血管衬有单层内皮细胞，其形成血流和周围组织之间的界面。在称为血管生成的过程中，新血管通过内皮细胞的生长从现有小血管的壁发展。内皮细胞通常在血管系统发育后保持静止，没有新的血管形成，除了伤口愈合中的血管形成外。然而，在实体肿瘤生长期间，可响应肿瘤分泌因子发生血管形成，所述肿瘤促进内皮细胞的刺激以构建新的毛细管芽。肿瘤血管生成被广泛认为是实体瘤生长中的限速过程，因此在肿瘤进展中起重要作用。不吸引血液供应的肿瘤的大小受到限制，因此预防或限制肿瘤血管生成因此可代表实体瘤的治疗选择。
与正常组织中的内皮细胞相比，作为肿瘤内血管系统衬里的内皮细胞可以暴露于不同的细胞外环境。例如，肿瘤中的内皮细胞可能经受缺氧条件，营养缺乏和/或更酸性条件。此外，肿瘤内皮细胞可能经历不同的机械力，例如降低的血流速率和增加的机械压缩。与正常组织中的细胞相比，肿瘤内皮细胞暴露于不同条件导致表现不同的转录物组，与正常血管系统内的内皮细胞相比，肿瘤内皮细胞的表达可能在肿瘤内皮细胞中以更高的水平存在。因此，肿瘤内皮细胞可以通过靶向肿瘤内皮标志物进行治疗靶向。
clec14a是14型钙依赖性c型凝集素家族的成员(其另外包括内皮唾液酸蛋白/tem1/cd248，血栓调节蛋白和cd93作为成员)，是长度为490个氨基酸的单次i型跨膜蛋白，其中包含信号肽(氨基酸残基1-21处)，胞外区(氨基酸残基22-398处)，跨膜域(氨基酸残基399-421处)和胞质域(氨基酸残基422-490处)。clec14a的胞外区具有一个c型凝集素样域(在氨基酸残基22-173处)和表皮生长因子样区域(在氨基酸残基245-287处)。人和小鼠clec14a蛋白显示67％的氨基酸序列同一性，在c型凝集素和表皮生长因子样域内具有更大的序列保守性。
本发明人先前已经表明，clec14a在作为许多常见人癌症(包括乳腺癌，肝癌，前列腺癌，胰腺癌，膀胱癌和卵巢癌)的血管系统衬里的内皮细胞表面上高度表达，但在健康组织的血管系统中，表达是低或不可检测的。据信由于血管形成不良而在肿瘤血管系统中经历的低剪切应力的条件可能是clec14a上调的原因。此外，clec14a已被公开为在发芽血管生成和促进小鼠肿瘤生长中起作用。因此，先前已提出clec14a作为肿瘤内皮标志物，其可靶向抑制肿瘤血管生成。
证明抗体或免疫疗法对于靶向某些肿瘤类型是有效的。一种此类免疫疗法治疗基于免疫细胞，特别是t细胞的修饰，其具有嵌合抗原受体(car)(一种可以特异性结合肿瘤靶物并且可以在结合后激活/刺激免疫细胞的受体)。原则上，可以通过使用car免疫疗法靶向任何细胞表面分子，从而克服对自身抗原的耐受性并提供不依赖于患者mhc状态的治疗。使用工程化改造为表达靶向cd19的嵌合抗原受体的t细胞，最近的试验已证明在白血病和淋巴瘤患者中具有显著的临床反应。car通常由单克隆抗体衍生的单链可变片段(scfv)组成，其由通过柔性接头连接，然后通过跨膜域融合至胞质信号传导域(通常为cd3zeta链)的重链和轻链组成。最近，这些构建体掺入了来自共刺激分子如cd28或4-1bb的额外胞质域，以增强体内t细胞存活。包含来自共刺激分子的一个胞质域的car称为第二代car，包含两个来自共刺激分子的胞质域的car称为第三代cars，并且包含两个(或更多个)各自来自共刺激分子的胞质域以及编码car的核酸中另外的遗传修饰的存在(例如细胞因子基因的存在)的car称为第四代car。还对car进行了其他遗传修饰，例如添加细胞因子基因以避免肿瘤部位的免疫抑制机制。本发明人现在开发了选择性靶向clec14a的car免疫疗法。在这方面，免疫疗法特异性地利用来自选择性地结合clec14a的c型凝集素域的抗体，特别是来自破坏clec14a和mmrn2之间相互作用的抗体的结合域/活性。因此，发明人已经鉴定clec14a和mmrn2之间的相互作用在血管发生中起重要作用(mmrn2是emilin家族的内皮特异性标志物和细胞外基质的组分)。本发明人进一步鉴定了clec14a和mmrn2之间的相互作用可以被结合clec14a的c型凝集素域，特别是clec14a的氨基酸残基97-108的抗clec14a抗体破坏。在这方面，本发明人在car免疫疗法中主要使用靶向clec14a的这些域的抗体的结合活性，并且已经证明使用此类免疫疗法例如在减少肿瘤大小有效的结果。
因此，在第一方面，本发明提供了核酸分子其包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含：
(i)抗clec14a结合域,
(ii)跨膜域和
(iii)胞内信号传导域；
其中所述抗clec14a结合域能够结合clec14a的c型凝集素域。
特别地，抗clec14a结合域可以能够破坏clec14a和mmrn2之间的相互作用。
因此，根据本发明并如上所讨论，基于结合clec14a的c型凝集素域的抗体的发现和分离以及结合clec14a的c型凝集素域内特定表位的抗体能够破坏clec14a和mmrn2之间的相互作用(发明人已经显示其参与血管生成)的发现，已经开发了car免疫疗法。如实施方案中所示，本发明人已经制备并测试了几种car免疫疗法，其掺入与clec14a的c型凝集素域结合的结合域，并且已经显示此类car免疫疗法有效减少肿瘤大小和体积。本发明人已经鉴定了四种特异性新抗体(本文分别描述为crt1,3,4和5，其cdr，重链和轻链可变序列示于表1中)，该抗体能够结合cclec14a的c型凝集素域和这些抗体的clec14a结合域已经用于开发本文所述的car免疫疗法，以提供本发明治疗的具体实例。使用本发明的car疗法产生的令人惊讶的有效结果表明，使用car靶向clec14a的c型凝集素域可以为肿瘤血管生成提供有效的治疗，从而为癌症提供有效的治疗。此外，clec14a在低剪切应力条件下的上调的关联可以使本发明的car疗法对血流特别受到限制的肿瘤特别有效，例如，在胰腺或卵巢的肿瘤中，对此目前几乎没有有效的治疗方法。
在本发明的另一方面，本发明人已经鉴定了另外的抗体，其特异性结合clec14a的外部区域，并且可以用于根据本发明的car中。该特异性抗体(在本文中称为crt2，其轻链cdr和轻链可变序列可见于表1中)可以有效结合clec14a，因此本发明涵盖包含该抗体的抗原结合能力的car免疫疗法。
在这方面，在第二实施方案中，本发明还提供了核酸分子其包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸序列，所述嵌合抗原受体
(i)抗clec14a结合域
(ii)跨膜域和
(iii)胞内信号传导域，
其中所述抗clec14a结合域包含以下至少一项：:
(a)重链cdr，其具有氨基酸序列seqidno.167或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，
(b)重链cdr，其具有氨基酸序列seqidno.168或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,
(c)重链cdr，其具有氨基酸序列seqidno.169或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，
(d)轻链cdr，其具有氨基酸序列seqidno.129或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，
(e)轻链cdr，其具有氨基酸序列seqidno.68或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，和/或
(f)轻链cdr，其具有氨基酸序列seqidno.130或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。
因此，如上所述的本发明的核酸包含编码嵌合抗原受体(car)的多核苷酸序列。本文可互换使用的“car”或“嵌合抗原受体”是指包含至少三个域的分子，即包含抗原结合域(在本发明中为抗clec14a结合域)的胞外域，跨膜域和包含胞内信号传导域的胞内域。
因此，当car在宿主细胞(特别是效应细胞，如下文进一步讨论)上表达时，抗原结合域将存在于胞外域内或作为胞外域。通常，大多数或所有抗原结合域将存在于细胞外，以允许car与靶抗原结合(例如，当car在宿主细胞中表达，转运至细胞膜并呈现时抗原结合域的至少90％，95％，97％，99％或100％将存在于细胞外)。
跨膜域将包含抗原结合域(即本发明中的抗clec14a结合域)的胞外域连接到胞内信号传导域，并且通常在car表达和膜靶向后跨越宿主细胞的细胞膜。因此，跨膜域在car表达和膜靶向后穿过细胞膜。跨膜域可以源自或基于具有至少一个跨膜区和/或胞外和/或胞内部分的蛋白质，因此car的跨膜域可以连接在来自其来源或基于的蛋白质的胞外和/或细胞内序列/多肽/蛋白质的n和/或c末端。因此，当跨膜蛋白获自或源自已知的跨膜蛋白时，可以与穿过或跨越膜的跨膜域一起在细胞外和/或细胞内存在另外的序列，以将car附着于其上。如下面进一步讨论的，跨膜域可以源自具有跨膜和胞内区域两者的蛋白质或蛋白质的一部分，例如cd28，并且这些域或其部分都可以包含在本发明的car中。
car的胞内信号传导域在car表达后存在于宿主细胞内(即包含在car的胞内域内)，通常在细胞的细胞质内。该域能够激活表达car的宿主细胞的一种或多种正常功能。例如，若宿主细胞是t细胞，则胞内信号传导域可以能够激活t细胞的细胞溶解或辅助活性。本发明的car可另外包含其他域，如下文更详细讨论的。
如本文所用，“抗clec14a结合域”是指能够结合clec14a的域，特别是当在car内表达并呈递在细胞表面上时能够结合clec14a的域。特别地，抗clec14a结合域能够结合在细胞表面上表达的clec14a(例如通过流式细胞术或免疫组织化学评估)，结合构象依赖性(例如非线性)clec14a表位(例如如通过western印迹评估)，结合游离clec14a(例如在固体支持物上重组表达的clec14a)(例如如通过elisa评估)和/或结合人clec14a。最特别地，抗clec14a结合域能够结合在细胞表面上表达的clec14a。
特别地，抗clec14a结合域选择性地结合clec14a，因此与其对其他蛋白质/分子的结合亲和力相比，对clec14a具有更大的结合亲和力。优选地，与对clec14a的结合相比，抗clec14a结合域不与其他蛋白质结合或以大大降低的亲和力结合(例如，与其对clec14a的亲和力相比小至少10,50,100,500,1000或10000倍的亲和力)。因此，如本文提及的抗clec14a结合域可以以其与其他蛋白质结合的亲和力的至少10,50,100,500,1000或10000倍结合clec14a。抗clec14a结合域的结合亲和力可以使用本领域公知的方法，例如使用biacore系统测定。
特别优选的是抗clec14a结合域与其对clec14a的结合亲和力相比对与clec14a相似或具有同一性区域的蛋白质或与clec14a的已知同源物具有降低的结合亲和力。因此，抗clec14a结合域与其对clec14a的结合亲和力相比对于与clec14a，特别是与cd248/tem1/内皮唾液酸蛋白，血栓调节蛋白和/或cd93具有至少60,70,80,90或95％同一性的蛋白质特别应当具有降低的结合亲和力(例如，结合亲和力降低至少10,50,100,1000或10000倍)。或者，特别地，抗clec14a结合域以其结合cd248/tem1/内皮唾液酸蛋白，血栓调节蛋白和/或cd93的亲和力的至少10,50,100,1000或10000倍的亲和力结合clec14a。
抗clec14a结合域可以具有对clec14a的高结合亲和力，即可以具有10-5m，10-6m，10-7m或10-9m或更低的kd。抗clec14a结合域可以具有对clec14a的结合亲和力，其对应于小于30nm,20nm,15nm或10nm，更优选小于10,9.5,9,8.5,8,7.5,7,6.5,6,5.5,5,4.5,4,3.5,3,2.5,2,1.5或1nm,最优选小于0.9,0.8,0.7,0.6,0.5,0.4,0.3,0.2或0.1nm的kd。
可以使用任何适当的确定kd的方法。然而，优选地，通过在体外测试针对各种浓度的抗原(clec14a)的各种浓度的测试抗体来确定kd，以建立饱和曲线，例如使用lineweaver-burk方法，或通过使用商品化结合模型软件，例如biacore1000评估软件中的1:1结合模型。
关于kd值的确定，技术人员将理解使用表达靶物(例如clec14a)的细胞的结合实验得到的表观kd值不能被认为是亲和力的绝对指示，因为实验条件将影响表观结合亲和力。例如，clec14a的表达水平可以根据培养细胞的条件，以及不同细胞类型之间的差异而变化。因此，最好比较在一组实验中获得的表观kd值，并且可能不总是合适的是将一组实验中获得的kd值与在不同实验组中获得的kd值进行比较，特别是若实验条件显著变化的话。
本文提及的“clec14a”是指人clec14a和来自其他物种的clec14a的直系同源物，例如来自马，狗，猪，牛，绵羊，大鼠，小鼠，豚鼠或灵长类动物，例如：猴。因此，抗clec14a结合域可以能够结合人clec14a和/或来自任何物种，例如鼠的clec14a的直系同源物。此外，抗clec14a结合域优选能够结合天然存在的clec14a变体，例如天然存在的人clec14a变体。尽管抗clec14a结合域可以以不同于其与人clec14a结合的亲和力结合clec14a直向同源物，但它可以以相似的亲和力结合人和鼠clec14a。
“相似的亲和力”指抗clec14a域，例如抗体或配体对人clec14a和一种或多种其他感兴趣物种(例如小鼠)的结合亲和力是可比的，例如，不超过20倍不同的。更优选地，结合亲和力之间的差异小于15倍，更优选小于10倍，最优选小于5倍，4倍，3倍或2倍。
然而，在一个具体实施方案中，抗clec14a结合域结合人clec14a，特别是结合人clec14a的胞外部分。人clec14a通常具有490个氨基酸，预测分子量为51kda，并由位于14q21.2的clec14a基因编码。人clec14a包括genbank登录号np_778230中发现的氨基酸序列及其天然存在的变体。人clec14a的氨基酸序列如seqidno:1所示(如表1所示)。因此，特别地，如本发明中使用的抗clec14a结合域能够结合seqidno:1的氨基酸序列。1。人clec14a由seqidno:2的cdna序列编码，所述cdna序列对应于clec14a的mrna序列，并且人clec4a的编码区以seqidno:3所示。
特别地，抗clec14a结合域在去除信号肽(其发生在490个氨基酸人多肽序列的残基1-21)后与成熟clec14a多肽结合。(应当理解，本领域可用的不同域预测程序可导致蛋白质内特定域的位置的轻微差异，例如通过1,2,3或4个氨基酸残基，例如相对于clec14a中的域位置。因此，可以预测信号传导域为例如在残基1-22处)。因此，通常，抗clec14a结合域在人clec14a(完整的多肽序列的残基22(或23)-490)的情况下结合氨基酸成熟clec14a序列的469(468，若预测1-22的信号肽)。如上所讨论，抗clec14a结合域结合clec14a的胞外区。在人clec14a的情况下，抗clec14a结合域因此特别结合seqidno.1的490氨基酸序列的残基22(或23)-396内的区域(即人clec14a的375(或374)氨基酸胞外域内的区域)，例如在残基22-173处结合c型凝集素域，(或者在残基23-173,22-175,23-175,32-173或32-175处)或在胞外域的残基245-287处结合egf样区。人clec14a进一步包含跨膜域和胞质区(分别在残基397-425和426-490)，并且优选本发明中使用的抗clec14a结合域不结合这些区域，或者除了结合clec14a的胞外域外至少仅以如上文讨论的亲和力结合。特别地，优选抗clec14a结合域以比对clec14a的任何其他域，例如对跨膜和/或胞质区更大的亲和力结合胞外域(例如以比对其他clec14a区域大至少10,50,100,1000或10000倍的亲和力结合胞外域)。
若本发明中使用的抗clec14a结合域能够结合人clec14a的直系同源物或天然存在的变体，则优选结合域结合直向同源物或变体中对应于人clec14a的胞外域的区域，如上文定义。使用本领域公知的序列比对程序可以容易地确定直系同源蛋白质中的相应区域。
如上所述，在本发明的第一方面，抗clec14a结合域能够结合clec14a的c型凝集素域。该域可以在残基22-173或残基22-173的1-4个残基内的位置找到，例如在人490个氨基酸的clec14a蛋白质序列(如seqidno.1所示)的残基22-175,23-173,23-175,32-173或32-175处。因此，在本发明的此方面，抗clec14a结合域将能够结合到c型凝集素域的此区域(在clec14a的胞外域内发现)或在此区域内结合。如上指示，当抗clec14a结合域能够结合clec14a直向同源物或变体时，在这方面，优选抗clec14a结合域结合对应于在人clec14a的胞外域内发现的c型凝集素域的区域。可以使用序列比对来鉴定此类相应区域。如上所讨论，抗clec14a结合域特别可以以比对clec14a中的任何其他区域(例如比人clec14a的残基245-287处对egf样区域)更大的亲和力(例如，大至少10倍，50倍，100倍，1000倍或10000倍)结合c型凝集素域。
特别地，根据本发明的第一方面，抗clec14a结合域可以能够结合clec14a的c型凝集素域内的表位。在一些情况下，抗clec14a结合域可以能够结合在人clec14a的残基97-108处发现并且具有errrschtlene(seqidno.24)的氨基酸序列的表位，或结合clec14a直向同源物或天然存在的变体中相应的表位。然而，在其他情况下，抗clec14a结合域可以结合clec14a的c型凝集素域内的不同表位或区域(即不结合残基97-108)。例如33-44,45-56,57-68,69-80,81-92,109-120,121-132,133-144,145-156或157-168或与该区域重叠(与97-108重叠)的区域。因此，第一方面的抗clec14a结合域可能与clec14a的c型凝集素域内的任何表位或残基结合。
根据本发明的第二方面，尽管抗clec14a结合域与clec14a的胞外域结合，但它可以不在seqidno.1的残基22-173处结合c型凝集素域和/或其1-4个残基内的位置，例如，seqidno.1的22-175,23-173,23-175,32-173或32-175。因此，在第二方面，抗clec14a结合域特别结合seqidno.1的人clec14a的残基174-396或seqidno.1的人clec14a的残基175或176-396)。特别地，在这方面，抗clec14a结合域可以结合clec14a的sushi域(或称为补体对照蛋白(ccp)域)，其在seqidno.1的残基174-244(或此位置的1-4个氨基酸残基内，例如在175-244或176-244)发现，或结合clec14a直系同源序列或天然存在的变体中的等同部分。特别地，抗clec14a结合域可以结合c型凝集素域近端的sushi域的一部分，例如在残基174-210,174-200或174-190处。
如上所讨论，如本文所定义的抗clec14a结合域可以在存在或包含在car分子内，并在合适的宿主细胞上表达时与clec14a结合。因此，特别地，本发明的car或由本发明的核酸分子编码的car能够通过car的抗clec14a结合域与clec14a结合。当分离表达时(例如作为配体或配体分子的一部分)或当作为抗体分子的一部分或其片段或scfv表达时，抗clec14a结合域还可以能够结合clec14a，如上所讨论。
另外，如上文进一步讨论的，在本发明的第一方面中使用的抗clec14a结合域可以能够破坏或抑制clec14a和mmrn2之间的相互作用。特别地，抗clec14a结合域可以能够破坏人clec14a和人mmrn2之间的相互作用，其中mmrn2的氨基酸序列如表1的seqidno.28所示(由seqidno.29编码)。因此，在这方面，当以分离形式(或作为抗体的一部分或scfv)使用时，抗clec14a结合域能够破坏相互作用。相互作用的破坏意味着形成相互作用的clec14a和mmrn2分子的量的减少，即抑制clec14a和mmrn2之间的结合水平。特别地，在本发明的第一方面中使用的抗clec14a结合域可以将clec14a和mmrn2之间的结合水平抑制至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％。在一个方面，抗clec14a结合域可以能够阻止clec14a和mmrn2之间的任何相互作用，因此可以完全消除相互作用(即，可以抑制100％的clec14a和mmrn2相互作用)。然而，特别地，相互作用水平可以降低到不可检测的水平。
或者，抗clec14a结合域可以能够与mmrn2竞争结合clec14a。
在这方面，抗clec14a结合域可以与clec14a的c型凝集素域内的clec14a多肽的mmrn2结合区结合。可以使用本领域的常规方法，例如表位作图，竞争结合研究等，确定给定的配体或抗体是否选择性结合mmrn2结合区或与mmrn2竞争对clec14a多肽的特异性结合。
确定clec14a和mmrn2之间相互作用水平的方法是本领域已知的，包括下拉测定法，酶联免疫吸附测定法(elisa)，表面等离振子共振测定法，基于芯片的测定法，免疫细胞荧光，酵母双杂交技术。和噬菌体展示。检测clec14a和mmrn2之间相互作用的其他方法包括超滤及离子喷雾质谱法/hplc方法或其他物理和分析方法。可以使用荧光能量共振转移方法(fret)，其中可以通过测量荧光标记物在彼此极其附近时的相互作用来测量两个荧光标记实体(即clec14a和mmrn2或其部分，直向同源物或变体)的结合。
如下文详细讨论的，抗clec14a结合域可以源自结合clec14a的抗体，或结合clec14a的任何其他配体(例如肽或多肽)。特别地，抗clec14a结合域可以源自mmrn2(例如seqidno.28的人mmrn2)，如上所述，其与clec14a相互作用，因此是clec14a的配体。抗clec14a结合域可以包含全长mmrn2氨基酸序列(例如对于人mmrn2为seqidno.28)或其至少一部分，其中所述部分能够结合clec14a。因此，特别地，mmrn2的一部分可以与全长mmrn2一样具有对clec14a的亲和力的至少50,60,70,80,90,100％或更多。或者，mmrn2的一部分可以具有对clec14a的亲和力，如上文关于抗clec14a结合域所讨论的。
特别地，抗clec14a结合域可以包含mmrn2的一部分，其能够结合clec14a并破坏mmrn2与clec14a的相互作用，如上所讨论。或者或另外，mmrn2的至少一部分可以能够结合clec14a的c型凝集素域，更具体地说，能够结合人clec14a的残基97-108处找到并且具有氨基酸序列errrschtlene(seqidno.24)的表位，或clec14a直向同源物或天然存在的变体中的相应表位。包含在抗clec14a结合域内的mmrn2的一部分可以包含来自mmrn2的至少3个连续氨基酸，特别是至少4,5,6,7,8,9,10,15,20或25个氨基酸。
或者，抗clec14a结合域可以包含全长mmrn2或其部分的变体，其中所述变体能够结合clec14a(例如以如上文关于抗clec14a结合域所讨论的亲和力)。变体可以与全长mmrn2或mmrn2的一部分具有至少60,70,80,90,95,96,97,98或99％的序列同一性，并且如上指示，保留与clec14a结合的能力。或者，mmrn2变体可以包含一个或多个，例如，两个，三个，四个，五个，十个或十五个与野生型mmrn2序列相比的氨基酸取代，缺失和/或添加，例如保守替代。应当理解，对mmrn2部分的变体进行的氨基酸取代，缺失和/或添加的数目可以与该部分的长度成比例，其中较短的部分可以比较长的部分包含更少的氨基酸取代，添加和/或缺失。
包含在抗clec14a结合域内的mmrn2变体序列可以与野生型mmrn2序列对clec14a具有不同的结合亲和力，例如，更高或更低的结合亲和力，或变体可以具有对clec14a的相同或基本相同的结合亲和力(例如相当的亲和力，例如不超过20倍不同的)。然而，应当理解，如先前所讨论，变体mmrn2或包含mmrn2变体的抗clec14a结合域优选对clec14a具有结合亲和力。
如本发明第一方面中使用的抗clec14a结合域(例如在本发明的car中)可以包含任何氨基酸序列，只要该序列具有上述讨论的结合活性，即只要结合域可以与clec14a的c型凝集素域结合。然而，特别地，抗clec14a结合域可以包含至少一个重链或轻链互补决定区(cdr)，其能够结合clec14a的c型凝集素域。可以从能够结合clec14a(即clec14a的c型凝集素域)的抗体的重链和/或轻链序列预测一个或多个cdr，如上所讨论(即以如上所讨论的亲和力和特异性)。特别地，抗clec14a结合域可以包含来自表1中列出的抗体crt1,3,4或5中的任一种的一个或多个cdr。
与此相关，在本发明的第二方面，抗clec14a结合域包含至少一个选自以下的cdr：seqidno.167，seqidno.168，seqidno.169，seqidno.129，seqidno.68或seqidno.130的重链和/或轻链cdr或具有一个，两个或三个氨基酸取代的这些序列中的任何一个的变体，其中可以从抗体crt2(其结合clec14a，如实施例中所示和如表1中所示)的轻链序列(seqidno.133)和重链序列(seqidno.173)预测所选择的cdr。
因此，抗clec14a结合域可以包含至少一个cdr，其可以从结合clec14a的抗体(或此类预测的cdr的变体(例如具有一个，两个或三个氨基酸取代的变体))预测，其中抗clec14a结合域以及因此包含抗clec14a结合域的car能够结合clec14a。
应当理解，含有三个或更少cdr区(例如单个cdr或甚至其一部分)的分子可以能够保留cdr来源的抗体的抗原结合活性。含有两个cdr区的分子在本领域中描述为能够结合靶抗原，例如，以微型抗体(minibody)的形式(vaughan和sollazzo，2001，combinationalchemistry&highthroughputscreening，4,417-430)。已经描述了含有单个cdr的分子，其可以展示对靶物的强结合活性(laune等，1997，jbc，272,30937-44；nicaise等，2004，proteinscience，13：1882-91)。
在这方面，本发明中使用的抗clec14a结合域可以包含一个或多个可变重链cdr，例如，一个，两个或三个可变重链cdr。或者或另外，抗clec14a结合域可以包含一个或多个可变轻链cdr，例如，一个，两个或三个可变轻链cdr。然而，特别地，抗clec14a结合域可以包含三个重链cdr和三个轻链cdr(更具体地，包括三个cdr的重链可变区和包含三个cdr的轻链可变区)，其中至少一个cdr可以自与clec14a结合的抗体预测，或者可以选自下面提供的cdr序列之一。
本发明的抗clec14a结合域可以包含可变重链和轻链cdr的任何组合，例如，一个可变重链cdr与一个可变轻链cdr一起，两个可变重链cdr与一个可变轻链cdr一起，两个可变重链cdr与两个可变轻链cdr一起，三个可变重链cdr与一个或两个变量轻链cdr一起，一个可变重链cdr与两个或三个可变轻链cdr一起，或三个可变重链cdr与三个可变轻链cdr一起。
抗clec14a结合域内存在的一个或多个cdr可以不是全部从相同抗体预测，只要该域具有上述结合活性即可。因此，一个cdr可以从结合clec14a的抗体的重链或轻链预测，而另一个cdr可以从不同的抗体预测。在此类情况下，可以优选从结合clec14a的抗体预测cdr3。然而，特别是若抗clec14a结合域中存在多于一个cdr，则优选从结合clec14a的抗体预测cdr。cdr不需要来自相同的clec14a结合抗体，并且可以使用来自不同的clec14a抗体，特别是来自结合相同的所需区域或表位的clec14a抗体的cdr的组合。
在一个具体实施方案中，抗clec14a结合域包含从结合clec14a的抗体的可变重链序列预测的三个cdr和从结合clec14a的抗体的可变轻链序列预测的三个cdr(优选相同的抗体)。
抗clec14a结合域可以进一步包含来自结合clec14a的抗体的可变重链和轻链，特别是可以包含scfv，其包含来自结合clec14a的抗体的可变重链和轻链。
如本文所用，提及“互补决定区”或“cdr”是指结合特定抗原，例如clec14a的抗体内的高变异性区域。因此，抗体的cdr通常对抗体提供具其结合特异性。三个cdr可以存在于完整抗体分子的每个重链的可变区中(即包含两个全长重链和两个全长轻链)，并且三个cdr可以存在于每个轻链的可变区中(重链cdr1,2和3以及轻链cdr1,2和3，从氨基到羧基末端编号)。可以使用本领域可获得的预测软件，使用abysis算法(www.bioinf.org.uk/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)，或使用mgt/v-quest软件，例如：可以在www.imgt.org上找到的imgt算法(immunogenetics)，参见例如lefranc等，2009nar37：d1006-d1012和lefranc2003，leukemia17：260-266，从抗体的重链和轻链可变区序列预测抗体重链和轻链可变区的cdr。通过任一算法鉴定的cdr区被认为同样适用于本发明。cdr在长度(这取决于预测它们的抗体)上和及重链和轻链之间可以变化。因此，完整抗体的三个重链cdr具有不同的长度(或可以具有相同的长度)，并且完整抗体的三个轻链cdr可以具有不同的长度(或可以具有相同的长度)。例如，cdr的长度范围可以是2或3个氨基酸至5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20个氨基酸。特别地，cdr的长度可以是3-14个氨基酸，例如至少3个氨基酸且少于20个氨基酸。
重链和轻链可变区的cdr(即重链可变cdr1,2和3以及轻链可变cdr1,2和3)通常通过框架区彼此分开。重链和轻链可变区均包含四个框架区(fr1,2,3和4，从氨基到羧基末端编号)。
如本文所用，术语“重链可变区”(vh域)是指抗体分子的重链的可变区。
如本文所用，术语“轻链可变区”(vl域)是指抗体分子的轻链的可变区。哺乳动物抗体的轻链基于其恒定域的氨基酸序列和其可变域的框架区中的一些氨基酸而归为两种明显不同的类型之一：kappa和lamda。
应当注意，在必要时遵循kabat命名法，以便定义cdr的定位(kabat等，1991，5thed，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,647-669，通过引用并入本文)。
提及“抗体”包括但不限于多克隆，单克隆，嵌合，单链，fab片段和fab表达文库产生的片段。这些片段包括保留其对靶物的结合活性的完整抗体片段，fv，f(ab')和f(ab')2片段以及单链抗体(scfv)，融合蛋白和包含抗体的抗原结合位点的其他蛋白质。该术语还包括抗体样分子，其可以使用噬菌体展示技术或分子的其他随机选择技术产生，所述分子结合特定多肽或其特定区域。因此，术语抗体包括含有结构的所有分子，所述结构是天然抗体的识别位点(即与表位或抗原结合或组合的抗体部分)的一部分。此外，抗体及其片段可以是人源化抗体，其中可以使用本领域已知的方法将框架区，例如vh和/或vl的框架区修饰为对应于至少一个人框架区。
如本文所用，“scfv”或“单链可变片段”包括其中抗体的可变重链(vh)和可变轻链(vl)通过柔性寡肽连接的分子。因此，scfv是至少一种可变重链和至少一种可变轻链之间的融合物。通常连接可变重链和轻链的柔性寡肽可以长度为从5个氨基酸，特别是从长度为8,9,10或11个氨基酸至20,21,22,23,24,25,26,27,28，29或30个氨基酸，例如长度10-20，12-18或14-17或14-16个氨基酸。柔性寡肽可以包含甘氨酸，丝氨酸和/或苏氨酸残基，并且特别地可以包含至少50,60,70或80％的甘氨酸残基。柔性接头通常可以将可变重链的c末端连接到可变轻链的n末端，或可变轻链的c末端连接到可变重链的n末端。可以使用本领域已知的技术和方法制备工程化抗体，例如scfv抗体。
fab，fv，scfv和dab抗体均可在大肠杆菌中表达并从大肠杆菌中分泌，这允许容易地产生大量抗体片段。完整或完整的抗体是二价的，即具有两个抗原结合位点。fab，fv，scfv和dab片段通常是单价的，因此通常仅具有一个抗原结合位点。因此，单价scfv可包含一个可变重链和一个可变轻链。然而，scfv可以是二价，三价或四价(除单价外)，并且scfv可以包含多于一个可变重链和多于一个可变轻链，例如两个，三个或四个可变重链或可变轻链。多于一个可变重和/或可变轻链可以是相同的或可以来自不同的抗体。scfv可以是双抗体，三体或四体。在这方面，使用的柔性接头可以比上面在单价scfv中使用的更短。
提及“结合clec14a的抗体”是指对clec14a具有相同结合亲和力的抗体，如上文针对抗clec14a结合域所讨论的。特别地，根据本发明的第一方面，结合clec14a的抗体与clec14a的c型凝集素域结合，如前所述。
在第一方面的另一个实施方案中，抗clec14a结合域可以包含以下中的至少一种：
(a)重链cdr1，其具有氨基酸序列seqidno.211或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是(s/t)syw(i/m)(e/h)(seqidno.150),gytf(s/t)syw(seqidno.151)或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体),
(b)重链cdr2，其具有氨基酸序列seqidno.212或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是wig(e/a)i(l/y)pg(s/n)(g/s)(s/d)t(n/s)(seqidno.152),i(l/y)pg(s/n)(g/s)(s/d)t(seqidno.153)或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)和/或
(c)重链cdr3，其具有氨基酸序列seqidno.213或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是(a/t)(r/h)(g/x)(g/x)(d/x)y(d/y)(e/g)(e/s)(y/d)y(v/a/l)md(seqidno.154),(a/t)(r/h)(g/x)(g/x)(d/x)y(d/y)(e/g)(e/s)(y/d)y(v/a/l)mdy(seqidno.155)或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)，
其中x是无氨基酸残基。
因此，第一方面的抗clec14a结合域可以包含seqidno.150,151,152,153,154或155中的任一个或多个，或seqidno.150-155中任一个或多个的具有一个，两个或三个氨基酸取代的一个或多个变体。在本文所述的氨基酸序列的上下文中使用“/”是指可以存在于特定位置的氨基酸残基的选择。例如，提及“s/t”指示s或t残基可以存在于该位置，并且提及gytf/x指示在该位置可以存在gytf或不存在氨基酸。因此抗clec14a结合域可以包含一个或多个选自以下的氨基酸序列：seqidno.150,152和/或154或seqidno.151,153和/或155，或如先前所定义的任何一种或多种这些序列的变体。
特别地，在该方面，抗clec14a结合域可以包含两个或三个上述cdr。最特别地，抗clec14a结合域可以包含具有氨基酸序列seqid150或151的cdr，具有氨基酸序列seqidno152或153和cdr，具有氨基酸序列154或155的cdr，或者如先前所定义的任何这些序列的一个或多个变体，例如抗clec14a结合域可以包含seqidno150,152和154或seqidno151,153和155，或具有一个，两个或三个氨基酸取代的任何这些cdr的一个或多个变体。
此外，本发明的第一方面，抗clec14a结合域可以包括以下中的至少一个：
(a)轻链cdr1，其具有氨基酸序列s/xs/xsym/ly/hwy(seqidno.156),ssvsy/ss/xy/x(seqidno.157)或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,
(b)轻链cdr2，其具有氨基酸序列seqidno.214或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是ll/wiyd/stsnla(seqidno.158),d/sts或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)和/或
(c)轻链cdr3，其具有氨基酸序列seqidno.215或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是q/hqw/ys/hs/ry/spl/r(seqidno.160),q/hqw/ys/hs/ry/spl/rtf/x(seqidno.161)或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)，
其中x是无氨基酸。
因此，第一方面的抗clec14a结合域可以包含seqidno.156,157,158,160,161或d/sts中的任何一个或多个，或其具有1,2或3个氨基酸取代的变体。因此，抗clec14a结合域可以包含一个或多个选自以下的氨基酸序列：seqidno.156,158和/或160或seqidno.157,161和/或d/sts，或如先前所述的这些序列中的一个或多个的变体。
特别地，在这方面，抗clec14a结合域可以包含两个或三个如上所述的cdr，例如，选自(a)的一个cdr，选自(b)的一个cdr和/或选自(c)的一个cdr。最特别地，抗clec14a结合域可以包含seqid156或157的cdr，seqidno158或d/sts的cdr和160或161的cdr，例如抗clec14a结合域可包含seqidnos156,158和160或seqidno157,161和d/sts，或具有一个，两个或三个氨基酸取代的任何这些cdr的变体。
第一方面的抗clec14a结合域可以包含选自seqidno.150-155中的任何一个或多个的至少一个cdr和(或/)选自seqidno.156-161中的任何一个或多个的至少一个cdr，例如来自seqidnos150-155的两个cdr和来自seqidno156-161的两个cdr。特别地，第一方面的抗clec14a结合域可包含具有氨基酸序列seqidno150或151的cdr，具有氨基酸序列seqidno.152或153的cdr，具有氨基酸序列seqidno.154或155的cdr，具有氨基酸序列seqidno.156或157的cdr，具有氨基酸序列seqno.158或d/sts的cdr和具有氨基酸序列seqidno.160或161的cdr，或这些序列中的任何一个的具有一个，两个或三个氨基酸取代的一个或多个变体。在本发明最优选的方面，根据第一方面的抗clec14a结合域可以包含具有seqidno.150,152,154,156,158和/或160的氨基酸序列或具有seqidno151,153,155,157,161和/或d/sts的氨基酸序列的cdr，或这些序列中的任何一个的具有一个，两个或三个氨基酸取代的一个或多个变体。
根据第一方面，更具体地本发明提供了核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸序列，所述嵌合抗原受体
(i)抗clec14a结合域,
(ii)跨膜域和
(iii)胞内信号传导域；
其中所述抗clec14a结合域能够结合clec14a的c型凝集素域并且其中所述抗clec14a结合域包含以下至少一项：
(a)重链cdr1，其具有氨基酸序列seqidno.32,seqidno.44,seqidno.64,seqidno.76或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,
(b)重链cdr2，其具有氨基酸序列seqidno.33,seqidno.45,seqidno.65,seqidno.77或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体和/或
(c)重链cdr3，其具有氨基酸序列seqidno.116,seqidno.118,seqidno.66,seqidno.78,seqidno.34,seqidno.46,seqidno.100,seqidno.102或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。
因此，抗clec14a结合域可包含选自上文所述的重链可变cdr序列的一个，两个或三个cdr。特别地，抗clec14a结合域可包含选自(a)中提供的序列的一个cdr，选自(b)中提供的序列的一个cdr和/或来自(c)中提供的序列的一个cdr，或那些序列的具有一个，两个或三个氨基酸取代的一个或多个变体。例如，抗clec14a结合域可包含具有氨基酸序列seqidno.32的cdr，具有氨基酸序列seqidno.33的cdr，和具有氨基酸序列seqidno.66或116的cdr。
根据第一方面，本发明还提供核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含
(i)抗clec14a结合域，
(ii)跨膜域和
(iii)胞内信号传导域；
其中所述抗clec14a结合域能够结合clec14a的c型凝集素域并且其中所述抗clec14a结合域包含以下至少一项：
(a)轻链cdr1，其具有氨基酸序列seqidno.35,seqidno.47,seqidno.67,seqidno.79或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,
(b)轻链cdr2，其具有氨基酸序列seqidno.36,dts,seqidno.68,sts或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，和/或
(c)轻链cdr3，其具有氨基酸序列seqidno.37,seqidno.49,seqidno.69,seqidno.81或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体.
