中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[9']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.61中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[10']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.64中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[11']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.63中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[12']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.56中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[13']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.57中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[14']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.55中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[15']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.58中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[16']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.59中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[17']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.60中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[18']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.61中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[19']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.62中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.65中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[20']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.62中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.67中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[21']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.62中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[22']一种抗myl9抗体或其myl9结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含由在seqidno.62中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽。
[23']根据[1']-[22']中任一项所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其抑制myl9与cd69之间的相互作用。
[24']根据[1']-[23']中任一项所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其包含重链和轻链，其中所述重链的恒定区是igg。
[25']根据[24']所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其中所述重链的恒定区是人igg2的恒定区。
[26']根据[25']所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其中人igg2的所述恒定区具有突变v234a和g237a。
[27']根据[25']或[26']所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其中所述恒定区具有c末端赖氨酸残基缺失。
[28']根据[24']所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其中所述轻链的恒定区包含人igκ的恒定区。
[29']根据[1']至[28']中任一项所述的抗myl9抗体或其myl9结合片段，其中所述抗体或其myl9结合片段抑制myl12a或myl12b与cd69之间的相互作用。
[30']一种药物组合物，包含根据[1']至[29']中任一项所述的抗体或其myl9结合片段以及药学上可接受的载体或添加剂。
[31']根据[30']所述的药物组合物，其用于治疗过敏性气道炎症或炎性肠病。
[32']根据[31']所述的药物组合物，其中该炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩病。
[33']根据[30']所述的药物组合物，其用于治疗肿瘤，其中该药物组合物与免疫检查点抑制剂组合使用。
[34']根据[33']所述的药物组合物，其中该免疫检查点抑制剂是pd-1抑制剂。
[35']根据[34']所述的药物组合物，其中该pd-1抑制剂是抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体。
[36']根据[34']所述的药物组合物，其中该pd-1抑制剂是抗pd-1抗体。
[37']根据[33']-[36']中任一项所述的药物组合物，其中该肿瘤选自下组，该组由以下组成：结直肠癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌、肝细胞癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、小细胞肺癌、间皮瘤和子宫内膜癌。
[38']根据[37']所述的药物组合物，其中该肿瘤是结直肠癌。
上文列举的本发明的一个或多个方面的任何组合的发明也包括在本发明的范围内。
发明的有利效果
根据本发明，提供了与myl9结合并且可以抑制myl9与cd69之间的相互作用的抗myl9抗体或其myl9结合片段，以及包含其的药物组合物。
附图说明
图1-1对应地显示了小鼠myl9与人myl9之间的氨基酸序列的比较(a)以及小鼠myl3与人myl3之间的氨基酸序列的比较(b)。*：保守氨基酸；-：空位；下划线：用于免疫小鼠以制备抗体a的肽的氨基酸序列。
图1-2对应地显示了小鼠myl3与小鼠myl9之间的氨基酸序列的比较(c)以及人myl3与人myl9之间的氨基酸序列的比较(d)。*：保守氨基酸；-：空位。
图2是显示抗小鼠/人myl9单克隆抗体(抗体a)与小鼠myl9和人myl9以及与小鼠myl3和人myl3的结合能力的结果。
图3显示了含糖链的小鼠cd69与小鼠myl9(a)或不含糖链的小鼠cd69与小鼠myl9(b)的浓度依赖性结合，并且显示所述结合被抗小鼠/人myl9单克隆抗体(抗体a)显著抑制(c)。
图4-1显示了给予抗小鼠/人myl9单克隆抗体(抗体a)对气道炎症时诱导的支气管周围细胞浸润的抑制作用。图4a显示了向患有诱导的气道炎症的小鼠给予抗小鼠/人myl9单克隆抗体(抗体a)后苏木精/伊红染色(he染色)和pas染色的结果。图4b显示了向患有诱导的气道炎症的小鼠给予抗小鼠/人myl9单克隆抗体(抗体a)后，在支气管肺泡灌洗液中观察到的浸润细胞数量和浸润细胞类型。图4c显示了向患有诱导的气道炎症的小鼠给予抗小鼠/人myl9单克隆抗体(抗体a)后产生的细胞因子的量。
图4-2显示了诱导气道炎症后第17天抗体a给予组(d)、抗myl9/12多克隆抗体给予组(e)与对照抗体给予组(d、e)之间的乙酰甲胆碱诱导的气道阻力的比较。
图5显示了cd4阳性cd45rb强阳性(cd4+cd45rb高)t淋巴细胞转移炎性肠病模型中由于抗小鼠/人myl9单克隆抗体(抗体a)引起的体重减轻(上图)和疾病活动指数(dai)(下图)的结果。
图6-1显示了评估由抗体a制备的嵌合抗体和人源化抗体与人myl9的结合能力的elisa结果。
图6-2显示了评估由抗体a制备的嵌合抗体和人源化抗体与人myl9的结合能力的elisa结果。
图6-3显示了评估由抗体a制备的嵌合抗体和人源化抗体与人myl9的结合能力的elisa结果。
图7对应地显示了小鼠myl9、小鼠myl12a与小鼠myl12b之间的氨基酸序列的比较(a)以及人myl9、人myl12a与人myl12b之间的氨基酸序列的比较(b)。*：保守氨基酸；-：空位；下划线：用于免疫小鼠以制备抗体a的肽的氨基酸序列。
图8显示了评估抗体a与小鼠myl9、小鼠myl12a和小鼠myl12b的结合能力(a)以及与人myl9、人myl12a和人myl12b的结合能力(b)的elisa结果。
图9a显示了评估由抗体a制备的嵌合抗体和人源化抗体与人myl12a和12b的结合能力的elisa结果。
图9b显示了评估由抗体a制备的人源化抗体与人myl12a和12b的结合能力的elisa结果。
图9c显示了评估由抗体a制备的人源化抗体与人myl12a和12b的结合能力的elisa结果。
图10显示了人和小鼠cd69的胞外区的氨基酸序列的比较。
图11显示了人cd69的胞外区与人myl9以及与人myl9具有较高的同源性的myl12a和12b的浓度依赖性结合。
图12显示了抗体a对人cd69的胞外区与人myl9(a)、人myl12a(b)或人myl12b(c))之间的结合的浓度依赖性抑制的结果。
图13-1显示了由抗体a制备的嵌合抗体和人源化抗体对人myl9与人cd69的胞外区之间的结合的浓度依赖性抑制的结果。
图13-2上接图13-1。
图13-3上接图13-2。
图13-4上接图13-3。
图13-5上接图13-4。
图14-1显示了由抗体a制备的嵌合抗体和人源化抗体对人myl12a或人myl12b与人cd69的胞外区之间的结合的浓度依赖性抑制的结果。
图14-2上接图14-1。
图14-3上接图14-2。
图14-4上接图14-3。
图15显示了小鼠结直肠癌细胞系ct26.wt中皮下肿瘤组织中myl9、myl12a和myl12b表达的分析结果。
图16显示了在小鼠结直肠癌细胞系ct26.wt皮下移植模型中对照组(a)、抗体a单独给予组(b)、抗pd-1抗体单独给予组(c)和抗体a和抗pd-1抗体组合给予组(d)中肿瘤生长的抑制。
具体实施方式
本发明涉及与肌球蛋白调节轻链多肽(在下文中称为myl)9结合的抗myl9抗体。
本发明中使用的抗myl9抗体是可识别myl9并与其结合的抗体，并且如下所述，所述抗体可以是完整抗体。可替代地，本发明中使用的抗myl9抗体可以是重组抗体(如嵌合抗体、人源化抗体或人抗体)或化学合成抗体以及其抗原结合片段，只要其具有与myl9的结合亲和力即可。本文中的myl9可以被理解为指来源于人或小鼠的myl9。来源于人或小鼠的myl9的氨基酸序列可以从登记了基因和氨基酸序列信息的公共数据库(如由美国国家生物技术信息中心提供的genbank)获得，或者氨基酸序列可以从myl9基因的序列信息确定，该序列信息是通过基于密切相关动物物种的myl9的碱基序列信息设计引物并且从所需动物物种中提取的rna进行克隆而获得的。例如，人和小鼠myl9的氨基酸序列信息分别以genbank登录号np_006088.2(seqidno.2)和genbank登录号np_742116.1(seqidno.1)登记在数据库中。
在本发明的一个方面中，myl9包含由在seqidno.1中阐述的氨基酸序列表示的肽或由在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列表示的肽。如本文所用的涉及myl9的“多个(multiple)”不受限制，只要保留与由其原始氨基酸序列表示的肽的功能特性等同的功能特性即可，并且是2至20个，例如2至15个、2至10个、2至9个、2至8个、2至7个、2至6个或2至5个。在本发明的另一个方面中，myl9包含由与在seqidno.1中阐述的氨基酸序列具有至少90％，例如91％、92％、93％、94％或95％同源性的氨基酸序列表示的肽。
