源自乳酸菌的蛋白质及其制备方法与流程

本发明涉及源自乳酸菌的蛋白质及其制备方法。
背景技术：
：大肠疾病是指包括大肠癌、大肠炎、肠易激综合症、克罗恩病等在内的大肠中发生的多种疾病的总称。在当代，由于频繁的压力和西方化的饮食习惯、饮酒等影响，大肠疾病患者的数量正在大幅增加。根据韩国国民健康保险公团的2012年大肠癌诊疗费用的报告书，大肠癌患者的数量由2007年的7万7,193名增加至2011年的11万3,504名，大肠癌的诊疗费用由2007年的3,360亿韩元增加至2011年的5,148亿韩元。为了治疗大肠癌，已经开发并正在使用合成化合物5-氟尿嘧啶(5-fu，fluorouracil)、优福定(uft，喃氟啶-尿嘧啶(tegafur-uracil))、卡培他滨(capecitabine)等氟嘧啶(fluoropyrimidine)类药物和伊立替康(irinotecan)、奥沙利铂(oxaliplatin)等，并且正在开发靶向治疗剂贝伐珠单抗(bevacizumab，商品名为阿瓦斯汀(avastin))及西妥昔单抗(cetuximab，商品名为爱必妥(erbitux))等。但是，高浓度施用及长期使用所带来的副作用的危险高，因此迫切需要开发天然物治疗剂。另外，益生菌是指摄入后到达肠时对肠道的环境起到有益作用的菌株。目前为止已知的大部分益生菌是乳酸菌，乳酸菌是指使糖类发酵来获取能量并生成大量的乳酸的细菌的总称。向包括大肠癌及大肠炎在内的大肠疾病患者施用乳酸菌而能够期待治疗效果是公知的，因此正在开发“抑制肠道有害酶的活性的新韩国型乳酸菌及其用途(kr10-0232639b1)”及“具有改善肠道环境效果的纳米型泡菜乳酸菌组合物(kr10-2016-0084822a)”等将乳酸菌用作大肠疾病治疗剂的技术，但是，对于在乳酸菌中确认并利用有效成分蛋白质的技术的开发还是不完善的情况。因此，本发明涉及源自乳酸菌的蛋白质及其制备方法，本发明的源自乳酸菌的蛋白质是从治疗大肠癌的效果优异的乳酸菌(鼠李糖乳杆菌)中分离的精制蛋白质，其对大肠疾病的显著的效果得到验证，因此，期待在医学领域中其作为天然蛋白质大肠疾病治疗剂的广泛的应用。技术实现要素：要解决的技术问题本发明是为了解决如上所述的现有技术中的问题而提出的，涉及源自乳酸菌的蛋白质及其制备方法。但是本发明所要解决的技术问题并不限于以上提及的问题，本领域具有通常知识的技术人员可以由下述记载明确地理解未提及的其他问题。技术方案下面，本申请中记载的多种具体实施方式是参照附图而记载。下述说明中，为了完全理解本发明而记载了多种特异性详细事项，例如，特异性形态、组合物及工艺等。但是，特定的具体实施方式可以以没有这些特异性详细事项中的一种以上的方式实施，或者可以与其他公知的方法及形态一同实施。在其他实施方式中，为了避免使本发明不必要地模棱两可，公知的工艺及制备技术没有记载为特定的详细事项。通过本说明书整体的对“一个具体实施方式”或“具体实施方式”的参考表示本发明的一个以上的具体实施方式中包含与具体实施方式结合进行记载的特别的特征、形态、组成或特性。因此，本说明书整体的多个部分中记载的“一个具体实施方式中”或“具体实施方式”的情况并不一定表示本发明的相同的具体实施方式。此外，进一步地，在一个以上的具体实施方式中，特别的特征、形态、组成或特性可以通过任何适当的方法进行组合。若说明书中没有特别的定义，则本说明书中使用的所有科学性术语及技术性术语具有与本发明所属
技术领域：