因此，抗clec14a结合域可包含选自上文所述的轻链可变cdr序列的一个，两个或三个cdr。特别地，抗clec14a结合域可包含选自(a)中提供的序列的一个cdr，选自(b)中提供的序列的一个cdr和/或来自(c)中提供的序列的一个cdr，或那些序列的具有一个，两个或三个氨基酸取代的一个或多个变体。例如，抗clec14a结合域可包含具有氨基酸序列seqidno.35的cdr，具有氨基酸序列seqidno.68的cdr，和具有氨基酸序列seqidno.49的cdr。
第一方面的抗clec14a结合域可以包含至少一种选自以下的cdr：seqidnos32,33,34,44,45,46,100,102,116,118,64,65,66,76,77,或78中的任一个或多个和(/或)至少一种选自以下的cdr：seqidnos35,36,37,47,49,67,68,69,79,81,sts或dts中的任一个或多个，例如来自seqidnos32,33,34,44,45,46,100,102,116,118,64,65,66,76,77,或78的两个cdr和来自seqidnos.35,36,37,47,49,67,68,69,79,81,sts或dts的两个cdr。特别地，第一方面的抗clec14a结合域可以包含具有氨基酸序列seqidno32,44,64或76的cdr，具有氨基酸序列seqidno.33,45,65或77的cdr，具有氨基酸序列seqidno.34,46,100,102,116,118,66或78的cdr，具有氨基酸序列seqidno.35,47,67或79的cdr，具有氨基酸序列seqno.36,68,sts或dts的cdr，和具有氨基酸序列seqidno.37,49,69或81的cdr，或这些序列的任一个的具有1、2或3个氨基酸取代的一个或多个变体。
更具体地，抗clec14a结合域可以包含以下至少一个
(a)重链cdr1，其具有氨基酸序列seqidno.209或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是seqidno.32,seqidno.44,或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体),
(b)重链cdr2，其具有氨基酸序列seqidno.210或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是seqidno.33,seqidno.45,或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)，和/或
(c)重链cdr3，其具有氨基酸序列seqidno.207或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是seqidno.116,seqidno.118,seqidno.34,seqidno.46,seqidno.100,seqidno.102或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)。
因此，如上文指示，抗clec14a结合域可以包含两个或三个上述cdr并且可以特别包含选自(a)的一个cdr，选自(b)的一个cdr和/或选自(c)的序列的一个cdr。因此，优选地，抗clec14a结合域可以包含选自以下的至少一个重链cdr：seqidno.32,33和/或34；seqidno.44,45和/或46；seqidno.32,33和/或100；seqidno.44,45和/或102；seqidno.32,33和/或116或seqidno.44,45和/或118或这些序列的任一个或多个的具有1、2或3个氨基酸取代的变体。
在一个特别优选的实施方案中，第一方面的抗clec14a结合域可以包含具有以下氨基酸序列的cdr：
seqidno.32,seqidno.33和seqidno.34,
seqidno.44,seqidno.45和seqidno.46,
seqidno.32,seqidno.33和seqidno.100,
seqidno.44,seqidno.45和seqidno.102,
seqidno.32,seqidno.33和seqidno.116,或
seqidno.44,seqidno.45和seqidno.102,
其中任何以上所示的序列可以包含1、2或3个氨基酸取代。
此外，抗clec14a结合域可以包含以下至少一个：
(a)轻链cdr1，其具有氨基酸序列seqidno.35,seqidno.47或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,
(b)轻链cdr2，其具有氨基酸序列seqidno.36,dts或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，和/或
(c)轻链cdr3，其具有氨基酸序列seqidno.208或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是seqidno.37,seqidno49,或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)。
因此，如上文指示，抗clec14a结合域可以包含两个或三个上述cdr并且可以特别包含选自(a)的一个cdr，选自(b)的一个cdr和/或选自(c)的序列的一个cdr。因此，优选地，抗clec14a结合域可以包含选自以下的至少一个轻链cdr：seqidno.35,36和/或37；seqidno.47,49和/或dts；或seqidno.47，和/或dts；或这些序列的任一个或多个的具有1、2或3个氨基酸取代的变体。在一个特别优选的实施方案中，第一方面的抗clec14a结合域可以包含具有氨基酸序列seqidno.35,seqidno.36,和seqidno.37；或seqidno.47,dts和seqidno.49的cdr，其中任一个或多个上述序列可以具有1、2或3个氨基酸取代。
第一方面的抗clec14a结合域可以包含至少一个选自以下的cdr：seqidnos32,33,34,44,45,46,100,102,116或118中的任一个或多个和至少一个选自以下的cdr：seqidnos35,36,37,47,或49或dts中的任一个或多个，例如选自seqidnos32,33,34,44,45,46,100,102,116或118的两个cdr和选自seqidnos.35,36,37,47或49或dts的两个cdr。特别地，第一方面的抗clec14a结合域可以包含具有氨基酸序列seqidno32或44的cdr,具有氨基酸序列seqidno.33或45的cdr，具有氨基酸序列seqidno.34,46,100,102,116或118的cdr，具有氨基酸序列seqidno.35或47的cdr，具有氨基酸序列seqno.36或dts的cdr和具有氨基酸序列seqidno.37或49的cdr或这些序列的任一个的具有1、2或3个氨基酸取代的一个或多个变体。
特别地，抗clec14a结合域可以包含具有以下氨基酸序列的cdr：
seqidno.32,seqidno.33,seqidno.34,seqidno.35,seqidno.36和/或seqidno.37；
seqidno.44,seqidno.45,seqidno.46,seqidno.47,dts，和/或seqidno.49；
seqidno.32,seqidno.33,seqidno.100,seqidno.35,seqidno.36，和/或seqidno.37；
seqidno.44,seqidno.45,seqidno.102,seqidno.47,dts，和/或seqidno.49；
seqidno.32,seqidno.33,seqidno.116,seqidno.35,seqidno.36，和/或seqidno.37；或者
seqidno.44,seqidno.45,seqidno.118,seqidno.47,dts和/或seqidno.49,
其中任一个或多个上述seqidno可以包含1、2或3个氨基酸取代。
或者，抗clec14a结合域可以包含
(a)重链cdr1，其具有氨基酸序列seqidno.209；
(b)重链cdr2，其具有氨基酸序列seqidno.210；
(c)重链cdr3，其具有氨基酸序列seqidno.207；
(d)轻链cdr1，其具有氨基酸序列seqidno.35或47；
(e)轻链cdr2，其具有氨基酸序列seqidno.36或dts和/或
(f)轻链cdr3，其具有氨基酸序列seqidno.208。
或者，第一方面的抗clec14a结合域可以包含以下至少一个
(a)重链cdr1，其具有氨基酸序列seqidno.216或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是seqidno.64,seqidno.76或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体),
(b)重链cdr2，其具有氨基酸序列seqidno.217或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是seqidno.65,seqidno.77或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)，和/或
(c)重链cdr3，其具有氨基酸序列seqidno.218或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是seqidno.66,seqidno.78或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)。
在此实施方案中，抗clec14a结合域可以特别包含来自(a)的一个cdr，来自(b)的一个cdr和/或来自(c)的一个cdr，例如至少一个选自以下的cdr：seqidno.64,seqidno.65和seqidno.66或至少一个选自以下的cdr：seqidno.76,seqidno.77和seqidno.78，或这些序列中任一个的具有1、2或3个氨基酸取代的变体。
因此，在一个优选的实施方案中，第一方面的抗clec14a结合域可以包含具有以下序列的cdr：
seqidno.64,seqidno.65和/或seqidno.66或
seqidno.76,seqidno.77和/或seqidno.78,
其中任何上文所示的序列可以具有1、2或3个氨基酸取代。
此外，第一方面的抗clec14a结合域可以包含以下至少一个
(a)轻链cdr1，其具有氨基酸序列seqidno.219或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是seqidno.67,seqidno.79或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体),
(b)轻链cdr2，其具有氨基酸序列seqidno.220或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是seqidno.68,sts或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)，和/或
(c)轻链cdr3，其具有氨基酸序列seqidno.221或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体(例如特别是seqidno.69,seqidno.81或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体)。
在此实施方案中，抗clec14a结合域可以特别包含来自(a)的一个cdr，来自(b)的一个cdr和/或来自(c)的一个cdr，例如至少一个选自以下的cdr：seqidno.67,68或69，或至少一个选自以下的cdr：seqidno.79,81或sts，或任何这些序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体。
因此，特别地，在此方面，抗clec14a结合域可以包含具有以下序列的cdr：
seqidno.67,seqidno.68和/或seqidno.69,或
seqidno.79,sts和/或seqidno.81,
其中任一个或多个上述序列可以包含1、2或3个氨基酸取代。
第一方面的抗clec14a结合域可以包含至少一个选自以下的cdr：seqidnos64,65,66,76,77和78中的任一个或多个和至少一个选自以下的cdr：seqidnos67,68,69,79,81或sts中的任一个或多个，例如两个选自seqidnos64,65,66,76,77和78的cdr和两个选自seqidnos.67,68,69,79,81或sts的cdr。特别地，第一方面的抗clec14a结合域可以包含具有氨基酸序列seqidno64或76的cdr，具有氨基酸序列seqidno.65或77的cdr，具有氨基酸序列seqidno.66或78的cdr，具有氨基酸序列seqidno.67或79的cdr，具有氨基酸序列seqno.68或sts的cdr和具有氨基酸序列seqidno.69或81的cdr，或这些序列的任一个的具有1、2或3个氨基酸取代的一个或多个变体。
特别地，抗clec14a结合域可以包含具有以下氨基酸序列的cdr：
seqidno64,seqidno.65,seqidno.66,seqidno.67,seqidno.68和/或seqidno.69或
seqidno.76,seqidno.77,seqidno.78,seqidno.79,sts和/或seqidno.81
其中任一个或多个上述序列可以包含1、2或3个氨基酸取代。
如先前讨论，根据本发明的第二方面，抗clec14a结合域包含以下至少一项：
(a)重链cdr，其具有氨基酸序列seqidno.167或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,
(b)重链cdr，其具有氨基酸序列seqidno.168或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,
(c)重链cdr，其具有氨基酸序列seqidno.169或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体
(d)轻链cdr，其具有氨基酸序列seqidno.129或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体,
(e)轻链cdr，其具有氨基酸序列seqidno.68或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体，和/或
(f)轻链cdr，其具有氨基酸序列seqidno.130或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。
因此，在第二方面，抗clec14a结合域可以包含来自(a)，(b)，(c)，(d)，(e)和/或(f)的一个，两个或三个cdr，特别是来自(a)的一个cdr，来自(b)的一个cdr和来自(c)的一个cdr，和/或来自(d)的一个cdr，来自(e)的一个cdr和来自(f)的一个cdr，或这些序列的任何一个或多个的具有一个，两个或三个氨基酸取代的变体。
因此，特别地，根据第二方面，抗clec14a结合域包含具有seqidno.167，seqidno.168和seqidno.169和/或seqidno.129，seqidno.68和seqidno.130的氨基酸序列的cdr。
如上所讨论，抗clec14a结合域可包含上文讨论的任何cdr序列的变体序列。在这方面，抗clec14a结合域中存在的任何cdr序列中的一个或多个可以是变体序列。例如，当抗clec14a结合域包含来自可变重链抗体序列的1-3个cdr时，那些cdr中的任何一个、全部或无一可以是变体。或者，当抗clec14a结合域包含来自轻链抗体序列的1-3个cdr时，那些cdr中的任何一个，全部或无一可以是变体。因此，当抗clec14a结合域包含6个cdr(例如来自重链的3个cdr和来自轻链的3个cdr)时，存在的cdr序列中的一个，两个，三个，四个，五个或六个可以是变体序列并且抗clec14a结合域内每个单独的cdr可具有一个，两个或三个氨基酸取代。抗clec14a结合域可包含非变体cdr序列和变体cdr序列两者。或者，抗clec14a结合域可包含所有变体cdr序列或不包含变体cdr序列。
如前所讨论，变体cdr可包含一个，两个或三个氨基酸取代。然而，应当理解，对于较短的cdr序列，可以优选具有较少的氨基酸取代。例如，在cdr序列长度仅为3个氨基酸的情况下，尽管可以存在3个氨基酸取代(例如保守取代)，但优选cdr可具有少于3个取代，例如两个，一个或无氨基酸取代。
如下文进一步讨论的，变体可具有任何氨基酸取代，但优选可具有保守氨基酸取代。特别地，包含变体cdr的抗clec14a结合域(和内部包含它的car)应当保持能够结合clec14a，如先前所定义的。应当理解，使用变体cdr可以改变抗clec14a结合域的结合活性(例如，clec14a的结合亲和力可以增加或减少，或者结合域可以识别clec14a的不同表位)。然而，如上所述，使用一个或多个变体cdr序列仍应允许如前所定义的clec14a结合，即使该结合与包含一个或多个非变体cdr的抗clec14a结合域的结合不相同。或者，结合亲和力可以类似，如前所述。可优选在抗clec14a结合域中使用一个或多个变体cdr，其产生抗clec14a结合域(和本发明的car)，其对clec14a具有降低的结合亲和力。以此类方式，可以减少脱靶clec14a结合并且特别地可以使其最小化(例如与非肿瘤组织结合)，同时维持中靶结合(即结合肿瘤血管系统)。因此，在本发明的另一个实施方案中，涵盖用于鉴定对clec14a具有降低的结合亲和力的抗clec14a结合域的方法，其中所述方法包括将一个或多个氨基酸取代(特别是一个，两个或三个氨基酸取代)引入包含在抗clec14a结合域内的如本文所定义的cdr序列中，并测试变体域对clec14a的结合亲和力。
本发明进一步提供包含含有任何一种或多种上文定义的cdr序列或其变体的重链可变区和/或轻链可变区的抗clec14a结合域。因此，上述定义的cdr可以存在于抗clec14a结合域内的重链和/或轻链可变区内。如前所讨论，抗clec14a结合域可包含具有三个cdr的vh和/或具有三个cdr的vl，其中至少一个cdr选自上文列出的cdr序列之一，或其具有1、2或3个氨基酸取代的变体。
根据本发明的第一方面，抗clec14a结合域可以包含以下氨基酸序列：
(a)seqidno.56,
(b)seqidno.88,
(c)seqidno.90,
(d)seqidno.104
(e)seqidno.106或
(0seqidno.121,
或(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中任何一个的与其具有至少80％的同一性，例如，1-20，例如1到10个氨基酸取代的变体。
根据本发明的第二方面，抗clec14a结合域可包含seqidno.173的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性，例如1-20，例如1到10个氨基酸取代的其变体。
因此，根据该方面，抗clec14a结合域可包含如上所述的可变重链序列或与其具有至少80％同一性的其变体，如下文进一步所定义，例如具有一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个，十个，十五个或二十个氨基酸取代的变体。应当理解，重链可变序列(例如seqidno.56,88,90,104,106,121和173的那些)可包含一个或多个cdr(例如3个cdr)。在这方面，尽管可以改变上述重链可变区序列，例如，最多20％(例如，通过多达20个氨基酸取代)，优选在重链可变区内发生的任何cdr各自仅经历最多三个氨基酸取代(例如，每个cdr的一个，两个或三个氨基酸取代)。因此，关于seqidno.56，尽管涵盖了与其具有至少80％同一性的变体，但优选其中包含的seqidno.32，seqidno.33和seqidno.34的序列各自仅具有最多三个氨基酸取代。关于seqidno.88，优选其中包含的序列seqidno.64,65和66各自仅具有最多三个氨基酸取代。这也适用于seqidno.90中包含的seqidnos76,77和78，在seqidno.104中包含的seqidno:32,33和100，在seqidno.106中包含的seqidno.44,45和102，在seqidno.121中包含的seqidno:32,33和116以及seqidno173中包含的seqidnos167,168和169。
根据本发明的第一方面，抗clec14a结合域可包含以下氨基酸序列
(a)seqidno.57
(b)seqidno.89
(c)seqidno.91
(d)seqidno.105
(e)seqidno.107或
(f)seqidno.122,
或(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中任何一个的与其具有至少80％的同一性，例如具有1-20，例如1到10个氨基酸取代的变体。
根据本发明的第二方面，抗clec14a结合域可包含seqidno.133的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性，例如具有1-20，例如1到10个氨基酸取代的变体的其变体。
因此，根据这些方面，抗clec14a结合域可包含如上所述的可变轻链序列或其具有至少80％同一性，例如具有至少一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个，十个，十五个或二十个氨基酸取代的其变体。应当理解，轻链可变序列(例如seqidno.57,89,91,105,107或122或133的那些)可包含一个或多个cdr(例如3个cdr)。在这方面，尽管上述轻链可变区序列可以改变例如至多20％，优选在轻链可变区内发生的任何cdr各自仅经历最多三个氨基酸取代(例如每个cdr的一个，两个或三个氨基酸取代)。因此，关于seqidno.57，尽管涵盖了与其具有至少80％同一性的变体，但优选本文含有的seqidno.35，seqidno.36和seqidno.37的序列仅各自具有最多三个氨基酸取代。关于seqidno.89，优选本文含有的序列seqidno.67,68和69各自仅具有最多三个氨基酸取代。这也适用于seqidno:91中包含的seqidnos79,81和sts中，在seqidno.105中包含的seqidno:35,36和37，以及seqidno.107包含的seqidno47和49和dts，seqidno.112内包含的seqidno:35,36和37和seqidno.133中包含的seqidnos129,68和130。
特别地，根据本发明的第一方面，抗clec14a结合域可包含与clec14a结合(即与clec14a上的c型凝集素域结合)的重链和轻链可变序列。因此，抗clec14a结合域可以包含seqidnos56,88,90,104,106或121或与其具有至少80％同一性的其变体，以及seqidnos57,89,91，105,107或122中的任一个或与其具有至少80％同一性的其变体。因此，在这方面，抗clec14a结合域可以包含
(a)seqidno.56或与其具有至少80％同一性的其变体和seqidno.57或与其具有至少80％同一性的其变体
(b)seqidno.88或与其具有至少80％同一性的其变体和seqidno.89或与其具有至少80％同一性的其变体
(c)seqidno.90或与其具有至少80％同一性的其变体和seqidno.91或与其具有至少80％同一性的其变体
(d)seqidno104或与其具有至少80％同一性的其变体和seqidno.105或与其具有至少80％同一性的其变体
(e)seqidno106或与其具有至少80％同一性的其变体和seqidno.107或与其具有至少80％同一性的其变体或
(f)seqidno.121或与其具有至少80％同一性的其变体和seqidno.122或与其具有至少80％同一性的其变体。
如上所讨论，优选seqidnos56,57,88,89,90,91,104,105,106,107,121和122的重链和轻链可变区内存在的任何cdr仅具有至多每个cdr一个，两个或三个氨基酸取代。
在本发明的第二方面，抗clec14a结合域可包含与clec14a结合(即与clec14a上的c型凝集素域结合)的重链和轻链可变序列。因此，抗clec14a结合域可包含seqidno.173的重链可变序列和seqidno.133的轻链可变序列或与其具有至少80％同一性的任一或两种序列的变体。
如前所讨论，根据本发明的“变体”序列是指与定义的或参考序列(即由seqidno.提供的)相比具有许多氨基酸取代的序列。因此，与原始序列相比，变体序列可具有不同的氨基酸残基。尽管可以进行任何氨基酸取代以获得变体序列，但如前所述，任何此类变体序列应当在某种程度上保留原始序列的功能活性，例如，结合亲和力。因此，尽管与原始序列相比，变体可具有增加或减少的功能活性(例如结合亲和力)，但应保留一些功能。在包含变体cdr或变体重链或轻链的本发明的抗clec14a结合域的情况下，优选包含变体序列的抗clec14a结合域仍然可以与clec14a结合。尽管变体的实际结合亲和力可能与抗clec14a结合域不同(增加或减少)，但仍应选择性地发生与clec14a的结合。
因此，包含变体序列(例如cdr或重链/轻链)的抗clec14a结合域应当优选具有与包含非变体序列的抗clec14a结合域基本相同的结合亲和力。例如，变体可以具有有非变体序列的抗clec14a结合域的结合亲和力的至少20,30,40,50,60,70,80,85,90,95,100,105,110,115,120或125％或更多。检测和测量对clec14a的结合亲和力的方法是本领域已知的。例如，可以使用下拉测定法，酶联免疫吸附测定法(elisa)，表面等离振子共振测定法，基于芯片的测定法，免疫细胞荧光，酵母双杂交技术和噬菌体展示。
本文描述的氨基酸取代可以是保守氨基酸取代，例如其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(如甘氨酸，半胱氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β-分支侧链(如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，保守氨基酸取代包括
在第一方面的另一个实施方案中，抗clec14a结合域可以包含scfv，其包含上文定义的重链和轻链，其中所述重链和轻链通过如先前定义的接头序列连接。特别地，在此方面，抗clec14a结合域可以包含以下的氨基酸序列：
(a)seqidno.58
(b)seqidno.96
(c)seqidno.112,或
(d)seqidno.125,
或与其具有至少80％同一性的序列。
在第二方面的另一个实施方案中，抗clec14a结合域可包含scfv，其包含上文定义的重链和轻链(seqidno.133和173)，其中所述重链和轻链通过如前所定义的接头序列连接。特别是在这方面，抗clec14a结合域可以包含seqidno.175的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的序列。
因此，技术人员将理解，可以将变体序列用于本发明的抗clec14a结合域中的seqidno.58,96,112,125或175的scfv序列。如上所讨论，此类变体优选保留未修饰的scfv序列的结合亲和力，或者基本上保留未修饰的scfv序列的结合亲和力，例如可以具有未修饰的scfv序列的结合亲和力的至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，110％或120％。
与未修饰的氨基酸或核苷酸序列具有至少80％同一性的本发明的氨基酸或核苷酸序列包括具有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的序列。例如，关于seqidno.58，96,112,125或175的上述scfv序列，涵盖与其具有至少85,90,95,96,97,98或99％同一性的序列。可以通过任何方便的方法评估序列同一性。然而，为了确定序列之间的同一性程度，进行序列多重比对的计算机程序是有用的，例如clustalw。若期望的话，clustalw算法可以与blosum62评分矩阵和缺口开放罚分10并且缺口延伸罚分0.1一起使用，从而在两个序列之间获得最高阶匹配，其中序列之一的总长度的至少50％参与比对。计算两个氨基酸序列之间的百分比同一性的其他方法通常是本领域公认的，包括例如computationalmolecularbiology，lesk编oxforduniversitypress,newyork,1988,biocomputing:informaticsandgenomicsprojects中描述的那些。
通常，计算机程序将用于此类计算。比较和比对序列对的程序，如align，fasta，由缺口的blast，blastp，blastn或gcg也可用于此目的。此外，欧洲生物信息学研究所的dali服务器提供基于结构的蛋白质序列比对。
通过提供参考点，可以使用align程序以默认参数(例如，在genestream网络服务器，igh,montpellier,france在因特网上可用)确定具有80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性等的根据本发明的序列。
如上所讨论，与本发明的限定序列具有至少80％序列同一性的变体序列优选仅在其中包含的特定cdr内具有最多3个氨基酸取代。因此，尽管变体可以在其整个长度上与限定的序列显示出至少80％的同一性，但优选其中包含的任何cdr将仅具有最多3个氨基酸取代，例如，无一，一个或两个氨基酸取代。因此，在此类情况下，优选在任何cdr之外的重链或轻链可变链序列或scfv序列的区域中发生变异，例如在框架区内。对于任何cdr之外的变异，例如，在框架区中，变异可包括氨基酸取代，缺失和/或添加。
应当理解，对于vh，vl和scfv，例如，如在抗clec14a结合域内，变异可包括框架区的人源化。vh，vl或scfv可以以已知方式人源化，例如通过将鼠序列的cdr区插入人抗体的框架中。可以使用verhoeyen等(1988)science，239,1534-1536和kettleborough等，(1991)proteinengineering，14(7)，773-783中描述的技术和方法制备人源化抗体。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架残基被相应的非人残基取代。通常，人源化抗体将含有可变域，其中所有或大部分cdr区对应于非人免疫球蛋白的域，和框架区基本上或完全是人免疫球蛋白共有序列的域。
根据第一方面，多核苷酸序列可包含以下中的至少一种：
(a)seqidno.38,seqidno.50,seqidno.82,或其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，
(b)seqidno.39,seqidno.51或seqidno.83,或其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，
和/或
(c)seqidno.40,seqidno.52,seqidno.84,seqidno.101,seqidno.103,seqidno.117,seqidno.120,或其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体。
上文定义的核苷酸序列各自编码重链cdr，其可存在于本文所述的抗clec14a结合域内。(a)中列出的核苷酸序列编码抗体crt1,3,4和5的重链cdr1序列(因此seqidno38编码seqidno.32，seqidno.50编码seqidno.44并且seqidno.82编码seqidno.76)，(b)中列出的核苷酸序列编码抗体crt1,3,4和5的重链cdr2序列(因此seqidno.39编码seqidno.33，seqidno.51编码seqidno.45并且seqidno.83编码seqidno.77)并且(c)中列出的核苷酸序列编码抗体crt1,3,4和5的重链cdr3序列(因此seqidno.44编码seqidno.34，seqidno.52编码seqidno.46，seqidno.84编码seqidno.78，seqidno.101编码seqidno.100，seqidno.117编码seqidno.116并且seqidno.120编码seqidno.118)。因此，多核苷酸可包含任何一种限定的核苷酸序列，例如这些序列中的2或3种。特别地，多核苷酸序列可包含一个来自(a)的核苷酸序列，一个来自(b)的核苷酸序列和/或一个来自(c)的核苷酸序列。
此外，涵盖简并变体。应当理解，由于遗传密码的简并性，几种不同的核苷酸序列可以编码相同的氨基酸序列。因此，对于特定的氨基酸，超过一个核苷酸密码子可以编码该氨基酸。因此，简并变体涵盖编码与seqidno.1所定义的核苷酸序列相同的氨基酸序列的核苷酸变体。特别地，简并变体可以涵盖密码子优化的变体，其中可以进行密码子优化以增强编码序列在特定生物体中的表达。这是本领域的标准实践，并且技术人员将充分了解如何根据宿主密码优化核苷酸序列。
另外或或者，如第一方面中所定义的多核苷酸可包含以下核苷酸序列中的至少一种：
(a)seqidno.41,seqidno.53,seqidno.85,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，
(b)seqidno.42,gacacatcc,agcacatcc,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体和/或
(c)seqidno.43,seqidno.55,seqidno.87,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体。
上文定义的核苷酸序列各自编码轻链cdr，其可存在于本文所述的抗clec14a结合域内。(a)中列出的核苷酸序列编码抗体crt1,3,4和5的轻链cdr1序列(因此seqidno.41编码seqidno.35，seqidno.53编码seqidno.47，并且seqidno.85编码seqidno.79)，(b)中列出的核苷酸序列编码抗体crt1,3,4和5的轻链cdr2序列(因此，seqidno.42编码seqidno.36，gacacatcc编码dts和agcacatcc编码sts)，(c)中列出的核苷酸序列编码抗体crt1,3,4和5的轻链cdr3序列(因此seqidno.43编码seqidno.37，seqidno.55编码seqidno.49，并且seqidno.87编码seqidno.81)。因此，多核苷酸可包含任何一种限定的核苷酸序列，例如这些序列中的2或3种。特别地，多核苷酸序列可包含一个来自(a)的核苷酸序列，一个来自(b)的核苷酸序列和/或一个来自(c)的核苷酸序列。
多核苷酸序列可包含至少一个选自以下的编码重链cdr的核苷酸序列：seqidnos38,39,40,50,51,52,82,83,84,101,103,117或120中的任一个或多个和至少一个选自以下的编码轻链cdr的核苷酸序列：seqidnos41,42,43,53,55,85,87，agcacatcc或gacacatcc中的任何一个或多个，例如至少两个选自seqidnos38,39,40,50,51,52,82,83,84,101,103,117或120的核苷酸序列和至少两个选自seqidnos41,42，43，53,55,85,87，agcacatcc或gacacatcc的核苷酸序列。特别地，多核苷酸序列可包含seqidnos38,50或82的一个核苷酸序列；seqidnos39,51或83的一个核苷酸序列；seqidnos40,52,84,101,103,117或120的一个核苷酸序列；41,53或85的一个核苷酸序列；42，或agcacatcc或gacacatcc的一个核苷酸序列和43,45或87的一个核苷酸序列，或具有1、2或3个核苷酸取代的这些序列的一个或多个变体。
更具体地，多核苷酸可包含至少一种以下的核苷酸序列
(a)seqidno.38,seqidno.50,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体
(b)seqidno.39,seqidno.51,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，和/或
(c)seqidno.40,seqidno.52,seqidno.101,seqidno.103,seqidno.117,seqidno.120,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体。
因此，如上文指示，多核苷酸可以包含上述核苷酸序列中的两个或三个，并且可以特别包含一个来自(a)的核苷酸，一个来自(b)的核苷酸和/或一个来自(c)的核苷酸。更特别地，多核苷酸序列可以包含seqidnos38,39和/或40；seqidnos50,51和/或52；seqidnos38,39和/或101,seqidnos50,51和/或103；seqidnos38,39和/或117或seqidnos50,51和/或120,或这些序列的任一个的具有1、2或3个核苷酸取代的变体。
在一个特别优选的实施方案中，第一方面的多核苷酸可以包含以下核苷酸序列：
seqidno.38,seqidno.39和seqidno.40
seqidno.50,seqidno.51和seqidno.52
seqidno.38,seqidno.39和seqidno.101
seqidno.50,seqidno.51和seqidno.103
seqidno.38,seqidno.39和seqidno.117或
seqidno.50,seqidno.51和seqidno.120,
其中任何上述序列可以包含1、2或3个核苷酸取代。
此外，多核苷酸可以包含以下至少一个以下的核苷酸序列：
(a)seqidno.41,seqidno.53,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体
(b)seqidno.42或gacacatcc,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体和/或
(c)seqidno.43,seqidno.55,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体.
因此，如上文指示，多核苷酸可以包含上述核苷酸序列中的两个或三个，并且可以特别包含一个来自(a)的核苷酸，一个来自(b)的核苷酸和/或一个来自(c)的核苷酸。更特别地，多核苷酸序列可以包含至少一个选自seqidno.41,42和/或43的核苷酸序列；或至少一个选自seqidno.53,55和/或gacacatcc的核苷酸序列，或这些序列的任一个或多个的具有1、2或3个核苷酸取代的变体。
在一个具体的实施方案中，多核苷酸序列可以包含seqidno.41,seqidno.42和seqidno.43，或seqidno.53,gacacatcc和seqidno.55，其中核苷酸序列的任一个或多个可以具有1、2或3个核苷酸取代或简并序列。
第一方面的多核苷酸可以包含至少一个选自以下的核苷酸序列：seqidnos38,39,40,50,51,52,101,103,117或120中的任一个或多个和至少一个选自以下的核苷酸序列：seqidnos41,42,43,53或55或gacacatcc中的任一个或多个，例如至少两个选自以下的核苷酸序列：seqidnos38,39,40,50,51,52,101,103,117或120中的任一个或多个和至少两个选自以下的核苷酸序列：seqidnos41,42,43,53,或55或gacacatcc中的任一个或多个。特别地，多核苷酸序列可以包含核苷酸序列seqidno.38或50；核苷酸序列seqidno.39或51；核苷酸序列seqidno.40,52,101,103,117或120，核苷酸序列seqidno.41或53；核苷酸序列seqidno.42或gacacatcc和核苷酸序列seqidno.43或55。
特别地，多核苷酸序列可以包含以下核苷酸序列：
seqidno.38,39,40,41,42和43；
seqidno.50,51,52,53,55和gacacatcc；
seqidno.38,39,101,41,42和43；
seqidno.50,51,103,53,55和gacacatcc；
seqidno.38,39,117,41,42和43；或
seqidno.50,51,120,53,55和gacacatcc，
其中任何一个或多个上述seqidno可以包含1、2或3个氨基酸取代或者是其简并序列。
或者，多核苷酸序列可以包含以下至少一个：
(a)seqidno.82,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体
(b)seqidno.83,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，和/或
(c)seqidno.84,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体。
特别地，多核苷酸可以包含seqidno.82,83或84序列中的两个或者可以包含seqidnos82,83和84的全部。
此外，多核苷酸可以包含以下至少一个
(a)seqidno.85,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体
(b)agcacatcc,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体，和/或
(c)seqidno.87,其简并变体或其具有1、2或3个核苷酸取代的变体。
特别地，多核苷酸序列可以包含seqidno.85,87或agcacatcc的序列中的两个或可以包含seqidnos85,87和agcacatcc的全部。第一方面的多核苷酸序列可以包含至少一个选自以下的核苷酸序列：seqidno.82,83和84中的任一个或多个和至少一个选自以下的核苷酸序列：seqidno.85,87和agcacatcc中的任一个或多个，例如两个来自seqidnos82,83和84的核苷酸序列和两个来自seqidnos85,87和agcacatcc的核苷酸序列。特别地，多核苷酸序列可以包含seqidnos82,83,84,85,87和agcacatcc的全部，其中任一个或多个序列可以包含1、2或3个核苷酸取代。
根据本发明的第二方面，多核苷酸序列可以包含以下至少一个：
(a)seqidno.170,其简并变体或具有1、2或3个核苷酸取代的变体,
(b)seqidno.171,其简并变体或具有1、2或3个核苷酸取代的变体，和/或
(c)seqidno.172,其简并变体或具有1、2或3个核苷酸取代的变体。
因此，多核苷酸序列可以包含两个选自以下的核苷酸序列：seqidno.170,seqidno.171和seqidno.172。特别地，根据第二方面，多核苷酸序列可以包含seqidno.170,seqidno.171和seqidno.172。
如先前讨论，根据本发明的第二方面，多核苷酸序列可以包含以下至少一个:
(a)seqidno.131,其简并变体或具有1、2或3个核苷酸取代的变体,
(b)seqidno.74,其简并变体或具有1、2或3个核苷酸取代的变体，和/或
(c)seqidno.132,其简并变体或具有1、2或3个核苷酸取代的变体.
因此，在第二方面，多核苷酸序列可包含选自seqidno.131，seqidno.74和seqidno.132的两个核苷酸序列。特别地，根据第二方面，多核苷酸序列可包含seqidno131,74和132。
此外，根据第二方面，多核苷酸序列可包含seqidnos170,171,172,131,74和/或132中的任何一个或多个。特别地，多核苷酸序列可包含seqidno.170,171,172,131,74和132的全部，或那些序列中的任何一个或多个的简并变体，或任何一个或多个序列的具有1、2或3个核苷酸取代的变体。
如上所讨论，多核苷酸序列可包含上文列出的任何核苷酸序列的变体。在这方面，一个或多个核苷酸序列可以是变体序列。例如，当多核苷酸包含1-3个编码重链cdr的限定核苷酸序列时，那些序列中的任何一个，全部或无一可以是变体。或者，当多核苷酸序列包含1-3个编码轻链cdr的限定核苷酸序列时，那些序列中的任何一个、全部或无一是变体。因此，当多核苷酸包含编码轻链和重链cdr的6个核苷酸序列(例如3个编码轻链和3个编码重链)时，cdr编码核苷酸序列中的一个，两个，三个，四个，五个或六个可以可以是变体序列，每个单独的核苷酸序列可以包含1、2或3个核苷酸取代。多核苷酸序列可以包含变体和非变体核苷酸序列两者，或备选可以包含所有变体或不包含变体核苷酸序列。
本领域技术人员将理解，由于核酸编码的简并性，序列内的核苷酸取代可以或可以不导致编码的蛋白质或多肽序列中的氨基酸改变。因此，多个密码子可以编码相同的氨基酸。在这方面，本发明的核苷酸变体可以编码与非变体序列相同的氨基酸序列。若核苷酸取代确实导致氨基酸取代，则优选如上所讨论，取代是保守的(尽管本发明不限于保守氨基酸取代)并且编码的抗clec14a结合域具有上文先前讨论的功能。
根据本发明的第一方面，多核苷酸序列可以包含以下任何一种
(a)seqidno.59,
(b)seqidno.92,
(c)seqidno.94,
(d)seqidno.108,
(e)seqidno.110,或
(0seqidno.123，
或(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中任一个的具有1-10个核苷酸取代的变体。
因此，根据本发明的第一方面，多核苷酸序列可以包含如上所述的核苷酸序列，其编码重链可变区，或其具有1,2,3,4,5,6，7,8,9或10个核苷酸取代的变体。应当理解，编码的重链可变区将包含至少一个cdr(特别是3个cdr)。在这方面，尽管上述核苷酸序列可以变化多达10个核苷酸，但优选编码cdr的seqidnos59,92,94,108,110和123的核苷酸序列的部分仅变化每个cdr最多三个核苷酸取代。特别地，优选在编码cdr的任何区域之外的核苷酸序列seqidnos59,92,94,108,110和123，例如编码框架区的序列的区域或部分发生任何变异。因此，对于seqidno.59，尽管可以对该序列进行多达10个核苷酸的取代，但是对于seqidno:38,39和40中的每一个，或seqidno59中包含的seqidno50,51和52，可以进行最多三个取代。对于seqidno.92，可以对seqidnos70,71或72中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于seqidno.94，可以对seqidnos82,83和84中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于seqidno.108，可以对seqidnos38,39和101中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于seqidno.110，可以对seqidnos50,51和52中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于seqidno.123，可以对seqidnos38,39和117中的每一个进行最多三个核苷酸取代。
根据第一方面，多核苷酸序列可以包括以下任何一种：
(a)seqidno.60,
(b)seqidno.93,
(c)seqidno.95,
(d)seqidno.109,
(e)seqidno.111或
(0seqidno.124或
(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中任一个的具有1-10个核苷酸取代的变体或其简并变体。
根据本发明的第二方面，多核苷酸序列可以包含seqidno.174和/或seqidno.134或其具有1至10个核苷酸取代的变体。
因此，多核苷酸序列可以包含编码轻链可变区的如上所述的核苷酸序列(seqidnos60,93,95,109,111,124或134)，或其具有1,2,3,4,5,6，7,8,9或10个核苷酸取代的变体。应当理解，编码的轻链可变区将包含至少一个cdr(特别是3个cdr)。在这方面，尽管上述核苷酸序列可以变化多达10个核苷酸，但优选编码cdr的seqidnos60,93,95,109,111,124或134的核苷酸序列的部分仅变化最多三个核苷酸取代。特别地，优选在编码cdr的任何区域之外的核苷酸序列seqidnos60,93,95,109,111,124或134，例如编码框架区的序列的区域或部分发生任何变异。因此，对于seqidno.60，尽管可以对该序列进行多达10个核苷酸的取代，但是对于seqidno:41,42和43中的每一个，或seqidno60中包含的seqidnos53,55和gacacatcc，可以进行最多三个取代。对于seqidno.93，可以对seqidnos73,74或75中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于seqidno.95，可以对seqidnos85,87和agcacatcc中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于seqidno.109，可以对seqidnos41,42和43中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于seqidno.111，可以对seqidnos53,55和gacacatcc中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于seqidno.124，可以对seqidnos53,55和gacacatcc中的每一个进行最多三个核苷酸取代；对于seqidno.134，可以对seqidnos131,74和132中的每一个进行最多三个核苷酸取代。
在本发明的一个具体的实施方案中，多核苷酸可以包含编码抗体的重链和轻链可变区两者的序列，所述抗体结合clec14a(结合根据本发明的第一方面的clec14a的c型凝集素域)。因此，多核苷酸可以包含seqidnos59,92,94,108,110,123,和174中的任一个或其具有1-10个核苷酸取代的变体，和seqidnos60,93,95,109,111,124和134中的任一个或其具有1-10个核苷酸取代的变体。因此，在此方面，多核苷酸可以包含：
(a)seqidno.59,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体和seqidno.60,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体；
(b)seqidno.92,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体和seqidno.93,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体；
(c)seqidno.94,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体和seqidno.95,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体；
(d)seqidno.108,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体和seqidno.109,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体；
(e)seqidno.110,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体和seqidno.111,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体；
(f)seqidno.123,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体和seqidno.124,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体；或
(g)seqidno.174,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体和seqidno.134,其简并变体或其具有1-10个核苷酸取代的变体。
与此相关，多核苷酸可以包含编码scfv的核苷酸序列，所述scfv包含结合clec14a的抗体的轻和重可变链，其中所述轻链和重链可以通过如先前限定的接头序列连接。特别地，多核苷酸序列可以包含编码scfv的以下序列之一：
(a)seqidno.61
(b)seqidno.97
(c)seqidno.113
(d)seqidno.126，或
(e)seqidno.176
或其简并变体或与(a),(b),(c)或(d)的任一个具有至少80％同一性的序列。
因此，技术人员将理解，可以将变体序列用于上述scfv编码核苷酸序列(seqidnos61,97,113,126或176)，其中如上所讨论的此类变体序列将是优选编码scfv，其保留未修饰的scfv的结合亲和力或基本上保留未修饰的scfv序列的结合亲和力，例如可以具有scfv序列的结合亲和力的至少50％，60％，70％，80％，90％，100％，110％或120％。特别地，scfv可具有抗clec14a结合域的结合亲和力，如上文先前所讨论。
如本文所讨论的，还涵盖限定的核苷酸序列的简并变体。特别地，涵盖密码子优化的核苷酸序列，其被优化用于在特定生物体的细胞内表达。例如，可以开发密码子优化以在人或鼠细胞中表达的多核苷酸序列，并且是本发明涵盖的。
更具体地，编码包含在抗clec14a结合域中的scfv的多核苷酸序列可以是密码子优化的。在这方面，如本文所定义的抗clec14a结合域可以由多核苷酸编码或包含由核苷酸编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列包含seqidno.177,178,179,180,181,182,183，184,185或186中的任一个，或与其具有至少80％同一性的变体，其中所述变体编码能够结合clec14a的scfv，如先前所定义。在这方面，seqidno177和178分别涉及seqidno.61的人和鼠密码子优化的序列；seqidno:179和180分别涉及seqidno.176的人和鼠密码子优化的序列；seqidno181和182分别涉及seqidno.97的人和鼠密码子优化序列；seqidno:183和184分别涉及seqidno.113的人和鼠密码子优化的序列；并且seqidnos185和186分别涉及seqidno.126的人和鼠密码子优化序列。
可以如前所讨论确定序列同一性。此外，如已经讨论的，优选的是，变异发生在不编码cdr区的核苷酸序列的区域中。这些区域如上所讨论。
尽管上面定义的核苷酸序列是dna，但在本发明的备选实施方案中，核苷酸序列可以是rna。因此涵盖与本文所述dna序列的相应rna序列。技术人员将理解如何将编码相同蛋白质/多肽产物的rna序列衍生为上文所示的dna序列。“t”应当替换为“u”。
如本文所用，术语“核酸序列”或“核酸分子”或“多核苷酸”或“核苷酸序列”是指由天然存在的碱基，糖和糖间(骨架)连接组成的核苷或核苷酸单体的序列。该术语还包括含有非天然存在的单体或其部分的修饰或取代的序列。本发明的核酸，多核苷酸或核苷酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(dna)或核糖核酸序列(rna)，并且可以包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸苷和尿嘧啶。序列还可含有修饰的碱基。此类修饰碱基的实例包括氮杂和去氮腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸苷和尿嘧啶；和黄嘌呤和次黄嘌呤。核酸，多核苷酸或核苷酸序列可以是双链或单链的。核酸，多核苷酸或核苷酸序列可以是完全或部分合成的或重组的。
如上所讨论，本文所述的多核苷酸编码car，其包含抗clec14a结合域，跨膜域和胞内信号传导域。
如本文所用，“跨膜域”可以基于或源自任何跨膜蛋白的跨膜域。通常，它可以是或可以源自来自cd8a，cd28，cd4，cd3ζcd45，cd9，cd16，cd22，cd33，cd64，cd80，cd86，cd134(ox40)，cd137(4-1bb)，和cd154，优选人cd8a，cd28，cd4，od3ζcd45，cd9，cd16，cd22，cd33，cd64，cd80，cd86，cd134，cd137和cd154的跨膜域。在一个实施方案中，跨膜域可以是或可以源自来自cd8a，cd28，cd4或cd3ζ，优选来自人cd28，cd4或cd3ζ的跨膜域。在另一个实施方案中，跨膜域可以是合成的，在此类情况下，它将包含主要疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。因此，跨膜域能够跨越或存在于细胞的细胞膜内。如上所讨论，跨膜域可以源自包含胞外和/或胞内部分的蛋白质，因此除了细胞膜内或跨越细胞膜的部分，如本文所用的跨膜域可以附着于源自原始蛋白质的胞外和/或胞内残基。例如，跨膜域可以附着到源自起源蛋白的铰链或间隔物区，例如，源自cd8α的跨膜域可以附着到源自cd8a的间隔物区或铰链域。可以使用本领域已知的任何合适的方法评估细胞膜内跨膜域的存在，包括荧光标记及荧光显微术。
在一个实施方案中，跨膜域可以将car的抗clec14a结合域连接到胞内信号传导域，其中胞内信号传导域可以源自与跨膜域不同的蛋白质，或者可以源自与跨膜域相同的蛋白质(例如，跨膜域和胞内域可以具有与天然存在于同一蛋白质内的跨膜域和胞内域相同的序列)。因此，在一个实施方案中，跨膜域和胞内信号传导域可以来自相同的蛋白质或源自相同的蛋白质。在另一个实施方案中，跨膜域可以源自也包含共刺激部分的蛋白质，因此car可以包含来自该蛋白质的跨膜域以及能够提供共刺激信号的部分两者。
如本文所用，跨膜域可以具有与天然存在的跨膜域的序列不同的序列，只要该域仍然能够存在于膜内。例如，跨膜域可以与天然存在的蛋白质的跨膜域具有至少70,80,90,95,96,97,98或99％的序列同一性，只要修饰的域能够跨越细胞膜。可以如前所讨论测量序列同一性。
在一个优选的实施方案中，跨膜域是cd28跨膜域，其具有氨基酸序列seqidno.146或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。或者，cd28跨膜域可以由核苷酸序列seqidno.147或与其具有至少95％序列同一性的核苷酸序列编码。
在进一步的实施方案中，跨膜域是由seqidno.119中所示的核苷酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的核苷酸序列编码的cd8α跨膜域。该跨膜序列可以进一步附着到来自如seqidno.165所示，或与其具有至少95％序列同一性的序列的cd8α的铰链域。
如本文所用，“胞内信号传导域”是指car蛋白的一部分，其参与将car与靶抗原(clec14a)的有效结合的信息转导到细胞(宿主细胞，例如免疫效应细胞)内部以引发细胞功能(例如效应子细胞功能)，例如，激活，细胞因子产生，增殖和细胞毒活性，包括细胞毒性因子释放到car结合的靶细胞，或通过抗原结合胞外car域引起的其他细胞反应。
术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，t细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或包括细胞因子分泌的帮助或活性。因此，“效应子细胞”是具有此类效应功能的细胞。因此，术语“胞内信号传导域”是指蛋白质的一部分，其转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能。虽然天然存在的蛋白质的整个胞内信号传导域可用于本发明，但在许多情况下，不必使用整个域。就使用变体，例如天然存在的胞内信号传导域的截短部分而言，可以使用此类变体(例如截短的部分)代替整个域，只要它转导效应子功能信号，例如，具有全长域的转导效应子功能的能力的至少50,60,70,80,90或95％。与全长胞内信号传导域相比，变体(例如截短的)胞内信号传导域可以进一步具有增加的转导效应子功能信号的能力，例如，转导效应子功能的能力的至少105,110,120,130或140％。转导效应子功能的能力可以通过测量与靶物相互作用后细胞的效应子功能来测量，例如通过测量细胞因子释放，细胞增殖等。因此，术语胞内信号传导域意味着包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导域的任何截短部分。
变体胞内信号传导域可以与天然存在的胞内信号传导域具有至少70％，80％，90％或95％的序列同一性。应当理解，若使用截短的域，则与全长序列相比，％序列同一性可小于70％。胞内信号传导域也称为“信号转导域”，并且通常源自人cd3ζ或fcry链的部分。