如本文所用的，氨基酸序列的“同源性”意指在以下参数设置下使用clustalw算法通过成对比对计算的同源性：
k元组(字)长：1
窗口大小：5
空位罚分：3
顶对角线数量：5
评分方法：百分比
在本发明的一个方面中，myl9包含由在seqidno.2中阐述的氨基酸序列表示的肽或由在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列表示的肽。如本文所用的涉及myl9的“多个”不受限制，只要保留与由其原始氨基酸序列表示的肽的功能特性等同的功能特性即可，并且是2至20个，例如2至15个、2至10个、2至9个、2至8个、2至7个、2至6个或2至5个。在本发明的另一个方面中，myl9包含由与在seqidno.2中阐述的氨基酸序列具有至少90％，例如91％、92％、93％、94％或95％同源性的氨基酸序列表示的肽。
在本发明的一个方面中，myl9包含由在seqidno.3中阐述的氨基酸序列表示的肽或由在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列表示的肽。如本文所用的涉及myl9的“多个”不受限制，只要保留与由其原始氨基酸序列表示的肽的功能特性等同的功能特性即可，并且是2至20个，例如2至15个、2至10个、2至9个、2至8个、2至7个、2至6个或2至5个。在本发明的另一个方面中，myl9包含由与在seqidno.3中阐述的氨基酸序列具有至少90％，例如91％、92％、93％、94％或95％同源性的氨基酸序列表示的肽。
在本发明的一个方面中，小鼠myl9和小鼠myl12a以及小鼠myl9和小鼠myl12b的氨基酸序列分别具有94.2％和93.6％的同源性，并且小鼠myl12a和小鼠myl12b具有97.7％的同源性。人myl9和人myl12a以及人myl9和人myl12b的氨基酸序列分别具有91.8％和93.0％的同源性，并且人myl12a和人myl12b具有96.5％的同源性。由于这个原因，识别myl9的抗体有时识别myl12a。此外，识别myl9的抗体有时识别myl12b。因此，在本发明的一个实施例中，本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段也可以识别myl12a和/或myl12b。
在本发明的一个方面中，本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段是抑制myl9与cd69的胞外区之间的结合的抗体。例如，本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段可以是抑制cd69胞外区的任何部分与myl9之间的结合的抗体或抗原结合片段，该myl9包含由在seqidno.4中阐述的氨基酸序列表示的肽或由在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列表示的肽。如本文所用的涉及cd69的胞外区的“多个”是但不限于2至15个，例如2至14个、2至13个、2至12个、2至11个、2至10个、2至9个、2至8个、2至7个、2至6个或2至5个。在本发明的另一个方面中，本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段可以是抑制cd69胞外区的任何部分与myl9之间的结合的抗体或抗原结合片段，该任何部分包含由与在seqidno.4中阐述的氨基酸序列具有至少90％，例如91％、92％、93％、94％或95％同源性的氨基酸序列表示的肽。
在本发明的另一个方面中，本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段是抑制myl12a和/或myl12b与cd69的胞外区之间的结合的抗体。例如，本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段可以是抑制cd69胞外区的任何部分与myl12a和/或myl12b之间的结合的抗体或抗原结合片段，该任何部分包含由在seqidno.97中阐述的氨基酸序列表示的肽或由在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列表示的肽。在本发明的另一个方面中，本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段可以是抑制cd69胞外区的任何部分与myl12a和/或myl12b之间的结合的抗体或抗原结合片段，该任何部分包含由与在seqidno.97中阐述的氨基酸序列具有至少90％，例如91％、92％、93％、94％或95％同源性的氨基酸序列表示的肽。
在本发明的一个方面中，该抗myl9抗体或其myl9结合片段可以与哺乳动物(例如啮齿动物如小鼠、大鼠或兔、猴、牛、马、山羊、人等)的myl9结合以抑制myl9与cd69之间的相互作用，并且优选地可以与人myl9结合以抑制人myl9与人cd69之间的相互作用。本文中的“抑制myl9与cd69之间的相互作用”意指myl9与cd69之间的相互作用消失或降低。myl9与cd69之间的相互作用可以通过测量由于myl9和cd69在共存下作用而引起的cd69功能的变化(例如cd69功能的表达或增强，或由于myl9的作用引起的cd69功能的变化而产生的生理功能)或测量表达cd69的cd4t细胞向骨髓的迁移来评估。
在本发明的另一个方面中，该抗myl9抗体或其myl9结合片段还可以与哺乳动物(例如啮齿动物如小鼠、大鼠或兔、猴、牛、马、山羊、人等)的myl12a和/或myl12b结合以抑制myl12a和/或myl12b与cd69之间的相互作用，并且优选地还可以与人myl12a和/或人myl12b结合以抑制人myl12a和/或人myal12b与人cd69之间的相互作用。本文中的“抑制myl12a和/或myl12b与cd69之间的相互作用”意指myl12a和/或myl12b与cd69之间的相互作用消失或降低。myl12a和/或myl12b与cd69之间的相互作用可以通过测量由于myl12a和/或myl12b和cd69在共存下作用而引起的cd69功能的变化(例如cd69功能的表达或增强，或由于myl12a和/或myl12b的作用引起的cd69功能的变化而产生的生理功能)或测量表达cd69的cd4t细胞向骨髓的迁移来评估。
用于测量抗体或其抗原结合片段的抗原结合特性(如结合亲和力和跨物种反应性)的方法可以是本领域的普通技术人员在技术领域中众所周知的方法。例如，结合亲和力可以使用(但不限于)
本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段可以优选地是与myl9或具有针对所述抗体的myl9的结合区的氨基酸序列的其他肽分子结合的单克隆抗体、多克隆抗体或其myl9结合片段中的任一种。
本文中的单克隆抗体可以意指从基本上一致的抗体群体获得的抗体。换言之，所述群体中所包含的各个抗体相同，除了少量有可能存在的天然存在的突变体以外。单克隆抗体针对单个抗原位点。此外，与靶向不同抗原或不同表位的典型的多克隆抗体相反，每种单克隆抗体靶向抗原的单个表位。修饰语“单克隆”表示从基本上一致的抗体群体获得的抗体的特性，不应被理解为限于需要通过特定方法来产生抗体。
本文中的本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段可以为诸如igg、iga或igm(或其亚类)等任何类别，并不限于特定类别。根据重链(有时也称为h链)的恒定区的抗体氨基酸序列，将免疫球蛋白分成不同类别。有五种主要的免疫球蛋白类别：iga、igd、ige、igg和igm，这些中的一些可以进一步细分为诸如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2等亚类(同种型)。不同类别的免疫球蛋白所对应的重链的恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。此外，抗体的轻链(有时也称为l链)的类型包括λ链和κ链。
在一个方面中，本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段可以为igg抗体，例如igg1抗体或igg2抗体等。此外，本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段可以处于单体、二聚体或多聚体的形式。
本文中的myl9结合片段是抗myl9抗体的功能和结构片段，并且没有特别限制，只要其具有对myl9的结合能力即可。这样的myl9结合片段的实例可以包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、fv、单链(scfv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白或融合肽、包含myl9识别位点的免疫球蛋白分子的其他修饰结构体等。
抗myl9抗体的myl9结合片段可以经由通过例如蛋白酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶对完整抗体进行蛋白水解消化而获得，或者可以由重组宿主细胞(例如诸如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞等真核生物、或诸如大肠杆菌等原核生物)直接产生。例如，f(ab')2片段可以通过自大肠杆菌直接回收fab'-sh片段并使其经受化学结合而形成。f(ab')2也可以使用促进f(ab')2分子的组装的亮氨酸拉链gcn4形成。此外，当通过化学合成技术产生scfv时，可以使用自动合成仪。当通过基因重组技术产生scfv时，可以将包含编码scfv的多核苷酸的适当的质粒引入适当的宿主细胞(例如诸如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞等真核生物、或诸如大肠杆菌等原核生物)中。编码感兴趣的scfv的多核苷酸可以通过诸如多核苷酸连接等众所周知的操作产生。作为结果产生的scfv可以使用本领域中众所周知的标准蛋白质纯化技术分离。
本文中的抗体的可变区意指抗体轻链的可变区、抗体重链的可变区或两者。此外，本文中的抗体的恒定区意指抗体轻链的恒定区、抗体重链的恒定区或两者。重链和轻链的可变区各自由通过也称为高变区的三个cdr连接的四个框架区(fr)组成。各链中的cdr通过fr而保留在附近，与另一链中的cdr一起有助于抗体的抗原结合位点的形成。用于确定cdr的技术可以包括但不限于例如(1)基于跨物种序列变异性的方法(如kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest[免疫学感兴趣的蛋白质的序列]，第5版，1991，nationalinstitutesofhealth[国立卫生研究院]，马里兰州贝塞斯达])；和(2)基于抗原-抗体复合体的结晶结构学研究的方法(al-lazikani等人，1997j.molec.biol.[分子生物学杂志]273:927-948)。这些或其他方法可以组合使用。
本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段是重组抗体(如嵌合抗体、人源化抗体或人抗体)或化学合成抗体、非人哺乳动物(例如啮齿动物如小鼠、大鼠或兔、猴、牛、马、山羊等)抗体或其myl9结合片段。本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段是人源化或嵌合抗体、优选人源化抗体。嵌合抗体是例如将非人(如小鼠或大鼠)抗体的可变区引入人抗体的恒定区的抗体，例如指可变区来源于非人抗体且恒定区来源于人抗体的抗体。人源化抗体是例如将非人抗体的高变区引入人抗体的抗体，例如指cdr来源于非人抗体且其余抗体区来源于人抗体的抗体。请注意，在本发明中，嵌合抗体与人源化抗体的界限并非必须明确，抗体可以处于可称为嵌合抗体或人源化抗体的状态。本文优选的人源化抗体的一个方面是cdr来源于啮齿动物抗体且其余抗体区来源于人抗体的抗体，特别优选cdr来源于小鼠抗体且其余抗体区源自人抗体的抗体。人源化也可以通过使用cdr移植方法将来源于例如啮齿动物的抗体的cdr序列引入人抗体的相应位点来进行(参见jones等人，nature[自然]321:522-525(1986)；riechmann等人，nature[自然]332:323-327(1988)；和verhoeyen等人，science[科学]239:1534-1536(1988)；kontermann和dubel，antibodyengineering,springerlabmanual[抗体工程，施普林格实验室手册](2001)和tsurushita等人，methods[方法]36:69-83(2005))。在一些情况下，人源化抗体也可以是fr中的几个氨基酸残基被来源于非人抗体中相似位点的氨基酸残基取代的人源化抗体。