中的技术人员通常理解的意义相同的意义。本发明的一个具体实施方式中，“益生菌(probiotics)”是指摄入后到达肠时对肠道的环境起到有益作用的菌株。目前为止已知的大部分益生菌为乳酸菌，并且包括一部分杆菌(bacillus)等。俄罗斯科学家伊利亚梅契尼柯夫(eliemechinikoff)查明了保加利亚人长寿的理由是摄入了由乳杆菌属(lactobacillus)发酵的发酵乳，并以此获得了诺贝尔奖，自此以来，对乳酸菌、益生菌的功能性的研究持续了很长时间。为了被认证为益生菌，包括乳酸菌在内的细菌需要在胃酸和胆汁酸中存活并到达小肠而在肠道中增殖并滞留，并且需要在肠道中显示出有益的效果，应为无毒性且为非病原性。人的肠道中栖息有约1kg的菌，所存在的食物的量和菌的量几乎相同，每天排泄的粪便内容物中除了水分以外，菌约占40％。用显微镜观察人的粪便可知其几乎由菌团组成，这些菌的99％左右是厌氧性菌。吃母乳的健康婴儿的粪便菌中90％以上由双歧杆菌组成，但随着年龄的增长，双歧杆菌逐渐减少，而肠道的有害菌会增加(bifidomicrofl7:35-43,1998)。在这种正常的老化过程中，帮助肠道菌群的分布保持健康的状态即为益生菌的功能。本发明的一个具体实施方式中，“乳酸菌(lacticacidbacteria)”也被命名为乳杆菌，其是指使糖类发酵来获取能量并生成大量的乳酸的细菌的总称。“乳酸菌”的名称是俗称，而并非表示分类学中的位置。与乳酸菌的定义相符的是乳杆菌属(lactobacillus)、乳球菌属(lactococcus)、明串珠菌属(leuconostoc)、片球菌属(pediococcus)、双歧杆菌属(bifidobacterium)等菌属。形态上分为球菌(乳球菌属、片球菌属、明串珠菌属)和杆菌(乳杆菌属、双歧杆菌属)，革兰(gram)染色性为阳性。任何一种都可以在缺少氧气的环境下很好地发育，从而由各种糖生成乳酸。很多乳酸菌都显示出耐酸性，并且也有如下的乳酸菌，即，营养需求性非常复杂而除了糖类之外还需要很多种类的氨基酸或维生素，并且根据菌种、菌株，若未添加微量营养素，则无法生殖的乳酸菌。从农作物或食品到人或动物的身体，乳酸菌广泛地分布于自然界中，也有无法获知确切的生殖地点的乳酸菌。乳球菌属是在10℃下发育，但在45℃下不会发育，在30℃左右的最适温度下同型发酵的球菌。有多种菌株作为乳制品的起子(starter)而用于食品加工。片球菌属为同型发酵的球菌，成四联的细胞排列状。根据生殖温度、乳酸的旋光性等分类为8种菌种。片球菌属和明串珠菌属一同为与发酵相关的主要菌，与动物的生物体的关联少。明串珠菌属为异型发酵的链球菌，根据糖的分解、生长、生殖的ph等分类为4种菌种。乳杆菌属大致分为同型发酵和异型发酵的2种，根据生殖温度、糖的分解、生长、生成的乳酸的旋光性等分类为55种菌种11种亚菌种。乳杆菌属为代表性的乳酸菌，用于各种发酵食品中，并且乳杆菌属为肠道的常居菌群，与人或动物的健康有重要的关系。双歧杆菌属是异型发酵的专性厌氧性革兰阳性杆菌，所生成的最终产物主要为乳酸和醋酸。本发明的一个具体实施方式中，“p8蛋白质(proteinno.8)”是指通过本发明的实施例中记载的制备方法，从乳酸菌(鼠李糖乳杆菌)中提取的8kda尺寸的蛋白质片段。本发明的p8蛋白质可以定义为由seqidno：1表示的碱基序列或由seqidno：2表示的氨基酸序列，具有有效地治疗大肠疾病的效果。本发明的一个具体实施方式中，“载体(vector)”是指在重组dna实验中以将基因导入宿主中进行增殖为目的而使用的具有自主增殖能力的小型dna。通常使用质粒和噬菌体。载体的条件为需要有效地插入到细胞内、需要具有可以用限制酶切割的位点以能够组合插入其他dna、需要具有耐药剂性以能够进行筛选、需要具有标记基因等。本发明中，载体是指包含编码p8蛋白质或p8蛋白质的活性部位的dna的载体，但并不受限于此。