用于本文所述的多核苷酸编码的car的胞内信号传导域的其他实例包括t细胞受体(tcr)的细胞质序列和协同作用以在抗原受体结合后启动信号转导的共受体，以及如上所讨论的这些序列的任何变体。已知通过单独的tcr产生的信号通常不足以完全激活t细胞，并且还可能需要二次和/或共刺激信号。因此，t细胞活化可以说是由两种不同类型的信号序列介导的：那些通过tcr(胞内信号传导域)启动抗原依赖性初级激活的信号序列和那些以抗原非依赖性方式起作用以提供二次或共刺激信号的信号序列(如共刺激域)。共刺激域促进效应子功能的激活，并且还可以促进效应子功能的持久性和/或细胞的存活。
以刺激方式起作用的胞内信号传导域可包含信号基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)(例如2,3,4,5或更多itam)。例如，cd3zeta,fc受体γ,fc受体β,cd3γ,cd3δ,cd3ε,cd5,cd22,cd79a,cd79b和cd66d包含一个或多个itam。因此，在一个实施方案中，本文使用的胞内信号传导域可以包括一个或多个itam，例如，来自cd3zeta,fc受体γ,fc受体β,cd3γ,cd3δ,cd3ε,cd5,cd22,cd79a,cd79b和cd66d中的任何一个或多个。可以理解，如上所讨论，可以在胞内信号传导域内使用itam的变体，只要胞内信号传导域能够诱导效应子功能，如先前所讨论。
特别地，如本文所定义的car可包含源自cd3zeta的胞内信号传导域，更具体地，包含seqidno.148序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列或由核苷酸序列seqidno.149或与其具有至少95％同一性的核苷酸序列的序列编码的氨基酸序列的胞内信号传导域。
如先前指示，多核苷酸可以编码包含额外部分或域的car，即除了抗clec14a结合域，跨膜域和胞内信号传导域之外。因此，特别地，car可另外包含至少一个共刺激域。如先前指示，通常优选存在至少一个共刺激域以从表达car的细胞提供最佳效应子功能。因此，尽管car可以仅包含胞内信号传导域，但在具体实施方案中，也将存在共刺激域。
“共刺激域”是指共刺激分子的胞内域的一部分或区域。共刺激分子可以是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是细胞对抗原(例如免疫细胞对抗原)的有效响应所需的。共刺激分子的实例包括cd28，4-1bb(cd137)，ox40，icos，dap10，cd27，cd30，cd40，icos，淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)，cd2，cd7，light，nkg2c，b7-h3，和与cd83特异性结合的配体等。
如上所讨论，若共刺激分子另外包含跨膜部分，则本文所述的car的跨膜域和共刺激域可以源自相同的蛋白质。在一个具体实施方案中，car可包含跨膜域和来自cd28的共刺激域。
存在于本发明的car内的胞内信号传导域和共刺激域可以以任何顺序(例如随机或指定顺序)彼此连接。任选地，例如长度为2至10个氨基酸(例如，2,3,4,5,6,7,8,9或10个氨基酸)的短的寡肽或多肽接头可以形成胞内信号传导域的胞内信号传导序列和一个或多个共刺激域之间的连接。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可用作合适的接头。在另一个实施方案中，单个氨基酸，例如丙氨酸或甘氨酸可用作合适的接头。
由本发明的核酸编码的car可包含两个或更多个，例如3,4,5或更多个共刺激信号传导域。在一个实施方案中，共刺激信号传导域可以通过如上所述的接头分开，例如，由甘氨酸或丙氨酸残基分开。
特别地，本发明的car可以包括来自cd3zata的胞内信号传导域，例如一种包含氨基酸序列seqidno.148或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列的胞内信号传导域，和cd28,4-1bb，ox40，icos或dap-10的共刺激域。ox40的共刺激域特别具有如以seqidno.168所示的氨基酸序列或与其具有至少95％的同一性。或者，ox40的共刺激域可以由如以seqidno.48所示的核苷酸序列或与其具有至少95％同一性的序列编码。4-1bb的共刺激域可以由如以seqidno.80所示的核苷酸序列或与其具有至少95％同一性的序列编码，并且cd28的共刺激域可以由如以seqidno.54所示的核苷酸序列或与其具有至少95％同一性的序列编码。更具体地，本发明的car可以包括来自cd3zeta的胞内信号传导域，例如一种包含氨基酸序列seqidno.148或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列的胞内信号传导域和cd28和ox40的共刺激域，cd28和4-1bb的共刺激域或4-1bb和ox40的共刺激域。
此外，本发明的多核苷酸可以编码car，其包含1)来自cd28的跨膜和共刺激域以及来自cd3zeta的胞内信号传导域；2)来自cd8a的跨膜域，来自4-1bb的共刺激域和来自cd3zeta的胞内信号传导域；3)来自cd8a的跨膜域，来自ox40的共刺激域和来自cd3zeta的胞内信号传导域；4)来自cd28的跨膜域，来自cd28和4-1bb的共刺激域和来自cd3zeta的胞内信号传导域；5)来自cd28的跨膜域，来自cd28和ox40的共刺激域和来自cd3zeta的胞内信号传导域；6)来自cd8a的跨膜域，来自4-1bb和ox40的共刺激域和来自cd3zeta的胞内信号传导域；7)来自cd8a的跨膜域，来自cd28的共刺激域和来自cd3zeta的胞内信号传导域；8)来自cd8a的跨膜域，来自cd28和4-1bb的共刺激域和来自cd3zeta的胞内信号传导域或9)来自cd28α的跨膜域，来自cd28和ox40的共刺激域以及来自cd3zeta的胞内信号传导域。特别地，包含来自cd8α的跨膜域的任何一种构建体可以进一步包含铰链或间隔域，其也源自cd8a，例如如以seqidno.165或与其具有至少95％同一性的序列中定义的铰链或间隔域。
多核苷酸可以进一步编码包含前导物序列的car。术语“前导物序列”是指将car靶向细胞膜的肽序列。前导物序列可以存在于抗clec14a结合域的n末端，和/或前导物序列可以在细胞处理和car定位于细胞膜期间从car切割。可以在如本文所述的car中使用的典型前导物序列是seqidno.135的制瘤素m前导物序列，由seqidno.162编码的cd8α前导物序列，或与其具有至少70,80,85,90,95,96,97,98或99％同一性的其变体，其能够将car靶向细胞膜。前导物序列的基本部分通常包含一段疏水性氨基酸，其倾向于形成单个α-螺旋。
car还可包含抗clec14a结合域和跨膜域之间的铰链域或间隔物区(在本文中可互换使用)。铰链域和/或间隔物区可以具有允许其在不同方向上取向的柔性，这可以帮助抗原结合抗clec14a结合域。在某些实施方案中，铰链区和/或间隔物区可以是免疫球蛋白铰链区，并且可以是野生型免疫球蛋白铰链区或改变的野生型免疫球蛋白铰链区，例如截短的铰链区。可以使用的其他示例性铰链区和/或间隔物包括源自1型膜蛋白，例如cd8a，cd4，cd28和cd7的胞外区的铰链区和/或间隔物区，其可以是来自这些分子的野生型铰链区/间隔物区或可以是改变的。优选地，铰链区/间隔物区是或源自人cd8a，cd4，cd28或cd7的铰链区/间隔物区。igd，ch3和fc间隔物或铰链也可用于本发明的car中。
“改变的野生型铰链或间隔物区”或“改变的铰链或间隔物区”是指(a)具有高达30％氨基酸变化(例如高达25％，20％，15％，10％或5％氨基酸变化，例如取代或缺失)的野生型铰链/间隔物区，(b)具有高达30％的氨基酸变化(例如，高达25％，20％，15％，10％或5％的氨基酸变化，例如取代或缺失)的长度至少10个氨基酸(例如，至少12,13,14或15个氨基酸)的野生型铰链/间隔物区的一部分，或(c)野生型铰链区域的一部分，其包括核心铰链区(其长度可以是4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15，或至少4,5,6,7,89,10,11,12,13,14或15个氨基酸)。当改变的野生型铰链区插入本文所述的嵌合抗原受体中的clec14a特异性结合域和另一个区域(例如，跨膜域)之间并将它们连接时，它允许嵌合融合蛋白维持与clec14a的特异性结合。
在某些实施方案中，野生型免疫球蛋白铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基可被一个或多个其他氨基酸残基(例如，一个或多个丝氨酸残基)取代。或者或另外，改变的免疫球蛋白铰链区可以具有被另一个氨基酸残基(例如丝氨酸残基)取代的野生型免疫球蛋白铰链区的脯氨酸残基。
包含ch2和ch3恒定区域的铰链区在本领域中描述用于car(例如ch2ch3铰链，称为“fc铰链”或“igg铰链”，如seqidno.163所示。或者，ch2ch3铰链可以由seqidno.164编码。然而，优选当铰链域基于或源自免疫球蛋白时，它不包含ch3域，例如它可以在不包括ch3的情况下包含ch2域或其片段或部分，或由ch2域或其片段或部分组成。
在一个实施方案中，铰链域具有或包含seqidno.165的氨基酸序列(其代表cd8a的铰链域)或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，铰链域具有或包含seqidno.166的氨基酸序列(其代表缩短的igg铰链)或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
铰链域可以通过接头序列附着到跨膜域，所述接头序列可以是如上定义的接头序列。示例性接头序列是kdpk(seqidno.159)。此类序列或与其具有至少95％序列同一性的序列可包括在由上述多核苷酸编码的car中。更具体地，此类序列可以包括在胞外域(例如scfv部分)和跨膜域之间。用于特定car的铰链域可以凭经验确定。
如本文所用的铰链域或间隔物区的长度可以是至少10个氨基酸，例如，长度为至少20,30,40,50,60,70,80,90,100,150或200个氨基酸。
在本发明的一个具体实施方案中，可以不使用铰链域，并且抗clec14a结合域可以直接附着到跨膜域。
因此，根据本发明的第一方面，多核苷酸可以编码包含以下任何一种序列的car：
(a)seqidno.62,
(b)seqidno.98,
(c)seqidno.114,或
(d)seqidno.127,或
其与(a)，(b)，(c)或(d)中的任一个具有至少80％的同一性的变体。
因此，car可以与seqidnos62,98,114或127中的任一个具有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。特别地，变体car应当保留具有seqidno.62,98,114或127的序列的car的活性，例如应当具有非变体car的至少50％，60％，70％，80％，90％或95％的活性。这可以测量为car的结合亲和力，其可以如先前关于抗clec14a结合域所讨论的那样测定，或者可以测量为刺激细胞内效应子功能的能力，其可以如先前关于胞内信号传导域所讨论的那样测定。
或者，编码car的多核苷酸可以包含以下任一个的核苷酸序列：
(a)seqidno.63，
(b)seqidno.99，
(c)seqidno.115，或
(d)seqidno.128，
或其与(a)，(b)，(c)或(d)中任一个具有至少80％同一性的变体。
如上所讨论，变体可以与seqidnos63,99,115或128中的任一个具有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性，并且编码的car应保留由非变体序列编码的car的活性，如上所讨论。
本发明提供了由本发明的核酸分子编码的car(多肽)。术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指氨基酸的聚合物，不限于任何特定长度。该术语不排除诸如十四烷基化，硫酸化，糖基化，磷酸化和信号序列的添加或删除的修饰。因此，术语“肽”，“多肽”或“蛋白质”是指一条或多条氨基酸链，其中每条链包含通过肽键共价连接的氨基酸。
本发明还涵盖包含本发明核酸的载体。载体可以是例如表达载体(例如mrna表达载体或用于转移到免疫细胞中的表达载体(例如病毒载体))或克隆载体。可能的表达载体包括但不限于转座子，粘粒，质粒或修饰的病毒(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒和慢病毒)，只要该载体与所用的宿主细胞相容即可。特别地，表达载体可以是gamma逆转录病毒，例如engels等，humangenetherapy，14:1155-1168,2003或schambach等，mol.ther.2:435-445,2000，其通过引用并入本文。表达载体“适合转化宿主细胞”，这意味着表达载体含有本发明的核酸分子和基于宿主细胞选择以用于表达的调节序列，其与核酸分子可操作地连接。可操作地连接意指核酸以允许核酸表达的方式与调节序列连接。
因此，本发明涵盖含有本发明核酸分子的重组表达载体，以及由本发明的核酸分子编码的蛋白质序列的转录和翻译所必需的调节序列。
合适的调节序列可以源自多种来源，包括细菌，真菌，病毒，哺乳动物或昆虫基因。合适的调节序列的选择取决于如下所讨论选择的宿主细胞，并且可以由本领域普通技术人员容易地完成。此类调节序列的实例包括：转录启动子和增强子或rna聚合酶结合序列，核糖体结合序列，包括翻译起始信号。另外，取决于所选择的宿主细胞和所用的载体，可以将其他序列，例如复制起点，额外的dna限制性位点，增强子和赋予转录诱导能力的序列掺入表达载体中。
能够在细胞(哺乳动物细胞)中表达car分子的启动子的实例是ef1a启动子或cmv启动子。启动子的其他实例包括sv40早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)，hiv长末端重复启动子，momulv启动子，禽白血病病毒启动子，埃巴病毒立即早期启动子，劳氏肉瘤病毒启动子或mpsvltr(如engel等，同上所述)。
如上所指示，可以使用诱导型系统控制car的转录。特别地，可以使用诱导型启动子来控制car的表达，其中例如表达可以由小分子或药物(例如，其结合启动子，调节序列或转录抑制物或激活物分子)或通过使用环境触发器诱导。
特别地，可以使用四环素或诸如多西环素的衍生物来控制car表达，例如，使用tet-on系统，其中一个或多个tet操纵基因序列(例如至少2,3,4或5)可以掺入启动子中或附近。然后可以通过添加四环素或其衍生物之一(例如多西环素)来控制来自启动子的基因表达，所述衍生物可以结合四环素反式激活蛋白，允许其与tet操纵基因序列结合。四环素反式激活蛋白可以由与本发明的car相同或另外的载体表达。tet-on系统的变化在本领域中是公知的，并且可以在本发明中使用。
此外，car表达可以通过加入他莫昔芬来控制，例如，使用激活剂与突变的ert域融合的系统。在这方面，可以使用cre/loxp系统，特别是该系统的修饰形式，其中cre与雌激素受体(ert)的配体结合域的突变形式融合，所述突变形式仅与他莫昔芬结合。此类融合物是无活性的，直到加入他莫昔芬，其激活cre并允许loxp位点之间的重组，这允许car的转录。此类系统允许通过加入他莫昔芬来诱导car的表达。
其他药物诱导系统是本领域公知的，例如，加入松甾酮(ponasterone)a后激活的系统(例如使用蜕皮激素受体的基因和具有受体结合位点的启动子)，加入香豆霉素(coumermycin)后激活的系统，任何此类系统都可以根据本发明用于car表达。
如上所讨论，表达系统也可用于本发明，其中car表达由环境触发器控制，例如，缺氧，辐射，升高的温度等。特别地，缺氧诱导型启动子可用于本发明中的car表达，例如，包含缺氧反应元件的嵌合启动子。
可以进一步开发新的诱导型启动子用于本发明，例如，由小分子或药物激活的诱导型启动子。
本发明的重组表达载体还可含有选择标志物基因，其有助于选择用本发明的重组分子转化或转染的宿主细胞。选择标志物基因的实例是编码赋予对某些药物的抗性的蛋白质的基因，例如新霉素和潮霉素，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，萤火虫萤光素酶或免疫球蛋白或其部分，例如免疫球蛋白的fc部分，优选igg。通过选择标志物蛋白质如β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶或萤火虫萤光素酶的浓度变化来监测选择标志物基因的转录。若选择标志物基因编码赋予抗生素抗性的蛋白质，例如新霉素抗性，则可以用g418选择转化细胞。掺入选择标志物基因的细胞将存活，而其他细胞死亡。这使得可以显现和测定本发明的重组表达载体的表达，特别是测定突变对表达和表型的影响。应当理解，可以在与感兴趣的核酸分开的载体上引入选择标志物。
重组表达载体还可含有编码融合部分的基因，该融合部分提供重组蛋白的增加的表达；增加重组蛋白的溶解度；并且通过在亲和纯化中充当配体来帮助纯化靶重组蛋白(例如，可以存在适当的“标签”以实现纯化和/或鉴定，例如his标签或myc标签)。例如，可以将蛋白水解切割位点添加到靶重组蛋白中，以允许在纯化融合蛋白后从重组蛋白中分离重组蛋白。典型的融合表达载体包括pgex(amradcorp.，melbourne，australia)，pmal(newenglandbiolabs，beverly，ma)和prit5(pharmacia，piscataway，nj)，其分别将谷胱甘肽s-转移酶(gst)，麦芽糖e结合蛋白，或蛋白a融合到重组蛋白。
可以将重组表达载体引入宿主细胞中以产生转化的宿主细胞。术语“用......转化”，“用...转染”，“转化”，“转导”和“转染”旨在包括通过本领域已知的许多可能技术之一将核酸(例如载体)引入细胞中。如本文所用的，术语“转化的宿主细胞”或“转导的宿主细胞”还意图包括已经用本发明的重组表达载体转化的能够糖基化的细胞。可以通过例如电穿孔或氯化钙介导的转化用核酸转化原核细胞。例如，可以通过常规技术，例如磷酸钙或氯化钙共沉淀，deae-葡聚糖介导的转染，脂质转染，电穿孔或显微注射将核酸引入哺乳动物细胞。用于转化和转染宿主细胞的合适方法可以在sambrook等，1989(同上)和其他实验室教科书中找到。
包含本发明核酸的载体可以转导或转染到任何细胞类型中，例如以对编码的car分子进行体外研究，或产生另外的载体或rna/病毒载体，用于转导入细胞以对患者施用。例如，载体可以转导入极其多种真核宿主细胞和原核细胞，例如，真核细胞或酵母细胞或哺乳动物细胞或大肠杆菌。因此，本发明进一步提供了包含本发明的核酸或载体的细胞。本发明另外提供包含本发明car的细胞。
哺乳动物细胞可以包括：cos(例如，atccno.crl1650或1651)，bhk(例如，atccno.crl6281)，cho(atccno.ccl61)，hela(例如，atccno.ccl2)，293(atccno.1573)，ns-1细胞，nso(atcccrl-11177)和
对于治疗用途，可以将本发明的载体转导入哺乳动物细胞，特别是免疫细胞，例如t细胞(例如人t细胞)。已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的，例如，慢病毒载体，如hiv，siv或fiv。特别地，如上所指示，可以使用逆转录病毒载体，例如gamma逆转录病毒，例如mp71。
除car分子外，包含本发明核酸的本发明载体还可包含可编码其他蛋白质或多肽的其他核苷酸序列。此类另外的蛋白质或多肽可以由与编码car分子的核苷酸序列相同的启动子控制下或者在与编码car分子的核苷酸序列的不同启动子的控制下的核苷酸序列编码。若另外的蛋白质/多肽由与编码car分子的核苷酸序列相同的启动子控制的核苷酸序列编码(例如，其中两个序列都在启动子的下游)，则编码car的核苷酸序列和编码其他蛋白质/多肽的核苷酸序列之间可以存在另外的核苷酸序列，使其在表达后能够分离，例如其切割。此类其他核苷酸序列是本领域公知的，包括编码内含肽的核苷酸序列。或者，若期望来自相同启动子的表达，可以在本发明的载体中使用ires或2a肽序列。
在这方面，可以期望另外从本发明的car表达载体中表达多肽，以允许检测细胞中car的表达。因此，通过检测在与编码car的核苷酸序列的相同(或不同启动子)控制下的另一多肽的表达，可以鉴定用载体成功转导细胞和成功表达car分子。特别地，本发明的car分子可另外包含cd34分子或经修饰的cd34分子，例如截短的cd34分子，其中此类分子包含胞外部分，其允许通过公知的技术检测，例如，使用合适的抗体和标记物进行免疫荧光。在一个具体实施方案中，本发明的载体可另外包含核苷酸序列seqidno.145的核苷酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。或者，载体可以另外编码seqidno.144的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的序列的序列。可以与本发明的car分子共表达以允许鉴定car转导的细胞的其他分子包括萤光素酶。
在这方面，本发明特别涵盖包含编码car的多核苷酸的核酸分子，所述car包含seqidno.136,138,140或142中任一个的序列，或者与其具有至少80％同一性的序列(并保留如前所述的未修饰car的功能活性)。更具体地，本发明的核酸分子可包含seqidno.137,139,141或143的多核苷酸序列。或与其具有至少80％同一性的序列。特别地，此类修饰的序列将编码car，其保留或基本上保留如前所述的未修饰的car的功能活性。还涵盖包含这些序列的载体。包含seqidno.136,138,140或142中任一个的序列的cars包含制瘤素m前导物序列。应当理解，如上所讨论，这可以用另一种前导物序列代替，特别是可以用cd8α的前导物序列代替。因此，可以修饰seqidnos136,138,140或142的序列以用由seqidno162编码的cd8α前导物替换seqidno.135的制瘤素m前导物序列。
如前所讨论，本发明提供核酸分子，其在转导成合适的细胞类型时能够表达可与clec14a结合的car分子。因此，本发明的核酸分子可用于治疗与clec14a表达增加有关的状况，特别是可用于抑制血管生成(例如肿瘤血管生成)。此类状况的治疗依赖于表达的car分子与靶抗原的结合，即与在肿瘤血管系统内表达的clec14a结合。应当理解，car分子与非靶clec14a的结合可以是不想要的，并且应当避免任何此类结合，无论在将转导细胞施用于患者时还是在随后的时间。为了实现这点，可以期望确保转导的细胞不能在患者中长期存活(即在治疗状况后)或转导的细胞仅瞬时表达靶向clec14a的car分子。
为了实现car分子的瞬时表达，可以用编码如本文所述的car的rna(例如mrna)转导细胞，并使用那些细胞以对患者施用。用于产生mrna的mrna表达载体可以根据本领域已知的方法制备(例如使用gatewaytechnology)并且是本领域已知的(例如pcipa102，
此外，mrna可以通过例如体外转录体外产生。然后可以将mrna导入免疫效应细胞，例如作为裸mrna，例如通过电穿孔(例如记载于例如almasbak等,cytotherapy2011,13,629-640,rabinovich等,hum.genether.,2009,20,51-60和beatty等,cancerimmunol.res.2014,2,112-120)。
或者或另外，可以期望用一旦激活导致细胞死亡的核苷酸序列(所谓的“自杀基因”)转导细胞。以此类方式，一旦细胞用于治疗该状况，就可以激活自杀基因，导致car表达细胞的死亡和从患者除去car表达细胞。自杀基因可以从与本发明的car分子相同的载体表达，例如，使用如前所讨论的元件(单独的启动子，或与内含肽，ires或2a肽一起的相同启动子)，或者可以从不同的载体表达，所述载体可以在编码car的载体或核酸分子同时、之前或之后转导到细胞中。可用于本发明的自杀基因的实例包括胱天蛋白酶9，rqr8和/或tk。可以在编码car的载体内，或者在编码car的载体或核酸分子同时，在之前或之后将这些基因中的一个或多个转导到细胞中。应当理解，期望任何自杀基因的表达可诱导地控制。
还可以期望对用本发明的载体或核酸转导或要用其转导的细胞进行进一步修饰。特别是对免疫细胞的修饰可能是期望的，所述修饰延长或增强其对clec14a的应答。例如，已知tgf由肿瘤分泌，并且这可以抑制t细胞的诱导。在这方面，可以期望能够中和tgfβ的作用的修饰的免疫细胞，例如本发明的t细胞(即用本发明的核酸或载体转导的那些细胞)，例如通过表达显性阴性tgfβ受体ii。另外或或者，本发明的细胞可以用编码可以增强细胞的效应子功能的细胞因子，例如il-15，或il2，il7，il12等的核酸转导。同样，如上所讨论，任何另外的核酸序列可以从与car分子相同或不同的载体表达。
还应当理解，本发明的细胞可包含本发明的超过一种核酸或载体。特别地，本发明的细胞可包含2,3,4或5种或更多种本发明的核酸或载体，其各自表达不同的car分子。因此，本发明的细胞可包含不同的car分子，其能够结合clec14a，例如在clec14a的相同或不同的位置。在这方面，本发明的细胞可包含car分子，其包含结合clec14a的scfv和car分子，所述car分子包含结合clec14a的配体(例如mmrn2或其部分或变体)。
此外，除了本发明的表达的car之外，本发明的细胞可以包含至少一种其他受体(特别是外源的)(例如多种受体)，其可以与car一起以组合方式用于结合靶物。细胞(例如表达clec14a的肿瘤血管系统)。因此，在此类方法中，可以需要car和至少一种其他受体与靶细胞的结合来刺激针对靶细胞的免疫应答(例如，每种car/受体可以仅提供免疫细胞刺激的部分信号，其单独可以不足以免疫细胞刺激，但一起允许免疫细胞刺激)。在本发明的细胞是t细胞的情况下，可以必需car结合clec14a和至少一种其他受体结合clec14a表达细胞上的其配体两者来刺激t细胞。至少一种其他受体可以是另外的car分子。
在该实施方案的变型中，可诱导表达本发明细胞内的car。特别地，在该实施方案中，细胞上表达的至少一种其他受体与其靶物的结合可以允许或控制car分子的表达。因此，在此类情况下，在car表达发生之前需要至少一种其他受体与其配体的结合，因此免疫细胞刺激需要至少一种其他受体与其配体的结合以及随后的car与靶细胞的结合。此类特定的系统可以包括synnotch受体的额外表达，所述synnotch受体工程化改造为具有针对感兴趣的抗原，例如cd19的胞外配体结合域正交转录因子(例如tetr或gal4)。在与感兴趣的抗原结合后，正交转录因子从synnotch受体的尾部切割并激活car的表达。因此，本发明的细胞可以进一步包含编码受体的核酸或载体，所述受体与clec14a以外的抗原结合，特别是与clec14a以外的肿瘤相关抗原结合。
或者，也可以使用组合方法，其中除了本发明的car之外的另外的受体在本发明的细胞上表达，其中所述另外的受体能够结合脱靶细胞或组织(例如非肿瘤细胞)。在此类情况下，若另外的受体与其配体结合，则产生负信号，阻止免疫细胞刺激(例如t细胞刺激)。
进一步的组合方法可以使用另外的受体与本发明的car组合，其中两种受体结合不同的靶物并诱导不同的效果来治疗肿瘤。因此，两种抗肿瘤作用可以完全彼此独立，但是一起可以呈现针对肿瘤的有效疗法。在这方面，本发明的car可以与tcr疗法组合使用，其中免疫细胞可以用一种或多种核酸分子转导，所述核酸分子编码本发明的car和能够结合可以在肿瘤细胞上发现(例如在特定类型的肿瘤细胞上或在任何肿瘤细胞上)的特定mhc/肽组合的tcr。或者，可以单独、序贯或同时提供用编码car的核酸转导的免疫细胞和用编码tcr的核酸转导的分开的免疫细胞群体。还设想了使用一种或多种核酸的基因疗法治疗，所述核酸编码本发明的car和识别肿瘤mhc/肽组合的tcr。
无论用于将外源核酸引入宿主细胞的方法如何，细胞内核酸的存在可以使用本领域公知的各种测定来确定，例如southern和northern印迹法，rt-pcr和pcr。此外，如前所讨论，可以使用免疫荧光技术，elisa或western印迹检测car或其他多肽的表达。
在这方面，本发明还提供了产生表达car分子的细胞的方法，该方法包括用本发明的核酸或载体转导细胞的步骤。
如前所述，包含本发明的核酸，载体和/或car的本发明的细胞可以是免疫细胞，特别是哺乳动物免疫细胞，例如人免疫细胞。免疫细胞能够具有如前所述的效应子功能，并包括t细胞和nk细胞。t细胞可以是任何类型的t细胞，包括α-βt细胞，γ-δt细胞，记忆t细胞(例如具有干细胞样特性的记忆t细胞)。nk细胞可以是不变的nk细胞。
如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，但特别是指人，家畜(例如猫，狗等)，马，小鼠，大鼠，灵长类动物，例如猴，牛，猪等
t细胞可以从许多来源获得，包括来自外周血单个核细胞，骨髓，淋巴结组织，脐带血，胸腺组织，来自感染部位的组织，腹水，胸腔积液，脾组织和肿瘤。特别是在本发明中，免疫或t细胞可以从具有可以用本发明的核酸，载体或细胞治疗的状况的受试者获得，例如，具有与clec14a表达水平增加相关的状况，或更特别地，与肿瘤血管系统中表达clec14a的肿瘤相关的状况的受试者。t细胞(或免疫细胞)可通过本领域已知的任何方法获得。
t细胞也可以“现成(offtheshelf)”获得，因此可能不一定从具有可用本发明的核酸，载体或细胞治疗的状况的受试者获得。因此，用于本发明的t细胞可以已经在用本发明的核酸或载体转导之前先前已经储存和/或修饰。
特别地，可以使用本领域任何合适的技术例如ficoll分离自从受试者收集的血液单位(特别是抗凝结血液)获得t细胞。或者，可以通过单采血液成分术(apheresis)从受试者(通常是哺乳动物受试者)获得免疫细胞(例如t细胞)，其中单采血液成分术产品通常包含淋巴细胞(包括t细胞，单核细胞，粒细胞，b细胞，其他有核白细胞，红细胞和血小板)。应当理解，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆级份并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于后续处理，例如，可以使用pbs洗涤细胞，或使用缺少二价离子，缺少钙和/或镁的洗涤溶液洗涤细胞。洗涤步骤可通过本领域已知的方法实现，例如通过使用半自动“流通”离心机(例如cobe2991细胞处理器，baxtercytomate或haemoneticscellsaver5)。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如无ca，无mg的pbs，plasmalytea，rpmi1640(sigma)或pbs或含有或不含缓冲液的其他盐水溶液。在英国，输血细胞按照http://www.transfusionguidelines.org.uk/red-book上的指南进行处理。欧洲可接受的其他程序可参见“血液成分的制备，使用和质量保证指南”，当前版本，edqm。在美国，通常遵循aabb血液和血液成分指南。还存在血液，血液成分和血浆衍生物的收集，处理qc的who要求。
可以通过裂解红细胞和消耗单核细胞，例如从外周血淋巴细胞中分离t细胞，例如通过经由percolltm梯度的离心或通过逆流离心淘洗。可以选择用于本发明的特定t细胞群。然而，选择不是强制性的，并且可以用本发明的核酸或载体(例如用于抑制受试者中的肿瘤血管生成)转导混合的细胞群体(例如包含不同类型的t细胞)。可以选择的细胞亚组包括cd3+，cd28+，cd4+，cd8+，cd45ra+和cd45ro+t细胞。使用与选择性结合t细胞群体上表达的抗原的抗体偶联的珠可以实现特定群体的选择。针对在特别地t细胞群中独特表达的表面标志物的抗体组合可用于选择。
可以期望在使用前储存免疫细胞，特别是在用于本发明的治疗方法之前。在这方面，可以冷冻或温育本发明的细胞(例如在2-10℃的旋转器上)。细胞可以在用本发明的核酸或载体转导之前和/或之后以此类方式储存。
如前所讨论，本发明的转导免疫细胞具有治疗效用，特别是可用于抑制肿瘤血管生成。在治疗上使用细胞之前，可以期望使用本领域公知的方法使细胞经历活化或扩增步骤。任何此类步骤可以在用本发明的核酸或载体转导之前或之后进行。可以使用刺激cd3/tcr复合物相关信号的试剂和刺激t细胞表面上的共刺激分子的配体扩增t细胞。例如，t细胞可以在适于刺激t细胞增殖的条件下与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触。
本发明另外特别提供了细胞群体，其中所述群体的至少一种细胞包含本发明的核酸或载体。细胞群体可以包含含有本发明的不同核酸或载体的细胞。因此，群体中的一种细胞可以包含编码第一car的本发明的核酸，并且群体的第二种细胞可以包含编码第二car的本发明的核酸。
此外，本发明提供了“现成”的细胞产品，其中可以储存本发明的细胞(特别是t细胞)(即包含本发明的核酸或载体)并提供以后的使用(例如在疗法中)。通常，此类细胞可以是同种异体免疫细胞(例如t细胞)。
本发明进一步提供了包含本发明的核酸，载体，细胞或细胞群体的组合物或药物组合物，以及另外提供了用于疗法(或对抗疾病)的包含本发明的核酸，载体，细胞或细胞群体的药物组合物。本发明的组合物或药物组合物可包含另外的或进一步的活性(例如治疗)剂。本发明的核酸，载体，car，细胞，细胞群体或组合物可用于治疗与clec14a表达水平增加相关的状况，特别是本发明的核酸，载体，car，细胞，细胞群体或组合物可用于抑制肿瘤内的血管生成(例如，其中肿瘤血管系统表达clec14a)。因此，在这方面，本发明提供了用于疗法的本发明的核酸，载体，car，细胞，细胞群体或组合物。此外，本发明提供了本发明的核酸，载体，car，细胞，细胞群体或组合物在制备用于对抗疾病的药物中的用途。或者，本发明提供了对抗疾病的方法，包括对有此需要的受试者施用本发明的核酸，载体，car，细胞，细胞群体或组合物的步骤。更具体地，本发明提供了用于治疗与clec14表达相关的状况的本发明的核酸，载体，car，细胞，细胞群体或组合物。此外，本发明提供了本发明的核酸，载体，car，细胞，细胞群体或组合物在制备用于治疗与clec14a表达相关的状况的药物中的用途。或者，本发明提供了治疗与clec14a表达相关的状况的方法，该方法包括对有此需要的受试者，例如具有该状况的受试者施用本发明的核酸，载体，car，细胞，细胞群体或组合物的步骤。
尽管可以使用本发明的核酸和/或载体直接治疗患者，如上所述，例如，如上所述，在基因治疗方法中，在一个具体实施方案中，将包含本发明的核酸或载体的细胞用于治疗。优选此类细胞是免疫细胞，特别是t细胞。因此，本发明特别提供了用于治疗，例如用于治疗与clec14a表达相关的状况的包含本发明的载体或核酸的t细胞。
通过“对抗”，我们包括该方法可用于减轻病症症状(即姑息使用该方法)，或治疗病症，或预防病症(即预防性使用该方法)的含义。
“与clec14a表达相关的病症”是指在表达clec14a的情况下期望治疗，预防或改善的任何疾病状况。如前所讨论，clec14a在正常健康组织和正常血管系统中的表达非常低或不可检测。因此，通常，clec14a在组织，特别是血管系统中的表达(即任何可检测的表达)可以与疾病状况有关。在这方面，clec14a表达(例如mrna或蛋白质)的任何检测可以指示疾病。clec14a可以如前所述进行测量和检测，例如，使用免疫荧光。因此，检测clec14a的表达是指与相应组织中健康受试者中存在的clec14a的量相比，检测受试者组织中clec14a的量增加。或者，clec14a表达的增加可以是与疾病之前相同受试者中或相同受试者内组织的非患病部分中clec14a的表达相比增加。clec14a的水平可以增加至少50,60,70,80,90,100,200,300,400或500％，或者备选可以增加至少100,200,300,400,500,600，700,800,900或1000倍。
如前所讨论，clec14a在肿瘤血管系统内表达并与血管生成相关，因此，与clec14a表达相关的状况可包括任何包含不需要的血管生成的状况。特别地，状况包括治疗实体瘤(即表达clec14a的实体瘤)，月经过多，子宫内膜异位症，关节炎(炎症和类风湿两者)，黄斑变性，佩吉特病，视网膜病变及其血管并发症(例如增殖性和早产性和糖尿病性视网膜病变)，良性血管增生，纤维化，肥胖和炎症。
与clec14a表达相关的状况的治疗包括治疗与clec14a表达相关的现有状况或预防与clec14a表达相关的状况。如本文所用，“治疗”是指改善或预防受试者体内疾病状态的恶化。例如，治疗包括肿瘤大小的减小，肿瘤生长速率的降低，肿瘤转移速率的降低，或肿瘤的大小，生长速率或转移速率的维持。“减小”是指减小至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％。“维持”意味着没有实质性的增加，例如，增加不超过10％，5％，3％，2％或1％。肿瘤大小可以通过本领域已知的任何方法确定，例如，通过适当的抗体，mri等进行肿瘤成像，可以通过测量肿瘤大小随时间的增加并确定肿瘤在特定时间段内生长多少来确定肿瘤生长速率。转移率可以通过测量肿瘤生长在受试者中的新位点开始的时间段来确定。
如本文所用，“肿瘤”是指所有形式的新生物细胞生长，并且特别包括实体瘤。用于本发明治疗的实体瘤包括乳腺，卵巢，肝脏，膀胱，前列腺，肾，胰腺，胃，食道，直肠，肺(例如间皮瘤)，脑，宫颈，结肠，皮肤(例如黑素瘤)，子宫，神经系统(如神经母细胞瘤)，甲状腺和肉瘤，如骨肉瘤。特别地，胰腺或卵巢肿瘤可以在本发明中治疗，例如，使用本发明的t细胞。
治疗与clec14a表达相关的状况包括抑制血管生成。术语“抑制血管生成”旨在表示降低血管生成的速率或水平。减少可以是血管生成速率或水平的约10％，或约20％，或约30％，或约40％的低水平降低。优选地，所述降低是血管生成速率或水平降低约50％，或约60％，或约70％，或约80％的中等水平降低。更优选地，该降低是血管生成速率或水平的约90％，或约95％，或约99％，或约99.9％的高水平降低。最优选地，抑制还可以包括消除血管生成或将其降低至不可检测的水平。用于确定血管生成的速率或水平，并因此确定抗体是否以及在何种程度上抑制血管生成的方法和测定法是本领域已知的，并且在本文的实施方案中进一步详细描述。
通常，被抑制的血管生成是肿瘤血管生成。因此，个体可具有实体瘤，其可通过抑制肿瘤血管生成来治疗，即实体瘤与新血管生成相关。
如前所讨论，优选将包含本发明的核酸或载体的免疫细胞(例如t细胞)用于本发明的治疗方法中。免疫细胞(例如t细胞)可以是自体的或同种异体的。
“自体”是指要用于治疗方法或用途(即要用核酸或载体转导)的细胞来源于或者获自要进行治疗方法的受试者。因此，从受试者获得自体细胞，用核酸或载体转导并返回相同的受试者。
“同种异体”是指要用于治疗方法或用途(即要用核酸或载体转导)的细胞来源于或获自与要进行治疗方法的受试者的不同受试。因此，同种异体细胞从第一个受试者获得，用核酸或载体转导并施用于第二个受试者。
用于向受试者施用的细胞，特别是t细胞的方法，制剂和量是本领域公知的，并且在下文进一步讨论。特别地，t细胞可以用于肿瘤内施用或通过iv(静脉内)输注施用。典型的剂量可以是每kg的106-108个细胞。本发明还提供了包含本发明的核酸，载体或细胞的药物组合物。
如本文所用，术语“受试者”是指人或非人受试者，例如，如前所定义的哺乳动物。
尽管本发明的核酸，载体或细胞在分离使用时可以有效对抗疾病，但是可以将另外的治疗剂与本发明的核酸，载体或细胞组合使用以对抗疾病。特别地，可以期望通过施用本发明的核酸，载体或细胞，然后用细胞毒性剂治疗肿瘤来抑制肿瘤血管生成并因此减小受试者中肿瘤的大小。
因此，在本发明的另一个实施方案中，可以向受试者施用至少一种另外的或额外的治疗剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)。因此，可以向受试者施用本发明的核酸，载体，car，细胞或细胞群体和其他治疗剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)。因此，本发明的组合物或药物组合物可以包含其他活性剂或治疗剂，以及本发明的核酸，载体，car，细胞和/或细胞群体。然而，应当理解，本发明的核酸，载体，car，细胞或细胞群体和其他治疗剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)可以分开施用，例如通过分开施用途径。另外，本发明的核酸，载体，car，细胞或细胞群体和至少一种其他治疗剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)可以序贯或(基本上)同时施用。它们可以在相同的药物制剂或药物中施用，或者它们可以分别配制和给药。对于序贯施用，可以在施用核酸/载体/细胞之前或之后至少1分钟，10分钟，1小时，6小时，12小时，1天，5天，10天，2周，4周或6周施用另外的治疗剂。
在一个具体实施方案中，本发明提供了对抗与clec14a表达有关的疾病或状况，例如用于抑制血管生成，特别是肿瘤血管生成的方法，例如治疗癌症的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用如本文所定义的本发明的核酸/载体/car/细胞/细胞群题，特别是有效量的所述核酸/载体/car/细胞/细胞群体并且分开、同时、序贯施用一种或多种另外的活性(例如治疗)剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)。
或者，提供了如本文所定义的本发明的核酸，载体，car，细胞或细胞群体，用于对抗与clec14a表达相关的疾病或状况(例如用于抑制血管生成)其中所述核酸酸，载体，car，细胞或细胞群体用于与一种或多种另外的活性(例如治疗)剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)分开、同时或序贯施用。
因此，提供了如本文所定义的本发明的核酸，载体，car，细胞或细胞群体在制备用于对抗与clec14a表达相关的疾病或状况，例如用于抑制血管生成，特别是肿瘤血管生成，例如用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述核酸，载体，car，细胞或细胞群体与一种或多种另外的活性剂(例如治疗剂)(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)组合施用。
因此，在一个实施方案中，药物可进一步包含一种或多种另外的活性(例如治疗)剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)。另外的活性剂还可以是免疫检查点抑制剂。
药物可以是单一组合物的形式，其包含如本文定义的本发明的核酸，载体，抗体或基于配体的car或免疫效应细胞以及一种或多种另外的活性(例如治疗性)剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)两者，或者它可以是含有它们以用于分开(例如同时或序贯)施用的试剂盒或产品的形式。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗癌剂。另外的抗癌剂可以选自烷基化剂，包括氮芥类，例如氮芥(hn2)，环磷酰胺，异环磷酰胺，美法仑(l-沙可来新)和苯丁酸氮芥；乙烯亚胺类和甲基三聚氰胺类如六甲基三聚氰胺，塞替派；磺酸烷基酯诸如白消安；亚硝基脲类，如卡莫司汀(bcnu)，洛莫司汀(ccnu)，司莫司汀(甲基-ccnu)和链脲佐菌素(链脲佐菌素)；和三嗪类如氨烯咪胺(dtic；二甲基三氮烯咪唑-咪唑羧酰胺)；抗代谢物，包括叶酸类似物，如甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)；嘧啶类似物如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-fu)，氟尿苷(氟脱氧尿苷；fudr)和阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)；和嘌呤类似物和相关的抑制剂，如巯嘌呤(6-巯基嘌呤；6-mp)，硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤；tg)和喷司他丁(2'-脱氧助间型霉素)；天然产物，包括长春花生物碱类诸如长春碱(vlb)和长春新碱；表鬼臼毒素如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素如更生霉素(放线菌素d)，柔红霉素(道诺霉素；红比霉素)，多柔比星，博来霉素，普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素(丝裂霉素c)；酶诸如l-天冬酰胺酶；和生物反应调节剂，如干扰素alphenomes；混杂的试剂，包括铂配位络合物，如顺铂(cis-ddp)和卡铂；蒽二酮诸如米托蒽醌和蒽环类药物；取代的尿素如羟基脲；甲基肼衍生物如丙卡巴肼(n-甲基肼，mih)；和肾上腺皮质抑制剂，如米托坦(ο，p'-ddd)和氨鲁米特；紫杉醇和类似物/衍生物；细胞周期抑制剂；蛋白酶体抑制剂如硼替佐米（
临床使用的抗癌剂通常按作用机制分组：烷化剂，拓扑异构酶i抑制剂，拓扑异构酶ii抑制剂，rna/dna抗代谢物，dna抗代谢物和抗有丝分裂剂。美国国立卫生研究院/国家癌症研究所网站列出了122种化合物(http://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/searches/standard_mechanism.html)，所有这些化合物都可以与本发明的抗体，组合物或免疫效应细胞一起使用。它们包括烷基化剂，包括asaley，azq，bcnu，白消安，羧基邻苯二甲酸铂(carboxyphthalatoplatinum)，cbdca，ccnu，chip，苯丁酸氮芥，氯噻嗪，顺铂，氯乙矾(clomesone)，氰基吗啉代-多柔比星，环二酮(cyclodisone)，二脱水半乳糖醇(dianhydrogalactitol)，氟多潘(fluorodopan)，hepsulfam，海恩酮，美法仑，甲基ccnu，丝裂霉素c，mitozolamide，氮芥，pcnu，哌嗪，哌嗪二酮，哌泊溴烷，泊非霉素，spirohydantoinmustard，替罗昔隆，四铂，picoplatin(sp-4-3)(顺式-氨基二氯(2-甲基吡啶))(pt-ii))，塞替派，曲他胺，尿嘧啶氮芥，yoshi-864；抗有丝分裂剂，包括allocolchicine，halichondrinb，秋水仙素，秋水仙素衍生物，多拉司他汀10，美坦辛，根霉素，紫杉醇，紫杉醇衍生物，硫代秋水仙碱，三苯甲基半胱氨酸，硫酸长春碱，硫酸长春新碱；拓扑异构酶i抑制剂，包括喜树碱，喜树碱，钠盐，氨基喜树碱，20种喜树碱衍生物，吗啉代多柔比星；拓扑异构酶ii抑制剂，包括多柔比星，氨萘非特，m-amsa，蒽吡唑衍生物，吡唑啉吖啶，比生群hcl，柔红霉素，脱氧多柔比星，米托蒽醌，美诺立尔，n,n-二苄基道诺霉素，oxanthrazole，柔红霉素苯腙(rubidazone)，vm-26，vp-16；rna/dna抗代谢物，包括l-阿拉诺新，5-氮杂胞苷，5-氟尿嘧啶，阿西维辛，3氨基蝶呤衍生物，抗叶酸剂，baker可溶性抗叶酸剂，二氯烯丙基指甲花醌(dichlorallyllawsone)，布喹那，替加氟(前药)，5,6-二氢-5-氮杂胞苷，甲氨蝶呤，甲氨蝶呤衍生物，n-(膦酰基乙酰基)-l-天冬氨酸(pala)，吡唑霉素，三甲曲沙；dna抗代谢物，包括3-hp，2'-脱氧-5-氟尿苷，5-hp，α-tgdr，阿非科林甘氨酸盐(aphidicolinglycinate)，ara-c，5-氮杂-2'-脱氧胞苷，β-tgdr，环胞苷，胍那唑，羟基脲，肌苷糖二醛(inosineglycodialdehyde)，macbecinii，吡唑并咪唑(pyrazoloimidazole)，硫鸟嘌呤和硫嘌呤。
在一些优选的实施方案中，至少一种其他抗癌剂选自顺铂；卡铂；picoplatin；5-氟尿嘧啶；紫杉醇；丝裂霉素c；多柔比星；吉西他滨；拓优得；培美曲塞；甲氨蝶呤；伊立替康，氟尿嘧啶和亚叶酸钙(leucovorin)；奥沙利铂，5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸；和紫杉醇和卡铂。
当已经显示另外的抗癌剂对特定肿瘤类型特别有效时，可以优选本发明的核酸，载体或细胞与该另外的抗癌剂组合使用以治疗该特异性肿瘤类型。
在一些实施方案中，抗血管生成化合物可以选自以下任何一种：贝伐单抗
另外的治疗剂可以是缺氧激活的细胞毒剂，例如替拉扎明，或细胞因子，其可以增强car表达细胞(例如t细胞)的功效/持久性/扩增。或者/另外，另外的治疗剂可以是改善与施用car表达细胞相关的一种或多种副作用的治疗剂。
如先前所提及，另外的治疗剂可以是免疫检查点抑制剂。此类抑制剂通常通过阻断免疫细胞和靶细胞(例如肿瘤细胞)之间的相互作用来起作用，所述相互作用阻止或下调免疫细胞的刺激。特别地，检查点抑制剂预防或减少t细胞上表达的蛋白质与肿瘤细胞上表达的蛋白质之间的相互作用，该相互作用将阻止或减少t细胞的刺激。检查点抑制剂可以例如阻止pd1和pdl1之间的相互作用，特别是可以构成结合pd1的试剂。或者，检查点抑制剂可以与ctla-4结合。此类检查点抑制剂是本领域公知的，包括单克隆抗体，例如派姆单抗(pembrolizumab)，纳武单抗(nivolumab)或伊匹单抗(ipilimumab)。
另外的活性剂也可以是鞘氨醇-1-磷酸酶激动剂，例如fty720，其能够通过阻断来自鞘氨醇-1磷酸受体的信号来隔离淋巴样器官中的淋巴细胞。以此类方式，此类化合物可以限制对细胞因子如il-7和il-15的竞争，并因此可以使施用的car表达细胞疗法的增殖增加。特别地，此类化合物可以在本发明的核酸，表达载体，car或细胞之前施用，例如，之前至少12小时，24小时，36小时或48小时。
另外，别的或另外的活性(例如治疗)剂可以是tcr分子(例如在免疫细胞例如t细胞上表达，或为可溶形式)，包含编码tcr分子的多核苷酸的核酸分子或包含所述核酸分子的载体。在特别优选的实施方案中，另外的治疗剂是细胞(例如t细胞)，其包含编码tcr分子的核酸(例如rna或载体)。因此，如前所讨论，在本发明的一个具体实施方案中，编码如本文所述的car的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述核酸或表达本发明的car的细胞或所述car本身可用于与t细胞受体(tcr)分子疗法(例如作为基因或细胞疗法或作为可溶性tcr)一起治疗。本发明的该实施方案涵盖组合产品，其可具有增强的靶向实体瘤的能力。因此，特别地，tcr分子疗法可以将不同的肿瘤相关抗原靶向到靶向clec14a的本发明的car，因此此类组合产品或疗法可以提供用于治疗实体瘤的特别有效的药物。
如本文所用，“tcr”或“t细胞受体”分子是指能够在t细胞表面上表达并且能够结合特定mhc或hla/抗原肽复合物的分子(例如呈现在抗原呈递细胞或肿瘤细胞表面上)的分子。因此，当在具有特定mhc或hla的复合物中发现时，tcr通常识别抗原或抗原片段。如本文所用，tcr分子可包含两条蛋白质或多肽链(例如可包含αtcr链和βtcr链，或γtcr链和δtcr链)，或tcr可为单链分子，其中α和β链或γ和δ链得到表达并包含在单个蛋白质或多肽链中。单链tcr分子记载于chung等(1994),proc.natl.acad.sci.usa,91,12654-12658，其通过引用并入本文。
每个tcrα，β，γ或δ链通常包含可变区，其中每个可变区通常包含至少一个互补决定区(例如，两个，特别是三个互补决定区)，其能够识别和结合肿瘤相关的抗原肽/mhc复合物。互补决定区(cdr)可以通过一个或多个框架区(fr)彼此分开，并且通常如本文定义的tcrα，β，γ或δ链可变区可以包含三个cdr和三个fr。特别地，如本文所述，tcr分子可包含α链可变区和β链可变区，所述α链可变区以n至c末端顺序包含fr1α-cdr1α-fr2α-cdr2α-fr3α-cdr3α，所述β链可变区以n至c末端顺序包含fr1β-cdr1β-fr2β-cdr2β-fr3β-cdr3β。
此外，α，β，γ或δ链可以包含恒定区(例如具有细胞外和跨膜区)或恒定区的一部分(例如仅具有胞外域)。特别地，包含两个单独的α/β或γ/δ多肽链的tcr可包含其中一个或两个所述链具有恒定域(例如具有细胞外和跨膜域)的链。在一个具体实施方案中，α/β或γ/δtcr链均包含可变区和恒定区。
如本文所用，单链tcr可包含单个恒定区，例如，可以包含在单个多肽链内包含的α链可变区，β链可变区和β链恒定区，或α链可变区，β链可变区和α链恒定区。
如本文所定义，tcr分子可以是可溶性tcr分子或膜结合tcr。可溶性tcr分子通常包含截短的恒定区或不具有恒定区，其中任何截短足以除去恒定区的跨膜部分。缺乏跨膜部分的可溶性tcr可用于将其他分子靶向到显示肿瘤相关抗原肽/mhc复合物的细胞。然而，特别地，膜结合tcr可用于本发明的组合疗法中。因此，特别地，如本文所定义，tcr分子可包含恒定区跨膜域(例如，一个跨膜域或两个跨膜域，在每个链中包含一个)。
应当理解，tcr的α/β和γ/δ链的恒定区在tcr之间是相对保守的。因此，仅存在天然tcr分子中的两个变体β恒定区(其仅在4个氨基酸中不同)，单个α和δ链恒定区，以及三个变体γ恒定区。尽管如本文使用的tcr分子可包含任何天然恒定区，但特别地，tcr可包含对tcr中包含的任何恒定区或其部分的一种或多种修饰。特别优选改善tcr链配对或改善可溶性或单链tcr分子产生的修饰。
如本文所用，tcr分子可以包含通过用半胱氨酸残基取代α/β和γ/δ链中的一个或多个残基而不存在于天然存在的分子内的另外的二硫键。在这方面，在β链恒定区中用半胱氨酸残基取代氨基酸和α链恒定区中用半胱氨酸残基取代氨基酸可以允许取代的半胱氨酸残基之间形成非天然存在的二硫键，其可以防止或减少α和β链与t细胞中内源α和β链的错配。特别地，可以对tcr中包含的两条链的恒定区的细胞外部分进行修饰。
更具体地，如本文所用，tcr分子可以包含在α链恒定区中的thr48处取代为半胱氨酸和在β链恒定区中的ser57处取代为半胱氨酸；在α链恒定区中的thr45处取代为半胱氨酸和在β链恒定区中的ser77处取代为半胱氨酸；在α链恒定区中的tyr10处取代为半胱氨酸和在β链恒定区中的ser17处取代为半胱氨酸；在α链恒定区中的thr45处取代为半胱氨酸和在β链恒定区中的asp59处取代为半胱氨酸；在α链恒定区中的ser15处取代为半胱氨酸和在β链恒定区中的glu15处取代为半胱氨酸。
因此，如本文所用的tcr分子可以在α链恒定区中具有thr48至半胱氨酸取代以及在β链恒定区中具有ser57至半胱氨酸取代。α链和β链恒定区的天然存在的氨基酸序列分别在seqidno.187和188中列出，因此特别地，上述讨论的修饰可以在这些序列内的所述位置进行。
可以对tcr进行其他修改以改善链之间的配对。例如，可以使用亮氨酸拉链，链可以是鼠源化的或部分鼠源化的，例如，至少一个或两个氨基酸可以是鼠源化的，可以构建tcr样分子(例如通过将tcr融合至cd3ζ)，或者可以反向交换α和β恒定区界面处的氨基酸对。特别地，反向交换的氨基酸对在α和β链的天然tcr恒定区中的表面彼此相互作用。可以对该相互作用的氨基酸对进行诱变，使得α链恒定域的氨基酸被与天然存在的氨基酸相比具有空间突出基团的氨基酸替换，并且β链恒定域的氨基酸被与天然存在的氨基酸相比具有空间凹陷基团的氨基酸替换(或反之亦然，即α链氨基酸可以被具有空间凹陷基团的氨基酸取代并且β链氨基酸可以用具有空间突出基团的氨基酸取代)。与天然存在的氨基酸相比可具有空间凹陷基团的氨基酸可选自甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸和丙氨酸。与天然存在的氨基酸相比可具有空间突出基团的氨基酸可选自谷氨酰胺，谷氨酸，α-甲基缬氨酸，组氨酸，羟赖氨酸，色氨酸，赖氨酸，精氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。特别地，α恒定区中的甘氨酸残基可以被精氨酸取代，并且β恒定区中的精氨酸残基可以被甘氨酸残基取代，例如，可以在α链恒定区中的位置85.1处进行甘氨酸至精氨酸取代，并且可以在β链恒定区中的位置88处进行精氨酸至甘氨酸取代(使用immunogenetics信息系统(imgt)命名法来编号tcr恒定域)。因此，精氨酸至甘氨酸取代可发生在seqidno.188的β恒定区的第73位。
此外，可能期望除去在tcr链之间(例如在α链和β链之间)发生的天然存在的二硫。因此，tcr中的链间天然二硫键可以通过取代参与键的半胱氨酸残基，例如取代为丝氨酸或丙氨酸残基，或通过缺失残基来除去。可以期望的另外的或替代的修饰是除去或取代在天然βtcr链中发生的未配对的半胱氨酸残基。此类修饰可以是优选的，其中tcr是单链tcr。
如本文所用，“肿瘤相关抗原”是指其表达与肿瘤(例如与任何肿瘤类型或与多于一种肿瘤类型)相关的任何抗原。因此，特别地，与健康组织或相同类型的细胞相比，肿瘤相关抗原的表达可在肿瘤或肿瘤细胞中上调或增强。与健康组织或相同类型的细胞(例如，相同类型的从相同器官获得的相同类型的细胞或组织)中的该抗原的表达相比，肿瘤相关抗原的表达可在肿瘤或肿瘤细胞中上调至少2,3,4,5,10,20,50或100倍，或者备选至少20,30,40,50,60，70，80，90或100％。因此，检测组织或细胞中的肿瘤相关抗原可指示肿瘤。特别地，肿瘤相关抗原可以仅以非常低的水平表达，或者可以在健康组织或与特定器官相关的健康组织中检测不到。
肿瘤相关抗原的表达水平通常是指用特定细胞/组织表达的蛋白质的量。测量蛋白质表达水平或检测过表达蛋白质的方法是本领域公知的，包括例如western印迹法，免疫染色等。
本领域已知许多肿瘤相关抗原，与健康组织相比，其在肿瘤细胞中上调或过表达，并且任何这些抗原可以通过tcr作为本发明治疗中的另外的治疗剂来靶向。特别地，根据本发明，期望靶向实体瘤，因此优选地，如本文所讨论的tcr分子可识别并结合在实体瘤上过表达或上调的肿瘤相关抗原。例如，ny-eso(与黑素瘤和睾丸癌相关的肿瘤相关抗原)，magea家族(特别是magea10)(与睾丸癌相关的肿瘤相关抗原)，afp(与肝细胞癌相关的肿瘤相关抗原)和wt1(在几种肿瘤类型上表达的肿瘤相关抗原)可以在本发明的组合疗法中靶向。
应当理解，tcr分子识别并结合肽/mhc或hla复合物，因此如本文所用的tcr分子通常识别肿瘤相关抗原的部分或肽片段。此类肽片段可以长5-25个氨基酸，例如长5-10,8-15,10-18,15-25个氨基酸，例如，可以长至少5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个氨基酸，并且通常是包含在肿瘤相关抗原内的连续肽序列。此外，当与特定mhc或hla(例如mhci类或ii类或hla-a1或hla-a2)组合时，tcr分子仅识别来自肿瘤相关抗原的肽。特别地，如本文所定义的tcr分子在与hla-a2组合时可识别肽肿瘤相关抗原。
tcr与肽/mhc或hla复合物的结合可通过本领域已知的各种方法测定，例如通过测量与t细胞活化相关的各种参数，当tcr在t细胞上表达时，通过四聚体测定或通过细胞毒性测定。
如前所讨论，本文使用的tcr优选与编码的car结合不同的肿瘤相关抗原，即tcr优选不结合clec14a。
在本发明的一个具体实施方案中，tcr分子可以识别并结合wt1肽/mhc或hla复合物，更特别是wt1肽/hlaa2复合物。例如，tcr可以结合wt1肽235-243(cmtwnqmnl)seqidno.202-hlaa*2402组合。然而，在特别优选的实施方案中，tcr识别并结合wt1/hlaa2复合物的rmfpnapyl(seqidno.189)肽。应当理解，超过一种tcr可以能够结合该复合物，并且一种或多种此类tcr可以用于本发明的组合疗法中。此外，关于该方面，组合疗法可以利用双链tcr(即具有单独的α和β或γ和δ链)和/或单链tcr来结合wt1复合物。
因此，如本文所述的组合疗法中使用的tcr分子(例如作为另外的治疗剂)可包含α链和β链，
其中α链包含seqidno.190的cdr1α，seqidno.191的cdr2α和seqidno.192或193和cdr3α，
其中β链包含seqidno194的cdr1β，seqidno.195的cdr2β和seqidno196或197的cdr3β，
或其变体，其中一个或多个cdr包含一个，两个或三个氨基酸取代，
其中所述tcr分子能够结合hlaa2/rmfpnapyl复合体。
应当注意，在一些命名系统中，β链的cdr3可以定义为比下面描述的immunogenetics(imgt)数据库中使用的命名系统长。另外，在一些命名系统中，α链的cdr3可以定义为比在imgt系统中短。类似地，恒定区可以包括或不包括在不同命名系统中位于cdr3区侧翼的框架残基。
因此，使用imgt系统，cdr3α可具有seqidno.192的氨基酸序列，并且和恒定区包括框架氨基酸序列fgkgthliiqp。
使用不同的命名系统(garcia)(garcia等，1999，ann.rev.immunol.17,369-397，通过引用并入本文)，cdr3α具有seqidno.193的氨基酸序列，在此序列直接c端的框架区具有fgkgthliiqp的氨基酸序列，并且恒定区以氨基酸序列yiq开始。
使用imgt命名系统，cdr3β可具有氨基酸序列seqidno.196，并且该序列的直接c端的恒定区包括框架氨基酸序列set。
使用garcia命名系统，cdr3β具有氨基酸序列seqidno.197，并且在此序列的直接c端的框架区具有氨基酸序列fgpgtrllvl，并且直接c端恒定区以氨基酸序列edl开始。
应当理解，只要框架区与cdr相容，技术人员可以使用任意或任何命名系统容易地设计和合成用于本发明的tcr。氨基酸序列，包括许多tcrα和β链的可变区(以及因此框架区)是本领域公知的，其中一些在imgt(immunogenetics)数据库中描述于http://imgt.cines.fr。该信息与例如garcia等(同上)一起可用于设计和生产包含cdr和fr的tcr。