为了降低抗原性在人源化抗体的产生中针对轻链和重链选择人可变区的使用可能是重要的。针对已知人fr序列的完整文库筛选啮齿动物如小鼠、大鼠或兔抗体的可变区的氨基酸序列。接下来，接受与啮齿动物抗体序列最接近的人抗体的氨基酸序列作为人源化抗体的人fr。例如，o'brien和jones，antibodyengineering[抗体工程](springerlabmanual[施普林格实验室手册])，567-590可以用作参考。在另一种方法中，使用来源于轻链或重链的特定亚组中所有人抗体共有的序列的特定框架。几种不同的人源化抗体可以使用相同的框架。例如，carter等人，proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]，89:4285-4289(1992)和presta等人，j.immunol.[免疫学杂志]，151:2623-2632(1993)可以用作参考。
此外，理想的是人源化抗体通常保留对抗原的高结合亲和力和其他优选的生物性质。为了实现此目的，根据一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的步骤来制备人源化抗体。通常，三维免疫球蛋白模型可供使用并且是本领域的普通技术人员已知的。说明和显示选择的候选免疫球蛋白序列的潜在三维构象的计算机程序可供使用。通过研究这些说明的三维构象，可以分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的氨基酸残基。通过此方法，可以设计fr残基，使得获得期望的抗体特性，如保留对单个或多个靶抗原(如myl9或其片段)的结合亲和力。
对上文例示的嵌合或人源化抗体进行适当改变(例如抗体的修饰、或抗体的氨基酸序列的部分取代、添加或缺失)同时保留所述抗体的功能(或者为了增加或改进所述抗体的功能)的抗体也包括在本发明的抗体中。具体地，为了减少由抗体产生细胞产生的抗体的不均一性而通过诸如遗传修饰等人工方法使位于重链的羧基末端(c末端)的赖氨酸(lys)缺失的抗体也包括在本发明的范围内。其他部分取代的实例可以包括但不限于重链234位的氨基酸残基从缬氨酸(v)突变成丙氨酸(a)的抗体、重链237位的氨基酸残基从甘氨酸(g)突变成丙氨酸(a)的抗体、以及它们的组合等。请注意，所述突变在本文中分别被描述为v234a和g237a。
本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段可以根据需要进行修饰。本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段的修饰可以为改变(a)诸如片层或螺旋构象等在修饰区的氨基酸序列的三维结构；(b)靶位点的分子的电荷或疏水性状态；或者(c)修饰对侧链体积维持的影响的修饰，或者可替代地可以实施不会明显观察到这些变化的修饰。
本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段的修饰可以例如通过构成氨基酸残基的取代、缺失、添加等实现。
本文中的氨基酸以其最广泛的含义使用，不仅包括诸如丝氨酸(ser)、天冬酰胺(asn)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、丙氨酸(ala)、酪氨酸(tyr)、甘氨酸(gly)、赖氨酸(lys)、精氨酸(arg)、组氨酸(his)、天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)、谷氨酰胺(gln)、苏氨酸(thr)、半胱氨酸(cys)、甲硫氨酸(met)、苯丙氨酸(phe)、色氨酸(trp)和脯氨酸(pro)等天然氨基酸，也包括诸如氨基酸变异体和衍生物等非天然氨基酸。本领域的普通技术人员应认识到，鉴于此广泛的定义，本文中的氨基酸的实例可以包括l-氨基酸；d-氨基酸；诸如氨基酸变异体和衍生物等经化学修饰的氨基酸；诸如正亮氨酸、β-丙氨酸和鸟氨酸等在体内不为蛋白质的构成材料的氨基酸；以及具有本领域的普通技术人员众所周知的氨基酸特性的经化学合成的化合物。非天然氨基酸的实例可以包括α-甲基氨基酸(如α-甲基丙氨酸)、d-氨基酸(如d-天冬氨酸和d-谷氨酸)、组氨酸样氨基酸(如2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸和α-甲基-组氨酸)、在侧链具有多余的亚甲基的氨基酸(高氨基酸)以及侧链中的羧酸官能基氨基酸被磺酸基取代的氨基酸(如磺基丙氨酸)。
天然存在的氨基酸残基可以例如根据一般的侧链特性而分为以下几组：
(1)疏水性：met、ala、val、leu和ile；
(2)中性亲水性：cys、ser和thr；
(3)酸性：asp和glu；
(4)碱性：asn、gln、his、lys和arg；
(5)影响链取向的残基：gly和pro；以及
(6)芳香族：trp、tyr和phe。
构成抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的非保守性取代可以通过将属于这些组之一的氨基酸与属于另一组的氨基酸交换来进行。更具保守性的取代可以通过将属于这些组之一的氨基酸与属于同一组的另一氨基酸交换来进行。类似地，也可以适当地进行氨基酸序列的缺失或取代。
构成抗体或其抗原结合片段的氨基酸的修饰可以例如为诸如利用糖的糖基化、乙酰化或磷酸化等翻译后修饰。抗体可以在其恒定区中的保守位置进行糖基化。抗体的糖基化通常为n-连接的或o-连接的。n-连接的意指糖部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸、天冬酰胺-x-苏氨酸和天冬酰胺-x-半胱氨酸(其中x为除脯氨酸以外的任何氨基酸)为用于将糖部分酶促地添加到天冬酰胺侧链的识别序列。当这些三肽序列中的任一者存在于抗体或其抗原结合片段中时，存在潜在的糖基化位点。o-连接的糖基化可以为n-乙酰基半乳胺糖、半乳糖或木糖与羟基氨基酸(如丝氨酸或苏氨酸)的连接，并且在一些情况下可以为与5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸的连接。本领域的普通技术人员可以根据目的适当地选择糖基化条件(例如当使用生物学方法进行糖基化时，宿主细胞或细胞培养基的类型、ph值等)。
本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段可以进一步基于本领域的普通技术人员众所周知的技术常识通过其他修饰方法单独或组合进行修饰。
本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段可以通过本领域的普通技术人员众所周知的方法产生。例如，可以使用产生本发明的myl9抗体或其myl9结合片段的杂交瘤而产生抗体，或者可以通过将编码本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段的基因整合到表达载体中并将所述表达载体引入大肠杆菌细胞、猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞等中而产生抗体。编码本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段的基因优选地具有编码信号序列的dna，并且更优选地具有在编码重链可变区的dna和编码轻链可变区的dna的5'末端编码信号序列的dna。信号序列是存在于蛋白质n末端的氨基酸残基，其是在分泌性蛋白或整合膜蛋白在核糖体上合成后通过磷脂双分子层所必需的。本文中的信号序列没有特别限制，只要其是具有此功能的序列即可。可以包含在本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段中的信号序列可以包括来源于人、小鼠、大鼠、兔、驴、山羊、马、鸟、狗、猫、酵母等的信号序列。信号序列的一个具体方面可以包括包含由seqidno.12表示的氨基酸序列作为与重链有关的信号序列的肽和包含由seqidno.14表示的氨基酸序列作为与轻链有关的信号序列的肽。此外，一个或多个(如2个、3个、4个或5个)氨基酸的取代、添加或缺失可以存在于由seqidno.12表示的氨基酸序列或由seqidno.14表示的氨基酸序列中，只要其在功能上是等同的即可。
本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段可以为根据本领域的普通技术人员众所周知的方法分离或纯化的那些。此处，“分离的”或“纯化的”意指从天然的状态人工地进行分离或纯化。当分子或组合物天然存在时，这意味着当它发生改变或自原来存在的环境中去除或两者时为“分离的”或“纯化的”。分离或纯化方法的实例可以包括但不限于电泳、分子生物学、免疫学或层析方法等，具体地离子交换层析、疏水层析或反相hplc层析、或等电聚焦等。
本文中的“免疫检查点抑制剂”意指针对参与免疫检查点机制(一种抑制t细胞活化的系统)的免疫检查点分子的抑制剂，并且包括pd-1抑制剂和ctla-4抑制剂。术语“免疫检查点分子”包括作为免疫检查点起作用的受体和配体两者。
本文中的术语“与免疫检查点抑制剂组合使用”意指将包含本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段和药学上可接受的载体或添加剂的药物组合物与免疫检查点抑制剂大约同时向患有肿瘤的患者给予，作为治疗方案的一部分。当组合给予时，该药物组合物和该免疫检查点抑制剂可以同时地、分开地、连续地或以一定时间间隔以各自的有效量向患者给予。该治疗方案可以包括另一种抗癌剂。该药物组合物和该免疫检查点抑制剂可以按分开的给药周期向患者给予。如果该药物组合物和该免疫检查点抑制剂同时给予，则可以给予包含这些的单个组合制剂。
本文中的“pd-1抑制剂”意指直接或间接作用于pd-1以抑制pd-1的t细胞抑制作用的物质。pd-1抑制剂包括与pd-1结合以抑制其t细胞抑制作用的低分子化合物、肽和抗pd-1抗体，以及与pd-l1结合并抑制其pd-1结合活性以抑制pd-1的t细胞抑制作用的低分子化合物、肽和抗pd-1抗体。抗pd-1抗体并不限于但包括派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)和medi0680(amp-514)。抗pd-l1抗体并不限于但包括阿特珠单抗(atezolizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)和阿维单抗(avelumab)。
本文中的“ctla-4抑制剂”是指作用于ctla-4以抑制ctla-4的t细胞抑制作用的物质。ctla-4抑制剂包括与ctla-4结合以抑制其t细胞抑制作用的低分子化合物、肽和抗ctla-4抗体。抗ctla-4抗体并不限于但包括伊匹木单抗(ipilimumab)和曲美木单抗(tremelimumab)。
本文中的“恶性淋巴瘤”意指从淋巴组织发展而来的一组血液恶性肿瘤。恶性淋巴瘤包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤，后者包括弥漫性大b细胞淋巴瘤等。
本文中的“头颈癌”意指从面部到颈部的区域中发展的恶性肿瘤的总称，包括头颈部鳞状细胞癌作为一部分。
本文中的“尿路上皮癌”意指从尿路上皮细胞发展而来的上皮恶性肿瘤，包括肾盂癌、尿道癌和膀胱癌作为狭义术语。
本文中的“乳腺癌”意指在乳腺组织中发展的癌。部分乳腺癌是不表达雌激素受体、孕酮受体和人表皮生长因子受体2(her-2)的三阴性乳腺癌。
在本发明的另一个优选的实施例中，该抗myl9抗体或其myl9结合片段具有以下cdr：
(a)由在seqidno.28中阐述的氨基酸序列表示的肽组成的重链cdr1；
(b)由在seqidno.30中阐述的氨基酸序列表示的肽组成的重链cdr2；
(c)由在seqidno.32中阐述的氨基酸序列表示的肽组成的重链cdr3；
(d)由在seqidno.33中阐述的氨基酸序列表示的肽组成的轻链cdr1；
(e)由在seqidno.34中阐述的氨基酸序列表示的肽组成的轻链cdr2；以及
(f)由在seqidno.35中阐述的氨基酸序列表示的肽组成的轻链cdr3。
在本发明的另一个优选的实施例中，该抗myl9抗体或其myl9结合片段包含重链和轻链，所述重链的可变区包含由在seqidno.55、56、57、58、59、60、61、62、63或64中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且所述轻链的可变区包含由在seqidno.65、66、67或68中阐述的氨基酸序列表示的肽。