本发明的一个具体实施方式中，“转化(transformation)”是具有与原来的细胞所具有的基因的种类不同的基因的dna链片段或质粒渗透到细胞之间而与原来的细胞中存在的dna结合的结果，其是指细胞的遗传性状发生变化。通常可以在细菌(bacteria)中观察到转化，转化也可以通过人工的基因操作来实现。将通过所述转化而使遗传性状发生变化的细胞或个体称为“转化体”。具体而言，将接受非自身的dna而发生转化的细胞称为转化受体细胞。转化的受体细胞可以通过接合和转导扩散新的遗传性状。以如噬菌体等病毒为媒介所转化的细菌的新性状转移到其他细菌时，称为转导或转染。转导在有病毒参与的这一点与转化不同。本发明中，转化体是指通过载体的插入而使遗传性状发生变化的细胞或个体，其中，所述载体包含编码所述p8蛋白质或p8蛋白质的活性部位的dna，遗传性状发生变化的所述细胞优选为乳酸菌，但并不限定于此。本发明的一个具体实施方式中，“大肠疾病”是指大肠中发生的各种疾病的总称，优选包括大肠癌、大肠息肉、大肠炎、缺血性肠病、痢疾、肠道血管发育不良、憩室病、肠易激综合症及克罗恩病等，但并不限定于此。本发明的一个具体实施方式中，“药学组合物”是指为了特定目的而施用的组合物。在本发明的目的方面，本发明的药学组合物可以是选自由seqidno：2～10表示的氨基酸序列中的一种以上的蛋白质，或者可以是包含选自由seqidno：2～10表示的氨基酸序列中的一种以上的蛋白质作为有效成分的组合物，并且可以包含参与其中的蛋白质及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。所述“药学上可接受的”载体或赋形剂是指政府管理部门所认可的载体或赋形剂，或者是为了用于脊椎动物，以及更加特别地，为了用于人类，政府所认可的或其他普遍认可的药典中列出的载体或赋形剂。为了非口服施用，本发明的药学组合物可以为在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形态，并可以制备为固体或半固体的形态，但最优选可以为液体形态。此外，本发明的药学组合物可以包含诸如悬浮剂、稳定剂、溶解剂及/或分散剂的剂型化剂，并可以进行灭菌。所述药学组合物可以在制备及储存条件下保持稳定，并且可以防止如细菌或霉菌等微生物的污染作用而进行保存。作为可替代方案，为了在使用之前与适当的载体进行重组，本发明的药学组合物可以为灭菌的粉末形态。药学组合物可以以单位剂量的形态存于微针贴片、安瓿，或其他单位剂量容器，或多次剂量容器中。作为可替代方案，药学组合物可以仅仅以无菌液体载体的状态进行保存，例如，需要在使用前即刻添加用于注射的水的冻结-干燥(冷冻干燥)的状态进行保存。即时使用的注射溶液及悬浮液可以制备为灭菌的粉末、颗粒或片剂。在几个非限制性实施方式中，本发明的药学组合物可以剂型化为液体，或者可以以微球的形态包含于液体中。此外，在某个非限制性实施方式中，适合于本发明的药学组合物的赋形剂可以包括保存剂、悬浮剂、稳定剂、染料、缓冲剂、抗菌剂、抗真菌剂及等渗剂，例如，可以包括糖或氯化钠。其中所使用的术语“稳定剂”是指为了提高储存寿命而选择性地用于本发明的药学组合物中的化合物。在非限制性的实施中，附加的稳定剂可以是糖、氨基酸或聚合物。此外，本发明的药学组合物可以包含一种或一种以上的药学上可接受的载体，所述载体可以是溶剂或分散介质。药学上可接受的载体的非限制性例子包括水、盐水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液态聚乙二醇)、油及它们的适当的混合物。