如上所指示，变体tcr可用于本发明，其中一个或多个cdr可包含一个，两个或三个氨基酸取代。如本文所讨论的，关于car序列，特别是取代可以是保守取代，并且任何变体分子应当能够结合hlaa2/rmfpnapyl复合物。与具有如上定义的cdr的tcr相比，变体结合的亲和力可以是增加或降低的，但仍应当发生结合。用于检测tcr与其肿瘤相关抗原肽/mhc复合物靶物的结合的方法如上所述。
特别地，用作根据本发明的另外的治疗剂的tcr分子可以包含seqidno.200中所示的tcrα链和seqidno.201中所示的tcrβ链。或者，tcr分子可包含seqidno.198中所示的tcrα链和seqidno.199中所示的tcrβ链，其中所述α和β链序列可以进一步修饰以稳定或增强所述α链和β链的配对。
编码如本文所述的tcr分子的核酸分子可以是dna或rna的形式。因此，本发明的组合物可包含编码本发明的car和如本文所述的tcr分子的rna分子。
或者，载体可包含核酸分子，其包含编码tcr的多核苷酸序列。本文描述了用于表达car的合适载体，并且此类载体也可用于tcr表达。尽管设想可以使用单独的载体用于car和tcr表达，但载体可以编码本发明的car和tcr分子两者。在这方面，每个基因的表达可以由不同的启动子控制，或者可以如本文其他地方所述使用单个启动子。
在这方面，本发明提供了包含编码本发明car的多核苷酸序列并包含编码能够结合肿瘤相关抗原肽/mhc或hla复合物的tcr分子的多核苷酸序列的载体。
此外，本发明提供了细胞，所述细胞包含编码car的多核苷酸序列的本发明的核酸分子和包含编码能够结合肿瘤相关抗原肽/mhc或hla复合物的tcr分子的多核苷酸序列的核酸分子。还涵盖细胞，所述细胞包含含有编码本发明的car的多核苷酸序列的载体和包含编码能够结合肿瘤相关抗原肽/mhc或hla复合物的tcr分子的多核苷酸序列的载体。
或者或另外，本发明的细胞可以包含载体，所述载体包含编码本发明的car的多核苷酸序列，并且包含编码能够结合肿瘤相关抗原肽/mhc或hla复合物的tcr分子的多核苷酸序列。
因此，细胞可以表达本发明的car分子和如本文所定义的tcr分子(例如来自相同或不同的载体)。
本发明还提供细胞群体，其中至少一个细胞包含包含编码car的多核苷酸序列的本发明的核酸，并且至少一个细胞包含含有编码如先前定义的tcr分子的多核苷酸序列的核酸。因此，在该实施方案中，细胞群体可以包含仅表达car分子的细胞和仅表达tcr分子的细胞。另外，此类细胞群体还可以包含表达car分子和tcr分子的细胞。
通常，如上所讨论，本发明的细胞可以是免疫细胞，特别是t细胞。
本发明的此方面还涵盖包含编码car分子和tcr分子的核酸分子或载体(作为分开的多核苷酸序列，或来自相同或不同的载体)的试剂盒。
在本发明的一个具体实施方案中，提供了组合物，其包含：
(i)核酸分子，其包含编码tcr分子的多核苷酸序列，其中所述tcr分子包含α链和β链，
其中α链包含seqidno.190的cdr1α，seqidno.192的cdr2α和seqidno.192或193的cdr3α，和
其中β链包含seqidno.194的cdr1β，seqidno.195的cdr2β和seqidno.196或197的cdr3β，
或其变体，其中一个或多个cdr包含一个，两个或三个氨基酸取代，
其中所述tcr分子能够结合hlaa2/rmfpnapyl复合物，和
(ii)核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含抗clec14a结合域，跨膜域和信号传导域，其中所述抗clec14a结合域包含氨基酸序列seqidno58,96,112，125或175，(优选seqidno58，优选seqidno.96或优选seqidno.125)或其与seqidno58,96,112，125或175中的任一个具有至少80％序列同一性的变体。
进一步具体提供了包含如上文(i)和(ii)中定义的核酸分子的细胞，特别是t细胞。此外，细胞群体可以包含第一细胞和第二细胞，所述第一细胞包含如上文(i)中定义的核酸，所述第二细胞包含如上文(ii)中定义的核酸。
从上面的讨论中可以明显看出，本发明提供了各种组合物，例如，药物，治疗剂，其包含本发明的核酸，载体，细胞或细胞群体和药学上可接受的稀释剂，载体或赋形剂。在这方面，应当理解，通常可以将本发明的试剂(即核酸，载体或细胞)配制成药物组合物以对个体(即受试者)施用，即与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起。
“药学上可接受的”包括制剂是无菌和无热原的。合适的药物载体，稀释剂和赋形剂在药学领域是公知的。在与药物相容并且对其接受者无害的意义上，载体必须是“可接受的”。通常，载体将是盐水或输注介质(或者称为输注溶液)，其将是无菌和无热原的；但是，可以使用其他可接受的载体。本发明的组合物可包含合适的冷冻保存剂，例如dmso。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物或制剂用于胃肠外施用，更特别用于静脉内施用。在优选的实施方案中，药物组合物适合于例如通过注射给患者静脉内施用。
适用于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂和溶质，其使制剂与意图接受者的血液等张；和含水无菌悬浮液。
液体药物组合物通常可以包含输注介质中的本发明的细胞，例如，t细胞，其可包含plasmalytea加hsa(例如为4％)。本发明的细胞通常使用无菌等张溶液输注。胃肠外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿，一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选是无菌的。
本发明的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数目和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重性等因素确定，尽管适当的剂量可以通过临床试验确定。
本发明的组合物可以以单剂量或多剂量施用。特别地，该组合物可以单次一次性施用。
本发明的试剂或组合物可以通过任何胃肠外途径以包含活性成分的药物制剂的形式施用。取决于病症和待治疗的患者以及施用途径，组合物可以以不同剂量(例如以细胞/kg或m2测量)施用。在任何情况下，内科医生将确定最适合于任何个体患者的实际剂量，并且它将随着特定患者的年龄，体重和反应而变化。然而，通常，对于本发明的细胞，可以提供高达1x109/kg(或以m2计等同)的剂量用于静脉内施用，例如，至少1x108个细胞/kg的剂量。对于肿瘤内施用，设想高达1x1010个细胞/kg的剂量。
在人疗法中，本发明的试剂或组合物通常与根据预期施用途径和标准药学实践选择的合适的药物赋形剂，稀释剂或载体混合施用。通常，本发明的细胞可以在输注缓冲液中施用。
本发明的试剂或组合物还可以以胃肠外施用，例如静脉内，动脉内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内，颅内，肌内或皮下，或者它们可以通过输注技术施用。它们最好以无菌水溶液的形式使用，其可以含有其他物质，例如足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等张。若必要的话，水溶液应当适当缓冲(优选ph为3至9)。在无菌条件下制备合适的胃肠外制剂可通过本领域技术人员公知的标准制药技术容易地完成。
制剂可以在单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿，袋和小瓶中呈现。
在一些实施方案中，本发明的试剂或组合物可以通过眼途径施用。对于眼使用，本发明的试剂或组合物可以配制成例如等渗ph调节的无菌盐水中的微粉化悬浮液，或者优选地，作为等渗ph调节的无菌盐水中的溶液，任选地与防腐剂例如苄基氯化铵组合。
本发明的核酸分子试剂(例如核酸分子，载体等)可以作为如下所述的合适的遗传构建体施用，并在表达它的情况下递送给患者。通常，遗传构建体中的核酸与可在细胞中表达化合物的启动子可操作地连接。本发明的遗传构建体可以使用本领域公知的方法，例如sambrook等(2001)中的方法制备。
用于递送多核苷酸的遗传构建体可以是dna或rna。因此，本发明涵盖涉及将本发明的核酸分子或表达载体直接施用于受试者的基因疗法治疗方法。此外，还涵盖涉及直接施用car的治疗方法。此类方法可以是有利的，因为这些方法避免细胞的离体处理。
优选地，遗传构建体适于递送至人细胞。将遗传构建体导入细胞中的手段和方法是本领域已知的，包括使用免疫脂质体，脂质体，病毒载体(包括痘苗，改良痘苗，慢病毒，细小病毒，逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒(aav)载体)，并通过直接递送dna，例如使用基因枪和电穿孔。此外，将多核苷酸递送至患者的靶组织以进行治疗的方法也是本领域公知的。在另一种方法中，使用利用受体介导的胞吞作用将dna大分子携带到细胞中的高效核酸递送系统。这通过将铁转运蛋白转铁蛋白与结合核酸的聚阳离子结合来实现。使用高效率受体介导的本发明的dna构建体或其他遗传构建体的递送，其使用由cotten等(1992)proc.natl.acad.sci.usa，89:6094-6098的方法产生的缺陷或化学灭活的腺病毒颗粒的内体破坏活性进行。应当理解，“裸dna”和与阳离子和中性脂质复合的dna也可用于将本发明的dna导入待治疗个体的细胞中。ledley(1995，humangenetherapy6,1129-1144)中描述了基因治疗的非病毒方法。
虽然对于特定组织的癌症/肿瘤，在编码多核苷酸抑制剂的载体中使用组织特异性启动子可能是有用的，但这不是必需的，因为预期除了癌症/肿瘤外的位置处的身体中的核酸分子试剂的表达风险与对患有癌症/肿瘤的患者的治疗性益处相比是可耐受的。可以期望能够暂时调节细胞中多核苷酸抑制剂的表达，尽管这也不是必需的。
可以适当地修改用于施用的本发明的试剂(例如核酸，载体，细胞或细胞群)以用于药物组合物。例如，可以例如通过使用适当的添加剂，例如盐或非电解质，乙酸盐，edta，柠檬酸盐，tris，磷酸盐或乙酸盐缓冲液，甘露醇，甘氨酸，hsa(人血清白蛋白)或polysorbate在本发明的组合物中将试剂稳定化以防止降解。许多稳定剂在本领域中是已知的。特别地，可以将细胞冷冻保存，并且在输注入受试者中之前在适当的时间时解冻。
本发明还包括试剂盒，其包含下列一种或多种：本发明的核酸，载体，细胞或组合物。优选地，所述试剂盒用于如本文所述的方法和用途，例如如本文所述的治疗方法，或用于体外测定或方法。优选地，所述试剂盒包含使用试剂盒组分的说明书。
本文对“肿瘤”的任何提及也指“癌症”或“癌瘤”。也可以治疗转移性癌症，其可以减少原发性肿瘤的转移。留在术后患者中的所谓的微小残留病(mrd)可以适合用如本文定义的试剂进行免疫疗法。
如在整个申请中所使用的，术语“一个”和“一种”在它们意味着所引用的组件或步骤的“至少一个/种”、“至少第一”、“一个/种或多个/种”或“多个/种”的意义上使用，除了在其后具体说明上限的情况之外。因此，如本文所用，“抗体”意指“至少第一抗体”。根据本公开内容，本领域普通技术人员将知道组合的可操作限制和参数，与任何单一试剂的量一样。
本文引用的文献通过引用并入本文。
现在将参考以下实施方案和附图更详细地描述本发明：
图1显示来自genbank登录号np_778230(seqidno.1)的人clec14a的多肽序列(图1a)；来自genbank登录号nm_175060的人clec14a的cdna(seqidno.2)(图1b)和来自nm_175060的348-1820位的人clec14acdna的编码区(seqidno.3)。
图2显示了clec14a在huvec和其他原代细胞中的相对表达的图。clec14a在内皮细胞(huvec)中特异性表达，而不在人主动脉平滑肌细胞(hasmc)，人肺成纤维细胞(mrc50，人支气管上皮细胞(hbe)，肝细胞或外周血单个核细胞(pbmc)中表达。
图3显示了用抗clec14a单克隆抗体crt-3进行的huvec划痕伤口愈合测定的图示结果，显示了伤口闭合的延迟。
图4显示用clec14a抗体处理的huvec的小管形成测定的分析。用2cμg/mlcrt2,3或4或小鼠igg同种型对照处理huvec。在16小时时取小管图像并分析总小管长度，接合(junction)数目，分支数目，分支长度，网孔(mesh)数目和总网孔面积。显示的数据代表三个实验，每个分析五个数据点。误差棒显示sem。*p，0.05。**p<0.01。
图5显示了clec14a的sirna敲低，其揭示了clec14a在内皮发芽中的作用。图5a显示如通过qpcr测定，clec14a的sirna双链体靶向可有效敲低huvec中的clec14amrna表达。通过相对于flotilin2将表达标准化来确定相对表达。图5b显示通过蛋白质印迹分析在蛋白质水平上的clec14a敲低。微管蛋白用作上样对照。图5c显示对照或clec14a靶向sirna处理的huvec在16小时后芽长出的代表性图像。图5d显示了用于对照和clec14a敲低huvec的27个球状体(来自3个带的9个球状体)的芽的定量；mann-whitney统计检验p<0.001。图5e显示了混合对照(绿色)和clec14a靶向sirna处理的huvec(红色)24小时后芽长出的代表性图像。图5f显示来自对照(con)和clec14a敲低(kd)huvec的尖端和茎细胞的百分比的定量；使用bonferroni后检验的双因素anova统计检验***＝p<0.001，ns＝不显著。
图6显示clec14a的丧失抑制体外和体内发芽。图6a显示了c57bl/6(clec14a+/+)或c57bl/6(clec14atm1(komp)vlcg)(clec14a-/-)小鼠中clec14a基因的示意图。图6b显示了对于clec14a的5'非翻译区(utr)，编码序列(cds)和3'utr的从三个clec14a+/+小鼠(白色柱)和三个clec14a-/-小鼠(黑色柱)产生的cdna的定量pcr分析。通过相对于flotilin2将表达标准化确定相对表达。图6c显示了使用针对鼠clec14a的多克隆抗血清对来自clec14a+/+和clec14a-/-小鼠的肺裂解物中clec14a蛋白表达的western印迹分析。微管蛋白用作上样对照。图6d显示了来自clec14a+/+和clec14a-/-小鼠的主动脉环发芽测定的代表性图像。图6e显示了每个环形成的管的定量，图6f显示了内皮管从主动脉环迁移的最大距离的定量，来自每个基因型的48个环的数据，每个基因型的6个小鼠；mann-whitney统计检验p<0.001。图6g显示了来自clec14a+/+和clec14a-/-小鼠的海绵植入物的苏木精和曙红染色切片的代表性图像，分析了海绵中心的切片。图6h显示了细胞侵入图6g中所示的海绵植入物的定量；mann-whitney统计检验p<0.05。图6i显示了血管密度的定量；mann-whitney统计检验p<0.001。图6j显示用x-gal染色，用苏木精和曙红复染色的来自clec14a-/-小鼠的肝脏和海绵组织的切片。
图7显示clec14a的丧失抑制肿瘤生长。图7a显示了clec14a+/+(带点的黑线)和clec14a-/-(带有正方形的黑线)小鼠中的lewis肺癌(llc)肿瘤生长；双因素anova统计分析，*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001。图7b显示llc肿瘤的代表性图像。图7c显示7个clec14a+/+(点)和7个clec14a-/-(正方形)小鼠的终点肿瘤重量；mann-whitney统计检验p<0.001。图7d显示了针对鼠cd31染色的llc肿瘤切片的免疫荧光染色的代表性图像。图7e显示了血管密度的定量，而图7f显示了来自clec14a+/+和clec14a-/-小鼠的内皮覆盖百分比；mann-whitney统计检验p<0.0001。图7g显示用x-gal染色，用苏木精和曙红复染色的来自clec14a-/-小鼠的肝脏和llc肿瘤组织的切片。
图8显示mmrn2结合clec14a。在图8a中，使用20μgclec14a-ecd-fc或fc来沉淀相互作用的配偶体。在sds-pag上分离沉淀物和huvec裂解物，并针对mmrn2(上图)或clec14a-ecd-fc(下图)进行印迹法。在图8b中，使用针对clec14a的多克隆抗血清从huvec裂解物中免疫沉淀clec14a。通过western印迹分析免疫沉淀物的mmrn2(上图)和clec14a(下图)。
图9显示mmrn2-clec14a相互作用阻断性抗体抑制肿瘤生长。图9a显示注射llc的小鼠用migg1(带点的黑线；n＝7)或c4抗体(带有正方形的黑线；n＝7)的100μg注射处理的结果；双因素anova统计分析，**＝p<0.01，***＝p<0.001。图9b显示了llc肿瘤的代表性图像。图9c显示7个migg1处理的小鼠(点)和7个c4抗体处理的小鼠(正方形)的终点肿瘤重量；mann-whitney统计检验p<0.001。图9d显示了针对鼠cd31染色的llc肿瘤切片的免疫荧光染色的代表性图像。图9e显示血管密度的定量，而图9f显示用migg1或c4抗体处理的小鼠的内皮覆盖百分比；mann-whitney统计检验p<0.001。
图10显示clec14a单克隆抗体c1，c4和c5阻断clec14a-mmrn2相互作用。将人clec14a-ecd-fc与蛋白a珠结合，在20％fcs中封闭，然后在每种阻断条件下温育。然后将这加入过表达具有his标签的全长人mmrn2的hek293t细胞的裂解物中。与crt1，crt4和crt5预温育降低由clec14a-ecd-fc下拉的mmrn2水平。
图11显示mmrn2在非还原条件下直接结合clec14a的c型凝集素或sushi域。用含有clec14a野生型(wt)的pcs2载体或每个主要域缺失(δ)且具有n末端ha标签的构建体模拟转染或转染hek293t细胞。在用mmrn2蛋白裂解物进行远western印迹法后，除了缺少c型凝集素域(ctld)或sushi域的那些突变体外，可以在所有突变体中看到结合。包括抗ha印迹以显示表达所有突变蛋白。
图12显示了嵌合蛋白嵌合体5和嵌合体6的蛋白质序列。
图13显示了使用流式细胞术分析crt抗体的结合。所有构建体都具有c末端gfp标签，因此将绿色细胞门控并染成红色。所有crt抗体结合hek293t细胞中表达的具有c末端gfp标签的clec14a野生型。crt抗体无一结合hek293t细胞中表达的具有gfp标签的野生型血栓调节蛋白。
图14显示cd141的clec14a区域1-42的比对；cd141的clec14a区域97-108；和cd141的clec14a区域122-142。
图15显示除了在crt2的情况下荧光的轻微移动之外，任何crt抗体都不识别嵌合体5(血栓调节蛋白的ctld，其余clec14a)。嵌合体6(血栓调节蛋白的sushi以确保clec14a的ctld的正确折叠)导致除crt2之外的所有crt抗体的结合。
图16显示当残基97-108与来自血栓调节蛋白的相应区域交换时抗体crt1-5的结合的流式细胞术分析。这导致正确的折叠，因为crt2和crt3仍然可以结合。然而，crt1，crt4和crt5不能识别此类突变体，这提示这是结合区。
图17显示当使用crt-4抗体药物缀合物治疗时肺癌的肿瘤重量减少。图17a显示当将100万个lewis肺癌细胞皮下注射到小鼠的右体侧中并允许生长至可见大小时的结果。通过尾静脉注射施用1mg/kg抗体crt4-adc(右图)或对照b12-adc(左图)。观察小鼠一小时并在24小时后扑杀。解剖并固定所有器官。n＝1。图17b显示抗体药物缀合物治疗的终点肿瘤重量。当与b12-adc处理组相比时，crt4-adc处理组的湿重之间存在显著差异。mannwhitney检验p＝0.0317。误差棒sem，n＝5。数据汇集自同一方法的两个分开的实验。
图18显示crt-3抗体药物缀合物的内化及这在施用后24小时对肿瘤的影响。图18a显示crv-3抗体药物缀合物在huvec中的内化，其中荧光成像显示0和90分钟后crt-3的定位，而图18b显示通过crt-3-adc处理的huvec中的celltitreglo发光细胞存活力测定法测量的细胞毒性(ic50＝137.6ng/ml)。图18c显示crt3-adc处理的小鼠而不是对照中肿瘤部位的广泛出血，表明血管生成的肿瘤特异性破坏。
图19显示了共表达截短的cd34标志物基因和scfv片段/cd3ζ链嵌合受体的逆转录病毒car载体(基于pmp71)(图19a)。表达由ltr启动子驱动，并且2a肽接头确保cd34和car两者的等摩尔表达。第二代car构建体包括cd28共刺激域。图19b显示通过流式细胞术分析的cd34染色，证明使用共表达clec14a特异性car的逆转录病毒构建体成功转导t细胞。基于抗体crt3和crt5的第一代car分别称为crt3.z和crt5.z。基于抗体crt3和crt5的第二代car分别称为crt3.28z和crt5.28z。注意在cd4和cd8t细胞亚组中观察到等同表达(数据未显示)。图19c显示使用clec14a-fc针对car表达直接染色的细胞(％值显示clec14a-fc的特异性结合，其已经扣除仅用fc的背景染色)。
图20显示了经转导以表达基于抗体crt3或crt5的第一代或第二代car的t细胞或模拟转导的(对照)t细胞响应clec14a的能力，所述clec14a表达为(a)平板结合的重组fc融合蛋白，(b)在工程化cho细胞上表达，或(c)在静态培养中培养时天然表达clec14a的人脐静脉内皮细胞(huvec)上表达。使用用于干扰素γ产生的elisa测量的t细胞应答。显示的数据代表从3-7次重复实验获得的数据。调节t细胞以使转基因表达细胞的频率相等。所有直方图显示均值响应+sd。
图21显示了clec14a特异性car转导的t细胞的进一步体外功能测试。在以下功能性测定法中对经转导以表达基于抗体crt3或crt5的第一代或第二代car的t细胞或模拟转导的(对照)t细胞测试其响应clec14a的能力：(a)细胞毒性，使用工程化改造为表达人clec14a的cho细胞(扣除单独cho(对照细胞)裂解的背景水平)。显示的数据代表5次重复实验。(b)增殖，使用cfse标记的car转导的t细胞，当与huvec共培养4天时，我们测量了car+(cd34+)和car-(cd34-)细胞亚组的增殖。显示的数据代表2次重复实验。(c)使用干扰素γ释放评估(clec14a特异性car转导的t细胞对人和小鼠clec14a两者的响应。调节t细胞以使转基因表达细胞的频率相等。所示数据代表6次重复实验。所有直方图显示均值响应+sd。
图22显示了用基于抗体crt1的第三种clec14a特异性car转导的t细胞的体外功能测试。对经转导以表达基于抗体crt1的第一代或第二代car的t细胞或模拟转导(对照)t细胞测试它们响应(a)工程化cho细胞或(b)人脐静脉内皮细胞(huvec)上表达的clec14a的能力，所述人脐静脉内皮细胞当在静态培养中培养时天然表达clec14a的细胞。使用用于干扰素γ产生的elisa测量t细胞响应。(c)细胞毒性，使用工程化改造为表达人clec14a的cho细胞(扣除单独cho(对照细胞)裂解的背景水平)。所示数据代表从至少3次重复实验获得的数据。调节t细胞以使转基因表达细胞的频率相等。所有直方图显示均值响应+sd。
图23显示了使用注射clec14a特异性car转导的小鼠t细胞的健康c57/bl6小鼠的体内毒性测试。将经转导以表达基于抗体crt3或crt5的第一代或第二代car的t细胞或或模拟转导(对照)t细胞注射到先前已经照射(4gy)以帮助t细胞植入的健康c57bl6小鼠的尾静脉中。t细胞源自携带标志物cd45.1的c57bl6同源株(boyj)。每只小鼠输注2000万个t细胞(含有4百万个工程化t细胞)。在接下来的45天监测小鼠并且小鼠没有显示明显的毒性体征。(a)在此时间期间体重正常增加。(b)每周尾部出血证明输注的cd45.1+t细胞在输注后持续至少五周，并且贯穿此时间，它们占总循环t细胞合并物的至少30％(注意随着时间，宿主自身的t细胞恢复)。(c)针对cd34以及cd45.1染色相同样品证明在此时间期间，工程化(cd34+)t细胞相对于总输注t细胞群体的比例保持相对恒定。(d)在实验结束时，从car处理的小鼠收获脾细胞，并使用免疫磁珠选择分离cd34+细胞。立即离体测试这些细胞证明它们仍然能够响应人和小鼠clec14a两者，如通过用于干扰素γ释放的elisa测量的。图a-c显示均值+sem。图d显示均值+sd。
图24显示了使用注射clec14a特异性car转导的小鼠t细胞的健康c57/bl6小鼠的体内毒性测试。在实验结束时，扑杀小鼠并收获主要器官。组织学检查揭示无病理学证据。
图25显示当注射到携带lewis肺癌肿瘤的小鼠中时clec14a特异性car转导的小鼠t细胞的抗肿瘤响应。给c57bl6小鼠皮下注射lewis肺癌细胞(1百万个细胞/小鼠)，4天后小鼠接受4gy全身照射以辅助t细胞植入。然后将经转导以表达基于抗体crt3或crt5的第二代car的t细胞或模拟转导的(对照)t细胞注射到尾静脉中。小鼠接受总共2000万个t细胞(cd8:cd4＝5:2)，其中crt3.28z和crt5.28z在220万和140万个这些细胞上表达。然后使用(a)生物发光或(b)卡尺监测肿瘤生长。
图26显示当注射到携带lewis肺癌肿瘤的小鼠中时clec14a特异性car转导的小鼠t细胞的抗肿瘤响应。在实验结束时，切除肿瘤并称重(a)。组织学分析表明，来自用car处理的小鼠的肿瘤显示显著降低的血管密度(b，meca-32染色)和更高水平的血管渗漏(c，纤维蛋白原染色)。
图27显示当注射到riptag2小鼠中时clec14a特异性car转导的小鼠t细胞的抗肿瘤响应(其中大鼠胰岛素启动子(rip)指导sv40大t抗原转基因(tag)表达为胰岛的β细胞)。肿瘤在10周龄左右时出现，并且通常导致动物约14周死亡。将表达基于crt5的第二代car的小鼠t细胞(或模拟转导的对照细胞)输注到10周龄的riptag2小鼠中。将模拟处理的小鼠在14周龄时扑杀并测量肿瘤大小。2周后(16周龄)扑杀car处理的小鼠，并再次测量肿瘤大小。结果证明与模拟转导的t细胞处理的动物相比，用car转导的t细胞(a)处理的小鼠中肿瘤大小的高度显著的抑制。还有一些存活益处的证据，因为在每项研究中处理12只小鼠，而在接受模拟转导的t细胞的那些小鼠中，4只在14周龄前死亡，而所有12只用car转导的t细胞处理的小鼠在14周龄时仍存活，并且两周后它们中的剩余部分仍然存活。数据显示个体小鼠中的肿瘤大小。水平线指示均值肿瘤大小+sem。注意未处理的小鼠未被照射。
图28显示静脉内注射car-t细胞4周后rip-tag2肿瘤的共聚焦成像。成像显示cd34+(car转导的)t细胞在肿瘤中累积。
图29显示用car-(或模拟-)工程化t细胞处理的riptag2肿瘤的组织学分析。图29a显示car-t细胞处理的肿瘤中血管密度降低，如通过内皮标志物meca32的染色所示。图29b显示了car细胞处理的肿瘤相对于模拟t细胞处理的肿瘤中的血管密度的汇总。图29c和d显示用car转导的t细胞处理的小鼠显示肿瘤中凋亡血管的增加，如通过胱天蛋白酶3染色指示。图29e和f显示用car转导的t细胞处理的小鼠显示肿瘤血管系统中纤维蛋白原染色的减少。
图30显示了人肿瘤组织阵列中clec14a表达的进一步表征，其计算表达clec14a的肿瘤内血管的百分比。n＝针对每种癌症类型研究的病例数。每个病例用圆圈表示，水平线显示每种癌症类型的均值百分比值+sem。
图31显示了用crt4car转导t细胞。
图32显示了第一代和第代crt1cart细胞两者均可以介导表达clec14a的cho细胞的细胞裂解。
图33显示了表达第一代和第二代crt-1car构建体的t细胞的增殖活性。
图34显示了表达第一代和第二代crt-1car构建体的t细胞响应于表达人clec14a的cho细胞的干扰素γ释放活性(已经扣除对单独cho细胞的响应)。数据显示从7次重复实验产生的ifnγ的平均浓度(+sem)。
图35显示了表达第一代和第二代crt-1car构建体的t细胞响应人或小鼠clec14a-fc融合蛋白(或单独的fc蛋白)的干扰素γ释放活性。
图36显示逆转录病毒tcr基因转移到人t细胞中和转导后人pbmc中的tcr表达。使用抗cd3抗体，il-7和il-2进行外周血淋巴细胞活化，然后在三天后用逆转录病毒载体(编码wt1特异性tcr)进行转导。在第6天，使用tcr-v-β2.1抗体监测tcr表达。使用模拟转导的t细胞显示表达v-β2.1的未操作的人t细胞的百分比。转导后cd8阴性和cd8阳性t细胞两者均具有增加的v-β2.1细胞百分比。
图37显示通过用呈递wt126肽的t2细胞重复刺激tcr转导的t细胞，实现表达v-β2.1的cd8阳性t细胞的扩增。因此，在抗原刺激后发生cd8+-vb2.1+t细胞的增加。
图38显示hla-a2/pwt126四聚体和tcr转导的t细胞一起染色。
图39显示用tcr转导的t细胞能够杀死呈递wt126肽的t2细胞但非呈递pwt235肽的t2细胞。转导的t细胞还进一步杀死内源性表达wt1的hla-a2bv173白血病细胞。因此，tcr转导的整体(bulk)t细胞显示pwt126特异性杀伤活性。
图40显示呈递wt126肽的hla-a2阳性t2细胞被纯化的tcr转导的cd8阳性t细胞杀死，但是用wt235肽包被的t2细胞未被杀死。此外，cd8阳性转导的t细胞还杀死内源性表达wt1的hla-a2bv173白血病细胞。因此，转导的cd8+t细胞显示pwt126特异性杀伤活性。(图解-未填充的正方形＝t2+pwt235，填充的菱形＝t2+pwt126，未填充的圆＝bv173)。
图41显示少量纯化的cd4阳性转导的t细胞与hla-a2/pwt126四聚体一起染色。
图42显示呈递wt126肽的hla-a2阳性t2细胞被纯化的tcr转导的cd4阳性t细胞杀死，但是用wt235肽包被的t2细胞未被杀死。此外，cd4阳性转导的t细胞还杀死内源性表达wt1的hla-a2bv173白血病细胞。
图43显示在用wt126包被的hla-a2阳性t2细胞刺激后纯化的tcr-转导的cd8阳性细胞，而不是用pwt235肽包被的等同细胞产生ifn-γ。在用内源性表达wt1的hla-a2阳性bv173白血病细胞刺激后，cd8阳性转导的t细胞也产生ifn-γ。因此，tcr转导的cd8+t细胞显示pwt126特异性ifnγ产生。
图44显示crt5car不阻碍荷瘤小鼠皮肤伤口的愈合。
图45显示用对照(n＝5)或crt5car(具有cd28共刺激域)表达细胞处理后3周的pdac肿瘤体积。
图46显示了对滴定浓度的人和小鼠重组clec14a的crt1,3和5car(具有cd28共刺激域)t细胞应答。
图47显示了编码具有不同共刺激域的car的构建体的设计；1)tcd34-f2a-scfv-cd28tm-cd28信号-cd3zeta,2)tcd34-f2a-scfv-cd8tm-4-1bb信号-cd3zeta,3)tcd34-f2a-scfv-cd8tm-ox40信号-cd3zeta,4)tcd34-f2a-scfv-cd28tm-cd28信号-4-1bb信号–cd3zeta,5)tcd34-f2a-scfv-cd28tm-cd28信号-ox40信号-cd3zeta,6)tcd34-f2a-scfv-cd8tm-4-1bb信号–ox40信号-cd3zeta。包括tcd34以鉴定成功转导的细胞，因此构建体可以排除此物和f2a。可以另外包括铰链或间隔物区域，例如，来自cd8a的一个。
图48显示了用crt1,3和5car相对于表达clec14a的小鼠内皮细胞的细胞毒性测定结果(图48a)。crt1,3和5car的增殖测定的结果在图48b中显示。
图49显示了包含不同的共刺激域的crt3cart细胞的功能测试和响应于滴定数目的表达人clec14a的cho细胞的ifnγ产生。
图50显示用模拟(n＝5)或crt5car(cd28共刺激域)t细胞(n＝8)处理后3周的原位pdac肿瘤体积(p＝0.022；mannwhitney)。
图51显示在与工程化改造为表达clec14a嵌合体(a1-具有小鼠胞内域的人clec14a，b1-具有小鼠跨膜和胞内域的人clec14a，huclec-人clec14a)的293或send细胞温育后crt1,3和5car(cd28共刺激域)t细胞的ifnγ释放。与send细胞一起温育后，cart细胞的细胞毒性数据显示在图51b中。
图52显示了通过体外转录产生用于电穿孔的rna的合适载体的示意图。
图53显示可以用于转导鼠t细胞的编码car的构建体。构建体包含来自鼠蛋白的跨膜，共刺激和胞内信号传导序列(参见seqidno227-232)。构建体可以进一步包含来自鼠cd8α的铰链或间隔物域。
表1显示了序列
在上表中，氨基酸的名称为“x”表示在该位置可以不存在氨基酸。
实施例
实施例1：对clec14a的实验研究
材料和方法
huvec制备和培养
在捐赠者知情同意后，从英国国家卫生服务局(uknationalhealthservice)捐赠的脐带中分离人脐静脉内皮细胞(huvec)。从胎盘解剖脐带，并在无菌pbs中洗涤静脉以除去血液。将在m199培养基(sigma)中稀释的1mg/ml胶原酶注射到静脉中，然后在37℃下温育20分钟以分离内皮细胞。通过在含有10％fcs，10％大血管内皮细胞生长补充物(tcscellworks)和4mml-谷氨酰胺的m199完全培养基中洗涤来收集huvec，并在来自猪皮(sigma)包被的皿的0.1％1型明胶上铺板。
原代细胞来源
人主动脉平滑肌细胞(hasmc)和人支气管上皮细胞(hbe)购自tcscellworks。人肺成纤维细胞(mrc5)获自癌症研究英国中心服务局(cancerresearchukcentralservices)。人外周血单核细胞(pbmc)获自伯明翰大学癌症研究所。肝细胞是伯明翰大学免疫和感染学院davidadams教授的赠品。
huvec免疫荧光
在固定在冰冷甲醇中的玻璃微孔室(nunc)中培养huvec，用pbst清洗，在pbst中的10％fcs3％bsa中封闭。然后遵循用于石蜡包埋切片的相同方案用clec14a抗体染色或用针对人ve-钙粘蛋白的5μg/ml小鼠单克隆igg抗体(mariagrazialampugnani教授,fircinstituteformolecularoncology,milan友情赠送)共染色细胞。用510激光扫描共聚焦显微镜(carlzeiss)分析切片染色。
用clec14a单克隆抗体进行划痕伤口愈合测定
在汇合的huvec中用10μl移液管尖端产生划痕。应用新培养基，其含有1μg/ml或10μg/ml在小鼠中针对clec14a的胞外域产生的单克隆clec14a抗体。通过使用leicadm1000光学显微镜和usb2.02mxli照相机在0、4、6、12小时获取伤口闭合的图像来评估huvec的化学动力学迁移。使用imagej软件定量伤口的开放区域。
石蜡包埋组织上的免疫荧光
对从癌症研究英国组织学服务获得的石蜡包埋的正常和癌症人组织收集和癌症正常组织阵列(superbiochips)进行免疫荧光(数据未显示)。使用人常见癌症1(ma2)，包括以下每种癌症的10个核心：胃，食道，肺，结肠/直肠，甲状腺和肾脏，以及常见癌症2(mb3)，包括以下每种癌的10个核心：乳房，肝，膀胱，卵巢，胰腺和前列腺。还分析了匹配相邻正常组织的另外两个对照阵列。除去石蜡后，将组织再水合并在柠檬酸盐缓冲液ph6中在中等功率下微波处理3分钟以用于抗原修复。在含有10％fcs和3％bsa的pbst中封闭切片。用10μg/ml针对人clec14a的胞外域的绵羊igg多克隆一抗(r&d系统)和15μg/ml缀合有fitc的兔igg抗绵羊多克隆二抗(zymax)探测切片。用20μg/ml与罗丹明缀合的乌乐树(ulexeuropeaus)凝集素i(ueai)(vectorlabs)染色血管内皮细胞。用具有dapi的延长金抗褪色试剂(prolonggoldanti-fadereagent)(invitrogen)永久性封固载玻片以复染细胞核。使用510激光扫描共聚焦显微镜(carlzeiss)分析切片染色。
单克隆抗体的制备
用于制备单克隆抗体的抗原是鼠clec14a-fc(cm)和人clec14a-fc(ch)，任选地与佐剂蛋白(ap)缀合。使用以下方案将这四种抗原(cm，ch，cm-ap，ch-ap)用于小鼠免疫：
日操作
0采集免疫前样品
完全弗氏佐剂中100ug抗原的免疫(足垫)
14不完全弗氏佐剂中100ug抗原的免疫(足垫)
17测试出血
18腘淋巴结收获物，用于融合
针对三种抗原：cm，ch和fc通过elisa测试血清。采集非免疫血清作为阴性对照。
融合方案如下：
(1)从免疫小鼠收获腘淋巴结并均质化。
(2)用温热的dmem洗涤细胞。
(3)将细胞与sp2/0骨髓瘤细胞混合。
(4)将混合物离心(1000g)
(5)将沉淀物悬浮在50％peg1500中并温育1分钟。
(6)用温热的dmem缓慢稀释悬浮液。
(7)将悬浮液离心(1000g)。
(8)将细胞接种到具有腹膜巨噬细胞的平板中。
(9)将细胞在37℃和5％co2下培养
获得来自每只小鼠的超过500个hat抗性杂交瘤克隆。通过elisa针对三种吸收的抗原(cm，ch和fc)以4天间隔测试所有克隆上清液两次。测试产生5个克隆(所有亚类igg1)，其与cm和ch两者起反应并且不与fc起反应。通过有限稀释法将所有阳性克隆2-4倍，在培养瓶中繁殖并注射到小鼠中以得到腹水。由于用clec14a人(ch)免疫而得到3个克隆，1个克隆(crt-3)是用clec14a人-ap(ch-ap)免疫的结果，而1个克隆(crt-2)是用clec14a小鼠-ap(cm-ap)免疫的结果。
小管形成测定
用20μg/ml的crt2，crt3或crt4或igg同种型对照处理huvec。在16小时时取小管的图像并分析总小管长度，接合数目，分支数目，分支长度，网孔数目和总网孔面积。将实验重复三次，每次实验分析五个数据点。
结果
图2是显示clec14a在huvec和其他原代细胞中的相对表达的图。clec14a在内皮细胞中特异性表达。这确认了我们之前的发现，即clec14a是内皮特异性的(herbert等，2008)。
检测clec14a单克隆抗体抑制血管生成的能力。使用单克隆抗体进行划痕伤口愈合测定。如图3所示，与对照中的13％相比，当用10μg/ml单克隆抗体crt-3处理huvec时，25％的伤口区域在12小时时保持开放。这些结果显示clec14a抗体对内皮细胞迁移具有抑制作用。内皮细胞迁移是血管生成的必需特征。因此，该测定提供了clec14a抗体抑制血管生成的证据。
此外，小管形成测定显示通过用crt4处理显著增加分支的数目和总长度，并且crt4也显著减少每个场的网孔数目。这些结果提示crt4不影响管形成，但它影响管的连接。这可以通过增加分支的数目和长度来证明，指示小管相互连接不太好的。crt2和crt3处理产生小管长度的显著减少，并且接合和crt2的数目也显著减少每个野的网孔面积。因此，这些测定提供进一步的证据，即不同的clec14a抗体抑制血管生成(尽管通过对管形成具有不同的影响。
使用clec14a特异性探针检查clec14a在实体瘤和正常组织切片中的表达(数据未显示)。在分析的所有肿瘤组织的血管中看到clec14a表达。卵巢，膀胱，肝，乳腺，肾和前列腺肿瘤对clec14a表达呈强阳性，而胃，食道，肺，结肠，直肠，胰腺和甲状腺肿瘤组织显示较低水平的特异性clec14a表达。在任何相应的正常对照(非肿瘤)组织中未检测到clec14a表达。因此，已经证明clec14a在肿瘤血管系统中特异性表达。
实施例2：阻断clec14a-mmrn2结合抑制发芽血管生成和肿瘤生长
材料和方法
试剂
对western印迹法和免疫沉淀；一抗：绵羊多克隆抗人clec14a(r&dsystems)，小鼠单克隆抗人tubulin(sigma)，小鼠多克隆抗人mmrn2(abnova)；二抗：与辣根过氧化物酶(hrp)缀合的山羊多克隆抗小鼠igg(dako)，与hrp缀合的驴多克隆抗绵羊igg(r&d系统)。对于免疫荧光；一抗：兔多克隆抗鼠pecam(santacruz)；二抗：与alexafluor488(invitrogen)缀合的驴多克隆抗兔。对于流式细胞术；一抗：小鼠单克隆抗ha标签(cruk)，小鼠单克隆抗clec14a(如下文所述的c2，c4)；二抗：与alexafluor488(invitrogen)缀合的山羊多克隆抗小鼠igg。
质粒
对于蛋白质产生；使用慢病毒质粒pspax2(慢病毒包装；addgene)，pmd2g(包膜质粒；addgene)和pwpihclec14a-ecd-fc(含有ires-egfp的慢病毒哺乳动物表达质粒；addgene)。通过从clec14aimage克隆(origene)初始pcr亚克隆到pcdna3-fc质粒中产生pwpihclec14a-fc和mclec14a-fc。使用的引物如下：人clec14afwd5’tagtaggaattcgagagaatgaggccggcgttcgccctg3’(seqidno:4)；人clec14arev-5’agaaccgcggccgctggaggagtcgaaagcctgaggagt3’(seqidno:5)；鼠clec14afwd-5’tagtaggaattcgagagaatgaggccagcgcttgccctg3’(seqidno:6；鼠clec14arev-5’ctactagcggccgctcgtggaagaggtgtcgaaagt3’(seqidno:7)。使用ecor1和not1限制性位点插入clec14a。进行另一轮pcr亚克隆以转移clec14a-fc融合到pwpi中。使用的引物如下：人clec14a，fwd-5’tagtagttaattaagagagaatgaggccggcgttc3’(seqidno:8)；鼠clec14afwd-5’tagtagttaattaagagagaatgaggccagcgctt3’(seqidno:9)；人fcrev-5’ctactagtttaaactcatttacccggagacaggga3’(seqidno:10)。对于该步骤，使用pad和pme1限制性位点。
通过使用以下引物从mmrn2image克隆(thermo)pcr克隆到phl-avitag3构建mmrn2哺乳动物表达质粒：fwd–ccggaccggtcaggcttccagtactagcc(seqidno:11)；rev–cggggtaccggtcttaaacatcaggaagc(seqidno:12)。使用age1和kpn1限制酶。
细胞培养
如前所述分离人脐静脉内皮细胞。在获得知情同意的情况下从birminghamwomen'shealthcarenhstrust获得脐带。在第1-6代之间使用huvec，并在含有10％胎牛血清(paa)，1％牛脑提取物，90μg/ml肝素和4mml-谷氨酰胺，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素(invitrogen)的m199完全培养基(cm199)中培养，并且在用来自猪皮的0.1％1型明胶中包被的平板上接种。将hek293t细胞在含有10％胎牛血清(paa)，4mml-谷氨酰胺，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素(invitrogen)的dmem(sigma)完全培养基(cdmem)中培养。
如前所述进行huvec中的sirna转染。通过用上述慢病毒包装，包膜和表达质粒瞬时转染，在hek293t细胞中产生慢病毒。将质粒在optimem(invitrogen)中与聚乙烯亚胺(36μg/ml)以1:4比率在室温下温育10分钟，然后加入到cdmem中的hek293t细胞。使用培养基上清液来转导新鲜的hek293t细胞。分选gfp阳性hek293t细胞并用于蛋白质生产。使用phl-avitag3hmmrn2通过如上的聚乙烯亚胺瞬时转染实现mmrn2在hek293t细胞中的表达。
定量pcr
使用high-capacitycdnaarchive试剂盒(appliedbiosystems)从1μg提取的总rna制备cdna。用expressqpcrsupermix(invitrogen)在rg-3000(corbett/qiagen，manchester，uk)热循环仪上进行qpcr反应。人clec14a和flotillin-2的引物如前所述。小鼠clec14a5'utr，cds和3'utr和鼠β-肌动蛋白的引物如下：5’utrfwd–ttccttttccagggtttgtg(seqidno:13)；5’utrrev–gcctacaaggtggcttgaat(seqidno:14)；cdsfwd–aagctgtgctcctgctcttg(seqidno:15；cdsrev–tcctgagtgcactgtgagatg(seqidno:16)；3’utrfwd–ctgtagagggcggtgacttt(seqidno17)；3’utrrev–agctgctcccaagtcctct(seqidno:18)；mactbfwd–ctaaggccaaccgtgaaaag(seqidno:19)；mactbrev–accagaggcatacagggaca(seqidno:20)。根据效率调节数学模型计算相对表达比率。
蛋白质印迹法和免疫沉淀
制备全细胞蛋白质裂解物并且进行共免疫沉淀实验，如前所述，只是从2x107个huvec中提取蛋白质。对于clec14a相互作用蛋白的初始分离，使用5μgclec14a-fc或等摩尔量的hfc。对于内源性免疫沉淀实验，使用0.4μg抗clec14a抗体或绵羊igg。对于阻断实验，将5μgclec14a-fc或hfc与蛋白g珠在pbs中结合过夜。将珠在含有20％fcs(paa)的pbs中封闭5-6小时。用结合缓冲液中增加浓度的migg，c2或c4过夜封闭结合的clec14a-fc或hfc蛋白。然后将来自mmrn2转染的hek293t细胞的裂解物与珠复合物一起温育过夜，然后洗涤并通过western印迹分析。标准方案用于western印迹法和sds-page。如文中所示使用一抗与相应的缀合有hrp的二抗。
流式细胞术
用细胞解离缓冲液(invitrogen)分离细胞，在pbs中漂洗，然后在封闭缓冲液(pbs，3％bsa，1％nan3)中温育15分钟。随后使用封闭缓冲液中10μg/ml抗ha标签(cruk)，10μg/ml抗clec14a(下文描述的c2，c4)作为第一抗体染色30分钟。将细胞在pbs中漂洗并用在封闭缓冲液中与alexafluor488(invitrogen)缀合的山羊多克隆抗小鼠igg染色。使用facscalibur装置(bectondickinson，oxford，uk)收集数据(15,000个事件/样品)，并用bectondickinsoncellquest软件分析结果。
huvec球状体发芽测定和体外基质胶管形成测定
每个球状体使用1000个huvec，如前所述进行huvec球状体的产生和胶原凝胶中内皮发芽的诱导。在包埋后16小时进行定量。为了量化芽生长，计算芽数目，评估累积芽长度和最大芽长度。对于两个颜色发芽实验，用橙色和绿色celltracker染料(invitrogen)预标记huvec。24小时后，将球状体固定在4％甲醛中，并用vectorshield(vectorlabs)封固。用axioskop2显微镜和axiovisionse64rel4.8软件(zeiss，cambridge，uk)对载玻片成像。
对于基质胶管形成测定，将1.4x105个huvec接种到12孔板中的70μl基底膜提取物(matrigel，bdbioscience，oxford，uk)上。16小时后，使用leicadmil显微镜(leica，miltonkeynes，uk)和usb2.02mxli数码照相机(xlimagingllc，carrollton，tx，usa)以10x放大率拍摄每孔5个视野的图像。使用imagej(carpentierg.等.,angiogenesisanalyzerforimagej.4thimagejuseranddeveloperconferenceproceedings)并且在nih网址(http://imagej.nih.gov/ij/macros/toolsets/angiogenesis％20analyzer.txt)可获得的血管生成分析仪插件分析图像。
蛋白质生产
收集来自表达clec14a-fc的hek293t细胞的培养基(cm)。使cm流过hitrap蛋白ahp柱(gehealthcare，amersham，uk)，并使用0-100％梯度的100mm柠檬酸钠(ph3)洗脱蛋白质，然后用1mtris碱中和。在sds-pag上运行级分，并通过考马斯染色和western印迹法评估蛋白质纯度和特异性。将含有相似浓度蛋白质的级分组合，并在功能测定之前在pbs中透析。
单克隆抗体产生
小鼠单克隆抗体由serotecltd(oxford，uk)商业制备，使用我们提供的破坏耐受性的以下方案进行。以50μg在完全弗氏佐剂中皮下给予纯化的小鼠clec14a-fc融合蛋白。两周后，对小鼠皮下给予另50μg，但这次是在弗氏佐剂中。将小鼠宰杀并在两周后收获脾脏用于融合。
产生clec14a-/-小鼠
将小鼠圈养在birminghambiomedicalservicesunit(birmingham,uk)。含有clec14a缺失盒(clec14atm1(komp)vlcg；项目idvg10554)的c57bl/6nvgb6饲养细胞依赖性胚胎干细胞从knockoutmouseproject(universityofcalifornia，davis，usa)获得。
伯明翰大学的转基因小鼠房通过将胚胎干细胞注射到白化c57bl/6小鼠中而产生嵌合小鼠，并与c57bl/6雌性育种以产生对于盒杂合的小鼠。动物维护有适当的内政部批准和许可。
主动脉环和鼠皮下海绵血管生成测定
分离主动脉并加工用于胶原中的主动脉环测定。定量管/芽长出，最大内皮迁移和总内皮长出。如前所述进行鼠皮下海绵血管生成测定，稍作修改。在第0天，在每个体侧的背部皮肤下向雄性c57黑色小鼠植入皮下无菌聚醚海绵盘(10x5x5mm)。每隔一天通过皮肤直接注射100μlbfgf(40ng/ml；r&dsystems)到海绵中达14天。在第14天切除海绵，在10％福尔马林中固定，并石蜡包埋。切片用苏木精和曙红染色，使用leicamz16显微镜(leica，miltonkeynes，uk)和usb2.02mxli数码照相机(xlimagingllc，carrollton，tx，usa)在1倍放大率下拍摄海绵横截面用于细胞侵入分析。分析通过leicadme显微镜(leica，miltonkeynes，uk)在40x放大率下捕获的图像的血管密度。在每个海绵的每个切片的五个场中评估血管计数。所有动物实验均按照rb持有的内政部许可证号ppl40/3339进行。
肿瘤植入测定
在8-10周龄时，将106个lewis肺癌细胞皮下注射到雄性小鼠的体侧中。通过每日卡尺测量监测肿瘤生长，并且在生长2-4周后，通过重量确定肿瘤质量，在4％pfa中固定，石蜡包埋并且以6μm切割连续切片。
免疫荧光和x-gal染色
使用本领域已知的方法进行免疫荧光染色和x-gal染色。
结果
clec14a在体外调节发芽血管生成
先前已经显示了clec14a参与体外内皮迁移和管形成。为了研究clec14a在体外发芽血管生成中的作用，从靶向clec14a的sirna或非互补sirna双链体处理的huvec产生huvec球状体。通过qpcr在三个实验间以74％的平均降低(图5a)在mrna水平上以及通过用抗clec14a多克隆抗血清探测的蛋白质提取物的western印迹分析在蛋白质水平上(图5b)确认clec14a表达的敲低。来自clec14a敲低球状体的vegf诱导的发芽受到损伤，与对照细胞的13.2个相比，敲低球状体平均产生每个球状体的6.9个芽(图5c和5d)。为了确定clec14a在尖端/茎细胞形成中的作用，在球体形成和诱导发芽之前，将对照huvec和敲低的huvec染成红色或绿色并混合(图5e)。与对照细胞(67％)相比，clec14a的敲低降低尖端位置处细胞的百分比(33％)，然而，对源自clec14a敲低的huvec的茎细胞的百分比没有影响(图5f)。这些数据提示clec14a在芽起始和迁移中起作用。
clec14a调节体内发芽血管生成
先前发表的clec14a数据已证明其在体外内皮生物学中的作用，但尚未报告其体内作用。为了研究clec14a的体内和离体作用，产生小鼠以用lacz报告物替换clec14a编码序列(图6a)。杂合子(clec14a-/+)的育种产生相等比例的雄性和雌性小鼠(分别为49.5％/50.5％)和野生型:杂合子:纯合子小鼠的孟德尔比率(分别为26.4％:47.2％:26.4％)。由于clec14a是内皮细胞限制性基因，因此从clec14a+/+和clec14a-/-小鼠中分离出主动脉。通过qpcr分析提取的cdna并确认clec14a编码区的丧失，但保留5'和3'非翻译区的表达(图6b)。通过肺组织裂解物的western印迹分析也确认蛋白质水平的clec14a丧失(图6c)。
为了确认clec14a在多细胞三维共培养中发芽血管生成中的作用，分离主动脉，切成环并包埋在胶原中。vegf刺激细胞长出，并在内皮发芽的终点定量前7天内监测。同样，clec14a的丧失损害内皮芽长出和迁移(图6d)。与对clec14a敲除小鼠的观察相比，来自野生型小鼠的主动脉环产生管数目的超过倍增(与13.4个管相比30.6个管)(图6e)。此外，最大迁移(其由远离每个主动脉环的最远距离定义)在敲除培养物中也减少(图6f)。为了评估clec14a是否在体内具有相似的功能，将海绵桶皮下植入clec14a敲除小鼠中。每两天使用bfgf注射到海绵中刺激细胞浸润和新血管生成，持续两周。用苏木精和曙红染色的海绵切片的宏观分析揭示在clec14a-/-动物中细胞对海绵的浸润受损(图6g和6h)。此外，clec14a-/-动物的血管供应显著降低(p<0.01)(图6i)。为了确认在该模型中作为新血管生成血管衬里的内皮细胞表达clec14a，用x-gal染色来自clec14ako小鼠的海绵和肝脏。与匹配的肝切片相比，在海绵内的血管上观察到强x-gal染色(图6j)。从这些数据，我们可以得出结论，小鼠clec14a表达在体内和体外调节内皮迁移和血管生成发芽，并且clec14a在发芽内皮上上调。
clec14a促进肿瘤生长
发现与来自健康组织的血管相比，clec14a表达在人肿瘤血管上高度上调，提示癌症疗法可以靶向clec14a。因此，为了研究clec14a的丧失是否实现肿瘤生长，我们使用同源lewis肺癌(llc)模型。对于这点，将1x106个llc细胞皮下注射到clec14a+/+或clec14a-/-小鼠的右体侧中。与clec14a+/+同窝小鼠相比，clec14a-/-小鼠中的肿瘤生长受损(图7a)。这通过三次独立实验得到确认。自clec14a-/-小鼠采集的切除的肿瘤比clec14a+/+同窝小鼠尺寸更小(图7b)并且重量更小(图7c)。为了确定这些肿瘤内的血管密度是否也受影响，用抗cd31抗体染色组织切片。分析显示离散血管的密度降低(图7d和7e)和内皮覆盖百分比降低(图7f)。此外，自clec14a-/-小鼠采集的肿瘤和肝脏切片的x-gal染色揭示具有充满红细胞的管腔的成熟血管(图3g，黑色箭头)和肿瘤内未成熟的微血管(图7g，红色箭头)两者上clec14a的高表达，确认clec14a在肿瘤血管上上调。
鉴定和确认clec14a-mmrn2相互作用
为了鉴定clec14a的胞外域的潜在结合配偶体，我们首先纯化用人fc标记的clec14a胞外域蛋白。将该蛋白质或单独的fc与huvec全细胞裂解物一起温育，并使用蛋白a琼脂糖珠沉淀。然后洗涤沉淀的蛋白质并在sds-pag上分离。切下七个凝胶区域，消化并通过质谱术分析。鉴定的最丰富的蛋白质是具有12种肽的mmrn2(11种独特的)，并且在相应的对照下拉级分中没有肽。沉淀物的western印迹分析确认在clec14a-ecd-fc下拉中存在mmrn2，并且在单独的fc下拉中未检测到(图8a)。为了进一步确认此相互作用，将内源性clec14a从huvec全细胞裂解物中免疫沉淀。蛋白质印迹分析确认clec14a沉淀物中的mmrn2共沉淀，但在igg对照中未检测到(图8b)。
开发和验证clec14a单克隆抗体
为了进一步了解clec14a，我们接下来产生交叉物种反应性抗体。为了实现这点，在hek293t细胞中表达具有人fc标签的鼠clec14a蛋白，并在蛋白a柱上纯化。然后在完全弗氏佐剂的情况下用50μgmclec14a免疫小鼠以破坏耐受性。筛选克隆的针对人clec14a或人fc的活性。为了确认克隆能识别细胞结合的clec14a，用克隆c2或c4或单克隆ha标签抗体染色过表达ha-clec14a的hek293t细胞。fac分析显示与对照转染的细胞相比，ha-clec14a过表达细胞中的每种抗体的荧光增加(数据未显示)。为了确认抗体识别clec14a的内源形式，将这些克隆用于染色用对照或clec14a靶向性sirna处理的huvec。通过克隆c2和c4强烈染色对照huvec，并通过敲低clec14a将该染色降低至同种型对照水平(数据未显示)。这些结果确认clec14a单克隆抗体的特异性。
为了确定c2和c4克隆是否与clec14a的相同区域结合，在c2-fitc染色之前用bsa，c2或c4抗体预处理huvec。c2温育有效阻断c2-fitc染色，但c4具有较小的影响。
在c4-fitc染色之前重复相同的预处理。c2抗体不影响c4-fitc染色，然而，用c4预处理的huvec显示c4-fitc的结合降低。从这些结果我们可以得出结论，c2和c4结合clec14a的离散区域。
clec14a单克隆抗体阻断clec14a-mmrn2结合
为了确定这些clec14a单克隆抗体中的任一种是否可以抑制mmrn2与clec14a的结合，在与来自过表达mmrn2的hek293t细胞的裂解物温育之前，将clec14a-ecd-fc与递增浓度的migg1或c2或c4预温育。然后分离沉淀物并探测mmrn2或clec14a-ecd-fc。观察到用migg1或c2封闭的clec14a-ecd-fc沉淀物的mmrn2结合，但在c4封闭的沉淀物中未观察到mmrn2结合。这确认c4而非c2单克隆抗体阻断mmrn2与clec14a的结合。(数据未显示)
clec14a-mmrn2阻断性抗体抑制肿瘤生长
每周两次用10μgc4或migg1(对照)腹膜内注射具有llc肿瘤的小鼠持续整个实验。与对照migg1处理组相比，用c4抗体处理的小鼠的肿瘤生长减慢(图9a)。来自c4处理的小鼠的肿瘤尺寸(图9b)和体重(图9c)小于对照动物。我们再次检查这些肿瘤内的血管密度。用抗cd31抗体染色组织切片，并且荧光分析揭示降低的离散血管密度(图9d和9e)和百分比内皮覆盖(图9f)，提示clec14a与mmrn2的结合是肿瘤诱导的血管生成的重要功能组分。
讨论
clec14a是促成多种肿瘤类型的肿瘤血管生成的一小组内皮基因之一。在这里，我们证明通过clec14a的丧失，肿瘤生长在体内被抑制(图7)。对于其他肿瘤内皮标志物，例如tem8，内皮因子(endoglin)，半乳凝素(galectin)，eltd1和内皮唾液酸蛋白也观察到类似的表型，并且这证明这些肿瘤内皮表达基因在血管化和肿瘤生长中的重要性。
已经在人肿瘤和胰腺癌和宫颈癌的鼠模型中观察到clec14a的上调，这支持了clec14a表达在llc模型中的肿瘤血管上调的发现(图7)。已经显示clec14a调节内皮生物学的多个方面，包括粘附，迁移，管形成，并且结果显示它对于体外和体内发芽血管生成也是重要的(图5和6)。我们可以推断clec14a的此作用是通过内皮-内皮相互作用或内皮-细胞外基质相互作用，因为体外huvec发芽受到clec14a敲低的干扰，提示其他细胞类型的存在是可有可无的。我们还首次观察到皮下海绵测定中新血管生成血管上clec14a表达的上调(图6)。这是预期的，因为已经建模新形成的内皮芽以经历从分叉点的4.2μm到芽的尖端的极低剪切应力(0.2pa)，并且已知clec14a表达被低剪切应力上调。
已经通过使用clec14a的胞外域从huvec裂解物中下拉蛋白质以及内源蛋白质的共免疫沉淀来显示clec14a与mmrn2的相互作用(图8)。通过clec14a单克隆抗体的产生和验证，我们鉴定了两种与clec14a的离散区域(c2和c4)结合的抗体，并且已经显示c4克隆而非c2克隆阻断clec14a与mmrn2的相互作用。为了探测clec14a-mmrn2相互作用的功能，我们在基质胶管形成测定中使用c4抗体，并且发现分支增加和演化网孔的减少。进一步发现clec14a-mmrn2相互作用对于肿瘤生长是重要的(图9)，c4处理重现肿瘤生长并且降低肿瘤血管供应，如clec14a-/-小鼠中所见(图7)。尽管在该实施例中未鉴定配体或活性模式，但这是第一次显示clec14a和特异性细胞外相互作用对肿瘤生长是重要的，并且提示迄今为止的通向新的抗血管生成疗法的途径。
实施例3clec14a单克隆抗体c1，c4和c5阻断clec14a-mmrn2相互作用
为了确定哪些clec14a单克隆抗体可以抑制mmrn2与clec14a的结合，在与来自过表达mmrn2的hek293t细胞的裂解物温育之前，将clec14a-ecd-fc与递增浓度的migg1或cr1-5预温育。然后分离沉淀物并探测mmrn2或clec14a-ecd-fc。对于用migg1或c2和c3封闭的clec14a-ecd-fc沉淀物观察到mmrn2结合，但在c1、4和5封闭的沉淀物中未观察到mmrn2结合。这确认抗体c1、4和5在与c2和3单克隆抗体结合的表位不同的表位上结合clec14a，因此特异性阻断mmrn2与clec14a的相互作用。
实施例4mmrn2结合域和crt抗体的定位
1)mmrn2与ctld或sushi域或clec14a结合
mmrn2与clec14a的结合被缩小至clec14a的ctld或sushi域。可能的是在没有域缺失中存在的ctld或sushi域的情况下，clec14a不是正确折叠的，导致它不再与mmrn2(或crt抗体)结合。这是使用图11中显示的用mmrn2进行远western印迹的clec14a的缺失构建体找出的。
2)crt抗体与clec的ctld域结合而不与sushi结合
为了进一步确定ctld或sushi是否是结合域并确保正确折叠，用与血栓调节蛋白(也称为cd141)(不结合mmrn2的14型ctld家族成员)的那些域交换的ctld或sushi域制备clec14a的嵌合构建体。
嵌合体5(具有cd141的ctld的clec14a)和嵌合体6(具有cd141的sushi的clec14a)的序列显示在图12中。