所述重链或轻链的可变区的氨基酸序列可以包含所述序列中一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失。如本文所用的“多个”不受限制，只要保留针对myl9的结合亲和力并抑制myl9与cd69之间的相互作用即可，并且是2至15个、更优选2至10个，例如9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个。可替代地，所述重链或轻链的可变区的氨基酸序列包含由与所述序列具有至少90％，例如91％、92％、93％、94％或95％同源性的氨基酸序列表示的肽。
在本发明的另一个优选的实施例中，该抗myl9抗体或其myl9结合片段是包含由以下组合组成的重链和轻链可变区的抗体：
(1)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.64中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(2)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.63中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(3)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.56中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(4)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.57中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(5)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.55中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(6)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.58中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(7)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.59中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(8)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.60中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(9)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.61中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(10)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.64中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(11)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.63中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(12)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.56中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(13)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.57中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(14)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.55中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(15)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.58中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(16)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.59中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(17)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.60中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(18)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.61中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(19)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.62中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.65中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(20)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.62中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.67中阐述的氨基酸序列表示的肽；
(21)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.62中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.66中阐述的氨基酸序列表示的肽；以及
(22)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包含由在seqidno.62中阐述的氨基酸序列表示的肽，并且该轻链可变区包含由在seqidno.68中阐述的氨基酸序列表示的肽。
在一个方面中，本发明涉及包含本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段的药物组合物。
处于水性或干燥制剂形式的包含本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂。可接受的载体、赋形剂或稳定剂的实例包括盐水；缓冲液，如磷酸、柠檬酸或其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；或非离子表面活性剂，如tweentm、pluronicstm或peg。
包含本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段的药物组合物可以例如封入微胶囊内、胶体性药物传递体系(如脂质粒、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子或纳米胶囊)内、或粗乳液内。当在具有适于需要给予抗体的任何疾病的释放特性的制剂中期望抗体的持续释放给予时，可以预期抗体的微胶囊化。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸、l-谷氨酸与γ乙基-l-谷氨酸酯的共聚物、非降解性乙烯-乙酸乙烯酯、降解性乳酸-乙醇酸共聚物如luprondepottm(一种由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的注射用微球体)以及聚-d-(-)-3-羟基丁酸。
如上所述，本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段可以抑制myl9与cd69之间的相互作用。因此，包含本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段的药物组合物可以用于治疗归因于myl9与cd69之间的相互作用的疾病，例如过敏性气道炎症如哮喘、慢性过敏性鼻炎或一些鼻窦炎，气道炎症疾病如不包括在过敏性气道炎症中的鼻窦炎，以及炎性肠病如溃疡性结肠炎、克罗恩病、白塞病和嗜酸性胃肠功能紊乱。换言之，在另一个方面中，本发明包括用于治疗气道炎症疾病或炎性肠病的方法，该方法包括向受试者给予治疗有效量的本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段的步骤。此外，在另一个方面中，本发明包括本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段用于制造气道炎症疾病或炎性肠病的治疗药物的用途。在另一个方面中，本发明包括用于治疗气道炎症疾病或炎性肠病的方法中使用的抗myl9抗体或其myl9结合片段。此外，在另一个方面中，本发明包括用于制造治疗气道炎症疾病或炎性肠病的药物的抗myl9抗体或其myl9结合片段。
当与免疫检查点抑制剂组合时，包含本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段的药物组合物可以用于治疗诸如结直肠癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌、肝细胞癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、小细胞肺癌、间皮瘤和子宫内膜癌等肿瘤。换言之，在另一个方面中，本发明包括用于治疗肿瘤的方法，该方法包括向受试者给予治疗有效量的本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段的步骤，其中该抗myl9抗体或其myl9结合片段与该免疫检查点抑制剂组合给予给该受试者。此外，在另一个方面中，本发明包括本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段用于制造待与免疫检查点抑制剂组合使用的肿瘤的治疗药物的用途。在另一个方面中，本发明包括待与免疫检查点抑制剂组合给予用于治疗肿瘤的方法中使用的抗myl9抗体或其myl9结合片段。此外，在另一个方面中，本发明包括用于制造待与免疫检查点抑制剂组合使用治疗肿瘤的药物的抗myl9抗体或其myl9结合片段。
当包含本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段的药物组合物与免疫检查点抑制剂组合使用治疗肿瘤时，该抗myl9抗体或其myl9结合片段优选地是也抑制myl12a和/或myl12b与cd69之间的相互作用的抗体或其结合片段。
本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段可以在治疗方法中单独或与其他药剂或组合物组合使用(在治疗肿瘤的方法中，本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段与免疫检查点抑制剂组合给予)。例如，本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段可以与另一种药剂同时或不同时给予。这样的组合治疗包括联合给予(在相同或不同的制剂中包含两种或更多种药剂)和分开给予(例如同时或依次地)。当分开给予两种或更多种药剂时，本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段的给予可以在伴随治疗方法之前或之后。
给予包含本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段的药物组合物的受试者不受限制，并且本发明用于人或非人哺乳动物(啮齿动物如小鼠、大鼠或兔、猴、牛、马、山羊等)。
向受试者给予包含本发明的抗myl9抗体或其myl9结合片段的药物组合物的方法(如给药途径、剂量、每天的给药频率和给药时间)不受限制，并且可以由本领域的普通技术人员(如医生)根据受试者的健康状态、疾病的程度、组合使用的药剂的类型等适当地决定。
只要技术上不矛盾，则可以将本文中所描述的所有方面中的任何一个或多个适当地组合以实施本发明。此外，只要技术上不矛盾，则应该优选的是将本文中所描述的所有优选或有利的方面适当地组合以实施本发明。