适用于本发明的药学组合物的灭菌技术的非限制性例子包括通过抑制细菌的过滤器的过滤、完全灭菌化、灭菌制剂的组合、照射放射线、照射灭菌气体、加热、真空干燥及冷冻干燥。本发明的一个具体实施方式中，“施用”是指以某种适当的方法对患者导入本发明的组合物，本发明的组合物的施用途径只要能够到达目标组织，则可以通过任何通常的途径进行施用。可以进行口服施用、腹腔内施用、静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、皮内施用、鼻内施用、肺内施用、直肠内施用、腔内施用、腹腔内施用、硬膜内施用，但是本发明的有效成分为选自由seqidno：2～10表示的氨基酸序列中的一种以上的蛋白质、或包含上述物质作为有效成分的组合物的情况下，最优选以粉末、片剂、胶囊或液体剂型的形态进行口服施用，但并不受限于此。本发明的目标适应症的治疗方法可以包括以药剂学有效剂量施用所述药学组合物。本发明中的有效剂量可以根据包括疾病的种类、疾病的严重程度、组合物中含有的有效成分及其他成分的种类及含量、剂型的种类、以及患者的年龄、体重、一般健康状态、性别及饮食、施用时间、施用途径及组合物的分泌率、治疗疗程、同时使用的药物在内的多种因素进行调节。本发明的一个具体实施方式中提供一种蛋白质，其包含选自由seqidno：8、9及10表示的氨基酸序列中的任意一种以上的氨基酸序列，并且提供一种蛋白质，其中，所述蛋白质由seqidno：2表示，并且提供一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质源自乳酸菌，提供一种蛋白质，其中，所述乳酸菌为选自鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)、副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)及短乳杆菌(lactobacillusbrevis)中的任意一种以上，并且提供一种蛋白质，其中，所述乳酸菌为鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)。本发明的另一个具体实施方式中提供包含蛋白质作为有效成分的用于预防或治疗大肠疾病的药学组合物，其中，所述蛋白质包含选自由seqidno：8、9及10表示的氨基酸序列中的任意一种以上的氨基酸序列，并且提供用于预防或治疗大肠疾病的药学组合物，其中，所述大肠疾病为选自大肠癌、大肠息肉、大肠炎、缺血性肠病、痢疾、肠道血管发育不良、憩室病、肠易激综合症及克罗恩病中的任意一种以上，并且提供用于预防或治疗大肠疾病的药学组合物，其中，所述大肠疾病为大肠癌。本发明的另一个具体实施方式中提供包含蛋白质作为有效成分的用于预防或改善大肠疾病的食品组合物，其中，所述蛋白质包含选自由seqidno：8、9及10表示的氨基酸序列中的任意一种以上的氨基酸序列，并且提供用于预防或改善大肠疾病的食品组合物，其中，所述大肠疾病为选自大肠癌、大肠息肉、大肠炎、缺血性肠病、痢疾、肠道血管发育不良、憩室病、肠易激综合症及克罗恩病中的任意一种以上，并且提供用于预防或改善大肠疾病的食品组合物，其中，所述大肠疾病为大肠癌。本发明的另一个具体实施方式中提供载体，其是为了表达包含选自由seqidno：8、9及10表示的氨基酸序列中的任意一种以上的氨基酸序列的蛋白质而制备的。本发明的另一个具体实施方式中提供包含载体的除人类之外的转化体，其中，所述载体是为了表达包含选自由seqidno：8、9及10表示的氨基酸序列中的任意一种以上的氨基酸序列的蛋白质而制备的，并且提供一种转化体，其中，所述转化体为乳酸菌，并且提供一种转化体，其中，所述乳酸菌为戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)。