使用流式细胞术分析crt抗体的结合。所有构建体都具有c末端gfp标签，因此将绿色细胞门控并染成红色。所有crt抗体结合wtclec14a，并且如预期，无一结合wtcd141(图13)。此外，抗体无一与嵌合体5结合(除crt2的轻微结合外)并且所有抗体都结合嵌合体6(除crt2外)(图13)。这确认了抗体crt1、3、4和5以及mmrn2的结合位点在c型凝集素域内。crt2可能在ctld和sushi域之间的区域上结合。
3)阻断mmrn相互作用的crt抗体不结合wo2013/187724中规定的区域，而是结合包含clec14actld的aa97-108的区域。
为了进一步确定抗体和mmrn2的结合区，制备嵌合环构建体。这是基于clec14actld的结构预测以及wo2013/187724抗体结合的区域。
具有cd141的区域1-42的clec14a
cd141序列–mlgvlvlgalalaglgfpapaepqpggsqcvehdcfalypgp(seqidno.21)
具有cd141的区域97-108的clec14a
cd141序列–qlppgcgdpkrl(seqidno.22)
具有cd141的区域122-142的clec14a
cd141序列–tsysrwarldlngaplcgpl(seqidno.23)
图12中显示了比对。不幸的是，1-42和122-142嵌合体不正确折叠。认为这是由于下述事实：它们存在于细胞表面上(clec14a多克隆抗体阳性染色，但它们对于任何c抗体不染色，c2甚至也不。
然而，97-108嵌合体确实结合c2和c3，显示该突变体是正确折叠的。该突变体不结合mmrn2或c1、4或5(其是认为阻断clec14a-mmrn2相互作用的抗体)(图15)。因此，我们得出结论，结合域依赖于含有以下残基的环：errrschtlene(seqidno:24)。
残基97-108与来自血栓调节蛋白的相应区域交换。这导致正确的折叠，因为c2和c3仍然可以结合(图16)。然而，c1，c4和c5不能识别该突变体，提示这是结合区。
该实验重复三次，结果相同。
实施例5-抗体药物缀合物肿瘤数据
对6-8周龄的野生型雄性c57bl6小鼠在右体侧中皮下注射1x106个lewis肺癌(llc)细胞。一旦肿瘤达到可触知的大小，将小鼠随机分配到每个处理组，b12-adc或c4-adc/crt3-adc。小鼠每隔1周接受1mg/kg对尾静脉的两次静脉内注射。在最终注射后一周，将小鼠扑杀，切除肿瘤并测量湿重。图17a和b中显示了数据。
用crt-3adc处理huvec，并进行荧光成像以确定0和90分钟后crt-3的定位。在图18a中显示结果。此外，使用celltitreglo发光细胞存活力测定法测量细胞毒性，并且在图18b中显示结果。如上所述，将100万个lewis肺癌细胞皮下注射到2只小鼠的右体侧中并允许生长至可见大小。通过尾静脉注射施用1mg/kg的crts-adc或b12-adc(对照)。观察小鼠一小时并在24小时后扑杀。
结果
图18a中所示的结果证明crt3-adc是内化的。用crt3-adc进一步处理24小时对小鼠的整体健康没有影响。仅在crt3-adc处理的小鼠而不是对照中观察到肿瘤部位的广泛出血，证明血管生成的肿瘤特异性破坏。
实施例6-car构建和实验
材料和方法
生成car构建体
如noy等人(blockingclec14a-mmrn2bindinginhibitssproutingangiogenesisandtumourgrowth.oncogene.2015)所述，获得表达与蛋白质的人和小鼠形式交叉反应的clec14a特异性单克隆抗体的杂交瘤。然后通过使用简并引物组的rt-pcr从每个小鼠杂交瘤中分离编码scfv的基因构建体，所述简并引物组设计为扩增所有小鼠v基因家族，如先前记载于hawkins等人(idiotypicvaccinationagainsthumanb-celllymphoma.rescueofvariableregiongenesequencesfrombiopsymaterialforassemblyassingle-chainfvpersonalvaccines.blood.1994；83(11):3279-88。
然后，将scfv基因以clai，noti片段亚克隆到两个先前描述的car载体pmp71.tcd34.2a.cd19ζ和pmp71.tcd34.2a.cd19.ievζ(cheadle等,j.immunol.,2014,192(8),3654-65)，替换cd19特异性scfv区域。最初使用mp71逆转录病毒表达质粒(来自c.baum，hannover的友情赠品)构建这些载体，并共表达截短的cd34标志物基因(fehse等,molther.,2000；1c5pt1:448-56)。
人和小鼠t细胞的转导
为了产生用于转导人t细胞的重组逆转录病毒，根据制造商的说明书，使用fugenehd(roche)，用mp71逆转录病毒载体和pclampho(imgenex)转染phoenix兼向性包装细胞。以相同的方式，但使用phoenix同向性(ecotropic)包装细胞和pcleco产生用于转导小鼠t细胞的重组逆转录病毒。通过在lymphoprep(axisshield，oslo，norway)上的密度梯度离心从肝素化血液中分离人外周血单个核细胞(pbmc)。使用抗cd3抗体(okt3，ebioscience；30ng/ml)，抗cd28抗体(r&dsystems；30ng/ml)和白细胞介素-2(il2；300u/ml；chiron，emeryville，ca)使用标准培养基(含有10％胎牛血清(fbs；paa，paschingaustria)，2mml-谷氨酰胺，100iu/ml青霉素和100pg/ml链霉素)的rpmi1640(sigma))加1％人ab血清(tcsbiosciences，buckingham，uk)预活化pbmc达48小时。使用小鼠脾细胞转导小鼠t细胞，所述小鼠脾细胞用标准培养基中的伴刀豆球蛋白a(2ug/ml；sigma)和小鼠白细胞介素7(1ng/ml；ebioscience)预活化48小时。随后根据制造商的说明书，在retronectin(takara)包被的板中通过旋转转染(spinfection)转导(或用来自未转染的phoenix细胞的条件化上清液模拟转导)预活化的人和小鼠t细胞。然后将人t细胞在含有il2(100u/ml)的标准培养基加1％人ab血清中培养。在旋转感染后，将小鼠t细胞在含有il2(100u/ml)的标准培养基中培养24小时，然后使用lymphoprep(axisshield)纯化。在指出的情况下，根据制造商的说明书，使用抗cd34微珠(miltenyibiotec，germany)通过免疫磁性选择富集转导的细胞。nationalresearchethicsservicecommitteewestmidlands(solihull)批准了对人捐赠者的研究，并且所有捐赠者给出书面知情同意书。
细胞系和重组蛋白
将phoenixa或e，cho和lewis肺癌细胞维持在含有10％胎牛血清(fbs；paa，paschingaustria)，2mml-谷氨酰胺，100iu/ml青霉素和100pg/ml链霉素的dulbecco改良eagle培养基(dmem)中。用表达全长人clec14a的pwpi载体(addgene)(或单独的载体)转导cho细胞。如前所述，使用从birminghamwomen’shealthcarenhstrust获得的脐带在知情同意和southbirminghamresearchethicscommittee的伦理批准下分离人脐静脉内皮细胞(huvec)。将huvec维持在含有10％fbs，4mml-谷氨酰胺，10％大血管内皮细胞生长补充物(tcscellworks)的m199完全培养基中，并在用来自猪皮的0.1％1型明胶(sigma)包被的平板中培养。将具有人fc标签的人和鼠clec14a蛋白在hek293t细胞中表达，并在蛋白a柱上纯化，如noy等(同上)中所述。
clec14a的sirna敲低
使用以下sirna双链体如前所述(armstrong等,arteriosclerosis,thrombosisandvascularbiology,2008,28(9):1640-6)进行sirna转染：d1-gaacaagacaattcagtaa(seqidno.30)和d2-caatcagggtcgacgagaa(seqidno.31)(eurogentec,liege,belgium)。
流式细胞术
将huvec用胰蛋白酶处理并在冰上用5％正常山羊血清/pbs中的上述clec14a特异性小鼠单克隆抗体(10ug/ml)或1gg1同种型对照(dako)染色1小时。洗涤细胞并通过与缀合有r-pe的山羊抗小鼠抗体(serotec)一起温育来检测结合的抗体。通过用碘化丙啶染色鉴定死细胞。用pbs洗涤人t细胞，并在黑暗中用活/死可固定的紫罗兰死细胞染色试剂盒(lifetechnologies)染色20分钟。然后用流动缓冲液(pbs中的0.5％w/vbsa+2mmedta；ph7.2)洗涤细胞，并用抗人cd4(缀合有pe)，抗人cd8(缀合有fitc)(均来自bdpharmingen)和抗人cd34(pe-cy5)(biolegend)在黑暗中在冰上染色30分钟。或者，不同于针对cd34染色，通过首先用人fc片段(10ug/ml)封闭细胞，然后将其与10ug/ml重组人clec14a-fc融合蛋白(或fc对照)一起温育，然后与绵羊抗clec14a多克隆抗体(r&dsystems，10ug/ml)温育，直接检测car表达。最后，用缀合有fitc的兔抗棉羊抗体(invitrogen，1:10稀释)染色细胞。所有温育均在冰上进行1小时。
当染色来自肝素化尾部出血的小鼠t细胞时，它们首先进行使用bdpharmlyse(bectondickinson)的红细胞裂解，然后如上所述，但使用抗小鼠cd4-fitc，cd8-pe和cd45.1(缀合有pe-cy7)(均为bdbiosciences)染色。使用bdlsrii流式细胞仪和flowjo软件(treestarinc，ashland，or)分析细胞。
cfse标记
用pbs洗涤t细胞两次，并且与2.5μm羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)在37℃下温育10分钟。通过加入含有10％fbs的rpmi-1640淬灭标记反应。洗涤细胞，以1.5x106个细胞/ml重悬于标准培养基加1％人ab血清和il2(10iu/ml)中，并加入到含有huvec的孔中以给出t细胞:huvec比率10:1。在37℃/5％co2下温育5天后，使用抗人cd34(pe-cy5)通过如上所述的流式细胞术分析细胞。
ifnγ释放测定
以指定的响应者:刺激物比率将刺激物细胞(2.5x104/孔)与cd34+car-t细胞一式三份共培养。或者，将2x104个cd34+car-t细胞在用重组蛋白(1μg/ml)预包被的孔中温育。将细胞在37℃/5％co2下在100μl/孔的补充有il2(25u/ml)的标准培养基中温育。18小时后，根据制造商的说明书，使用elisa(pierceendogen，rockford，il)测试培养上清液的分泌ifnγ。
细胞毒性测定
先前已详细描述铬释放测定。它们以已知的效应器:靶物比率(1250个靶物/孔)建立并在7.5小时后收获。
体内实验
毒性测试
6至8周龄的c57bl6小鼠(charlesriverlaboratories)接受4gy全身照射(tbi)。18小时后，对每只小鼠的尾静脉注射2x107个car或模拟转导的来自cd45.1+同源boyj小鼠的t细胞制备物。监测小鼠的毒性体征，并通过每周尾部出血进行免疫监测。最后在45天后扑杀小鼠并取出主要器官进行组织学分析。
riptag2转基因小鼠肿瘤模型
先前已经报道了rip-tag2小鼠的产生作为胰岛细胞癌发生的模型(hanahan等,nature,1985,315(6015),115-122)。将rip-tag2小鼠维持在c57bl/6j背景(thejacksonlaboratory)上。将冷冻保存的car转导的和模拟转导的t细胞解冻，洗涤，并且在单一时段中对12周龄的小鼠将1500万t细胞/小鼠静脉内注射到尾静脉中，所述小鼠在前一天已经用4gytbi调理。从12周龄开始，所有rip-tag2小鼠接受50％糖食物(harlanteklad)以缓解胰岛素分泌肿瘤诱导的低血糖症。使用卡尺测量在16周龄时量化扑杀的car-t细胞处理的小鼠中的总肿瘤负荷，以使用以下公式测量单独切除的宏观肿瘤(>1mm3)：体积＝axb2x0.52，其中a和b代表肿瘤的较长的和较短的直径。加入来自每只小鼠的所有肿瘤的体积，以给出每只动物的总肿瘤负荷。对于16周car处理的小鼠，没有年龄匹配的对照比较，因为未处理的rip-tag2小鼠不能存活至16周，因此与14周龄模拟处理的小鼠进行比较。
lewis肺癌(llc)小鼠模型
在体侧中对6-8周龄雌性c57bl6小鼠皮下接种106个llc细胞。三天后，小鼠接受4gytbi，并且18小时后，对每只小鼠的尾静脉中注射来自cd45.1+同类boyj小鼠的2x107个car或模拟t细胞制备物。用卡尺(使用公式：体积＝长度x宽度2x0.5)和生物发光成像(msspectrum，caliperlifesciences)测量肿瘤生长。通过每周尾部出血进行免疫监测。所有使用riptag2小鼠的程序均由都灵大学伦理委员会(ethicscommitteeoftheuniversityofturin)和意大利卫生部(italianministryofhealth)批准，符合国际法律和政策。所有其他小鼠研究均在英国内政部批准的情况下进行。
组织制备和免疫荧光分析
将来自小鼠实验的组织在oct(biooptica)中包埋，在干冰中冷冻并储存在-80℃。如(24)所述用以下一抗进行组织制备和组织学分析：纯化的大鼠单克隆抗-泛内皮细胞抗原(550563，克隆meca32，bdpharmingen，usa)，以1:100稀释；兔单克隆抗切割胱天蛋白酶3(asp175，克隆5a1，cellsignaling，usa)，1:100稀释；兔多克隆抗纤维蛋白原(a0080，dako)，以1:100稀释；和以1:50稀释的兔单克隆抗cd34(ab174720，abcam)；以1:50稀释的绵羊多克隆抗clec14a(af4968，r&d)。温育和洗涤后，将样品与二抗抗兔抗alexafluor-488和alexafluor-555一起温育；抗大鼠alexafluor-488和alexafluor-555；和抗绵羊alexafluor-488(molecularprobes)并用dapi核酸染剂(invitrogen)复染。为了检测car转导的t细胞，用在pbs中1:50稀释的兔单克隆抗cd34(ab174720，abcam)染色组织。温育和洗涤后，用抗兔alexafluor-555(molecularprobes)染色样品并用dapi复染。
使用1:20稀释的绵羊多克隆抗clec14a(af4968，r&d系统)和与罗丹明(vectorlabs，uk)缀合的乌乐树凝集素i染色人肿瘤组织阵列(superbiochipsinc.，seoul，korea)1小时，然后使用抗羊fitc抗体(10μg/ml，invitrogen，uk)染色。
对于riptag2肿瘤组织的分析，通过imagej软件将血管占据的表面积定量为meca32阳性结构占据的面积，与通过dapi可视化的总组织面积进行比较。对于每只动物，量化至少四个视野/图像的总血管面积。为了确定每个图像中的纤维蛋白原外渗量(红色通道)，我们在每个血管附近绘制感兴趣区域(roi)(meca32，绿色通道)，然后使用leica共聚焦软件直方图量化工具量化红色和绿色通道的平均荧光强度(mfi)。为了使得到的血管数值标准化，我们计算红色和绿色通道mfi之间的比率；值表示为红绿共染色的百分比。为了确定每个分析图像中胱天蛋白酶3(绿色通道)的表达水平，我们考虑了5个相同大小的随机roi。然后我们测量了绿色通道的mfi，我们通过比较胱天蛋白酶3染色区域与组织区域中存在的总细胞来标准化数值。对每个样品分析每个处理组5只小鼠的至少10张图像。使用leicatcssp2aobs共聚焦激光扫描显微镜(leicamicrosystems)分析来自riptag2小鼠的组织。使用axiovert100m激光扫描共聚焦显微镜(carlzeiss，welwyngardencity，uk)分析所有其他组织。
统计分析
使用指示的检验和graphpadprism软件进行数据的统计分析。p值<0.05被认为是显著的。
结果
已经使用crt1、3、4和5成功制备了car构建体，并且已经证明了这些car构建体在细胞上的表达(参见图19b和c，图22和图31)。因此，产生共表达截短的cd34标志物基因和scfv片段/cd3ζ链嵌合受体的逆转录病毒car载体(基于pmp71)。表达由ltr启动子驱动，并且2a肽接头确保cd34和car两者的等摩尔表达。第二代car构建体包括cd28共刺激域。如图19b所示，cd34染色显示用包含crt3和5的载体(第一代和第二代两者)成功转导t细胞。对于使用clec14a-fc针对car表达直接染色的细胞，可以得到类似的结果(％值显示clec14a-fc的特异性结合，其中扣除用单独fc的背景染色)。
此外，图20中的数据显示，经转导以表达基于抗体crt3或5的第一代或第二代car的t细胞可以在体外响应clec14a。显示了平板结合蛋白，在工程化cho细胞上表达的蛋白质或在huvec中表达的蛋白质的结果，其中响应于存在的clec14a，在所有三个实验中用car转导的t细胞可以看到ifnγ产生。
测试基于抗体crt3和5的car在choclec14a表达细胞中诱导细胞毒性的能力(图21a)，其中在暴露于具有carcrt3/5的t细胞的细胞中可以看到％特异性裂解的增加。此外，当与huvec一起培养时，cd34+t细胞的增殖显示crt3和5第一代和第二代cart细胞两者在此类培养条件下增殖(即由于暴露于表达clec14a的huvec)。因此，crt3/5cart细胞能够响应表达clec14a的细胞，导致t细胞的增殖和细胞的特异性裂解。
基于crt1抗体的car还显示针对clec14a表达靶物的活性。特别地，显示第二代crt1cart细胞响应于在工程化改造为表达clec14a的cho细胞和huvec上表达的clec14a(通过ifnγ释放测量)。此外，显示第一代和第二代crt1cart细胞在choclec14a表达细胞中诱导特异性裂解(参见图22)。图32至35进一步显示当用crt1-car转导时对clec14a的t细胞应答和由此类转导的t细胞诱导的％裂解。
将第一代或第二代crt3和5种cart细胞注射到c57/bl6小鼠中以确定cart细胞对健康小鼠的毒性。监测小鼠45天并且没有显示出明显的毒性体征。图23显示在此时间期间小鼠的体重增加，并且每周尾部出血指示cart细胞在注射后持续至少5周并且在此时间期间它们占总循环t细胞群的至少30％。在实验结束时收获的脾细胞仍然能够响应clec14a(小鼠和人两者)。此外，如图24所示，几种组织(脑，心脏，肺，肝，结肠和肾)的组织学分析未显示输注第二代crt3/5cart细胞的小鼠的病理学。
在先前已注射100万个lewis肺癌细胞的c57bl6小鼠中测试基于crt3或crt5抗体的第二代car的抗肿瘤效果。将用car构建体转导的t细胞注射到小鼠的尾静脉(2000万t细胞)中并监测肿瘤生长。从图25中可以看出，注射crt3或5第二代cart细胞的小鼠具有比对照小鼠更小体积的肿瘤，证明了cart细胞的抗肿瘤作用。此外，图26显示注射crt3或5第二代cart细胞的小鼠的平均肿瘤重量减少，血管密度降低和血管渗漏水平增加。
将第二代crt5cart细胞注射到rip-tag2小鼠中，其中大鼠胰岛素启动子将sv40大t抗原转基因的表达导向胰岛的β细胞，在10周龄左右导致肿瘤并且到第14周导致死亡。从图27中可以看出，与未处理或模拟t细胞对照小鼠相比，注射cart细胞的小鼠的肿瘤大小显著降低。此外，图28显示在静脉内注射后4周，car转导的t细胞在rip-tag2肿瘤中累积。
来自用car工程化t细胞处理的小鼠的riptag2肿瘤的组织学分析显示，与用模拟t细胞处理的小鼠相比，血管密度降低，凋亡血管增加并且纤维蛋白原染色降低(图29)。
实施例7-对wt1衍生肽pwt126(rmfpnapyl)特异性的功能活性tcr
已经克隆了对由hla-a2i类分子呈递的wilms肿瘤抗原-1(wt1)的肽rmfpnapyl(wt126)特异性的tcr。wt1转录因子在各种人恶性中表达，包括白血病，乳腺癌，结肠癌，肺癌，卵巢癌等。ctl(从所述ctl中克隆tcr)显示针对表达wt1的人癌细胞的杀伤活性，而非针对表达针对表达生理水平wt1的正常人细胞的杀伤活性。
治疗目标是通过转移编码tcr的基因为患者t细胞提供此类有力且特异性的杀伤活性。为此，已将tcr基因插入逆转录病毒载体中，并且已经证明基因转导的人t细胞显示出针对表达wt1的人癌症和白血病细胞系的杀伤活性。该ctl系的特异性概况已在若干研究论文中描述，并且可以概括为：(1)用wt1衍生的肽pwt126包被的hla-a2阳性靶物的杀伤(gaoetal(2000)blood95,2198-2203)；(2)表达wt1的新鲜hla-a2阳性白血病细胞的杀伤(gaoetal(2000)blood95,2198-2203)；(3)hla-a2阳性白血病cfu祖细胞的杀伤(gaoetal(2000)blood95,2198-2203；bellantuonoetal(2002)100,3835-3837)；(4)hla-a2阳性白血病ltc-ic干细胞的杀伤(bellantuonoetal(2002)blood100,3835-3837)；(5)hla-a2阳性nod/scid白血病起始细胞的杀伤(gaoetal(2003)transplantation75,1429-1436)；(6)正常hla-a2阳性nod/scid移植造血干细胞的无杀伤(gaoetal(2003)transplantation75,1429-1436)。现在已经显示了用wt1特异性tcr转导的人t细胞显示出与克隆tcr的ctl系相似的特异性。
在图36至43的图例中详细描述的数据指示tcr基因转移到人t细胞中是可行的，并且它导致引入的tcr链的表面表达。接受体t细胞显示针对用pwt126肽包被的hla-a2阳性靶物的杀伤活性。tcr转导的t细胞还杀死内源性表达wt1的人肿瘤细胞。此外，转导的t细胞以hla-a2限制的肽特异性方式产生ifn-γ。最后，转移的tcr可以在cd4阳性辅助t细胞中发挥功能。这些cd4阳性t细胞显示出hla-a2限制的抗原特异性杀伤活性和抗原特异性细胞因子产生(未显示)。这指示tcr基因转移可以用于对cd8阳性和cd4阳性人t细胞两者赋予hlai类限制性抗原特异性效应器功能。
方法
细胞系
t2是与抗原加工(tap)缺陷的人hla-a2+细胞系相关的转运蛋白，其可以有效地加载外源肽。bv173细胞系由患有cml的男性患者的外周血建立。所有细胞在rpmi加10％fcs中于37℃培养。
合成肽和hla-a2/肽复合物四聚体
pwt126(rmfpnapyl)和pwt235(cmtwnqmnl)是源自人wt1的hla-a2结合肽。将pwt126溶解在pbs中，并且将pwt235溶解在dmso中，然后在pbs中稀释以给出2mm的浓度。
逆转录病毒tcr构建体和tcr基因的转导
从同种限制性(allo-restricted)的pwt126特异性人ctl系77中分离wt1特异性tcrα和β基因。为了克隆tcr基因，从ctl系77中提取总rna，并逆转录成cdna。与一组恒定引物组合使用结合可变α和β基因两者的共有引物扩增cdna。然后使用noti和ecori限制性位点将分离的tcrvα或vβ基因克隆到pmp71逆转录病毒载体中。
将2x106个兼向性包装细胞接种到t25烧瓶中，并且24小时后用磷酸钙沉淀用逆转录病毒tcr构建体瞬时转染。在准备转导中，使用抗cd3抗体和il-2活化pbmc2天。然后将活化的t细胞(3x106)重悬浮于3ml正常生长培养基加上从转染的包装细胞收获的3ml病毒上清液中，并在用纤连蛋白包被的6孔板中铺板。将平板在37℃，5％co2下温育，并且转导后24至48小时，进行tcr转基因的表达。
ifnγ分泌测定
用5x104个白血病细胞或肽包被的t2细胞(1:1比例)在96孔板中一式三份刺激tcr转导的t细胞(5x104)。温育24小时后，收获上清液，并使用人ifnγ测定试剂盒(amsbiotechnology)在干扰素γ酶联免疫吸附测定(elisa)中测试。
实施例8：患者的选择和治疗
自具有wt1表达恶性的hla-a2阳性患者采集外周血单个核细胞(pbmc)。用添加到培养物或珠上的抗cd3/cd28抗体活化pbmc达3天，然后如实施例1所述用编码逆转录病毒颗粒的tcr转导。在第5天，我们可以证明转导的cd4和cd8t细胞表达导入的tcr。在第6天，我们可以证明转导的t细胞的抗原特异性活性。在第6天，将转导的t细胞再输注入患者中。
实施例9：荷瘤小鼠的伤口愈合
在第0天，对小鼠皮下注射1x106个lewis肺癌细胞，并在第3天用4gy照射。在第3天，给小鼠静脉内注射13x106个模拟(n＝7)或cart细胞(n＝7)(crt5car)。细胞为31％cd4+(93％cd34+)和43％cd8+(62％cd34+)。观察伤口愈合7天。
图44中的结果显示与用模拟转导的t细胞处理的类似小鼠相比，表达crt5car的小鼠t细胞不阻碍荷瘤小鼠中的皮肤伤口的愈合。
实施例10：pdac小鼠模型中的crt5car
将k-rasg12d；ink4a/arf-/-；p53r172h细胞注射到同系免疫感受态小鼠的胰腺中以产生pdac小鼠模型，其是胰腺癌的小鼠模型。来自该小鼠模型的肿瘤染色显示clec14a在大多数肿瘤血管上表达。用crt5cart细胞(其中car包含来自cd28的共刺激域)处理pdac小鼠导致治疗后3周显著的肿瘤控制(图45)。可以在图50中看到来自另外的实验的结果。
实施例11：crt1、3和5针对clec14a的滴度
将clec14a以fc融合蛋白表达以与crt1、3和5car(cd28共刺激域)t细胞温育。用模拟t细胞稀释所有car-t细胞系以在转导效率方面均衡。可以在图46中看到结果，其中显示所有测试的cart细胞良好响应clec14a(显示的数据是一式三份培养物平均值+sd)。
实施例12：crt1、3和5cart细胞的细胞毒性和增殖测定
使用crt1、3和5car(具有cd28共刺激域)t细胞进行细胞毒性研究。用模拟t细胞稀释t细胞以在转导效率方面均衡，并与表达人clec14a的小鼠内皮细胞一起温育。在图48a中显示结果，其证明所有三种测试的car均可介导细胞毒性。显示的数据是一式三份培养物的均值+sd。
此外，用板结合的重组clec14a-fc融合蛋白刺激的crt1、3和5car(cd28共刺激域)t细胞进行增殖测定(cfse标记)。用模拟t细胞稀释所有cart细胞系以在转导效率方面均衡，并且图48b中可以看到结果，其中所有三种测试的car在刺激后都能够增殖。显示的数据仅关于cd8+t细胞，但获得关于cd4+t细胞的类似数据。
实施例13：具有不同共刺激和跨膜区的car
使用逆转录病毒载体已经将以下car克隆并转染到来自单一供体的t细胞中：
1)crt3-cd28tm-cd28costim信号-cd3(crt3.28z)
2)crt3-cd8tm-4-1bbcostim信号-cd3(crt3.bbz)
3)crt3-cd28tm-cd28和4-1bbcostim信号-cd3(crt3.28bbz)
4)crt3-cd28tm-cd28和ox40costim信号-cd3(crt3.28oxz)
5)crt3-cd8tm-4-1bb和ox40costim信号-cd3(crt3.bboxz)
产生的所有构建体均良好地转导到t细胞中。在体外评估不同构建体的功能，分析细胞因子产生，细胞毒性和增殖响应(参见图49)。细胞因子释放指示强抗原特异性应答，特别是由表达crt3.28z和crt3.280xz的t细胞产生。通过测量响应滴定数目的表达人clec14a(或仅载体对照)的cho细胞的ifnγ产生来分析细胞因子的产生。用模拟t细胞稀释所有cart细胞系以在转导效率方面均衡。显示的数据是一式三份培养物的均值+sd。针对工程化改造为表达clec14a的小鼠内皮细胞(send)测量细胞毒活性，并在用平板结合的重组clec14a-fc融合蛋白刺激后测量增殖响应(数据未显示)。
实施例14：用嵌合clec14a刺激后测定从cart细胞释放的细胞因子
在293和send细胞中表达含有人序列但具有小鼠来源的跨膜和/或胞内域的clec14a的嵌合形式。使用从慢病毒载体共表达的gfp分选这些细胞以在clec表达方面均衡，然后使用cart细胞(具有cd28共刺激域的crt1、3和5)进行测试。在将cart细胞与293和send细胞两者一起温育后测量ifnγ的释放。可以在图51中看到结果。另外，测定了与表达clec14a嵌合体的send细胞一起温育时t细胞的细胞毒性。用模拟t细胞稀释所有cart细胞系以在转导效率方面均衡。显示的数据是一式三份培养物的平均值。
从图51中可以看出，所有测试的crt1、3和5cart细胞导致从表达人clec14a(huclec)、具有小鼠胞内域的人clec14a(a1)和具有小鼠跨膜和胞内域的人clec14a(b1)的293和send细胞释放ifnγ。
序列表
<110>癌症研究技术有限公司
伯明翰大学
细胞治疗飞跃有限责任公司
<120>嵌合抗原受体
<130>16/0002/ja
<160>232
<170>patentinversion3.5
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<213>智人
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agtgctggggagagatattttcttatgtttattcggagaatttggagaagtgattgaact2100
tttcaagacattggaaacaaatagaacacaatataatttacattaaaaaataatttctac2160
caaaatggaaaggaaatgttctatgttgttcaggctaggagtatattggttcgaaatccc2220
agggaaaaaaataaaaataaaaaattaaaggattgt2256
<210>3
<211>1473
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>clec14acds
<400>3
atgaggccggcgttcgccctgtgcctcctctggcaggcgctctggcccgggccgggcggc60
ggcgaacaccccactgccgaccgtgctggctgctcggcctcgggggcctgctacagcctg120
caccacgctaccatgaagcggcaggcggccgaggaggcctgcatcctgcgaggtggggcg180
ctcagcaccgtgcgtgcgggcgccgagctgcgcgctgtgctcgcgctcctgcgggcaggc240
ccagggcccggagggggctccaaagacctgctgttctgggtcgcactggagcgcaggcgt300
tcccactgcaccctggagaacgagcctttgcggggtttctcctggctgtcctccgacccc360
ggcggtctcgaaagcgacacgctgcagtgggtggaggagccccaacgctcctgcaccgcg420
cggagatgcgcggtactccaggccaccggtggggtcgagcccgcaggctggaaggagatg480
cgatgccacctgcgcgccaacggctacctgtgcaagtaccagtttgaggtcttgtgtcct540
gcgccgcgccccggggccgcctctaacttgagctatcgcgcgcccttccagctgcacagc600
gccgctctggacttcagtccacctgggaccgaggtgagtgcgctctgccggggacagctc660
ccgatctcagttacttgcatcgcggacgaaatcggcgctcgctgggacaaactctcgggc720
gatgtgttgtgtccctgccccgggaggtacctccgtgctggcaaatgcgcagagctccct780
aactgcctagacgacttgggaggctttgcctgcgaatgtgctacgggcttcgagctgggg840
aaggacggccgctcttgtgtgaccagtggggaaggacagccgacccttggggggaccggg900
gtgcccaccaggcgcccgccggccactgcaaccagccccgtgccgcagagaacatggcca960
atcagggtcgacgagaagctgggagagacaccacttgtccctgaacaagacaattcagta1020
acatctattcctgagattcctcgatggggatcacagagcacgatgtctacccttcaaatg1080
tcccttcaagccgagtcaaaggccactatcaccccatcagggagcgtgatttccaagttt1140
aattctacgacttcctctgccactcctcaggctttcgactcctcctctgccgtggtcttc1200
atatttgtgagcacagcagtagtagtgttggtgatcttgaccatgacagtactggggctt1260
gtcaagctctgctttcacgaaagcccctcttcccagccaaggaaggagtctatgggcccg1320
ccgggcctggagagtgatcctgagcccgctgctttgggctccagttctgcacattgcaca1380
aacaatggggtgaaagtcggggactgtgatctgcgggacagagcagagggtgccttgctg1440
gcggagtcccctcttggctctagtgatgcatag1473
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<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<210>5
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>人clec14a反向引物
<400>5
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<210>6
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>鼠clec14a正向引物
<400>6
tagtaggaattcgagagaatgaggccagcgcttgccctg39
<210>7
<211>36
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>鼠clec14a反向引物
<400>7
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<211>35
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>人clec14a正向引物
<400>8
tagtagttaattaagagagaatgaggccggcgttc35
<210>9
<211>35
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>鼠clec14a正向引物
<400>9
tagtagttaattaagagagaatgaggccagcgctt35
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<211>35
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>人fc反向引物
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<212>dna
<213>人工序列
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<211>29
<212>dna
<213>人工序列
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<212>dna
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<220>
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<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<210>16
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>cds反向引物
<400>16
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<211>20
<212>dna
<213>人工序列
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<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<210>19
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<212>dna
<213>人工序列
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<210>20
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<210>21
<211>39
<212>prt
<213>未知
<220>
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<400>21
metleuglyvalleuvalleuglyalaleualaleualaglyleugly
151015
pheproalaproalagluproglnproglyglyserglncysvalglu
202530
hisaspcysphealaleutyr
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<212>prt
<213>未知
<220>
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<400>22
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<211>20
<212>prt
<213>未知
<220>
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<400>23
thrsertyrserargtrpalaargleuaspleuasnglyalaproleu
151015
cysglyproleu
20
<210>24
<211>12
<212>prt
<213>未知
<220>
<223>人clec14a的残基97-108
<400>24
gluargargargsercyshisthrleugluasnglu
1510
<210>25
<211>169
<212>prt
<213>未知
<220>
<223>cd141的ctld
<400>25
metleuglyvalleuvalleuglyalaleualaleualaglyleugly
151015
pheproalaproalagluproglnproglyglyserglncysvalglu
202530
hisaspcysphealaleutyrproglyproalathrpheleuasnala
354045
serglnilecysaspglyleuargglyhisleumetthrvalargser
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65707580
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100105110
glyaspasnasnthrsertyrserargtrpalaargleuaspleuasn
115120125
glyalaproleucysglyproleucysvalalavalseralaalaglu
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145150155160
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<211>740
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>clec14a,cd141和gfp的嵌合体
<400>26
metleuglyvalleuvalleuglyalaleualaleualaglyleugly
151015
pheproalaproalagluproglnproglyglyserglncysvalglu
202530
hisaspcysphealaleutyrproglyproalathrpheleuasnala
354045
serglnilecysaspglyleuargglyhisleumetthrvalargser
505560
servalalaalaaspvalileserleuleuleuasnglyaspglygly
65707580
valglyargargargleutrpileglyleuglnleuproproglycys
859095
glyaspprolysargleuglyproleuargglypheglntrpvalthr
100105110
glyaspasnasnthrsertyrserargtrpalaargleuaspleuasn
115120125
glyalaproleucysglyproleucysvalalavalseralaalaglu
130135140
alathrvalprosergluproiletrpglugluglnglncysgluval
145150155160
lysalaaspglypheleucysglupheglnphegluvalleucyspro
165170175
alaproargproglyalaalaserasnleusertyrargalaprophe
180185190
glnleuhisseralaalaleuasppheserproproglythrgluval
195200205
seralaleucysargglyglnleuproileservalthrcysileala
210215220
aspgluileglyalaargtrpasplysleuserglyaspvalleucys
225230235240
procysproglyargtyrleuargalaglylyscysalagluleupro
245250255
asncysleuaspaspleuglyglyphealacysglucysalathrgly
260265270
phegluleuglylysaspglyargsercysvalthrserglyglugly
275280285
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290295300
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325330335
thrserileprogluileproargtrpglyserglnserthrmetser
340345350
thrleuglnmetserleuglnalagluserlysalathrilethrpro
355360365
serglyservalileserlyspheasnserthrthrserseralathr
370375380
proglnalapheaspserserseralavalvalpheilephevalser
385390395400
thralavalvalvalleuvalileleuthrmetthrvalleuglyleu
405410415
vallysleucysphehisgluserproserserglnproarglysglu
420425430
sermetglyproproglyleugluseraspprogluproalaalaleu
435440445
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465470475480
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485490495
proprovalalathrmetvalserlysglyglugluleuphethrgly
500505510
valvalproileleuvalgluleuaspglyaspvalasnglyhislys
515520525
pheservalserglygluglygluglyaspalathrtyrglylysleu
530535540
thrleulyspheilecysthrthrglylysleuprovalprotrppro
545550555560
thrleuvalthrthrleuthrtyrglyvalglncyspheserargtyr
565570575
proasphismetlysglnhisaspphephelysseralametproglu
580585590
glytyrvalglngluargthrilephephelysaspaspglyasntyr
595600605
lysthrargalagluvallysphegluglyaspthrleuvalasnarg
610615620
ilegluleulysglyileaspphelysgluaspglyasnileleugly
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645650655
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660665670
ilegluaspglyservalglnleualaasphistyrglnglnasnthr
675680685
proileglyaspglyprovalleuleuproaspasnhistyrleuser
690695700
thrglnseralaleuserlysaspproasnglulysargasphismet
705710715720
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725730735
gluleutyrlys
740
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<211>745
<212>prt
<213>人工序列
<220>
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metargproalaphealaleucysleuleutrpglnalaleutrppro
151015
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202530
alaserglyalacystyrserleuhishisalathrmetlysarggln
354045
alaalagluglualacysileleuargglyglyalaleuserthrval
505560
argalaglyalagluleuargalavalleualaleuleuargalagly
65707580
proglyproglyglyglyserlysaspleuleuphetrpvalalaleu
859095
gluargargargserhiscysthrleugluasngluproleuarggly
100105110
phesertrpleuserseraspproglyglyleugluseraspthrleu
115120125
glntrpvalglugluproglnargsercysthralaargargcysala
130135140
valleuglnalathrglyglyvalgluproalaglytrplysglumet
145150155160
argcyshisleuargalaasnglytyrleucyslystyrhisphepro
165170175
alathrcysargproleualavalgluproglyalaalaalaalaala
180185190
valserilethrtyrglythrprophealaalaargglyalaaspphe
195200205
glnalaleuprovalglyserseralaalavalalaproleuglyleu
210215220
glnleumetcysthralaproproglyalavalglnglyhistrpala
225230235240
argglualaproglyalacysproglyargtyrleuargalaglylys
245250255
cysalagluleuproasncysleuaspaspleuglyglyphealacys
260265270
glucysalathrglyphegluleuglylysaspglyargsercysval
275280285
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290295300
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305310315320
proileargvalaspglulysleuglygluthrproleuvalproglu
325330335
glnaspasnservalthrserileprogluileproargtrpglyser
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glnserthrmetserthrleuglnmetserleuglnalagluserlys
355360365
alathrilethrproserglyservalileserlyspheasnserthr
370375380
thrserseralathrproglnalapheaspserserseralavalval
385390395400
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405410415
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420425430
glnproarglysglusermetglyproproglyleugluserasppro
435440445
gluproalaalaleuglyserserseralahiscysthrasnasngly
450455460
vallysvalglyaspcysaspleuargaspargalagluglyalaleu
465470475480
leualagluserproleuglyserseraspalaleuglnserthrval
485490495
proargalaargaspproprovalalathrmetvalserlysglyglu
500505510
gluleuphethrglyvalvalproileleuvalgluleuaspglyasp
515520525
valasnglyhislyspheservalserglygluglygluglyaspala
530535540
thrtyrglylysleuthrleulyspheilecysthrthrglylysleu
545550555560
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565570575
cyspheserargtyrproasphismetlysglnhisaspphephelys
580585590
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595600605
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645650655
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675680685
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asnhistyrleuserthrglnseralaleuserlysaspproasnglu
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lysargasphismetvalleuleugluphevalthralaalaglyile
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<212>prt
<213>未知
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metileleuserleuleupheserleuglyglyproleuglytrpgly
151015
leuleuglyalatrpalaglnalaserserthrserleuseraspleu
202530
glnserserargthrproglyvaltrplysalaglualagluaspthr
354045
glylysaspprovalglyargasntrpcysprotyrprometserlys
505560
leuvalthrleuleualaleucyslysthrglulyspheleuilehis
65707580
serglnglnprocysproglnglyalaproaspcysglnlysvallys
859095
valmettyrargmetalahislysprovaltyrglnvallysglnlys
100105110
valleuthrserleualatrpargcyscysproglytyrthrglypro
115120125
asncysgluhishisaspsermetalaileprogluproalaasppro
130135140
glyaspserhisglngluproglnaspglyprovalserphelyspro
145150155160
glyhisleualaalavalileasngluvalgluvalglnglnglugln
165170175
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180185190
aspserleuproglyleutrplysalaleuproglyasnleuthrala
195200205
alavalmetglualaasnglnthrglyhisglupheproaspargser
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leugluglnvalleuleuprohisvalaspthrpheleuglnvalhis
225230235240
pheserproiletrpargserpheasnglnserleuhisserleuthr
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ileserargvalglnaspseralavalalaargalaasppheglnglu
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290295300
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thrleuhisargserilesergluleuglnalaaspvalaspthrlys
325330335
leulysargleuhislysalaglnglualaproglythrasnglyser
340345350
leuvalleualathrproglyalaglyalaargprogluproaspser
355360365
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850855860
progluargglyvaltyrleuphealavalservalglupheglypro
865870875880
glyproglythrglyglnleuvalpheglyglyhishisargthrpro
885890895
valcysthrthrglyglnglyserglyserthralathrvalpheala
900905910
metalagluleuglnlysglygluargvaltrpphegluleuthrgln
915920925
glyserilethrlysargserleuserglythralapheglyglyphe
930935940
leumetphelysthr
945
<210>29
<211>2850
<212>dna
<213>未知
<220>
<223>mmrn2核苷酸
<400>29
atgatcctgagcttgctgttcagccttgggggccccctgggctgggggctgctgggggca60
tgggcccaggcttccagtactagcctctctgatctgcagagctccaggacacctggggtc120
tggaaggcagaggctgaggacaccggcaaggaccccgttggacgtaactggtgcccctac180
ccaatgtccaagctggtcaccttactagctctttgcaaaacagagaaattcctcatccac240
tcgcagcagccgtgtccgcagggagctccagactgccagaaagtcaaagtcatgtaccgc300
atggcccacaagccagtgtaccaggtcaagcagaaggtgctgacctctttggcctggagg360
tgctgccctggctacacgggccccaactgcgagcaccacgattccatggcaatccctgag420
cctgcagatcctggtgacagccaccaggaacctcaggatggaccagtcagcttcaaacct480
ggccaccttgctgcagtgatcaatgaggttgaggtgcaacaggaacagcaggaacatctg540
ctgggagatctccagaatgatgtgcaccgggtggcagacagcctgccaggcctgtggaaa600
gccctgcctggtaacctcacagctgcagtgatggaagcaaatcaaacagggcacgagttc660
cctgatagatccttggagcaggtgctgctaccccacgtggacaccttcctacaagtgcat720
ttcagccccatctggaggagctttaaccaaagcctgcacagccttacccaggccataaga780
aacctgtctcttgacgtggaggccaaccgccaggccatctccagagtccaggacagtgcc840
gtggccagggctgacttccaggagcttggtgccaaatttgaggccaaggtccaggagaac900
actcagagagtgggtcagctgcgacaggacgtggaggaccgcctgcacgcccagcacttt960
accctgcaccgctcgatctcagagctccaagccgatgtggacaccaaattgaagaggctg1020
cacaaggctcaggaggccccagggaccaatggcagtctggtgttggcaacgcctggggct1080
ggggcaaggcctgagccggacagcctgcaggccaggctgggccagctgcagaggaacctc1140
tcagagctgcacatgaccacggcccgcagggaggaggagttgcagtacaccctggaggac1200
atgagggccaccctgacccggcacgtggatgagatcaaggaactgtactccgaatcggac1260
gagactttcgatcagattagcaaggtggagcggcaggtggaggagctgcaggtgaaccac1320
acggcgctccgtgagctgcgcgtgatcctgatggagaagtctctgatcatggaggagaac1380
aaggaggaggtggagcggcagctcctggagctcaacctcacgctgcagcacctgcagggt1440
ggccatgccgacctcatcaagtacgtgaaggactgcaattgccagaagctctatttagac1500
ctggacgtcatccgggagggccagagggacgccacgcgtgccctggaggagacccaggtg1560
agcctggacgagcggcggcagctggacggctcctccctgcaggccctgcagaacgccgtg1620
gacgccgtgtcgctggccgtggacgcgcacaaagcggagggcgagcgggcgcgggcggcc1680
acgtcgcggctccggagccaagtgcaggcgctggatgacgaggtgggcgcgctgaaggcg1740