本文中所引用的文献的全部披露内容应视为通过引用而明确地援用在本文中，本领域的普通技术人员可以根据本文的上下文在不脱离本发明的范围的情况下将与这些文献相关的披露内容作为本说明书的一部分加以援用。
本文中所引用的文献仅是为了披露本申请的申请日前的相关技术而提供，不应解释为诸位发明人由于先前发明或任何其他理由而承认不具有先行于所述披露内容的权利。这些文献的全部描述是基于诸位申请人可获取的信息，不以任何方式构成承认这些描述正确。
本文所用的术语是用于描述特定的实施例，并非意在限定本发明。
除非上下文明确地表明以另外的方式理解，如本文所用的术语“包含(comprise)”意指存在所描述的项目(如组分、步骤、要素或数字)，不排除存在其他项目(如组分、步骤、要素和数字)。术语“由......组成(consistof)”包括以术语“由......组成(consistof)”和/或“基本上由......组成(consistessentiallyof)”所描述的方面。
如本文所用的术语“中和活性”意指抑制myl9与cd69之间的结合的活性，和/或降低人体内诱导的由于myl9与cd69之间的相互作用造成的细胞的信号转导、分子表达应答或细胞功能改变的活性。
除非另外定义，本文所用的全部术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属技术领域的普通技术人员广泛认可的含义相同的含义。除非另有明确定义，本文所用的术语应解释为具有与本文和相关技术领域中的含义一致的含义，不应解释为具有理想化或过于正式的含义。
诸如第一和第二等术语是用以表述各种要素，应认识到这些要素不受这些术语本身的限制。这些术语仅用于将一个要素与另一要素区分的目的，例如可以在不脱离本发明的范围的情况下将第一要素描述为第二要素，类似地，将第二要素描述为第一要素。
除非明确指出，本文中用以表示组分含量或数值范围等的数值应理解为以术语“约”修饰。例如，除非明确指出，“4℃”应认为意指“约4℃”，本领域的普通技术人员可以根据技术常识和本说明书的上下文自然而合理地认识其范围。
除非上下文明确地表示其他含义，当在本文的说明书和权利要求书中使用时，应认识到以单数形式表示的各方面只要技术上不矛盾也可以是复数形式，反之亦然。
现在将参考实例更详细地描述本发明。然而，本发明可以通过各种方面来体现，不应解释为限于本文中所描述的实例。相关技术领域的本领域的普通技术人员可以在不改变本发明的范围的情况下通过各种修改、添加、删除、替换等实施本发明。
实例
实例1：抗小鼠/人myl9单克隆抗体的产生
小鼠抗小鼠/人myl9单克隆抗体的产生
为了产生针对小鼠myl9(genbank登录号np_742116.1，seqidno.1)和人myl9(genbank登录号np_006088.2，seqidno.2)的单克隆抗体，通过以下步骤制备在小鼠myl9和人myl9共有的n末端序列的c末端(位置1-27)添加有半胱氨酸(cys)的肽(在下文称为小鼠/人myl9肽)(seqidno.3)和具有与其融合的钥孔戚血蓝蛋白(klh)的蛋白质(在下文称为“小鼠/人myl9肽-klh”)。图1-1a显示了小鼠myl9和人myl9序列的比较。
首先，通过委托东丽研究中心公司(torayresearchcenter,inc.)合成小鼠/人myl9肽(seqidno.3)，并且用imject马来酰亚胺活化的mcklh旋转试剂盒(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))产生小鼠/人myl9肽-klh。
将10μg的小鼠/人myl9肽-klh与同量的gerbu佐剂(葛布生物技术有限公司(gerbubiotechnikgmbh))混合，皮下注射至c57bl/6j小鼠的足垫。然后，在第3天、第7天和第10天，类似地给予小鼠/人myl9肽-klh。在第3天和第10天使用gerbu佐剂(葛布生物技术有限公司)。在第13天处死小鼠，收集周围淋巴结以制备淋巴结细胞。在genomeone-cf(石原产业株式会社(ishiharasangyokaisha,ltd.))的存在下，将制备的淋巴结细胞和p3u1骨髓瘤细胞(由京都大学(kyotouniversity)的junshimizu教授捐赠)以5:1的比例融合。将所述融合细胞在96孔塑料板中培养。孵育(5％co2，37℃)7天后，收集培养上清液。
用获得的培养上清液选取出对小鼠/人myl9肽具有反应性的孔，以及对小鼠cd69胞外区蛋白与小鼠myl9之间的结合具有抑制活性的孔。
用具有与小鼠/人myl9肽(seqidno.3)融合的牛血清白蛋白(bsa)的蛋白质(在下文称为小鼠/人myl9肽-bsa)通过elisa评估对小鼠/人myl9肽的反应性。
通过委托东丽研究中心公司合成小鼠/人myl9肽(seqidno.3)，并且用imject马来酰亚胺活化的bsa旋转试剂盒(赛默飞世尔科技公司)产生小鼠/人myl9肽-bsa。
编码在n末端添加有flag标签的小鼠cd69胞外区蛋白(位置62-199)(seqidno.4)的质粒(在下文称为3xflag-小鼠cd69ec)是由千叶大学(chibauniversity)捐赠，并且将其用expifectamine293转染试剂盒(赛默飞世尔科技公司/吉布科公司)转染到expi293f细胞(英杰公司(invitrogen)/生命技术公司(lifetechnologies))中。孵育(8％co2，37℃)4天后，收集培养上清液。从收集的培养上清液中，用抗flagm2亲和凝胶(西格玛公司(sigma))纯化3xflag-小鼠cd69ec。纯化后，用pngasef(新英格兰生物实验室(newenglandbiolabs))进行糖链切割处理。
对于谷胱甘肽-s-转移酶(gst)-his-小鼠myl9(在下文称为gst-his小鼠myl9)，将由千叶大学捐赠的质粒在大肠杆菌bl21-gold(de3)plys(安捷伦科技公司(agilenttechnologies))中表达并用谷胱甘肽琼脂糖4fastflow(通用医疗集团(gehealthcare))纯化。
根据以下步骤采用小鼠/人myl9肽-bsa进行elisa。将小鼠/人myl9肽-bsa涂布到96孔板(nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1xblockace(ds制药生物医药有限公司(dspharmabiomedicalco.,ltd.))将孔在室温下封闭1小时。用0.02％tween20/pbs洗涤3次后，将所述融合细胞的培养上清液添加到孔中。在室温下孵育1小时并洗涤3次后，添加辣根过氧化物酶标记的抗小鼠igg抗体(杰克逊免疫研究实验室(jacksonimmunoresearchlaboratories))，并将其在室温下孵育1小时。洗涤5次后，将tmbz(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)溶液添加到孔中，并将其在室温下孵育5-20分钟。将等量的反应淬灭溶液(2nh2so4)添加到孔中，并用酶标仪(珀金埃尔默公司(perkinelmer))读取450nm处的吸光度。
根据以下步骤评估对小鼠cd69胞外区蛋白与小鼠myl9之间的结合的抑制活性。将gst-his-小鼠myl9涂布到96孔板(nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1xblockace(ds制药生物医药有限公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.02％tween20/pbs洗涤3次后，将所述融合细胞的培养上清液添加到孔中。将其在室温下孵育1小时。将经历糖链切割处理的3xflag-小鼠cd69ec添加到孔中。在室温下孵育1小时并洗涤3次后，添加辣根过氧化物酶标记的抗flag抗体(西格玛公司)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤5次后，将tmbz(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)溶液添加到孔中，并将其在室温下孵育5-20分钟。将等量的反应淬灭溶液(2nh2so4)添加到孔中，并用酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm处的吸光度。
通过有限稀释法从经由上述步骤选取出的孔中克隆杂交瘤，以最终获得表达对小鼠/人myl9肽具有反应活性和对小鼠cd69胞外区蛋白与小鼠myl9之间的结合具有抑制活性的小鼠抗小鼠/人myl9抗体的杂交瘤克隆。
培养获得的杂交瘤克隆，并用蛋白质a(通用医疗集团)从培养上清液中纯化抗小鼠/人myl9抗体(“抗体a”(有时描述为“maba”))。使用单克隆抗体分型试剂盒(serotec公司)将抗体a同种型确定为igg2c,κ。
抗体a对小鼠/人myl9蛋白的结合能力的分析
通过elisa评估抗体a对小鼠和人myl9的结合能力。按照以下步骤，产生具有与小鼠myl3(genbank登录号np_034989.1，seqidno.5)、小鼠myl9、人myl3(genbank登录号np_000249.1，seqidno.6)和人myl9各自的c末端结合的组氨酸标签的蛋白质(在下文分别称为小鼠myl3-his、小鼠myl9-his、人myl3-his和人myl9-his)。显示了小鼠myl3与人myl3(图1-1b)、小鼠myl3与小鼠myl9(图1-2c)以及人myl3与人myl9(图1-2d)之间的氨基酸序列的比较。
编码小鼠myl3和小鼠myl9蛋白的基因由千叶大学捐赠。通过pcr从人心脏cdna扩增编码人myl3和人myl9蛋白的基因。将这些基因插入在其中插入有编码prescission蛋白酶(通用医疗集团)的切割序列的基因的pet42b载体(默克公司(merck))的bglii/bamhi位点中。将产生的载体转化到大肠杆菌菌株bl21-gold(de3)plys(安捷伦科技公司)中以允许表达连接有gst标签的小鼠myl3-his、小鼠myl9-his、人myl3-his和人myl9-his。通过谷胱甘肽琼脂糖4fastflow(通用医疗集团)纯化表达的蛋白质，用prescission蛋白酶切割gst标签，并通过talon超流金属亲和树脂(clontech公司)纯化小鼠myl3-his、小鼠myl9-his、人myl3-his和人myl9-his。
按照以下步骤通过elisa评估对小鼠/人myl9的结合能力。将小鼠myl3-his、小鼠myl9-his、人myl3-his和人myl9-his涂布到96孔板(nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1xblockace(ds制药生物医药有限公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.02％tween20/pbs洗涤3次后，以抗体a的4倍，从10μg/ml的浓度制备10个连续稀释物，并添加到孔中。在室温下孵育1小时并洗涤3次后，添加辣根过氧化物酶标记的抗小鼠igg抗体(杰克逊免疫研究实验室)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤5次后，将tmbz(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)溶液添加到孔中，并将其在室温下孵育5-20分钟。将等量的反应淬灭溶液(2nh2so4)添加到孔中，并用酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm处的吸光度。
抗体a显示出与小鼠和人myl9的浓度依赖性结合，但不与同小鼠和人myl9具有低同源性的小鼠和人myl3结合(图2)。
抗体a对小鼠cd69胞外区蛋白与小鼠myl9之间的结合的抑制活性的评估
通过竞争elisa评估抗体a对小鼠cd69胞外区蛋白与小鼠myl9之间的结合的抑制活性。首先，产生小鼠cd69胞外区蛋白和小鼠myl9蛋白。
具体地，小鼠myl3和myl9各自克隆自骨髓和心肌组织的cdna，并将其插入pet42b载体(默克公司)的多克隆位点中。将产生的表达载体转化到rosetta感受态细胞(默克公司)中，并选择具有表达载体的克隆。将各预培养的克隆培养基添加到500ml含有卡那霉素的lb溶液中，并将其在37℃下在摇床中培养。在od600＝0.4时添加终浓度为1mm的iptg(半井株式会社(nacalai))，并在37℃下诱导表达小鼠myl3和myl9蛋白持续3小时。3小时后，通过离心收集细胞，用裂解缓冲液[tris-hcl(ph8.0)和150mmnacl]裂解，然后用超声波仪匀化，同时在冰上冷却。通过离心除去不溶部分，将其通过0.45μm过滤器(康宁公司(corning))，然后用填充有ni-nta珠(凯杰公司(qiagen))的柱纯化。用洗涤缓冲液[tris-hcl(ph8.0)、150mmnacl和10mm咪唑]洗涤珠，然后用洗脱缓冲液[tris-hcl(ph8.0)、150mmnacl和500mm咪唑]洗脱结合蛋白质。用pd10(通用医疗集团)使获得的gst-his-小鼠myl3和gst-his-小鼠myl9蛋白经历到pbs的溶液置换。使用bradford溶液(伯乐公司(bio-rad))测量纯化蛋白质的浓度。