本发明的另一个具体实施方式中提供用于预防或治疗大肠疾病的药学组合物，其包含除人类之外的转化体作为有效成分，其中，所述转化体包含为了表达蛋白质而制备的载体，所述蛋白质包含选自由seqidno：8、9及10表示的氨基酸序列中的任意一种以上的氨基酸序列，并且提供用于预防或治疗大肠疾病的药学组合物，其中，所述转化体为乳酸菌，并且提供用于预防或治疗大肠疾病的药学组合物，其中，所述乳酸菌为戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)，并且提供用于预防或治疗大肠疾病的药学组合物，其中，所述大肠疾病为选自大肠癌、大肠息肉、大肠炎、缺血性肠病、痢疾、肠道血管发育不良、憩室病、肠易激综合症及克罗恩病中的任意一种以上，并且提供用于预防或治疗大肠疾病的药学组合物，其中，所述大肠疾病为大肠癌。本发明的另一个具体实施方式中提供用于预防或改善大肠疾病的食品组合物，其包含除人类之外的转化体作为有效成分，其中，所述转化体包含为了表达蛋白质而制备的载体，所述蛋白质包含选自由seqidno：8、9及10表示的蛋白质中的任意一种以上的氨基酸序列，并且提供用于预防或改善大肠疾病的食品组合物，其中，所述转化体为乳酸菌，并且提供用于预防或改善大肠疾病的食品组合物，其中，所述乳酸菌为戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)，并且提供用于预防或改善大肠疾病的食品组合物，其中，所述大肠疾病为选自大肠癌、大肠息肉、大肠炎、缺血性肠病、痢疾、肠道血管发育不良、憩室病、肠易激综合症及克罗恩病中的任意一种以上，并且提供用于预防或改善大肠疾病的食品组合物，其中，所述大肠疾病为大肠癌。下面，对上述的本发明进行阶段性的详细说明。发明效果对于包括大肠癌、大肠炎、肠易激综合症、克罗恩病等在内的大肠疾病，使用乳酸菌作为治疗剂是公知的技术，但是对于在乳酸菌中确认有效成分蛋白质并利用其的技术的开发尚不完善。本发明涉及源自乳酸菌的蛋白质及其制备方法，本发明的源自乳酸菌的蛋白质是从治疗大肠癌的效果优异的乳酸菌(鼠李糖乳杆菌)中分离的精制蛋白质，其对大肠疾病的显著的效果得到验证，因此，期待在医学领域中其作为天然蛋白质大肠疾病治疗剂的广泛的应用。附图说明图1为示出本发明的一个实施例中的通过色谱法将鼠李糖乳杆菌菌体破碎液按照尺寸分类并分离为蛋白质和低分子物质的结果的图。图2为示出本发明的一个实施例中的用于制备本发明的p8蛋白质的蛋白质精制过程中的各步骤的结果的图。图3为示出本发明的一个实施例中的通过对本发明的p8蛋白质进行氨基酸序列分析(测序)来确认序列的结果的图。图4为本发明的一个实施例中的与本发明的p8蛋白质的氨基酸序列同源性高的源自乳酸菌的蛋白质之间的共有活性部位序列模式图。图5为示出本发明的一个实施例中的用本发明的p8蛋白质处理大肠癌细胞株dld-1和ht-29后确认抑制细胞生长效果的结果的图。图6为示出本发明的一个实施例中的用本发明的p8蛋白质处理大肠癌细胞株dld-1后确认阻碍细胞存活能力效果的结果的图。图7为示出本发明的一个实施例中的用本发明的p8蛋白质处理nih3t3细胞后确认细胞毒性的结果的图。图8为示出本发明的一个实施例中的用本发明的p8蛋白质处理大肠癌细胞株dld-1后确认抑制细胞迁移性效果的结果的图。图9为示出本发明的一个实施例中的用本发明的p8蛋白质处理大肠癌异种移植鼠模型后确认抑制癌组织生长效果的结果的图。