gccgcggccgaggcccgccacgaggtgcgccagctgcacagcgccttcgccgccctgctg1800
gaggacgcgctgcggcacgaggcggtgctggccgcgctcttcggggaggaggtgctggag1860
gagatgtctgagcagacgccgggaccgctgcccctgagctacgagcagatccgcgtggcc1920
ctgcaggacgccgctagcgggctgcaggagcaggcgctcggctgggacgagctggccgcc1980
cgagtgacggccctggagcaggcctcggagcccccgcggccggcagagcacctggagccc2040
agccacgacgcgggccgcgaggaggccgccaccaccgccctggccgggctggcgcgggag2100
ctccagagcctgagcaacgacgtcaagaatgtcgggcggtgctgcgaggctgaggccggg2160
gccggggccgcctccctcaacgcctcccttgacggcctccacaacgcactcttcgccact2220
cagcgcagcttggagcagcaccagcggctcttccacagcctctttgggaacttccaaggg2280
ctcatggaagccaacgtcagcctggacctggggaagctgcagaccatgctgagcaggaaa2340
gggaagaagcagcagaaagacctggaagctccccggaagagggacaagaaggaagcggag2400
cctttggtggacatacgggtcacagggcctgtgccaggtgccttgggcgcggcgctctgg2460
gaggcaggatcccctgtggccttctatgccagcttttcagaagggacggctgccctgcag2520
acagtgaagttcaacaccacatacatcaacattggcagcagctacttccctgaacatggc2580
tacttccgagcccctgagcgtggtgtctacctgtttgcagtgagcgttgaatttggccca2640
gggccaggcaccgggcagctggtgtttggaggtcaccatcggactccagtctgtaccact2700
gggcaggggagtggaagcacagcaacggtctttgccatggctgagctgcagaagggtgag2760
cgagtatggtttgagttaacccagggatcaataacaaagagaagcctgtcgggcactgca2820
tttgggggcttcctgatgtttaagacctga2850
<210>30
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>sirna双链体d1
<400>30
gaacaagacaattcagtaa19
<210>31
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>sirna双链体d2
<400>31
caatcagggtcgacgagaa19
<210>32
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的重链变体1的cdr1
<400>32
sersertyrtrpileglu
15
<210>33
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的重链变体的cdr2
<400>33
trpileglygluileleuproglyserglyserthrasn
1510
<210>34
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1重链变体1的cdr3
<400>34
alaargglyglyasptyraspgluglutyrtyrvalmetasp
1510
<210>35
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1轻链变体1的cdr1
<400>35
sertyrmettyrtrptyr
15
<210>36
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1轻链变体1的cdr2
<400>36
leuleuiletyraspthrserasnleuala
1510
<210>37
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1轻链变体1的cdr3
<400>37
glnglntrpsersertyrproleu
15
<210>38
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的重链变体1的cdr1
<400>38
agtagctactggatagag18
<210>39
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的重链变体1的cdr2
<400>39
tggattggagagattttacctggaagtggtagtactaat39
<210>40
<211>42
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的重链变体1的cdr3
<400>40
gcaagagggggggattacgacgaagaatactatgtcatggac42
<210>41
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的轻链变体1的cdr1
<400>41
agttacatgtactggtac18
<210>42
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的轻链变体1的cdr2
<400>42
ctcctgatttatgacacatccaacctggct30
<210>43
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的轻链变体1的cdr3
<400>43
cagcagtggagtagttacccgctc24
<210>44
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的重链变体2的cdr1
<400>44
glytyrthrphesersertyrtrp
15
<210>45
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的重链变体2的cdr2
<400>45
ileleuproglyserglyserthr
15
<210>46
<211>15
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的重链变体2的cdr3
<400>46
alaargglyglyasptyraspgluglutyrtyrvalmetasptyr
151015
<210>47
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的轻链变体2的cdr1
<400>47
serservalsertyr
15
<210>48
<211>108
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>ox40共刺激域的核苷酸序列
<400>48
agggaccagaggctgccccccgatgcccacaagccccctgggggaggcagtttccggacc60
cccatccaagaggagcaggccgacgcccactccaccctggccaagatc108
<210>49
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的轻链变体2的cdr3
<400>49
glnglntrpsersertyrproleuthr
15
<210>50
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的重链变体2的cdr1
<400>50
ggctacacattcagtagctactgg24
<210>51
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的重链变体2的cdr2
<400>51
attttacctggaagtggtagtact24
<210>52
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的重链变体2的cdr3
<400>52
gcaagagggggggattacgacgaagaatactatgtcatggactac45
<210>53
<211>15
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的轻链变体2的cdr1
<400>53
tcaagtgtaagttac15
<210>54
<211>204
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>cd28共刺激域的核苷酸序列
<400>54
ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtg60
gcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatg120
aacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccacca180
cgcgacttcgcagcctatcgctcc204
<210>55
<211>27
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1的轻链变体2的cdr3
<400>55
cagcagtggagtagttacccgctcacg27
<210>56
<211>122
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1重链蛋白
<400>56
metalagluvalglnleuglnglnserglyalagluleumetlyspro
151015
glyalaservallysilesercyslysalathrglytyrthrpheser
202530
sertyrtrpileglutrpvallysglnargproglyhisglyleuglu
354045
trpileglygluileleuproglyserglyserthrasntyrasnglu
505560
lysphelysglylysalathrphethralaaspthrserserasnthr
65707580
alatyrmetglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyr
859095
tyrcysalaargglyglyasptyraspgluglutyrtyrvalmetasp
100105110
tyrtrpglyglnglythrservalthrval
115120
<210>57
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1轻链蛋白
<400>57
glnilevalleuthrglnserproalailemetseralaserprogly
151015
glulysvalthrmetthrcysseralaserserservalsertyrmet
202530
tyrtrptyrglnglnlysproglyserserproargleuleuiletyr
354045
aspthrserasnleualaserglyvalprovalargpheserglyser
505560
glyserglythrsertyrserleuthrileserargmetglualaglu
65707580
aspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpsersertyrproleuthr
859095
pheglyalaglythrlysleugluleulysarg
100105
<210>58
<211>249
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1scfv蛋白
<400>58
metalagluvalglnleuglnglnserglyalagluleumetlyspro
151015
glyalaservallysilesercyslysalathrglytyrthrpheser
202530
sertyrtrpileglutrpvallysglnargproglyhisglyleuglu
354045
trpileglygluileleuproglyserglyserthrasntyrasnglu
505560
lysphelysglylysalathrphethralaaspthrserserasnthr
65707580
alatyrmetglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyr
859095
tyrcysalaargglyglyasptyraspgluglutyrtyrvalmetasp
100105110
tyrtrpglyglnglythrservalthrvalserserglyglyglygly
115120125
serglyglyglyglyserglyglyglyglyserglnilevalleuthr
130135140
glnserproalailemetseralaserproglyglulysvalthrmet
145150155160
thrcysseralaserserservalsertyrmettyrtrptyrglngln
165170175
lysproglyserserproargleuleuiletyraspthrserasnleu
180185190
alaserglyvalprovalargpheserglyserglyserglythrser
195200205
tyrserleuthrileserargmetglualagluaspalaalathrtyr
210215220
tyrcysglnglntrpsersertyrproleuthrpheglyalaglythr
225230235240
lysleugluleulysargalaalaala
245
<210>59
<211>366
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1重链核苷酸
<400>59
atggccgaggttcagcttcagcagtctggagctgagctgatgaagcctggggcctcagtg60
aagatatcctgcaaggctactggctacacattcagtagctactggatagagtgggtaaag120
cagaggcctggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaagtggtagtact180
aattacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagatacatcctccaacaca240
gcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtgcaaga300
gggggggattacgacgaagaatactatgtcatggactactggggtcaaggaacctcagtc360
actgtc366
<210>60
<211>321
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1轻链核苷酸
<400>60
caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcacc60
atgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgtactggtaccagcagaagccagga120
tcctcccccagactcctgatttatgacacatccaacctggcttctggagtccctgttcgc180
ttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaa240
gatgctgccacttattactgccagcagtggagtagttacccgctcacgttcggtgctggg300
accaagctggagctgaaacgt321
<210>61
<211>747
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1scfv核苷酸
<400>61
atggccgaggttcagcttcagcagtctggagctgagctgatgaagcctggggcctcagtg60
aagatatcctgcaaggctactggctacacattcagtagctactggatagagtgggtaaag120
cagaggcctggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaagtggtagtact180
aattacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagatacatcctccaacaca240
gcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtgcaaga300
gggggggattacgacgaagaatactatgtcatggactactggggtcaaggaacctcagtc360
actgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgcaa420
attgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatg480
acctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgtactggtaccagcagaagccaggatcc540
tcccccagactcctgatttatgacacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttc600
agtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagat660
gctgccacttattactgccagcagtggagtagttacccgctcacgttcggtgctgggacc720
aagctggagctgaaacgtgcggccgca747
<210>62
<211>493
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1car1蛋白
<400>62
metglyvalleuleuthrglnargthrleuleuserleuvalleuala
151015
leuleupheprosermetalasermetalagluvalglnleuglngln
202530
serglyalagluleumetlysproglyalaservallysilesercys
354045
lysalathrglytyrthrphesersertyrtrpileglutrpvallys
505560
glnargproglyhisglyleuglutrpileglygluileleuprogly
65707580
serglyserthrasntyrasnglulysphelysglylysalathrphe
859095
thralaaspthrserserasnthralatyrmetglnleuserserleu
100105110
thrsergluaspseralavaltyrtyrcysalaargglyglyasptyr
115120125
aspgluglutyrtyrvalmetasptyrtrpglyglnglythrserval
130135140
thrvalserserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglygly
145150155160
glyglyserglnilevalleuthrglnserproalailemetserala
165170175
serproglyglulysvalthrmetthrcysseralaserserserval
180185190
sertyrmettyrtrptyrglnglnlysproglyserserproargleu
195200205
leuiletyraspthrserasnleualaserglyvalprovalargphe
210215220
serglyserglyserglythrsertyrserleuthrileserargmet
225230235240
glualagluaspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpsersertyr
245250255
proleuthrpheglyalaglythrlysleugluleulysargalaala
260265270
alailegluvalmettyrproproprotyrleuaspasnglulysser
275280285
asnglythrileilehisvallysglylyshisleucysproserpro
290295300
leupheproglyproserlysprophetrpvalleuvalvalvalgly
305310315320
glyvalleualacystyrserleuleuvalthrvalalapheileile
325330335
phetrpvalargserlysargserargleuleuhisserasptyrmet
340345350
asnmetthrproargargproglyprothrarglyshistyrglnpro
355360365
tyralaproproargaspphealaalatyrargserargvallysphe
370375380
serargseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasnglnleu
385390395400
tyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleuasp
405410415
lysargargglyargaspproglumetglyglylysproglnargarg
420425430
lysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmet
435440445
alaglualatyrsergluileglymetlysglygluargargarggly
450455460
lysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysasp
465470475480
thrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg
485490
<210>63
<211>1502
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1car1核苷酸
<400>63
atgggcgtgctgctgacccagaggaccctgctgagcctggtgctggccctgctgtttcca60
tctatggcatcgatggccgaggttcagcttcagcagtctggagctgagctgatgaagcct120
ggggcctcagtgaagatatcctgcaaggctactggctacacattcagtagctactggata180
gagtgggtaaagcagaggcctggacatggccttgagtggattggagagattttacctgga240
agtggtagtactaattacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagataca300
tcctccaacacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctat360
tactgtgcaagagggggggattacgacgaagaatactatgtcatggactactggggtcaa420
ggaacctcagtcactgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggt480
ggcggatcgcaaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggag540
aaggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgtactggtaccagcag600
aagccaggatcctcccccagactcctgatttatgacacatccaacctggcttctggagtc660
cctgttcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatg720
gaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagttacccgctcacgttc780
ggtgctgggaccaagctggagctgaaacgtgcggccgcaattgaagttatgtatcctcct840
ccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctt900
tgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggt960
ggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgagg1020
agtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccggg1080
cccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc1140
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctc1200
tataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggc1260
cgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtac1320
aatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgag1380
cgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggac1440
acctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaataaaagcttaacacgagc1500
ca1502
<210>64
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3重链变体1的cdr1
<400>64
thrsertyrtrpmethis
15
<210>65
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的重链变体1的cdr2
<400>65
trpileglyalailetyrproglyasnseraspthrser
1510
<210>66
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的重链变体1的cdr3
<400>66
thrhistyrtyrglyserasptyralametasp
1510
<210>67
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的轻链变体1的cdr1
<400>67
sersersertyrleuhistrptyr
15
<210>68
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的轻链变体1的cdr2
<400>68
leutrpiletyrserthrserasnleuala
1510
<210>69
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的轻链变体1的cdr3
<400>69
hisglntyrhisargserproarg
15
<210>70
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的重链变体1的cdr1
<400>70
accagctactggatgcac18
<210>71
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的重链变体1的cdr2
<400>71
tggattggcgctatttatcctggaaatagtgatactagc39
<210>72
<211>33
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的重链变体1的cdr3
<400>72
acacattactacggtagtgactatgctatggac33
<210>73
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的轻链变体1的cdr1
<400>73
agttccagttacttgcactggtac24
<210>74
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的轻链变体1的cdr2
<400>74
ctctggatttatagcacatccaacctggct30
<210>75
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的轻链变体1的cdr3
<400>75
ccaccagtatcatcgttccccacgg25
<210>76
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的重链变体2的cdr1
<400>76
glytyrthrphethrsertyrtrp
15
<210>77
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的重链变体2的cdr2
<400>77
iletyrproglyasnseraspthr
15
<210>78
<211>12
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的重链变体2的cdr3
<400>78
thrhistyrtyrglyserasptyralametasptyr
1510
<210>79
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的轻链变体2的cdr1
<400>79
serservalsersersertyr
15
<210>80
<211>126
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>41bb共刺激域的核苷酸序列
<400>80
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaa60
actactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgt120
gaactg126
<210>81
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的轻链变体2的cdr3
<400>81
hisglntyrhisargserproargthr
15
<210>82
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的重链变体2的cdr1
<400>82
ggctacacctttaccagctactgg24
<210>83
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的重链变体2的cdr2
<400>83
atttatcctggaaatagtgatact24
<210>84
<211>36
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的重链变体2的cdr3
<400>84
acacattactacggtagtgactatgctatggactac36
<210>85
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的轻链变体2的cdr1
<400>85
tcaagtgtaagttccagttac21
<210>86
<211>36
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>ox40共刺激域
<400>86
argaspglnargleuproproaspalahislysproproglyglygly
151015
serpheargthrproileglnglugluglnalaaspalahisserthr
202530
leualalysile
35
<210>87
<211>27
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3的轻链变体2的cdr3
<400>87
caccagtatcatcgttccccacggacg27
<210>88
<211>122
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3重链变体1
<400>88
metalagluvalglnleuglnglnserglythrvalleualaargpro
151015
glyalaservallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethr
202530
sertyrtrpmethistrpvallysglnargproglyglnglyleuglu
354045
trpileglyalailetyrproglyasnseraspthrsertyrasngln
505560
lysphelysglylysalalysleuthralavalthrserthrserthr
65707580
alatyrmetgluleuserserleuthrasngluaspseralavalphe
859095
tyrcysthrhistyrtyrglyserasptyralametasptyrtrpgly
100105110
glnglythrservalthrilesersergly
115120
<210>89
<211>111
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3轻链变体1
<400>89
glnilevalleuthrglnserproalailemetseralaserleugly
151015
gluargvalthrmetthrcysthralaserserservalserserser
202530
tyrleuhistrptyrglnglnlysproglyserserprolysleutrp
354045
iletyrserthrserasnleualaserglyvalproalaargpheser
505560
glyserglyserglythrsertyrserleuthrilesersermetglu
65707580
alagluaspalaalathrtyrtyrcyshisglntyrhisargserpro
859095
argthrpheglyglyglythrlysleugluilelysargalaala
100105110
<210>90
<211>119
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3重链变体2
<400>90
metalagluvalglnleuglnglnserglythrvalleualaargpro
151015
glyalaservallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethr
202530
sertyrtrpmethistrpvallysglnargproglyglnglyleuglu
354045
trpileglyalailetyrproglyasnseraspthrsertyrasngln
505560
lysphelysglylysalalysleuthralavalthrserthrserthr
65707580
alatyrmetgluleuserserleuthrasngluaspseralavalphe
859095
tyrcysthrhistyrtyrglyserasptyralametasptyrtrpgly
100105110
glnglythrservalthrval
115
<210>91
<211>112
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3轻链变体2
<400>91
glnilevalleuthrglnserproalailemetseralaserleugly
151015
gluargvalthrmetthrcysthralaserserservalserserser
202530
tyrleuhistrptyrglnglnlysproglyserserprolysleutrp
354045
iletyrserthrserasnleualaserglyvalproalaargpheser
505560
glyserglyserglythrsertyrserleuthrilesersermetglu
65707580
alagluaspalaalathrtyrtyrcyshisglntyrhisargserpro
859095
argthrpheglyglyglythrlysleugluilelysargalaalaala
100105110
<210>92
<211>363
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3重链变体1核苷酸序列
<400>92
atggccgaggtccagctgcagcagtctgggactgtgctggcaaggcctggggcttcagtg60
aagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttaccagctactggatgcactgggtaaaa120
cagaggcctggacagggtctggaatggattggcgctatttatcctggaaatagtgatact180
agctacaaccagaagttcaagggcaaggccaaactgactgcagtcacatccaccagcact240
gcctacatggagctcagcagcctgacaaatgaggactctgcggtcttttactgtacacat300
tactacggtagtgactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcactgtctcc360
tca363
<210>93
<211>335
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3轻链变体1核苷酸序列
<400>93
caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctctaggggaacgggtcacc60
atgacctgcactgccagctcaagtgtaagttccagttacttgcactggtaccagcagaag120
ccaggatcctcccccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccca180
gctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggag240
gctgaagatgctgccacttattactgccaccagtatcatcgttccccacggacgttcggt300
ggaggcaccaagctggaaatcaaacgtgcggccgc335
<210>94
<211>357
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3重链变体2核苷酸序列
<400>94
atggccgaggtccagctgcagcagtctgggactgtgctggcaaggcctggggcttcagtg60
aagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttaccagctactggatgcactgggtaaaa120
cagaggcctggacagggtctggaatggattggcgctatttatcctggaaatagtgatact180
agctacaaccagaagttcaagggcaaggccaaactgactgcagtcacatccaccagcact240
gcctacatggagctcagcagcctgacaaatgaggactctgcggtcttttactgtacacat300
tactacggtagtgactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcactgtc357
<210>95
<211>327
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3轻链变体2核苷酸序列
<400>95
caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctctaggggaacgggtcacc60
atgacctgcactgccagctcaagtgtaagttccagttacttgcactggtaccagcagaag120
ccaggatcctcccccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccca180
gctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggag240
gctgaagatgctgccacttattactgccaccagtatcatcgttccccacggacgttcggt300
ggaggcaccaagctggaaatcaaacgt327
<210>96
<211>248
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3scfv
<400>96
metalagluvalglnleuglnglnserglythrvalleualaargpro
151015
glyalaservallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethr
202530
sertyrtrpmethistrpvallysglnargproglyglnglyleuglu
354045
trpileglyalailetyrproglyasnseraspthrsertyrasngln
505560
lysphelysglylysalalysleuthralavalthrserthrserthr
65707580
alatyrmetgluleuserserleuthrasngluaspseralavalphe
859095
tyrcysthrhistyrtyrglyserasptyralametasptyrtrpgly
100105110
glnglythrservalthrvalserserglyglyglyglyserglygly
115120125
glyglyserglyglyglyglyserglnilevalleuthrglnserpro
130135140
alailemetseralaserleuglygluargvalthrmetthrcysthr
145150155160
alaserserservalsersersertyrleuhistrptyrglnglnlys
165170175
proglyserserprolysleutrpiletyrserthrserasnleuala
180185190
serglyvalproalaargpheserglyserglyserglythrsertyr
195200205
serleuthrilesersermetglualagluaspalaalathrtyrtyr
210215220
cyshisglntyrhisargserproargthrpheglyglyglythrlys
225230235240
leugluilelysargalaalaala
245
<210>97
<211>744
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3scfv核苷酸序列
<400>97
atggccgaggtccagctgcagcagtctgggactgtgctggcaaggcctggggcttcagtg60
aagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttaccagctactggatgcactgggtaaaa120
cagaggcctggacagggtctggaatggattggcgctatttatcctggaaatagtgatact180
agctacaaccagaagttcaagggcaaggccaaactgactgcagtcacatccaccagcact240
gcctacatggagctcagcagcctgacaaatgaggactctgcggtcttttactgtacacat300
tactacggtagtgactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcactgtctcc360
tcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgcaaattgttctc420
acccagtctccagcaatcatgtctgcatctctaggggaacgggtcaccatgacctgcact480
gccagctcaagtgtaagttccagttacttgcactggtaccagcagaagccaggatcctcc540
cccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtcccagctcgcttcagt600
ggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgct660
gccacttattactgccaccagtatcatcgttccccacggacgttcggtggaggcaccaag720
ctggaaatcaaacgtgcggccgca744
<210>98
<211>492
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3car3
<400>98
metglyvalleuleuthrglnargthrleuleuserleuvalleuala
151015
leuleupheprosermetalasermetalagluvalglnleuglngln
202530
serglythrvalleualaargproglyalaservallysmetsercys
354045
lysalaserglytyrthrphethrsertyrtrpmethistrpvallys
505560
glnargproglyglnglyleuglutrpileglyalailetyrprogly
65707580
asnseraspthrsertyrasnglnlysphelysglylysalalysleu
859095
thralavalthrserthrserthralatyrmetgluleuserserleu
100105110
thrasngluaspseralavalphetyrcysthrhistyrtyrglyser
115120125
asptyralametasptyrtrpglyglnglythrservalthrvalser
130135140
serglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser
145150155160
glnilevalleuthrglnserproalailemetseralaserleugly
165170175
gluargvalthrmetthrcysthralaserserservalserserser
180185190
tyrleuhistrptyrglnglnlysproglyserserprolysleutrp
195200205
iletyrserthrserasnleualaserglyvalproalaargpheser
210215220
glyserglyserglythrsertyrserleuthrilesersermetglu
225230235240
alagluaspalaalathrtyrtyrcyshisglntyrhisargserpro
245250255
argthrpheglyglyglythrlysleugluilelysargalaalaala
260265270
ilegluvalmettyrproproprotyrleuaspasnglulysserasn
275280285
glythrileilehisvallysglylyshisleucysproserproleu
290295300
pheproglyproserlysprophetrpvalleuvalvalvalglygly
305310315320
valleualacystyrserleuleuvalthrvalalapheileilephe
325330335
trpvalargserlysargserargleuleuhisserasptyrmetasn
340345350
metthrproargargproglyprothrarglyshistyrglnprotyr
355360365
alaproproargaspphealaalatyrargserargvallyspheser
370375380
argseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasnglnleutyr
385390395400
asngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleuasplys
405410415
argargglyargaspproglumetglyglylysproglnargarglys
420425430
asnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmetala
435440445
glualatyrsergluileglymetlysglygluargargargglylys
450455460
glyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysaspthr
465470475480
tyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg
485490
<210>99
<211>1499
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3car3核苷酸序列
<400>99
atgggcgtgctgctgacccagaggaccctgctgagcctggtgctggccctgctgtttcca60
tctatggcatcgatggccgaggtccagctgcagcagtctgggactgtgctggcaaggcct120
ggggcttcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttaccagctactggatg180
cactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggcgctatttatcctgga240
aatagtgatactagctacaaccagaagttcaagggcaaggccaaactgactgcagtcaca300
tccaccagcactgcctacatggagctcagcagcctgacaaatgaggactctgcggtcttt360
tactgtacacattactacggtagtgactatgctatggactactggggtcaaggaacctca420
gtcactgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcg480
caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctctaggggaacgggtcacc540
atgacctgcactgccagctcaagtgtaagttccagttacttgcactggtaccagcagaag600
ccaggatcctcccccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccca660
gctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggag720
gctgaagatgctgccacttattactgccaccagtatcatcgttccccacggacgttcggt780
ggaggcaccaagctggaaatcaaacgtgcggccgcaattgaagttatgtatcctcctcct840
tacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgt900
ccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtgga960
gtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagt1020
aagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggccc1080
acccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccaga1140
gtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctat1200
aacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgg1260
gaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaat1320
gaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgc1380
cggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacc1440
tacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaataaaagcttaacacgagcca1499
<210>100
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt4的cdr3重链变体1
<400>100
alaargglyglyasptyraspgluglutyrtyrleumetasp
1510
<210>101
<211>42
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt4的cdr3重链变体1
<400>101
gcgagagggggggattacgacgaagaatactatctcatggac42
<210>102
<211>15
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt4的重链变体2的cdr3
<400>102
alaargglyglyasptyraspgluglutyrtyrleumetasptyr
151015
<210>103
<211>41
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt4的重链变体2的cdr3
<400>103
gcgagagggggggattacgacgaagaatactatctcattac41
<210>104
<211>124
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt4变体1重链
<400>104
metalaglnvalglnleuglnglnserglyalagluleumetlyspro
151015
glyalaservallysilesercyslysalathrglytyrthrpheser
202530
sertyrtrpileglutrpvalasnargargproglyhisglyleuglu
354045
trpileglygluileleuproglyserglyserthrasntyrasnglu
505560
lysphelysglylysalathrphethralaaspthrserserasnthr
65707580
alatyrmetglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyr
859095
tyrcysalaargglyglyasptyraspgluglutyrtyrleumetasp
100105110
tyrtrpglyglnglythrthrleuthrvalserser
115120
<210>105
<211>109
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt4变体1轻链
<400>105
glnilevalleuthrglnserproalailemetseralaserprogly
151015
glulysvalthrmetthrcysseralaserserservalsertyrmet
202530
tyrtrptyrglnglnlysproglyserserproargleuleuiletyr
354045
aspthrserasnleualaserglyvalprovalargpheserglyser
505560
glyserglythrsertyrserleuthrileserargmetglualaglu
65707580
aspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpsersertyrproleuthr
859095
pheglyalaglythrlysleugluilelysargalaala
100105
<210>106
<211>122
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt4变体2重链
<400>106
metalaglnvalglnleuglnglnserglyalagluleumetlyspro
151015
glyalaservallysilesercyslysalathrglytyrthrpheser
202530
sertyrtrpileglutrpvalasnargargproglyhisglyleuglu
354045
trpileglygluileleuproglyserglyserthrasntyrasnglu
505560
lysphelysglylysalathrphethralaaspthrserserasnthr
65707580
alatyrmetglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyr
859095
tyrcysalaargglyglyasptyraspgluglutyrtyrleumetasp
100105110
tyrtrpglyglnglythrthrleuthrval
115120
<210>107
<211>110
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt4变体2轻链
<400>107
glnilevalleuthrglnserproalailemetseralaserprogly
151015