接下来，进行elisa以分析小鼠myl9与小鼠cd69之间是否存在结合(图3a和3b)。具体地，添加5μg/ml浓度的gst-his-小鼠myl3蛋白和gst-his-小鼠myl9蛋白，并将其在4℃下孵育过夜以将它们固定在elisa板上。次日，使用blockace(大日本住友制药株式会社(sumitomodainipponpharmaco.,ltd.))在室温下封闭1小时，然后将其用洗涤缓冲液(50mmhepes(ph6.5)、150mmnacl和0.02％tween20)洗涤3次。向每个孔中添加不同浓度的3xflag小鼠cd69ec蛋白，并使其在室温下反应1.5小时。在图3b中，使用n-连接的糖链被pngasef(neb)切割的3xflag小鼠cd69ec蛋白。对于4μg的3xflag小鼠cd69ec蛋白，通过使用1000u的pngasef进行n-连接的糖链的切割处理。用洗涤缓冲液洗涤3次后，添加hrp标记的抗flag(m2)抗体(西格玛公司)，使其在室温下反应1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤5次。将tmb溶液(伯乐公司)用作着色底物，并将反应用1nh2so4淬灭。使用spectramaxparadigm(分子器件公司(moleculardevice))测量450nm处的值。
如图3a和3b所示，显著检测到小鼠cd69与小鼠myl9的浓度依赖性结合。
进行竞争elisa以评估抗体a对小鼠cd69胞外区蛋白与小鼠myl9之间的结合的抑制活性。具体地，将gst蛋白(abcam公司)和gst-his-小鼠myl9蛋白添加到谷胱甘肽涂布的板(赛默公司(thermo))中以固定它们。将每个孔用blockace在室温下封闭1小时，然后用洗涤缓冲液(pbs和0.02％tween20)洗涤3次。以图3c中所述的浓度添加抗体a和抗myl9/12多克隆抗体，并使其在室温下反应1小时。添加pngasef处理的3xflag小鼠cd69ec蛋白，使其在4℃下反应过夜，并用洗涤缓冲液洗涤3次。添加hrp标记的抗flag(m2)抗体(西格玛公司)，使其在室温下反应1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤5次。将tmb溶液(伯乐公司)用作着色底物，并将反应用1nh2so4淬灭。使用spectramaxparadigm(分子器件公司)测量450nm处的值。
如图3c所示，在抗体a存在下，小鼠cd69与小鼠myl9之间的结合是浓度依赖性且显著受抑制的。此抑制活性倾向于高于抗myl9/12多克隆抗体的抑制活性。
抗体a的序列分析
通过5'-race(cdna末端的5'-快速扩增)方法扩增编码抗体a的重链和轻链的信号序列以及可变区的dna序列。使用rneasy迷你试剂盒(凯杰公司)由所述杂交瘤制备总rna，并利用dnase(凯杰公司，无rna酶的dna酶组)处理。使用cdna合成试剂盒(宝生物公司(takara))由所述总rna制备双链cdna。向所述cdna上添加通过寡dnaad29s(acatcactccgt)(seqidno.7)和寡dnaad29as(acggagtgatgtccgtcgacgtatctctgcgttgatacttcagcgtagct)(seqidno.8)的退火获得的5'衔接子(adaptor)。通过5'正向引物(5'-pcr4引物，agctacgctgaagtatcaacgcagag(seqidno.9))和3'反向引物(gccagtggatagactgatgg(seqidno.10)用于扩增小鼠igg重链，且gatggatacagttggtgcagc(seqidno.11)用于扩增小鼠igκ轻链)扩增获得的cdna。将扩增的cdna插入pcr2.1载体(英杰公司/生命技术公司)中。使用abi3130xl(seqidno.12-19)分析抗体a的基因序列。
通过以下步骤获得抗体a的重链和轻链的全长序列。使用rneasy迷你试剂盒(凯杰公司)由所述杂交瘤制备总rna，并利用dnase(凯杰公司，无rna酶的dna酶组)处理。使用cdna合成试剂盒(宝生物公司)由所述总rna制备cdna。以获得的cdna作为模板，通过pcr扩增编码抗体a的重链和轻链的基因序列，使用5'正向引物(gcgaagcttgccgccaccatggaatggagctgggtctttc(seqidno.20)用于扩增重链，且gcgaagcttgccgccaccatgaagttgcctgttaggctg(seqidno.21)用于扩增轻链)以及3'反向引物(gcggaattcatcatttacccagagaccgggagatgg(seqidno.22)用于扩增重链，且gcggaattcactaacactcattcctgttgaagctcttgac(seqidno.23)用于扩增轻链)，并对应地克隆到pee6.4和pee12.4载体(龙沙集团(lonza))中。使用abi3130xl(seqidno.12-19和24-27)分析基因序列。
对于抗体a的cdr，根据kabat编号系统(kabatnumberingsystem)使用abysis软件(来自ucl的许可)对抗体a的氨基酸序列进行编号，并且基于此编号，根据用于cdr鉴定(seqidno.28-43)的kabat定义法或abm定义法来确定cdr。
实例2：抗体a在ova诱导的小鼠气道炎症模型中的药物作用的评估
用ova诱导的气道炎症模型验证体内给予纯化的小鼠抗小鼠/人myl9抗体(抗体a)对过敏性气道炎症的作用。
首先，研究给予抗体a对气道炎症时诱导的支气管周围细胞浸润的抑制作用。具体地，向野生型balb/c小鼠腹膜内给予100μg/小鼠的卵清蛋白(ova)(西格玛公司)和4mg/小鼠的明矾(赛默公司)用于免疫接种。第一次给药当天设定为第0天，第二次给药在第7天进行。在第14天和第16天，用超声波雾化器(欧姆龙公司(omron))使小鼠雾化吸入1％ova溶液(10mg/ml盐水)持续30分钟以诱导气道炎症(ova吸入)。制备未吸入ova的组作为对照组(无吸入)。在第13天和第15天腹膜内给予抗体a、或小鼠igg2a,κ抗体(百进生技公司(biolegend))(用于对照)各100μg。在第18天，切下小鼠肺，用10％福尔马林溶液固定，然后包埋在石蜡中以产生组织切片，并进行苏木精/伊红染色(h&e染色)和pas(过碘酸-希夫)染色(图4-1a)。
如图4-1a所示，在吸入ova的对照抗体给予组的支气管周围见到严重的细胞浸润，但在吸入ova的抗体a给予组中细胞浸润受到显著抑制(图4-1a上图)。此外，在吸入ova的对照抗体给予组的支气管内见到pas染色阳性的粘液的产生，但在吸入ova的抗体a给予组中粘液的产生也被显著抑制(图4-1a下图)。
随后，在诱导气道炎症后的第17天进行支气管肺泡灌洗，比较抗体a给予组和对照抗体给予组在支气管肺泡灌洗液(balf)中见到的浸润细胞数量和浸润细胞类型。向小鼠腹膜内给予戊巴比妥na(70-90mg/kg)进行麻醉，然后切开气道以插入套管(碧迪公司(bectondickinson))，并将盐水(大冢制药公司(otsukapharmaceutical))注射到肺中以收集细胞来进行支气管肺泡灌洗。对收集的细胞(所有细胞)计数细胞数量。此外，将这些细胞悬浮于胎牛血清(fcs)中，并用cytospin3(赛默飞世尔科技公司)将其贴在载玻片上。将may-gruenwaldgiemsa(默克公司)试剂用于染色，并将细胞根据形态学标准鉴定为嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞。
如图4-1b所示，与对照抗体给予组相比，抗体a给予组中浸润细胞的总数显著减少，并且嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的各种细胞的数量也显著减少。
随后，比较抗体a给予组和对照抗体给予组收集的支气管肺泡灌洗液中包含的各种细胞因子(il-4、il-5、il-6、il-13和rantes)。使用流式细胞小球微阵列术(bd生物科学公司(bdbiosciences))进行测量。
如图4-1c所示，与对照抗体给予组相比，抗体a给予组的任何细胞因子(il-4、il-5、il-6、il-13和rantes)的产生减少。
随后，比较抗体a给予组(图4-2d)、抗myl9/12多克隆抗体给予组(图4-2e)和对照抗体给予组在诱导气道炎症后第17天乙酰甲胆碱诱导的气道阻力。
如图4-2d所示，在对照抗体给予组中气道阻力是乙酰甲胆碱浓度依赖性地升高的，而抗体a给予组中的升高被显著抑制。此外，如图4-2e所示，在抗myl9/12多克隆抗体给予组中，虽然见到乙酰甲胆碱浓度依赖性气道阻力升高的抑制，但其效果未观察到显著差异。说明抗体a比抗myl9/12多克隆抗体具有更有效的抗气道炎症作用。
实例3：抗体a在小鼠结肠炎模型中的药物作用的评估
关于cd4阳性cd45rb强阳性(cd4+cd45rb高)t淋巴细胞转移炎性肠病模型的产生，参考powrie等人，int.immunol.[国际免疫学]，5，1461-1471，1993。切下8-10周龄雌性balb/c小鼠(查尔斯河实验室日本公司(charlesriverlaboratoriesjapan,inc.))的脾并用毛玻璃研磨以分离脾细胞。向每个脾的分离的脾细胞中添加含155mm氯化铵、10mm碳酸氢钾和80μmedta-4na的5ml蒸馏水，并将其在室温下放置5分钟以裂解红细胞。向脾细胞溶液中添加两倍体积的pbs，并将其在1500rpm下离心5分钟，收集沉淀物。通过cd4t细胞分离试剂盒(来自美天旎公司(miltenyi))从分离的脾细胞中纯化cd4t淋巴细胞。为了分离cd4阳性cd45rb强阳性t淋巴细胞，将纯化的cd4t淋巴细胞用藻红蛋白(pe)标记的抗cd4抗体(来自e生物科学公司(ebioscience))和异硫氰酸荧光素(fitc)标记的抗cd45rb抗体(来自e生物科学公司)双重染色。双重染色后，用facsaria(来自碧迪公司(becton,dickinsonandcompany))分选cd4阳性cd45rb强阳性细胞以收集感兴趣的细胞。用pbs洗涤收集的细胞后，将它们悬浮于pbs中，使细胞浓度为2x106个细胞/ml。向每只8周龄雌性scid小鼠(clea日本公司(cleajapan,inc.))的腹膜腔中转移250μl(即5x105个细胞/小鼠)如上制备的cd4阳性cd45rb强阳性细胞。向转移有cd4阳性cd45rb强阳性细胞的scid小鼠的每组八只动物从细胞转移后的第11天开始每周给予两次500μg对照抗体(小鼠igg)和500μg抗体a(在pbs溶液中的抗体)。请注意，从尾静脉给予。此外，作为阴性对照组，以5x105个细胞/小鼠转移用cd4t细胞分离试剂盒(来自美天旎公司)纯化但未针对cd45rb表达强度分离的小鼠cd4t淋巴细胞(全cd4阳性细胞)。细胞转移后27天进行尸体解剖以评分并评估体重减轻和大肠中的粪便性质。在葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎中使用的粪便性质的评分(cooper等人，lab.invest.[实验室研究]，69，238-249，1993)用于对粪便性质进行评分。
与对照抗体给予组相比，抗体a给予组的疾病活动指数(dai)显著降低(图5)。
实例4：从抗体a产生嵌合抗体和人源化抗体
嵌合抗体和人源化抗体的制备
首先，构建嵌合抗体的表达载体。作为重链，将编码抗体a重链的信号序列(seqidno.16)的基因序列和编码可变区(seqidno.17)的基因序列插入表达载体(pcdna3.4)中，该表达载体包含编码具有突变v234a和g237a和c末端赖氨酸残基缺失的人igg2恒定区(seqidno.44)的基因序列(seqidno.45)，并且作为轻链，将编码抗体a轻链的信号序列(seqidno.18)的基因序列和编码可变区(seqidno.19)的基因序列插入表达载体(pcdna3.4)中，该表达载体包含编码人igκ恒定区(seqidno.46)的基因序列(seqidno.47)，从而构建嵌合抗体的表达载体。为了产生嵌合抗体，使用expi293表达系统(吉布科公司/赛默飞世尔公司(thermofisher))，将所述表达载体转染到expi293f细胞(吉布科公司/赛默飞世尔公司)中。收集上清液，并用蛋白质a(通用医疗集团)纯化。此处，“v234a”表示将234位的缬氨酸取代为丙氨酸的突变，“g237a”表示将237位的甘氨酸取代为丙氨酸的突变。
随后，设计人源化抗体的可变区。基于与抗体a的框架区(fr)的高同源性，人抗体的fr，igkv2-28*01(seqidno.48)或igkv2-24*01(seqidno.49)和jk4(seqidno.50)(对于轻链)以及ighv1-69*02(seqidno.51)、ighv1-46*01(seqidno.52)或ighv7-4-1*02(seqidno.53)和jh4(seqidno.54)(对于重链)被选择为人源化抗体的fr。然后，使用小鼠抗体a的3d结构预测模型来预测与cdr的氨基酸相互作用的fr中的氨基酸，与cdr(seqidno.28-35)一起进行移植。具有突变v234a和g237a并且具有c末端赖氨酸残基缺失的人igg2恒定区(seqidno.44)和人igκ恒定区(seqidno.46)分别用作重链和轻链的恒定区。hk1-4(seqidno.55)、hk1-5(seqidno.56)、hk1-6(seqidno.57)、hk1-a(seqidno.58)、hk2-5(seqidno.59)、hk2-6(seqidno.60)、hk2-9(seqidno.61)和hk3-2(seqidno.62)被设计为移植通过kabat定义法确定的cdr(seqidno.28、30和32)的人源化抗体的重链可变区，ha1-4(seqidno.63)和ha1-6(seqidno.64)被设计为移植通过abm定义法确定的cdr(seqidno.29、31、32)的人源化抗体的重链可变区，hk1-4、hk1-5、hk1-6、hk1-a、ha1-4和ha1-6被设计为使用ighv1-69*02和jh4的人源化抗体的重链可变区，hk2-5、hk2-6和hk2-9被设计为使用ighv1-46*01和jh4的人源化抗体的重链可变区，hk3-2被设计为使用ighv7-4-1*02和jh4的人源化抗体的重链可变区，l1-4(seqidno.65)、l1-5(seqidno.66)和l1-a(seqidno.67)被设计为使用igkv2-28*01和jk4的人源化抗体的轻链可变区，并且l4-2(seqidno.68)被设计为使用igkv2-24*01和jk4的人源化抗体的轻链可变区。
编码hk1-4、hk1-5和hk1-6的氨基酸序列的基因序列通过以下方式产生：设计抗体a的重链cdr(seqidno.28、30和32)移植到ighv1-69*02(seqidno.51)和jh4(seqidno.54)中并在n末端添加信号序列(seqidno.69)的氨基酸序列，将设计的氨基酸序列转化为基因序列，并由金斯瑞美国公司(genscriptusainc.)合成基因序列，并通过pcr引入突变(hk1-4：seqidno.70，hk1-5：seqidno.71，hk1-6：seqidno.72，信号序列：seqidno.73)。编码hk1-a的氨基酸序列的基因序列由在hk1-a的n末端添加有信号序列(seqidno.69)的氨基酸序列转化而来，并由金斯瑞美国公司合成(hk1-a：seqidno.74，信号序列：seqidno.75)：。编码hk2-5、hk2-6和hk2-9的氨基酸序列的基因序列通过以下方式产生：设计抗体a的重链cdr(seqidno.28、30和32)移植到ighv1-46*01(seqidno.52)和jh4(seqidno.54)中并在n末端添加信号序列(seqidno.69)的氨基酸序列，将设计的氨基酸序列转化为基因序列，并由金斯瑞美国公司合成基因序列，并通过pcr引入突变(hk2-5：seqidno.76，hk2-6：seqidno.77，hk2-9：seqidno.78，信号序列：seqidno.79)。编码hk3-2的氨基酸序列的基因序列通过将在hk3-2的n末端添加有信号序列(seqidno.69)的氨基酸序列转化为基因序列由金斯瑞美国公司合成(hk3-2：seqidno.80，信号序列：seqidno.81)。编码ha1-4和ha1-6的氨基酸序列的基因序列通过以下方式产生：设计抗体a的重链cdr(seqidno.29、31和32)移植到ighv1-69*02(seqidno.51)和jh4(seqidno.54)中并在n末端添加信号序列(seqidno.69)的氨基酸序列，转化为基因序列，并由金斯瑞美国公司合成基因序列，并通过pcr引入突变(ha1-4：seqidno.82，ha1-6：seqidno.83，信号序列：seqidno.84)。编码l1-4和l1-5的氨基酸序列的基因序列通过以下方式产生：设计抗体a的轻链cdr(seqidno.33-35)移植到igkv2-28*01(seqidno.48)和jk4(seqidno.50)中并在n末端添加信号序列(seqidno.85)的氨基酸序列，转化为基因序列，并由金斯瑞美国公司合成基因序列，并通过pcr引入突变((l1-4：seqidno.86，l1-5：seqidno.87，信号序列：seqidno.88)。编码l1-a和l4-2的氨基酸序列的基因序列通过将在l1-a和l4-2的n末端添加有信号序列(seqidno.85)的氨基酸序列转化为基因序列由金斯瑞美国公司合成(l1-a：seqidno.89，l1-a的信号序列：seqidno.90，l4-2：seqidno.91，l4-2的信号序列：seqidno.92)。将编码这些人源化重链可变区和信号序列的基因插入包含编码具有突变v234a和g237a并且具有c末端赖氨酸残基缺失的人igg2恒定区(seqidno.44)的基因序列(seqidno.45)的表达载体(pcdna3.4)中。将编码这些人源化轻链可变区和信号序列的基因插入包含编码人igκ的恒定区(seqidno.46)的基因序列(seqidno47)的表达载体(pcdna3.4)中。此处，“v234a”表示将234位的缬氨酸取代为丙氨酸的突变，“g237a”表示将237位的甘氨酸取代为丙氨酸的突变。为了产生抗体，使用expi293表达系统(吉布科公司/赛默飞世尔公司)，将所述表达载体以表1所示的组合转染到expi293f细胞(吉布科公司/赛默飞世尔公司)中。收集上清液，并用蛋白质a(通用医疗集团)纯化。
[表1]
由抗体a制备的嵌合抗体和人源化抗体对人myl9蛋白的结合能力的分析
通过elisa评估由抗体a制备的嵌合抗体和人源化抗体对人myl9的结合能力。人myl3-his和人myl9-his蛋白通过实例1中描述的方法制备。
按照以下步骤通过elisa评估针对人myl9的结合能力。将人myl3-his和人myl9-his涂布到96孔板(nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1xblockace(ds制药生物医药有限公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.02％tween20/pbs洗涤3次后，以嵌合抗体和人源化抗体的6倍，从10μg/ml的浓度制备7个连续稀释物，并添加到孔中。在室温下孵育1小时并洗涤3次后，添加辣根过氧化物酶标记的抗人igg抗体(杰克逊免疫研究实验室)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤5次后，将tmbz(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)溶液添加到孔中，并将其在室温下孵育5-20分钟。将等量的反应淬灭溶液(2nh2so4)添加到孔中，并用酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm处的吸光度。
表1中的所有人源化抗体以与嵌合抗体相同的程度与人myl9浓度依赖性地结合，但不与人myl3结合(图6-1至6-3)。
实例5：抗体a及其嵌合抗体和人源化抗体对小鼠/人myl12a和12b蛋白的结合能力
小鼠/人myl12a和myl12b蛋白的制备
按照以下步骤，产生具有与小鼠myl12a(genbank登录号np_080340.2，seqidno.93)、小鼠myl12b(genbank登录号np_075891.1，seqidno.94)、人myl12a(genbank登录号np_001289976.1，seqidno.95)和人myl12b(genbank登录号np_001138416.1，seqidno.96)各自的c末端结合的组氨酸标签的蛋白质(在下文分别称为小鼠myl12a-his、小鼠myl12b-his、人myl12a-his和人myl12b-his)。显示了小鼠myl9、myl12a与myl12b(图7a)以及人myl9、myl12a与myl12b(图7b)之间的氨基酸序列的比较。
编码小鼠myl12a和myl12b蛋白的基因由千叶大学捐赠。通过pcr从人心脏或小肠cdna扩增编码人myl12a和人myl12b蛋白的基因。将这些基因插入在其中插入有编码prescission蛋白酶(通用医疗集团)的切割序列的基因的pet42b载体(默克公司)的bglii/bamhi位点中。将产生的载体转化到大肠杆菌菌株bl21-gold(de3)plys(安捷伦科技公司)中以允许表达连接有gst标签的小鼠myl12a-his、小鼠myl12b-his、人myl12a-his和人myl12b-his。通过谷胱甘肽琼脂糖4fastflow(通用医疗集团)纯化表达的蛋白质，用prescission蛋白酶切割gst标签，并通过talon超流金属亲和树脂(clontech公司)纯化小鼠myl12a-his、小鼠myl12b-his、人myl12a-his和人myl12b-his。
向实例1中纯化的小鼠myl12a-his、小鼠myl12b-his、人myl12a-his、人myl12b-his、或小鼠myl3-his、小鼠myl9-his、人myl3-his、人myl9-his中添加终浓度为50mm的二硫苏糖醇(和光株式会社(wako))，并在4℃孵育1小时以获得单体。孵育后用pbs进行透析。
抗体a对小鼠/人myl12a和myl12b蛋白的结合能力的分析
按照以下步骤通过elisa评估抗体a对小鼠/人myl12a和myl12b的结合能力。将小鼠myl3-his、小鼠myl9-his、小鼠myl12a-his、小鼠myl12b-his、人myl3-his、人myl9-his、人myl12a-his和人myl12b-his涂布到96孔板(nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1xblockace(ds制药生物医药有限公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.02％tween20/pbs洗涤3次后，以抗体a的4倍，从10μg/ml的浓度制备11个连续稀释物，并添加到孔中。在室温下孵育1小时并洗涤3次后，添加辣根过氧化物酶标记的抗小鼠igg抗体(杰克逊免疫研究实验室)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤5次后，将tmbz(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)溶液添加到孔中，并将其在室温下孵育5-20分钟。将等量的反应淬灭溶液(2nh2so4)添加到孔中，并用酶标仪(赛默科技公司(thermoscientific))读取450nm处的吸光度。
抗体a显示出与同小鼠和人myl9具有高同源性的myl12a和myl12b的浓度依赖性结合，但不与同小鼠和人myl9具有低同源性的小鼠和人myl3结合(图8a和8b)。
由抗体a制备的嵌合抗体和人源化抗体对人myl12a和myl12b蛋白的结合能力的分析
按照以下步骤通过elisa评估由抗体a制备的嵌合抗体和人源化抗体对人myl12a和myl12b的结合能力。将人myl3-his、人myl9-his、人myl12a-his和人myl12b-his分别涂布到96孔板(nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1xblockace(ds制药生物医药有限公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.02％tween20/pbs洗涤3次后，将嵌合抗体和人源化抗体分别以0.01μg/ml、0.1μg/ml和1μg/ml的浓度稀释，并添加到孔中。在室温下孵育1小时并洗涤3次后，添加辣根过氧化物酶标记的抗人igg抗体(杰克逊免疫研究实验室)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤5次后，将tmbz(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)溶液添加到孔中，并将其在室温下孵育5-20分钟。将等量的反应淬灭溶液(2nh2so4)添加到孔中，并用酶标仪(赛默科技公司)读取450nm处的吸光度。