glulysvalthrmetthrcysseralaserserservalsertyrmet
202530
tyrtrptyrglnglnlysproglyserserproargleuleuiletyr
354045
aspthrserasnleualaserglyvalprovalargpheserglyser
505560
glyserglythrsertyrserleuthrileserargmetglualaglu
65707580
aspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpsersertyrproleuthr
859095
pheglyalaglythrlysleugluilelysargalaalaala
100105110
<210>108
<211>372
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt4变体1重链
<400>108
atggcccaggttcagctgcagcagtctggagctgagctgatgaagcctggggcctcagtg60
aagatatcctgcaaggctactggctacacattcagtagctactggatagagtgggtaaac120
cggaggcctggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaagtggtagtact180
aattacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagatacatcctccaataca240
gcctacatgcaactcagcagcctcacatctgaggactctgccgtctattactgtgcgaga300
gggggggattacgacgaagaatactatctcatggactactggggtcaaggcaccactctc360
acagtctcctca372
<210>109
<211>329
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt4变体1轻链核苷酸序列
<400>109
caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcacc60
atgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgtactggtaccagcagaagccagga120
tcctcccccagactcctgatttatgacacatccaacctggcttctggagtccctgttcgc180
ttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaa240
gatgctgccacttattactgccagcagtggagtagttacccgctcacgttcggtgctggg300
accaagctggaaatcaaacgtgcggccgc329
<210>110
<211>366
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt4变体2重链核苷酸序列
<400>110
atggcccaggttcagctgcagcagtctggagctgagctgatgaagcctggggcctcagtg60
aagatatcctgcaaggctactggctacacattcagtagctactggatagagtgggtaaac120
cggaggcctggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaagtggtagtact180
aattacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagatacatcctccaataca240
gcctacatgcaactcagcagcctcacatctgaggactctgtcgtctattactgtgcgaga300
gggggggattacgacgaagaatactatctcatggactactggggtcaaggcaccactctc360
acagtc366
<210>111
<211>321
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt4变体2轻链核苷酸序列
<400>111
caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcacc60
atgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgtactggtaccagcagaagccagga120
tcctcccccagactcctgatttatgacacatccaacctggcttctggagtccctgttcgc180
ttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaa240
gatgctgccacttattactgccagcagtggagtagttacccgctcacgttcggtgctggg300
accaagctggaaatcaaacgt321
<210>112
<211>249
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt4scfv
<400>112
metalaglnvalglnleuglnglnserglyalagluleumetlyspro
151015
glyalaservallysilesercyslysalathrglytyrthrpheser
202530
sertyrtrpileglutrpvalasnargargproglyhisglyleuglu
354045
trpileglygluileleuproglyserglyserthrasntyrasnglu
505560
lysphelysglylysalathrphethralaaspthrserserasnthr
65707580
alatyrmetglnleuserserleuthrsergluaspservalvaltyr
859095
tyrcysalaargglyglyasptyraspgluglutyrtyrleumetasp
100105110
tyrtrpglyglnglythrthrleuthrvalserserglyglyglygly
115120125
serglyglyglyglyserglyglyglyglyserglnilevalleuthr
130135140
glnserproalailemetseralaserproglyglulysvalthrmet
145150155160
thrcysseralaserserservalsertyrmettyrtrptyrglngln
165170175
lysproglyserserproargleuleuiletyraspthrserasnleu
180185190
alaserglyvalprovalargpheserglyserglyserglythrser
195200205
tyrserleuthrileserargmetglualagluaspalaalathrtyr
210215220
tyrcysglnglntrpsersertyrproleuthrpheglyalaglythr
225230235240
lysleugluilelysargalaalaala
245
<210>113
<211>747
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt4scfv核苷酸序列
<400>113
atggcccaggttcagctgcagcagtctggagctgagctgatgaagcctggggcctcagtg60
aagatatcctgcaaggctactggctacacattcagtagctactggatagagtgggtaaac120
cggaggcctggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaagtggtagtact180
aattacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagatacatcctccaataca240
gcctacatgcaactcagcagcctcacatctgaggactctgtcgtctattactgtgcgaga300
gggggggattacgacgaagaatactatctcatggactactggggtcaaggcaccactctc360
acagtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgcaa420
attgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatg480
acctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgtactggtaccagcagaagccaggatcc540
tcccccagactcctgatttatgacacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttc600
agtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagat660
gctgccacttattactgccagcagtggagtagttacccgctcacgttcggtgctgggacc720
aagctggaaatcaaacgtgcggccgca747
<210>114
<211>493
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt4car4
<400>114
metglyvalleuleuthrglnargthrleuleuserleuvalleuala
151015
leuleupheprosermetalasermetalaglnvalglnleuglngln
202530
serglyalagluleumetlysproglyalaservallysilesercys
354045
lysalathrglytyrthrphesersertyrtrpileglutrpvalasn
505560
argargproglyhisglyleuglutrpileglygluileleuprogly
65707580
serglyserthrasntyrasnglulysphelysglylysalathrphe
859095
thralaaspthrserserasnthralatyrmetglnleuserserleu
100105110
thrsergluaspservalvaltyrtyrcysalaargglyglyasptyr
115120125
aspgluglutyrtyrleumetasptyrtrpglyglnglythrthrleu
130135140
thrvalserserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglygly
145150155160
glyglyserglnilevalleuthrglnserproalailemetserala
165170175
serproglyglulysvalthrmetthrcysseralaserserserval
180185190
sertyrmettyrtrptyrglnglnlysproglyserserproargleu
195200205
leuiletyraspthrserasnleualaserglyvalprovalargphe
210215220
serglyserglyserglythrsertyrserleuthrileserargmet
225230235240
glualagluaspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpsersertyr
245250255
proleuthrpheglyalaglythrlysleugluilelysargalaala
260265270
alailegluvalmettyrproproprotyrleuaspasnglulysser
275280285
asnglythrileilehisvallysglylyshisleucysproserpro
290295300
leupheproglyproserlysprophetrpvalleuvalvalvalgly
305310315320
glyvalleualacystyrserleuleuvalthrvalalapheileile
325330335
phetrpvalargserlysargserargleuleuhisserasptyrmet
340345350
asnmetthrproargargproglyprothrarglyshistyrglnpro
355360365
tyralaproproargaspphealaalatyrargserargvallysphe
370375380
serargseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasnglnleu
385390395400
tyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleuasp
405410415
lysargargglyargaspproglumetglyglylysproglnargarg
420425430
lysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmet
435440445
alaglualatyrsergluileglymetlysglygluargargarggly
450455460
lysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysasp
465470475480
thrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg
485490
<210>115
<211>1413
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt4car4核苷酸序列
<400>115
atggcccaggttcagctgcagcagtctggagctgagctgatgaagcctggggcctcagtg60
aagatatcctgcaaggctactggctacacattcagtagctactggatagagtgggtaaac120
cggaggcctggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaagtggtagtact180
aattacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagatacatcctccaataca240
gcctacatgcaactcagcagcctcacatctgaggactctgtcgtctattactgtgcgaga300
gggggggattacgacgaagaatactatctcatggactactggggtcaaggcaccactctc360
acagtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgcaa420
attgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatg480
acctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgtactggtaccagcagaagccaggatcc540
tcccccagactcctgatttatgacacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttc600
agtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagat660
gctgccacttattactgccagcagtggagtagttacccgctcacgttcggtgctgggacc720
aagctggaaatcaaacgtgcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagac780
aatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtccc840
ctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggct900
tgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagc960
aggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaag1020
cattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttc1080
agcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctc1140
aatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgag1200
atggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcag1260
aaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggc1320
aaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcc1380
cttcacatgcaggccctgccccctcgctaataa1413
<210>116
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt5重链变体1的cdr3
<400>116
alaargglyglyasptyraspgluglutyrtyralametasp
1510
<210>117
<211>42
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt5的cdr3重链变体1
<400>117
gcaagagggggggattacgacgaagaatactatgctatggac42
<210>118
<211>15
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt5的重链变体2的cdr3
<400>118
alaargglyglyasptyraspgluglutyrtyralametasptyr
151015
<210>119
<211>72
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>cd8alpha跨膜域的核苷酸序列
<400>119
atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatc60
accctttactgc72
<210>120
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt5的重链变体2的cdr3
<400>120
gcaagagggggggattacgacgaagaatactatgctatggactac45
<210>121
<211>122
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt5重链
<400>121
metalagluvalglnleuglnglnserglyalagluleumetlyspro
151015
glyalaservallysilesercyslysalathrglytyrthrpheser
202530
sertyrtrpileglutrpvalasnglnargproglyhisglyleuglu
354045
trpileglygluileleuproglyserglyserthrasntyrasnglu
505560
lysphelysglylysalathrphethralaaspthrserserasnthr
65707580
alatyrmetglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyr
859095
tyrcysalaargglyglyasptyraspgluglutyrtyralametasp
100105110
tyrtrpglyglnglythrservalthrleu
115120
<210>122
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt5轻链
<400>122
glnilevalleuthrglnserproalailemetseralaserprogly
151015
glulysvalthrmetthrcysseralaserserservalsertyrmet
202530
tyrtrptyrglnglnlysproglyserserproargleuleuiletyr
354045
aspthrserasnleualaserglyvalprovalargpheserglyser
505560
glyserglythrsertyrserleuthrileserargmetglualaglu
65707580
aspglyalathrtyrtyrcysglnglntrpsersertyrproleuthr
859095
pheglyalaglythrlysleugluleulysarg
100105
<210>123
<211>366
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt5重链的核苷酸序列
<400>123
atggccgaggttcagcttcagcagtctggagctgagctgatgaagcctggggcctcagtg60
aagatatcctgcaaggctactggctacacattcagtagctactggatagagtgggtaaat120
cagaggcctggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaagtggtagtact180
aattacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagatacatcctccaacaca240
gcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtgcaaga300
gggggggattacgacgaagaatactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtc360
accctc366
<210>124
<211>321
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt5轻链的核苷酸序列
<400>124
caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcacc60
atgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgtactggtaccagcagaagccagga120
tcctcccccagactcctgatttatgacacatccaacctggcttctggagtccctgttcgc180
ttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaa240
gatgctgccacttattactgccagcagtggagtagttacccgctcacgttcggtgctggg300
accaagctggagctgaaacgt321
<210>125
<211>249
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt5scfv
<400>125
metalagluvalglnleuglnglnserglyalagluleumetlyspro
151015
glyalaservallysilesercyslysalathrglytyrthrpheser
202530
sertyrtrpileglutrpvalasnglnargproglyhisglyleuglu
354045
trpileglygluileleuproglyserglyserthrasntyrasnglu
505560
lysphelysglylysalathrphethralaaspthrserserasnthr
65707580
alatyrmetglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyr
859095
tyrcysalaargglyglyasptyraspgluglutyrtyralametasp
100105110
tyrtrpglyglnglythrservalthrleuserserglyglyglygly
115120125
serglyglyglyglyserglyglyglyglyserglnilevalleuthr
130135140
glnserproalailemetseralaserproglyglulysvalthrmet
145150155160
thrcysseralaserserservalsertyrmettyrtrptyrglngln
165170175
lysproglyserserproargleuleuiletyraspthrserasnleu
180185190
alaserglyvalprovalargpheserglyserglyserglythrser
195200205
tyrserleuthrileserargmetglualagluaspalaalathrtyr
210215220
tyrcysglnglntrpsersertyrproleuthrpheglyalaglythr
225230235240
lysleugluleulysargalaalaala
245
<210>126
<211>747
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt5scfv的核苷酸序列
<400>126
atggccgaggttcagcttcagcagtctggagctgagctgatgaagcctggggcctcagtg60
aagatatcctgcaaggctactggctacacattcagtagctactggatagagtgggtaaat120
cagaggcctggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaagtggtagtact180
aattacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagatacatcctccaacaca240
gcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtgcaaga300
gggggggattacgacgaagaatactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtc360
accctctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgcaa420
attgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatg480
acctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgtactggtaccagcagaagccaggatcc540
tcccccagactcctgatttatgacacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttc600
agtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagat660
gctgccacttattactgccagcagtggagtagttacccgctcacgttcggtgctgggacc720
aagctggagctgaaacgtgcggccgca747
<210>127
<211>493
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>car5crt5(制瘤素前导物,scfvcrt5,cd28-cd3部分)
<400>127
metglyvalleuleuthrglnargthrleuleuserleuvalleuala
151015
leuleupheprosermetalasermetalagluvalglnleuglngln
202530
serglyalagluleumetlysproglyalaservallysilesercys
354045
lysalathrglytyrthrphesersertyrtrpileglutrpvalasn
505560
glnargproglyhisglyleuglutrpileglygluileleuprogly
65707580
serglyserthrasntyrasnglulysphelysglylysalathrphe
859095
thralaaspthrserserasnthralatyrmetglnleuserserleu
100105110
thrsergluaspseralavaltyrtyrcysalaargglyglyasptyr
115120125
aspgluglutyrtyralametasptyrtrpglyglnglythrserval
130135140
thrleuserserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglygly
145150155160
glyglyserglnilevalleuthrglnserproalailemetserala
165170175
serproglyglulysvalthrmetthrcysseralaserserserval
180185190
sertyrmettyrtrptyrglnglnlysproglyserserproargleu
195200205
leuiletyraspthrserasnleualaserglyvalprovalargphe
210215220
serglyserglyserglythrsertyrserleuthrileserargmet
225230235240
glualagluaspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpsersertyr
245250255
proleuthrpheglyalaglythrlysleugluleulysargalaala
260265270
alailegluvalmettyrproproprotyrleuaspasnglulysser
275280285
asnglythrileilehisvallysglylyshisleucysproserpro
290295300
leupheproglyproserlysprophetrpvalleuvalvalvalgly
305310315320
glyvalleualacystyrserleuleuvalthrvalalapheileile
325330335
phetrpvalargserlysargserargleuleuhisserasptyrmet
340345350
asnmetthrproargargproglyprothrarglyshistyrglnpro
355360365
tyralaproproargaspphealaalatyrargserargvallysphe
370375380
serargseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasnglnleu
385390395400
tyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleuasp
405410415
lysargargglyargaspproglumetglyglylysproglnargarg
420425430
lysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmet
435440445
alaglualatyrsergluileglymetlysglygluargargarggly
450455460
lysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysasp
465470475480
thrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg
485490
<210>128
<211>1502
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>car5crt5的核苷酸序列
<400>128
atgggcgtgctgctgacccagaggaccctgctgagcctggtgctggccctgctgtttcca60
tctatggcatcgatggccgaggttcagcttcagcagtctggagctgagctgatgaagcct120
ggggcctcagtgaagatatcctgcaaggctactggctacacattcagtagctactggata180
gagtgggtaaatcagaggcctggacatggccttgagtggattggagagattttacctgga240
agtggtagtactaattacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagataca300
tcctccaacacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctat360
tactgtgcaagagggggggattacgacgaagaatactatgctatggactactggggtcaa420
ggaacctcagtcaccctctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggt480
ggcggatcgcaaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggag540
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aagccaggatcctcccccagactcctgatttatgacacatccaacctggcttctggagtc660
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tataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggc120
cgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtac180
aatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgag240
cgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggac300
acctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaataa345
<210>150
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1,3,4和5变体1重链cdr1的共有序列
<220>
<221>x
<222>(1)..(1)
<223>x是s或t
<220>
<221>x
<222>(5)..(5)
<223>x是i或m
<220>
<221>x
<222>(6)..(6)
<223>x是e或h
<400>150
xaasertyrtrpxaaxaa
15
<210>151
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1,3,4和5变体2重链cdr1的共有序列
<220>
<221>x
<222>(5)..(5)
<223>x是s或t
<400>151
glytyrthrphexaasertyrtrp
15
<210>152
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1,3,4和5变体1重链cdr2的共有序列
<220>
<221>x
<222>(4)..(4)
<223>x是e或a
<220>
<221>x
<222>(6)..(6)
<223>x是l或y
<220>
<221>x
<222>(9)..(9)
<223>x是s或n
<220>
<221>x
<222>(10)..(10)
<223>x是g或s
<220>
<221>x
<222>(11)..(11)
<223>x是s或d
<220>
<221>x
<222>(13)..(13)
<223>x是n或s
<400>152
trpileglyxaailexaaproglyxaaxaaxaathrxaa
1510
<210>153
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1,3,4和5变体2重链cdr2的共有序列
<220>
<221>x
<222>(2)..(2)
<223>x是l或y
<220>
<221>x
<222>(5)..(5)
<223>x是s或n
<220>
<221>x
<222>(6)..(6)
<223>x是g或s
<220>
<221>x
<222>(7)..(7)
<223>x是s或d
<400>153
ilexaaproglyxaaxaaxaathr
15
<210>154
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1,3,4和5变体1重链cdr3的共有序列
<220>
<221>x
<222>(1)..(1)
<223>x是a或t
<220>
<221>x
<222>(2)..(2)
<223>x是r或h
<220>
<221>x
<222>(3)..(3)
<223>x是g或无氨基酸
<220>
<221>x
<222>(4)..(4)
<223>x是g或无氨基酸
<220>
<221>x
<222>(5)..(5)
<223>x是d或无氨基酸
<220>
<221>x
<222>(7)..(7)
<223>x是d或y
<220>
<221>x
<222>(8)..(8)
<223>x是e或g
<220>
<221>x
<222>(9)..(9)
<223>x是e或s
<220>
<221>x
<222>(10)..(10)
<223>x是y或d
<220>
<221>x
<222>(12)..(12)
<223>x是v,a或l
<400>154
xaaxaaxaaxaaxaatyrxaaxaaxaaxaatyrxaametasp
1510
<210>155
<211>15
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1,3,4和5变体2重链cdr3的共有序列
<220>
<221>x
<222>(1)..(1)
<223>x是a或t
<220>
<221>x
<222>(2)..(2)
<223>x是r或h
<220>
<221>x
<222>(3)..(3)
<223>x是g或无氨基酸
<220>
<221>x
<222>(4)..(4)
<223>x是g或无氨基酸
<220>
<221>x
<222>(5)..(5)
<223>x是d或无氨基酸
<220>
<221>x
<222>(7)..(7)
<223>x是d或y
<220>
<221>x
<222>(8)..(8)
<223>x是e或g
<220>
<221>x
<222>(9)..(9)
<223>x是e或s
<220>
<221>x
<222>(10)..(10)
<223>x是y或d
<220>
<221>x
<222>(12)..(12)
<223>x是v,a或l
<400>155
xaaxaaxaaxaaxaatyrxaaxaaxaaxaatyrxaametasptyr
151015
<210>156
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1,3,4和5变体1轻链cdr1的共有序列
<220>
<221>x
<222>(1)..(1)
<223>x是s或无氨基酸
<220>
<221>x
<222>(2)..(2)
<223>x是s或无氨基酸
<220>
<221>x
<222>(5)..(5)
<223>x是m或l
<220>
<221>x
<222>(6)..(6)
<223>x是y或h
<400>156
xaaxaasertyrxaaxaatrptyr
15
<210>157
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1,3,4,和5变体2轻链cdr1的共有序列
<220>
<221>x
<222>(5)..(5)
<223>x是y或s
<220>
<221>x
<222>(6)..(6)
<223>x是s或无氨基酸
<220>
<221>x
<222>(7)..(7)
<223>x是y或无氨基酸
<400>157
serservalserxaaxaaxaa
15
<210>158
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1,3,4和5变体1轻链cdr2的共有序列
<220>
<221>x
<222>(2)..(2)
<223>x是l或w
<220>
<221>x
<222>(5)..(5)
<223>x是d或s
<400>158
leuxaailetyrxaathrserasnleuala
1510
<210>159
<211>4
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>接头序列
<400>159
lysaspprolys
1
<210>160
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1,3,4和5变体1轻链cdr3的共有序列
<220>
<221>x
<222>(1)..(1)
<223>x是q或h
<220>
<221>x
<222>(3)..(3)
<223>x是w或y
<220>
<221>x
<222>(4)..(4)
<223>x是s或h
<220>
<221>x
<222>(5)..(5)
<223>x是s或r
<220>
<221>x
<222>(6)..(6)
<223>x是y或s
<220>
<221>x
<222>(8)..(8)
<223>x是l或r
<400>160
xaaglnxaaxaaxaaxaaproxaa
15
<210>161
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt1,3,4和5变体2轻链cdr3的共有序列
<220>
<221>x
<222>(1)..(1)
<223>x是q或h
<220>
<221>x
<222>(3)..(3)
<223>x是w或y
<220>
<221>x
<222>(4)..(4)
<223>x是s或h
<220>
<221>x
<222>(5)..(5)
<223>x是s或r
<220>
<221>x
<222>(6)..(6)
<223>x是y或s
<220>
<221>x
<222>(8)..(8)
<223>x是l或r
<220>
<221>x
<222>(10)..(10)
<223>x是f或无氨基酸
<400>161
xaaglnxaaxaaxaaxaaproxaathrxaa
1510
<210>162
<211>63
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>cd8alpha前导物的核苷酸序列
<400>162
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60
ccg63
<210>163
<211>239
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>ch2ch3铰链
<400>163
aspproalagluprolysserproasplysthrhisthrcyspropro
151015
cysproalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphepro
202530
prolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthr
354045
cysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasn
505560
trptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarg
65707580
glugluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrval
859095
leuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalser
100105110
asnlysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalys
115120125
glyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserargasp
130135140
gluleuthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphe
145150155160
tyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnproglu
165170175
asnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphe
180185190
pheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglngly
195200205
asnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyr
210215220
thrglnlysserleuserleuserproglylyslysaspprolys
225230235
<210>164
<211>703
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>ch2ch3铰链的核苷酸序列
<400>164
aaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctgggggg60
accgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccc120
tgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactg180
gtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa240
cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaa300
ggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctc360
caaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatga420
gctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacat480
cgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgt540
gctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtg600
gcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgagggtctgcacaaccactacac660
gcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagggccggccgct703
<210>165
<211>55
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>cd8alpha铰链
<400>165
phevalprovalpheleuproalalysprothrthrthrproalapro
151015
argproprothrproalaprothrilealaserglnproleuserleu
202530
argproglualacysargproalaalaglyglyalavalhisthrarg
354045
glyleuaspphealacysasp
5055
<210>166
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>缩短的igg铰链
<400>166
alagluprolysserproasplysthrhisthrcyspro
1510
<210>167
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt2的重链可变区的cdr1
<400>167
glyphethrpheasnthrtyrala
15
<210>168
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt2的重链可变区的cdr2
<400>168
ileargserlysserasnasntyralathr
1510
<210>169
<211>18
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt2的重链可变区的cdr3
<400>169
valarggluglyvaltyrtyrtyrglyserserglytyrtyralamet
151015
asptyr
<210>170
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>编码crt2重链cdr1的核苷酸序列
<400>170
ggtttcaccttcaatacctatgcc24
<210>171
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>编码crt2重链cdr2的核苷酸序列
<400>171
ataagaagtaaaagtaataattatgcaaca30
<210>172
<211>54
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>编码crt2重链cdr3的核苷酸序列
<400>172
gtgagagaaggggtttattactacggtagtagtgggtactatgctatggactac54
<210>173
<211>130
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt2重链可变区
<400>173
metalagluvalglnglyvalgluserglyglyglyleuvalglnpro
151015
lysglyserleulysleusercysalaalaserglyphethrpheasn
202530
thrtyralamethistrpvalcysglnalaproglylysglyleuglu
354045
trpvalalaargileargserlysserasnasntyralathrtyrtyr
505560
alaaspservallysaspargphethrileserargaspaspsergln
65707580
sermetleutyrleuglnmetasnasnleulysthrgluaspthrala
859095
mettyrtyrcysvalarggluglyvaltyrtyrtyrglysersergly
100105110
tyrtyralametasptyrtrpglyglnglythrservalthrvalser
115120125
sergly
130
<210>174
<211>401
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>编码crt2重链可变区的核苷酸序列
<400>174
gacgcttatcgatggccgaggtgcagggggtggagtctggtggaggattggtgcagccta60
aaggatcattgaaactctcatgtgccgcctctggtttcaccttcaatacctatgccatgc120
actgggtctgccaggctccaggaaagggtttggaatgggttgctcgcataagaagtaaaa180
gtaataattatgcaacatattatgccgattcagtgaaagacagattcaccatctccagag240
atgattcacaaagcatgctctatctgcaaatgaacaacctgaaaactgaggacacagcca300
tgtattactgtgtgagagaaggggtttattactacggtagtagtgggtactatgctatgg360
actactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcaggt401
<210>175
<211>254
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt2scfv
<400>175
metalagluvalglnglyvalgluserglyglyglyleuvalglnpro
151015
lysglyserleulysleusercysalaalaserglyphethrpheasn
202530
thrtyralamethistrpvalcysglnalaproglylysglyleuglu
354045
trpvalalaargileargserlysserasnasntyralathrtyrtyr
505560
alaaspservallysaspargphethrileserargaspaspsergln
65707580
sermetleutyrleuglnmetasnasnleulysthrgluaspthrala
859095
mettyrtyrcysvalarggluglyvaltyrtyrtyrglysersergly
100105110
tyrtyralametasptyrtrpglyglnglythrservalthrvalser
115120125
serglyglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglygly
130135140
sergluilevalleuthrglnserproalailemetseralaserpro
145150155160
glyglulysvalthrilethrcysseralaserserservalsertyr
165170175
methistrppheglnglnlysproglythrserprolysleutrpile
180185190
tyrserthrserasnleualaserglyvalproalaargphesergly
195200205
serglyserglythrsertyrserleuthrileserargmetgluala
210215220
gluaspalaalathrtyrtyrcysglnglnargsersertyrproleu
225230235240
thrpheglyalaproglylysleugluleulysargalaala
245250
<210>176
<211>781
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt2scfv核苷酸
<400>176
gacgcttatcgatggccgaggtgcagggggtggagtctggtggaggattggtgcagccta60
aaggatcattgaaactctcatgtgccgcctctggtttcaccttcaatacctatgccatgc120
actgggtctgccaggctccaggaaagggtttggaatgggttgctcgcataagaagtaaaa180
gtaataattatgcaacatattatgccgattcagtgaaagacagattcaccatctccagag240
atgattcacaaagcatgctctatctgcaaatgaacaacctgaaaactgaggacacagcca300
tgtattactgtgtgagagaaggggtttattactacggtagtagtgggtactatgctatgg360
actactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcaggttcctcaggtggaggcggtt420
caggcggaggtggctctggcggtggcggatcggaaattgttctcacccagtctccagcaa480
tcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccataacctgcagtgccagctcaagtgtaa540
gttacatgcactggttccagcagaagccaggcacttctcccaaactctggatttatagca600
catccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtggatctgggacctctt660
actctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcaaa720
ggagtagttaccccctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgtgcggccg780
c781
<210>177
<211>747
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1scfv密码子优化的人序列
<400>177
atggcagaggtgcagctgcagcagagcggagcagagctgatgaagccaggagcctctgtg60
aagatcagctgtaaggccaccggctatacattcagctcctactggatcgagtgggtgaag120
cagcggcctggccacggcctggagtggatcggagagatcctgccaggcagcggctccacc180
aactataatgagaagttcaagggcaaggccacctttacagccgacacctctagcaacaca240
gcctacatgcagctgtcctctctgacaagcgaggattccgccgtgtactattgcgccagg300
ggcggcgactatgatgaggagtactatgtgatggactactggggccagggcacctccgtg360
accgtgagcagcggcggaggcggcagcggaggaggaggctccggcggcggcggctctcag420
atcgtgctgacccagagcccagcaatcatgtctgccagcccaggagagaaggtgaccatg480
acatgttccgcctctagctccgtgagctacatgtattggtatcagcagaagcccggctct540
agccctcggctgctgatctatagaacctccaatctggcatctggcgtgcccgcaaggttc600
tccggctctggcagcggcacctcctactctctgaccatcggcacaatggaggccgaggat660
gccgccacatactattgccagcagtggtcctcttaccctctgacctttggcgccggcaca720
aagctggagatcaagcgcgcggccgca747
<210>178
<211>747
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt1scfv密码子优化的鼠序列