嵌合抗体和人源化抗体显示出与同人myl9具有高同源性的myl12a和myl12b的浓度依赖性结合，但不与同人myl9具有低同源性的人myl3结合(图9-a至9-c)。
实例6：抗体a及其嵌合抗体和人源化抗体对人myl9、人myl12a和人myl12b与人cd69胞外区蛋白之间的结合活性的抑制作用
人myl9、myl12a和myl12b蛋白与人cd69胞外区蛋白之间的结合
通过elisa评估人myl9、myl12a和myl12b蛋白与人cd69胞外区蛋白的结合。按照以下步骤产生在人cd69蛋白的胞外区(位置64-199，seqidno.97)的n末端添加有flag标签的蛋白质(在下文称为3xflag-人cd69ec蛋白)。显示了人与小鼠cd69蛋白胞外区之间的氨基酸序列的比较(图10)。
包含编码3xflag-人cd69ec蛋白的基因的表达质粒由千叶大学捐赠，并将其用expifectamine293转染试剂盒(赛默飞世尔科技公司/吉布科公司)转染到expi293f细胞(英杰公司/生命技术公司)中。孵育(8％co2，37℃)4天后，收集培养上清液。从收集的培养上清液中，用抗flagm2亲和凝胶(西格玛公司)纯化3xflag-人cd69ec蛋白。纯化后，通过使用superdex200或superdex75收集二聚化蛋白质。
通过elisa评估人myl9、myl12a和myl12b与人cd69胞外区蛋白之间的结合。将实例5中制备的人myl3-his、人myl9-his、人myl12a-his和人myl12b-his分别涂布到96孔板(nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1xblockace(ds制药生物医药有限公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.02％tween20/pbs洗涤3次后，用50mmnaoac(ph5.5)/150mmnacl/0.02％tween20，以3xflag-人cd69ec蛋白的3倍，从10μg/ml的浓度制备6个连续稀释物，并添加到孔中。在室温下孵育1.5小时并用50mmnaoac(ph5.5)/150mmnacl/0.02％tween20洗涤3次后，添加辣根过氧化物酶标记的抗flag(m2)抗体(西格玛公司)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤5次后，将tmbz(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)溶液添加到孔中，并将其在室温下孵育5-20分钟。将等量的反应淬灭溶液(2nh2so4)添加到孔中，并用酶标仪(赛默科技公司)读取450nm处的吸光度。
人cd69胞外区蛋白显示出与人myl9、同人myl9具有高同源性的myl12a和myl12b的浓度依赖性结合，，但不与同人myl9具有低同源性的人myl3结合(图11)。
抗体a对人myl9、人myl12a和人myl12b与人cd69胞外区蛋白的结合活性的抑制活性的评估
按照以下步骤通过elisa评估抗体a对人myl9、人myl12a和人myl12b与人cd69胞外区蛋白之间的结合的抑制活性。将实例5中制备的人myl9-his、人myl12a-his和人myl12b-his分别涂布到96孔板(nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1xblockace(ds制药生物医药有限公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.02％tween20/pbs洗涤3次后，用50mmnaoac(ph5.5)/150mmnacl/0.02％tween20，以抗体a或对照抗体(抗二硝基酚抗体，小鼠igg2c,κ)的3倍，从30μg/ml的浓度制备7个连续稀释物，并添加到孔中。在室温下孵育1小时并洗涤3次后，将3xflag-人cd69ec蛋白用50mmnaoac(ph5.5)/150mmnacl/0.02％tween20稀释到10μg/ml的浓度，并添加到孔中。在室温下孵育1.5小时并用50mmnaoac(ph5.5)/150mmnacl/0.02％tween20洗涤3次后，添加辣根过氧化物酶标记的抗flag(m2)抗体(西格玛公司)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤5次后，将tmbz(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)溶液添加到孔中，并将其在室温下孵育5-20分钟。将等量的反应淬灭溶液(2nh2so4)添加到孔中，并用酶标仪(赛默科技公司)读取450nm处的吸光度。
抗体a显示出对人myl9、人myl12a和人myl12b与人cd69胞外区蛋白之间的结合的浓度依赖性抑制(图12)。对照抗体未显示出抑制活性。图中的背景意指在未固定着人myl9-his、人myl12a-his或人myl12b-his的孔中，3xflag-人cd69ec蛋白与辣根过氧化物酶标记的抗flag(m2)抗体(西格玛公司)之间的着色。
由抗体a制备的嵌合抗体和人源化抗体对人myl9与人cd69胞外区蛋白的结合活性的抑制活性的评估
按照以下步骤通过elisa评估由抗体a制备的嵌合抗体和人源化抗体对人myl9与人cd69胞外区蛋白之间的结合的抑制活性。将实例5中制备的人myl9-his涂布到96孔板(nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1xblockace(ds制药生物医药有限公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.02％tween20/pbs洗涤3次后，用50mmnaoac(ph5.5)/150mmnacl/0.02％tween20，以抗体a、嵌合抗体、人源化抗体或对照抗体(人igg2,κ，西格玛公司)的3倍，从30μg/ml的浓度制备7个连续稀释物，并添加到孔中。在室温下孵育1小时并洗涤3次后，将3xflag-人cd69ec蛋白用50mmnaoac(ph5.5)/150mmnacl/0.02％tween20稀释到10μg/ml的浓度，并添加到孔中。在室温下孵育1.5小时并用50mmnaoac(ph5.5)/150mmnacl/0.02％tween20洗涤3次后，添加辣根过氧化物酶标记的抗flag(m2)抗体(西格玛公司)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤5次后，将tmbz(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)溶液添加到孔中，并将其在室温下孵育5-20分钟。将等量的反应淬灭溶液(2nh2so4)添加到孔中，并用酶标仪(赛默科技公司)读取450nm处的吸光度。
由抗体a制备的嵌合抗体和人源化抗体显示出对人myl9与人cd69胞外区蛋白之间的结合的浓度依赖性抑制(图13-1至13-5)。对照抗体未显示出抑制活性。图中的背景意指在未固定着人myl9-his的孔中，3xflag-人cd69ec蛋白与辣根过氧化物酶标记的抗flag(m2)抗体(西格玛公司)之间的着色。
由抗体a制备的嵌合抗体和人源化抗体对人myl12a和人myl12b与人cd69胞外区蛋白的结合活性的抑制活性的评估
按照以下步骤通过elisa评估由抗体a制备的嵌合抗体和人源化抗体对人myl12a和人myl12b与人cd69胞外区蛋白之间的结合的抑制活性。将实例5中制备的人myl12a-his和myl12b-his分别涂布到96孔板(nunc公司)的孔上。在4℃孵育过夜后，用1xblockace(ds制药生物医药有限公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.02％tween20/pbs洗涤3次后，用50mmnaoac(ph5.5)/150mmnacl/0.02％tween20将抗体a、嵌合抗体、人源化抗体或对照抗体(人igg2,κ，西格玛公司)稀释至浓度为0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml，并添加到孔中。在室温下孵育1小时并洗涤3次后，将3xflag-人cd69ec蛋白用50mmnaoac(ph5.5)/150mmnacl/0.02％tween20稀释到10μg/ml的浓度，并添加到孔中。在室温下孵育1.5小时并用50mmnaoac(ph5.5)/150mmnacl/0.02％tween20洗涤3次后，添加辣根过氧化物酶标记的抗flag(m2)抗体(西格玛公司)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤5次后，将tmbz(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)溶液添加到孔中，并将其在室温下孵育5-20分钟。将等量的反应淬灭溶液(2nh2so4)添加到孔中，并用酶标仪(赛默科技公司)读取450nm处的吸光度。
由抗体a制备的嵌合抗体和人源化抗体显示出对人myl12a和myl12b与人cd69胞外区蛋白之间的结合的浓度依赖性抑制(图14-1至14-4)。对照抗体未显示出抑制活性。图中的背景意指在未固定着人myl12a-his或人myl12b-his的孔中，3xflag-人cd69ec蛋白与辣根过氧化物酶标记的抗flag(m2)抗体(西格玛公司)之间的着色。
实例7：组合给予抗体a和抗pd-1抗体的抗肿瘤作用
将在含有10％fbs和青霉素/链霉素的rpmi1640培养基中培养的小鼠结直肠癌细胞系ct26.wt(atccno.crt-2638)悬浮于磷酸盐缓冲盐水中以获得浓度为1x107个细胞/ml的细胞悬浮液。将细胞悬浮液以0.1ml的剂量皮下移植到六周龄小鼠(balb/c，雌性，查尔斯河实验室日本公司()的右背部。移植后6天，用电子数字卡尺(数显(tm)卡尺，日本三丰株式会社(mitutoyo))测量肿瘤的最长直径和短轴。通过以下计算公式计算肿瘤体积。
肿瘤体积(mm3)＝最长直径(mm)x短轴(mm)x短轴(mm)/2
图15显示了小鼠结直肠癌细胞系ct26.wt的皮下肿瘤组织的基因表达分析的结果。通过trizol(注册商标)试剂(赛默飞世尔科技公司)从由ct26.wt衍生的肿瘤组织中提取核酸，并通过rneasy迷你试剂盒(凯杰公司)制备总rna。从总rna中通过sureselectstrandspecificrna文库制备试剂盒(安捷伦科技公司)制备文库用于rnaseq分析，并通过hiseq4000(illumine)进行测序。通过测序获得的fastq文件通过tpm(每百万转录本(transcriptpermillion))方法标准化，并测量myl9、myl12a和myl12b的表达。在肿瘤组织中，myl9的表达较低，myl12a和myl12b的表达较高。
基于给药第一天的肿瘤体积，将小鼠分组，使得每组的肿瘤体积的平均值几乎相等。通过磷酸盐缓冲盐水将抗体a和抗pd-1抗体(boxcell，目录号：be0146)制备成2mg/ml的溶液，并以0.1ml/小鼠的剂量以每7天两次共4次(癌细胞移植后的第6天、第9天、第13天和第16天)向小鼠腹膜内给予。在对照组中，以0.2ml/小鼠的剂量以每7天两次共4次(癌细胞移植后的第6天、第9天、第13天和第16天)向小鼠腹膜内给予磷酸盐缓冲盐水。各组有7-8只小鼠。
图16显示了对照组(a)、抗体a给予组(b)、抗pd-1抗体给予组(c)和抗体a与抗pd-1抗体组合给予组(d)至试验的最后几天(第30天)的计算的肿瘤体积随时间推移的变化。如图16b所示，单独的抗体a几乎不抑制肿瘤的生长。与对照组相比，单独的抗pd-1抗体轻微抑制肿瘤生长(图16c)。抗体a和抗pd-1抗体的组合给予显著抑制肿瘤的生长，并确认有肿瘤消失的小鼠(2/10)(图16d)。以上结果表明通过组合给予抗体a和抗pd-1抗体有协同作用。
工业实用性
可以提供与myl9结合并且可以抑制myl9与cd69之间的相互作用的抗myl9抗体或其myl9结合片段，以及包含其的药物组合物。根据本发明的抗体或药物组合物可以用于治疗归因于myl9与cd69之间的相互作用的疾病，例如过敏性气道炎症如哮喘、慢性过敏性鼻炎或一些鼻窦炎，气道炎症疾病如不包括在过敏性气道炎症中的鼻窦炎，以及炎性肠病如溃疡性结肠炎、克罗恩病、白塞病和嗜酸性胃肠功能紊乱。根据本发明的抗体还可以抑制myl12与cd69之间的相互作用。因此，根据本发明的抗体或药物组合物可以用于治疗与myl9和/或myl12与cd69之间的相互作用有关的疾病，例如诸如结直肠癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌、肝细胞癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、小细胞肺癌、间皮瘤和子宫内膜癌等肿瘤。