<400>178
atggctgaggtgcagctgcagcagtccggagctgagctgatgaagccaggcgcctctgtg60
aagatcagctgtaaggccaccggctacacattcagctcctactggatcgagtgggtgaag120
cagaggcctggccacggactggagtggatcggagagatcctgccaggcagcggcagcacc180
aactacaacgagaagttcaagggcaaggctacctttacagccgacacctctagcaacaca240
gcttacatgcagctgtcctctctgacaagcgaggatagcgccgtgtactactgcgccagg300
ggcggagactacgatgaggagtactacgtgatggactactggggccagggaacctctgtg360
accgtgagcagcggaggaggaggaagcggcggaggaggcagcggaggaggaggatctcag420
atcgtgctgacccagagcccagctatcatgtctgccagccccggcgagaaggtgaccatg480
acatgtagcgcctctagctccgtgtcctacatgtactggtatcagcagaagcccggatct540
agccctaggctgctgatctacagaacatccaacctggcttctggcgtgcccgctcggttc600
tccggctctggaagcggcacctcctactctctgaccatcggcacaatggaggctgaggat660
gccgctacatactactgccagcagtggtcctcttaccctctgacctttggagccggcaca720
aagctggagatcaagcgcgcggccgca747
<210>179
<211>762
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt2scfv密码子优化的人序列
<400>179
atggcagaggtgcagggagtggagagcggaggcggcctggtgcagcctaagggctccctg60
aagctgtcttgcgccgccagcggcttcacctttaacacatatgcaatgcactgggtgtgc120
caggcaccaggcaagggcctggagtgggtggcacggatcagaagcaagtccaacaattat180
gccacctactatgccgacagcgtgaaggataggttcacaatctcccgcgacgattctcag240
agcatgctgtacctgcagatgaacaatctgaagaccgaggacacagccatgtactattgc300
gtgcgggagggcgtgtactattacggcagctccggctattacgctatggactactggggc360
cagggcaccagcgtgacagtgtctagcggaggaggaggctccggaggaggaggctctggc420
ggcggcggcagcgagatcgtgctgacccagtccccagcaatcatgtccgcctctccagga480
gagaaggtgaccatcacatgctccgcctcctctagcgtgtcttatatgcactggttccag540
cagaagcccggcacctctcctaagctgtggatctacagcacatccaatctggcatccggc600
gtgcccgcaaggttttctggcagcggctccggcacctcttatagcctgacaatcagccgg660
atggaggcagaggacgcagcaacctattactgtcagcagagatcctcttaccctctgacc720
tttggcgccggcacaaagctggagctgaagcgcgcggccgca762
<210>180
<211>762
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt2scfv密码子优化的人序列
<400>180
atggctgaggtgcagggagtggagagcggaggaggcctggtgcagcctaagggctccctg60
aagctgtcttgcgccgctagcggattcacctttaacacatacgctatgcactgggtgtgc120
caggctccaggaaagggcctggagtgggtggccaggatcagaagcaagtccaacaactac180
gctacctactacgccgacagcgtgaaggatcggttcacaatctcccgcgacgattctcag240
agcatgctgtacctgcagatgaacaacctgaagaccgaggacacagctatgtactactgc300
gtgcgggagggcgtgtactactacggcagctccggatactacgctatggactactgggga360
cagggcacctccgtgacagtgtctagcggaggaggaggctccggaggaggaggctctgga420
ggcggaggcagcgagatcgtgctgacccagtctccagctatcatgtccgcctctcccggc480
gagaaggtgaccatcacatgctccgcctcctctagcgtgtcttacatgcactggttccag540
cagaagcccggcacctctcctaagctgtggatctacagcacatccaacctggctagcgga600
gtgcccgctcggttttctggaagcggctccggaacctcttacagcctgacaatctccagg660
atggaggctgaggacgccgctacatactactgtcagcagagatcctcttaccctctgacc720
tttggcgccggaacaaagctggagctgaagcgcgcggccgca762
<210>181
<211>744
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3scfv密码子优化的人序列
<400>181
atggccgaggtgcagctgcagcagtctggcaccgtgctggccaggcccggagcaagcgtg60
aagatgtcctgcaaggcctctggctacaccttcacaagctattggatgcactgggtgaag120
cagcgcccaggacagggcctggagtggatcggagcaatctaccccggcaactccgacacc180
tcttataatcagaagttcaagggcaaggccaagctgacagccgtgacctctacaagcacc240
gcctacatggagctgagcagcctgaccaacgaggatagcgccgtgttttattgcacacac300
tactatggctccgactacgctatggactattggggccagggcacctccgtgacagtgtct360
agcggaggaggaggcagcggaggaggaggctccggcggcggcggctctcagatcgtgctg420
acccagagccctgccatcatgtccgcctctctgggcgagcgggtgacaatgacctgtaca480
gcctcctctagcgtgtcctctagctacctgcactggtatcagcagaagcccggctcctct540
cctaagctgtggatctacagcacctccaatctggcatccggcgtgcctgcaaggttctct600
ggcagcggctccggcacctcttacagcctgacaatcagcagcatggaggcagaggacgca660
gcaacatactattgtcaccagtatcaccggagcccaagaacctttggcggcggcacaaag720
ctggagatcaagcgggcggccgca744
<210>182
<211>744
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt3scfv密码子优化的鼠序列
<400>182
atggccgaggtgcagctgcagcagtctggcaccgtgctggctcggcccggagctagcgtg60
aagatgtcctgcaaggcttctggctacaccttcacaagctactggatgcactgggtgaag120
cagcgcccaggacagggcctggagtggatcggcgccatctaccccggaaactccgacacc180
tcttacaaccagaagttcaagggcaaggctaagctgacagccgtgacctctacaagcacc240
gcttacatggagctgagcagcctgaccaacgaggatagcgccgtgttttactgcacacac300
tactacggctccgactacgctatggattactggggacagggcacctccgtgacagtgtct360
agcggaggaggaggaagcggcggaggcggcagcggaggaggaggatctcagatcgtgctg420
acccagtctcctgctatcatgtccgcctctctgggcgagagggtgacaatgacctgtaca480
gcctcctctagcgtgtcctctagctacctgcactggtatcagcagaagcccggctcctct540
cctaagctgtggatctacagcacctccaacctggcttccggagtgcctgctcggttctct600
ggaagcggctccggaacctcttacagcctgacaatcagcagcatggaggctgaggacgcc660
gctacatactactgtcaccagtaccacaggagcccaagaacctttggcggaggcacaaag720
ctggagatcaagagggcggccgca744
<210>183
<211>747
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt4scfv密码子优化的人序列
<400>183
atggcacaggtgcagctgcagcagagcggagcagagctgatgaagccaggagcctctgtg60
aagatcagctgtaaggccaccggctatacattcagctcctactggatcgagtgggtgaac120
agacggcccggccacggcctggagtggatcggagagatcctgccaggcagcggctccacc180
aactataatgagaagttcaagggcaaggccacctttacagccgacacctctagcaataca240
gcctacatgcagctgtcctctctgacaagcgaggattccgtggtgtactattgcgccagg300
ggcggcgactatgatgaggagtactatctgatggactactggggccagggcaccacactg360
accgtgagcagcggaggaggaggcagcggaggaggaggctccggcggcggcggctctcag420
atcgtgctgacacagtccccagcaatcatgtctgccagcccaggagagaaggtgaccatg480
acatgttccgcctctagctccgtgagctacatgtattggtatcagcagaagcccggctct540
agccctaggctgctgatctatgacacctccaacctggcatctggcgtgcccgtgcgcttc600
tccggctctggcagcggcacctcctactctctgacaatcagccggatggaggcagaggat660
gcagcaacctactattgccagcagtggtcctcttaccctctgacctttggcgccggcaca720
aagctggagatcaagcgggcggccgca747
<210>184
<211>747
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt4scfv密码子优化的鼠序列
<400>184
atggctcaggtgcagctgcagcagtccggagctgagctgatgaagccaggcgcctctgtg60
aagatcagctgtaaggccaccggctacacattcagctcctactggatcgagtgggtgaac120
aggaggcccggccacggactggagtggatcggagagatcctgccaggcagcggcagcacc180
aactacaacgagaagttcaagggcaaggctacctttacagccgacacctctagcaacaca240
gcttacatgcagctgtcctctctgacaagcgaggattccgtggtgtactactgcgccagg300
ggcggagactacgatgaggagtactacctgatggactactggggccagggaaccacactg360
accgtgagcagcggaggaggaggaagcggcggaggaggcagcggaggaggaggatctcag420
atcgtgctgacacagtctccagctatcatgtctgccagccccggcgagaaggtgaccatg480
acatgtagcgccagcagcagcgtgagctacatgtactggtatcagcagaagcccggatct540
agccctcggctgctgatctacgacacctccaacctggcttctggcgtgcccgtgcgcttc600
tccggctctggaagcggcacctcctactctctgacaatcagcaggatggaggctgaggat660
gccgctacatactactgccagcagtggtcctcttaccctctgacctttggagccggcaca720
aagctggagatcaagagggcggccgca747
<210>185
<211>747
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt5scfv密码子优化的人序列
<400>185
atggcagaggtgcagctgcagcagtccggagcagagctgatgaagccaggagcctctgtg60
aagatcagctgtaaggccaccggctatacattcagctcctactggatcgagtgggtgaac120
cagcgccctggccacggcctggagtggatcggagagatcctgccaggcagcggctccacc180
aactataatgagaagttcaagggcaaggccacctttacagccgacacctctagcaataca240
gcctacatgcagctgtcctctctgacaagcgaggattccgccgtgtactattgcgccaga300
ggcggcgactatgatgaggagtactatgctatggactactggggccagggcacctctgtg360
accctgagcagcggaggaggaggcagcggcggaggaggctccggcggcggcggctctcag420
atcgtgctgacccagagcccagcaatcatgtctgccagcccaggagagaaggtgaccatg480
acatgtagcgcctctagctccgtgtcctacatgtattggtatcagcagaagcccggctct540
agccctcggctgctgatctatgacacctccaacctggcctctggcgtgcccgtgagattc600
tccggctctggcagcggcacctcctactctctgacaatcagcaggatggaggccgaggat660
gccgccacatactattgccagcagtggtcctcttaccctctgacctttggcgccggcaca720
aagctggagctgaagagggcggccgca747
<210>186
<211>747
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>crt5scfv密码子优化的鼠序列
<400>186
atggctgaggtgcagctgcagcagtccggagctgagctgatgaagccaggcgcctctgtg60
aagatcagctgtaaggccaccggctacacattcagctcctactggatcgagtgggtgaac120
cagcgccctggccacggactggagtggatcggagagatcctgccaggcagcggcagcacc180
aactacaacgagaagttcaagggcaaggctacctttacagccgacacctctagcaacaca240
gcttacatgcagctgtcctctctgacaagcgaggatagcgccgtgtactactgcgccagg300
ggcggagactacgatgaggagtactacgctatggactactggggccagggaacctctgtg360
accctgagcagcggaggaggaggaagcggcggaggaggcagcggaggaggaggatctcag420
atcgtgctgacccagagcccagctatcatgtctgccagccccggcgagaaggtgaccatg480
acatgtagcgccagcagcagcgtgagctacatgtactggtatcagcagaagcccggatct540
agccctaggctgctgatctacgacacctccaacctggcctctggcgtgcccgtgagattc600
tccggctctggaagcggcacctcctactctctgacaatcagccggatggaggctgaggat660
gccgctacatactactgccagcagtggtcctcttaccctctgacctttggagccggcaca720
aagctggagctgaagcgggcggccgca747
<210>187
<211>141
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人tcralpha链恒定区
<400>187
tyrileglnasnproaspproalavaltyrglnleuargaspserlys
151015
serserasplysservalcysleuphethrasppheaspserglnthr
202530
asnvalserglnserlysaspseraspvaltyrilethrasplysthr
354045
valleuaspmetargsermetaspphelysserasnseralavalala
505560
trpserasnlysseraspphealacysalaasnalapheasnasnser
65707580
ileileprogluaspthrphepheproserproglusersercysasp
859095
vallysleuvalglulysserphegluthraspthrasnleuasnphe
100105110
glnasnleuservalileglypheargileleuleuleulysvalala
115120125
glypheasnleuleumetthrleuargleutrpserser
130135140
<210>188
<211>179
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人tcrbeta链恒定区
<400>188
gluaspleulysasnvalpheproprogluvalalavalpheglupro
151015
serglualagluileserhisthrglnlysalathrleuvalcysleu
202530
alathrglyphetyrproasphisvalgluleusertrptrpvalasn
354045
glylysgluvalhisserglyvalserthraspproglnproleulys
505560
gluglnproalaleuasnaspserargtyrcysleuserserargleu
65707580
argvalseralathrphetrpglnasnproargasnhispheargcys
859095
glnvalglnphetyrglyleusergluasnaspglutrpthrglnasp
100105110
argalalysprovalthrglnilevalseralaglualatrpglyarg
115120125
alaaspcysglyphethrserglusertyrglnglnglyvalleuser
130135140
alathrileleutyrgluileleuleuglylysalathrleutyrala
145150155160
valleuvalseralaleuvalleumetalametvallysarglysasp
165170175
serarggly
<210>189
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>wt1表位
<400>189
argmetpheproasnalaprotyrleu
15
<210>190
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>wt1tcralpha链的cdr1
<400>190
sersertyrserproser
15
<210>191
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>wt1tcralpha链的cdr2
<400>191
tyrthrseralaalathrleu
15
<210>192
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>wt1tcralpha链的cdr3
<400>192
valvalserpropheserglyglyglyalaaspglyleuthr
1510
<210>193
<211>12
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>wt1tcralpha链的cdr3
<400>193
serpropheserglyglyglyalaaspglyleuthr
1510
<210>194
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>wt1tcrbeta链的cdr1
<400>194
asppheglnalathrthr
15
<210>195
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>wt1tcrbeta链的cdr2
<400>195
serasngluglyserlysala
15
<210>196
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>wt1tcrbeta链的cdr3
<400>196
seralaargaspglyglyglugly
15
<210>197
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>wt1tcrbeta链的cdr3
<400>197
argaspglyglygluglysergluthrglntyr
1510
<210>198
<211>276
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人tcralpha链wt1
<400>198
metleuleuleuleuvalprovalleugluvalilephethrleugly
151015
glythrargalaglnservalthrglnleuaspserhisvalserval
202530
sergluglythrprovalleuleuargcysasntyrsersersertyr
354045
serproserleuphetrptyrvalglnhisproasnlysglyleugln
505560
leuleuleulystyrthrseralaalathrleuvallysglyileasn
65707580
glypheglualagluphelyslyssergluthrserphehisleuthr
859095
lysproseralahismetseraspalaalaglutyrphecysvalval
100105110
serpropheserglyglyglyalaaspglyleuthrpheglylysgly
115120125
thrhisleuileileglnprotyrileglnasnproaspproalaval
130135140
tyrglnleuargaspserlysserserasplysservalcysleuphe
145150155160
thrasppheaspserglnthrasnvalserglnserlysaspserasp
165170175
valtyrilethrasplysthrvalleuaspmetargsermetaspphe
180185190
lysserasnseralavalalatrpserasnlysseraspphealacys
195200205
alaasnalapheasnasnserileileprogluaspthrphephepro
210215220
serproglusersercysaspvallysleuvalglulysserpheglu
225230235240
thraspthrasnleuasnpheglnasnleuservalileglyphearg
245250255
ileleuleuleulysvalalaglypheasnleuleumetthrleuarg
260265270
leutrpserser
275
<210>199
<211>310
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人tcrbeta链wt1
<400>199
metleuleuleuleuleuleuleuglyproglyserglyleuglyala
151015
valvalserglnhisprosertrpvalilecyslysserglythrser
202530
vallysileglucysargserleuasppheglnalathrthrmetphe
354045
trptyrargglnpheprolysglnserleumetleumetalathrser
505560
asngluglyserlysalathrtyrgluglnglyvalglulysasplys
65707580
pheleuileasnhisalaserleuthrleuserthrleuthrvalthr
859095
seralahisprogluaspserserphetyrilecysseralaargasp
100105110
glyglygluglysergluthrglntyrpheglyproglythrargleu
115120125
leuvalleugluaspleulysasnvalpheproprogluvalalaval
130135140
phegluproserglualagluileserhisthrglnlysalathrleu
145150155160
valcysleualathrglyphetyrproasphisvalgluleusertrp
165170175
trpvalasnglylysgluvalhisserglyvalserthraspprogln
180185190
proleulysgluglnproalaleuasnaspserargtyrcysleuser
195200205
serargleuargvalseralathrphetrpglnasnproargasnhis
210215220
pheargcysglnvalglnphetyrglyleusergluasnaspglutrp
225230235240
thrglnaspargalalysprovalthrglnilevalseralagluala
245250255
trpglyargalaaspcysglyphethrserglusertyrglnglngly
260265270
valleuseralathrileleutyrgluileleuleuglylysalathr
275280285
leutyralavalleuvalseralaleuvalleumetalametvallys
290295300
arglysaspserarggly
305310
<210>200
<211>276
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>具有thr48至cys取代的人tcralpha链(wt1)
<400>200
metleuleuleuleuvalprovalleugluvalilephethrleugly
151015
glythrargalaglnservalthrglnleuaspserhisvalserval
202530
sergluglythrprovalleuleuargcysasntyrsersersertyr
354045
serproserleuphetrptyrvalglnhisproasnlysglyleugln
505560
leuleuleulystyrthrseralaalathrleuvallysglyileasn
65707580
glypheglualagluphelyslyssergluthrserphehisleuthr
859095
lysproseralahismetseraspalaalaglutyrphecysvalval
100105110
serpropheserglyglyglyalaaspglyleuthrpheglylysgly
115120125
thrhisleuileileglnprotyrileglnasnproaspproalaval
130135140
tyrglnleuargaspserlysserserasplysservalcysleuphe
145150155160
thrasppheaspserglnthrasnvalserglnserlysaspserasp
165170175
valtyrilethrasplyscysvalleuaspmetargsermetaspphe
180185190
lysserasnseralavalalatrpserasnlysseraspphealacys
195200205
alaasnalapheasnasnserileileprogluaspthrphephepro
210215220
serproglusersercysaspvallysleuvalglulysserpheglu
225230235240
thraspthrasnleuasnpheglnasnleuservalileglyphearg
245250255
ileleuleuleulysvalalaglypheasnleuleumetthrleuarg
260265270
leutrpserser
275
<210>201
<211>310
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>具有ser57至cys取代的的人tcrbeta链(wt1)
<400>201
metleuleuleuleuleuleuleuglyproglyserglyleuglyala
151015
valvalserglnhisprosertrpvalilecyslysserglythrser
202530
vallysileglucysargserleuasppheglnalathrthrmetphe
354045
trptyrargglnpheprolysglnserleumetleumetalathrser
505560
asngluglyserlysalathrtyrgluglnglyvalglulysasplys
65707580
pheleuileasnhisalaserleuthrleuserthrleuthrvalthr
859095
seralahisprogluaspserserphetyrilecysseralaargasp
100105110
glyglygluglysergluthrglntyrpheglyproglythrargleu
115120125
leuvalleugluaspleulysasnvalpheproprogluvalalaval
130135140
phegluproserglualagluileserhisthrglnlysalathrleu
145150155160
valcysleualathrglyphetyrproasphisvalgluleusertrp
165170175
trpvalasnglylysgluvalhisserglyvalcysthraspprogln
180185190
proleulysgluglnproalaleuasnaspserargtyrcysleuser
195200205
serargleuargvalseralathrphetrpglnasnproargasnhis
210215220
pheargcysglnvalglnphetyrglyleusergluasnaspglutrp
225230235240
thrglnaspargalalysprovalthrglnilevalseralagluala
245250255
trpglyargalaaspcysglyphethrserglusertyrglnglngly
260265270
valleuseralathrileleutyrgluileleuleuglylysalathr
275280285
leutyralavalleuvalseralaleuvalleumetalametvallys
290295300
arglysaspserarggly
305310
<210>202
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>wt1表位235-243
<400>202
cysmetthrtrpasnglnmetasnleu
15
<210>203
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>框架区
<400>203
pheglylysglythrhisleuileileglnpro
1510
<210>204
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>框架区
<400>204
pheglyproglythrargleuleuvalleu
1510
<210>205
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt5,1和4变体1重链cdr3的共有序列
<220>
<221>x
<222>(12)..(12)
<223>x是a或v或l
<400>205
alaargglyglyasptyraspgluglutyrtyrxaametasp
1510
<210>206
<211>15
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt5,1和4变体2重链cdr3的共有序列
<220>
<221>xaa
<222>(12)..(12)
<223>xaa是a或v或l
<400>206
alaargglyglyasptyraspgluglutyrtyrxaametasptyr
151015
<210>207
<211>15
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt5,1和4变体1和2重链cdr3的共有序列
<220>
<221>xaa
<222>(12)..(12)
<223>xaa是a或v或l
<220>
<221>xaa
<222>(15)..(15)
<223>xaa是y或无氨基酸
<400>207
alaargglyglyasptyraspgluglutyrtyrxaametaspxaa
151015
<210>208
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt5,1和4变体1和2轻链cdr3的共有序列
<220>
<221>xaa
<222>(9)..(9)
<223>xaa是t或无氨基酸
<400>208
glnglntrpsersertyrproleuxaa
15
<210>209
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt5,1和4变体1和2重链cdr1的共有序列
<220>
<221>xaa
<222>(1)..(1)
<223>xaa是gytf或无氨基酸
<220>
<221>xaa
<222>(6)..(6)
<223>xaa是ie或无氨基酸
<400>209
xaasersertyrtrpxaa
15
<210>210
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt5,1和4变体1和2重链cdr2的共有序列
<220>
<221>xaa
<222>(1)..(1)
<223>xaa是wige或无氨基酸
<220>
<221>xaa
<222>(10)..(10)
<223>xaa是n或无氨基酸
<400>210
xaaileleuproglyserglyserthrxaa
1510
<210>211
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt5,1,4和3变体1和2重链cdr1的共有序列
<220>
<221>xaa
<222>(1)..(1)
<223>xaa是gytf或无氨基酸
<220>
<221>xaa
<222>(2)..(2)
<223>xaa是s或t
<220>
<221>xaa
<222>(6)..(6)
<223>xaa是i或m和e或h,或无氨基酸
<400>211
xaaxaasertyrtrpxaa
15
<210>212
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt5,1,4和3变体1和2重链cdr2的共有序列
<220>
<221>xaa
<222>(1)..(1)
<223>xaa是wig和e或a,或无氨基酸
<220>
<221>xaa
<222>(3)..(3)
<223>xaa是l或y
<220>
<221>xaa
<222>(6)..(6)
<223>xaa是s或n
<220>
<221>xaa
<222>(7)..(7)
<223>xaa是g或s
<220>
<221>xaa
<222>(8)..(8)
<223>xaa是s或d
<220>
<221>xaa
<222>(10)..(10)
<223>xaa是n或s或无氨基酸
<400>212
xaailexaaproglyxaaxaaxaathrxaa
1510
<210>213
<211>15
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt5,1,4和3变体1和2重链cdr3的共有序列
<220>
<221>xaa
<222>(1)..(1)
<223>xaa是a或t
<220>
<221>xaa
<222>(2)..(2)
<223>xaa是r或h
<220>
<221>xaa
<222>(3)..(3)
<223>xaa是g或无氨基酸
<220>
<221>xaa
<222>(4)..(4)
<223>xaa是g或无氨基酸
<220>
<221>xaa
<222>(5)..(5)
<223>xaa是d或无氨基酸
<220>
<221>xaa
<222>(7)..(7)
<223>xaa是d或y
<220>
<221>xaa
<222>(8)..(8)
<223>xaa是e或g
<220>
<221>xaa
<222>(9)..(9)
<223>xaa是e或s
<220>
<221>xaa
<222>(10)..(10)
<223>xaa是y或d
<220>
<221>xaa
<222>(12)..(12)
<223>xaa是v或a或l
<220>
<221>xaa
<222>(15)..(15)
<223>xaa是y或无氨基酸
<400>213
xaaxaaxaaxaaxaatyrxaaxaaxaaxaatyrxaametaspxaa
151015
<210>214
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt5,1,4和3变体1和2轻链cdr2的共有序列
<220>
<221>xaa
<222>(1)..(1)
<223>xaa是(l,l或w,iy)或无氨基酸
<220>
<221>xaa
<222>(2)..(2)
<223>d或s
<220>
<221>xaa
<222>(5)..(5)
<223>xaa是nla或无氨基酸
<400>214
xaaxaathrserxaa
15
<210>215
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt5,1,4,和3变体1和2轻链cdr3的共有序列
<220>
<221>xaa
<222>(1)..(1)
<223>xaa是q或h
<220>
<221>xaa
<222>(3)..(3)
<223>xaa是w或y
<220>
<221>xaa
<222>(4)..(4)
<223>xaa是s或h
<220>
<221>xaa
<222>(5)..(5)
<223>xaa是s或r
<220>
<221>xaa
<222>(6)..(6)
<223>xaa是y或s
<220>
<221>xaa
<222>(8)..(8)
<223>xaa是l或r
<220>
<221>xaa
<222>(9)..(9)
<223>xaa是tf或无氨基酸
<400>215
xaaglnxaaxaaxaaxaaproxaaxaa
15
<210>216
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3变体1和2重链cdr1的共有序列
<220>
<221>xaa
<222>(1)..(1)
<223>xaa是gytf或无氨基酸
<220>
<221>xaa
<222>(6)..(6)
<223>xaa是mh或无氨基酸
<400>216
xaathrsertyrtrpxaa
15
<210>217
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3变体1和2重链cdr2的共有序列
<220>
<221>xaa
<222>(1)..(1)
<223>xaa是wiga或无氨基酸
<220>
<221>xaa
<222>(10)..(10)
<223>xaa是s或无氨基酸
<400>217
xaailetyrproglyasnseraspthrxaa
1510
<210>218
<211>12
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3变体1和2重链cdr3的共有序列
<220>
<221>xaa
<222>(12)..(12)
<223>xaa是y或无氨基酸
<400>218
thrhistyrtyrglyserasptyralametaspxaa
1510
<210>219
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3变体1和2轻链cdr1的共有序列
<220>
<221>xaa
<222>(1)..(1)
<223>xaa是ssv或无氨基酸
<220>
<221>xaa
<222>(6)..(6)
<223>xaa是lhwy或无氨基酸
<400>219
xaasersersertyrxaa
15
<210>220
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3变体1和2轻链cdr2的共有序列
<220>
<221>xaa
<222>(1)..(1)
<223>xaa是lwiy或无氨基酸
<220>
<221>xaa
<222>(5)..(5)
<223>xaa是nla或无氨基酸
<400>220
xaaserthrserxaa
15
<210>221
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>crt3变体1和2轻链cdr3的共有序列
<220>
<221>xaa
<222>(9)..(9)
<223>xaa是t或无氨基酸
<400>221
hisglntyrhisargserproargxaa
15
<210>222
<211>216
<212>dna
<213>小家鼠
<400>222
actactaccaagccagtgctgcgaactccctcacctgtgcaccctaccgggacatctcag60
ccccagagaccagaagattgtcggccccgtggctcagtgaaggggaccggattggacttc120
gcctgtgatatttacatctgggcacccttggccggaatctgcgtggcccttctgctgtcc180
ttgatcatcactctcatctgctaccacaggagccga216
<210>223
<211>123
<212>dna
<213>小家鼠
<400>223
aatagtagaaggaacagactccttcaaagtgactacatgaacatgactccccggaggcct60
gggctcactcgaaagccttaccagccctacgcccctgccagagactttgcagcgtaccgc120
ccc123
<210>224
<211>135
<212>dna
<213>小家鼠
<400>224
aaatggatcaggaaaaaattcccccacatattcaagcaaccatttaagaagaccactgga60
gcagctcaagaggaagatgcttgtagctgccgatgtccacaggaagaagaaggaggagga120
ggaggctatgagctg135
<210>225
<211>334
<212>dna
<213>小家鼠
<400>225
agagcaaaattcagcaggagtgcagagactgctgccaacctgcaggaccccaaccagctc60
tacaatgagctcaatctagggcgaagagaggaatatgacgtcttggagaagaagcgggct120
cgggatccagagatgggaggcaaacagcagaggaggaggaacccccaggaaggcgtatac180
aatgcactgcagaaagacaagatggcagaagcctacagtgagatcggcacaaaaggcgag240
aggcggagaggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagcactgccaccaaggac300
acctatgatgccctgcatatgcagaccctggccc334
<210>226
<211>108
<212>dna
<213>小家鼠
<400>226
cggaaggcttggagattgcctaacactcccaaaccttgttggggaaacagcttcaggacc60
ccgatccaggaggaacacacagacgcacactttactctggccaagatc108
<210>227
<211>752
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>鼠cd8alpha铰链cd8alpha跨膜域-cd28
共刺激域-cd3zeta胞内信号传导域
<400>227
ggaggcaccaagctggaaatcaaacgtgcggccgcaactactaccaagccagtgctgcga60
actccctcacctgtgcaccctaccgggacatctcagccccagagaccagaagattgtcgg120
ccccgtggctcagtgaaggggaccggattggacttcgcctgtgatatttacatctgggca180
cccttggccggaatctgcgtggcccttctgctgtccttgatcatcactctcatctgctac240
cacaggagccgaaatagtagaaggaacagactccttcaaagtgactacatgaacatgact300
ccccggaggcctgggctcactcgaaagccttaccagccctacgcccctgccagagacttt360
gcagcgtaccgccccagagcaaaattcagcaggagtgcagagactgctgccaacctgcag420
gaccccaaccagctctacaatgagctcaatctagggcgaagagaggaatatgacgtcttg480
gagaagaagcgggctcgggatccagagatgggaggcaaacagcagaggaggaggaacccc540
caggaaggcgtatacaatgcactgcagaaagacaagatggcagaagcctacagtgagatc600
ggcacaaaaggcgagaggcggagaggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagc660
actgccaccaaggacacctatgatgccctgcatatgcagaccctggcccctcgctaataa720
aagcttaacacgagccatagatagaataaaag752
<210>228
<211>764
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>鼠cd8alpha铰链cd8alpha跨膜域-41bb
共刺激域-cd3zeta胞内信号传导域
<400>228
ggaggcaccaagctggaaatcaaacgtgcggccgcaactactaccaagccagtgctgcga60
actccctcacctgtgcaccctaccgggacatctcagccccagagaccagaagattgtcgg120
ccccgtggctcagtgaaggggaccggattggacttcgcctgtgatatttacatctgggca180
cccttggccggaatctgcgtggcccttctgctgtccttgatcatcactctcatctgctac240
cacaggagccgaaaatggatcaggaaaaaattcccccacatattcaagcaaccatttaag300
aagaccactggagcagctcaagaggaagatgcttgtagctgccgatgtccacaggaagaa360
gaaggaggaggaggaggctatgagctgagagcaaaattcagcaggagtgcagagactgct420
gccaacctgcaggaccccaaccagctctacaatgagctcaatctagggcgaagagaggaa480
tatgacgtcttggagaagaagcgggctcgggatccagagatgggaggcaaacagcagagg540
aggaggaacccccaggaaggcgtatacaatgcactgcagaaagacaagatggcagaagcc600
tacagtgagatcggcacaaaaggcgagaggcggagaggcaaggggcacgatggcctttac660
cagggtctcagcactgccaccaaggacacctatgatgccctgcatatgcagaccctggcc720
cctcgctaataaaagcttaacacgagccatagatagaataaaag764
<210>229
<211>737
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>鼠cd8alpha铰链-cd8alpha跨膜域-ox40
共刺激域-cd3zeta胞内信号传导域
<400>229
ggaggcaccaagctggaaatcaaacgtgcggccgcaactactaccaagccagtgctgcga60
actccctcacctgtgcaccctaccgggacatctcagccccagagaccagaagattgtcgg120
ccccgtggctcagtgaaggggaccggattggacttcgcctgtgatatttacatctgggca180
cccttggccggaatctgcgtggcccttctgctgtccttgatcatcactctcatctgctac240
cacaggagccgacggaaggcttggagattgcctaacactcccaaaccttgttggggaaac300
agcttcaggaccccgatccaggaggaacacacagacgcacactttactctggccaagatc360
agagcaaaattcagcaggagtgcagagactgctgccaacctgcaggaccccaaccagctc420
tacaatgagctcaatctagggcgaagagaggaatatgacgtcttggagaagaagcgggct480
cgggatccagagatgggaggcaaacagcagaggaggaggaacccccaggaaggcgtatac540
aatgcactgcagaaagacaagatggcagaagcctacagtgagatcggcacaaaaggcgag600
aggcggagaggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagcactgccaccaaggac660
acctatgatgccctgcatatgcagaccctggcccctcgctaataaaagcttaacacgagc720
catagatagaataaaag737
<210>230
<211>887
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>鼠cd8alpha铰链-cd8alpha跨膜域-cd28
共刺激域-41bb共刺激域-cd3zeta
胞内信号传导域
<400>230
ggaggcaccaagctggaaatcaaacgtgcggccgcaactactaccaagccagtgctgcga60
actccctcacctgtgcaccctaccgggacatctcagccccagagaccagaagattgtcgg120
ccccgtggctcagtgaaggggaccggattggacttcgcctgtgatatttacatctgggca180
cccttggccggaatctgcgtggcccttctgctgtccttgatcatcactctcatctgctac240
cacaggagccgaaatagtagaaggaacagactccttcaaagtgactacatgaacatgact300
ccccggaggcctgggctcactcgaaagccttaccagccctacgcccctgccagagacttt360
gcagcgtaccgccccaaatggatcaggaaaaaattcccccacatattcaagcaaccattt420
aagaagaccactggagcagctcaagaggaagatgcttgtagctgccgatgtccacaggaa480
gaagaaggaggaggaggaggctatgagctgagagcaaaattcagcaggagtgcagagact540
gctgccaacctgcaggaccccaaccagctctacaatgagctcaatctagggcgaagagag600
gaatatgacgtcttggagaagaagcgggctcgggatccagagatgggaggcaaacagcag660
aggaggaggaacccccaggaaggcgtatacaatgcactgcagaaagacaagatggcagaa720
gcctacagtgagatcggcacaaaaggcgagaggcggagaggcaaggggcacgatggcctt780
taccagggtctcagcactgccaccaaggacacctatgatgccctgcatatgcagaccctg840
gcccctcgctaataaaagcttaacacgagccatagatagaataaaag887
<210>231
<211>860
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>鼠cd8alpha铰链-cd8alpha跨膜域-cd28和
ox40共刺激域s-cd3zeta胞内信号传导域
<400>231
ggaggcaccaagctggaaatcaaacgtgcggccgcaactactaccaagccagtgctgcga60
actccctcacctgtgcaccctaccgggacatctcagccccagagaccagaagattgtcgg120
ccccgtggctcagtgaaggggaccggattggacttcgcctgtgatatttacatctgggca180
cccttggccggaatctgcgtggcccttctgctgtccttgatcatcactctcatctgctac240
cacaggagccgaaatagtagaaggaacagactccttcaaagtgactacatgaacatgact300
ccccggaggcctgggctcactcgaaagccttaccagccctacgcccctgccagagacttt360
gcagcgtaccgcccccggaaggcttggagattgcctaacactcccaaaccttgttgggga420
aacagcttcaggaccccgatccaggaggaacacacagacgcacactttactctggccaag480
atcagagcaaaattcagcaggagtgcagagactgctgccaacctgcaggaccccaaccag540
ctctacaatgagctcaatctagggcgaagagaggaatatgacgtcttggagaagaagcgg600
gctcgggatccagagatgggaggcaaacagcagaggaggaggaacccccaggaaggcgta660
tacaatgcactgcagaaagacaagatggcagaagcctacagtgagatcggcacaaaaggc720
gagaggcggagaggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagcactgccaccaag780
gacacctatgatgccctgcatatgcagaccctggcccctcgctaataaaagcttaacacg840
agccatagatagaataaaag860
<210>232
<211>872
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>鼠cd8alpha铰链-cd8alpha跨膜域-41bb和
ox40共刺激域s-cd3zeta胞内信号传导域
<400>232
ggaggcaccaagctggaaatcaaacgtgcggccgcaactactaccaagccagtgctgcga60
actccctcacctgtgcaccctaccgggacatctcagccccagagaccagaagattgtcgg120
ccccgtggctcagtgaaggggaccggattggacttcgcctgtgatatttacatctgggca180
cccttggccggaatctgcgtggcccttctgctgtccttgatcatcactctcatctgctac240
cacaggagccgaaaatggatcaggaaaaaattcccccacatattcaagcaaccatttaag300
aagaccactggagcagctcaagaggaagatgcttgtagctgccgatgtccacaggaagaa360
gaaggaggaggaggaggctatgagctgcggaaggcttggagattgcctaacactcccaaa420
ccttgttggggaaacagcttcaggaccccgatccaggaggaacacacagacgcacacttt480
actctggccaagatcagagcaaaattcagcaggagtgcagagactgctgccaacctgcag540
gaccccaaccagctctacaatgagctcaatctagggcgaagagaggaatatgacgtcttg600
gagaagaagcgggctcgggatccagagatgggaggcaaacagcagaggaggaggaacccc660
caggaaggcgtatacaatgcactgcagaaagacaagatggcagaagcctacagtgagatc720
ggcacaaaaggcgagaggcggagaggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagc780
actgccaccaaggacacctatgatgccctgcatatgcagaccctggcccctcgctaataa840
aagcttaacacgagccatagatagaataaaag872