最佳实施方式在6孔板中以1.5×106细胞(cells)/孔的密度培养大肠癌细胞株dld-1细胞，并以1μg/ml或10μg/ml浓度添加本发明的p8蛋白质。将其培养24小时至48小时，然后用磷酸缓冲液洗涤2次，并用1ml的live/dead存活性/细胞毒性染色试剂盒(live/deadviability/cytotoxicitystainingkit)处理后反应20～40分钟。通过上述染色，活细胞被染为绿色，死细胞被染为红色。在荧光显微镜下确认上述细胞而确认抑制存活性程度的结果，用p8蛋白质处理大肠癌细胞时，与阴性对照组(cont.)相比，显示出减少的细胞存活率，并且确认了所处理的p8蛋白质的浓度越高，或者用p8蛋白质处理的时间越长，越会阻碍大肠癌细胞株的存活能力。具体实施方式下面，通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅用于更加具体地说明本发明，根据本发明的主旨，本发明的范围不受这些实施例的限制，这对于本领域具有通常知识的技术人员而言是显而易见的。实施例1：源自乳酸菌的蛋白质的分离及精制实施例1-1.源自乳酸菌的蛋白质的精制用多种乳酸菌的培养上清液或菌体破碎液处理大肠癌细胞株dld-1，并确认了抗癌活性。在其中筛选出抗癌活性最佳的鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus，kctc12202bp)菌体破碎液。为了从所述鼠李糖乳杆菌菌体破碎液中精制作为有效成分的抗癌蛋白质，通过快速蛋白液相色谱(fplc，fastproteinliquidchromatography，ge医疗公司)设备进行尺寸排除色谱法(sizeexclusionchromatography，交联葡聚糖凝胶(sephadex)g-25，脱盐柱，ge医疗公司)，从而只分离蛋白质。所述蛋白质和低分子物质得到分离的峰值图表记载于图1中。使用20mm的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(trisbuffer，ph为8.0)，对只分离蛋白质的区域进行透析，回收未吸附在hitrapdeaeff(ge医疗公司)上的蛋白质，并通过尺寸为3kda的膜(membrane)进行浓缩，然后利用0.05m磷酸盐的ph为6.0的溶液再次进行透析，并吸附于hitrapdeaesp(ge医疗公司)上，根据0.5m的氯化钠的浓度梯度，依次进行分离。用分离的各分馏物处理大肠癌细胞，并确认抗癌活性，将抗癌活性最佳的分馏物进行浓缩，并通过在sds-page中确认的方法，分离尺寸为8kda的蛋白质，并将其命名为“p8蛋白质”。将制备所述p8蛋白质的过程中各步骤的结果记载于图2中。实施例1-2.源自乳酸菌的蛋白质的鉴定将通过实施例1-1的方法精制的p8蛋白质进行考马斯亮蓝-250染色，然后进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析(maldi-tof，matrixassistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry)，从而算出了称为“未查明蛋白质lgg_02452[鼠李糖乳杆菌]”的编号(id)，将所述蛋白质转移到pvdf膜中，并通过n-末端氨基酸测序来进行鉴定的结果，确认了n-末端氨基酸序列为a-t-v-d-p-e-k-t-l-f。上述结果示于图3中。此外，将所述“未查明蛋白质lgg_02452”的dna序列为模板，制作如表1所示的引物，并通过聚合酶链式反应(pcr)进行序列分析(测序)的结果，确认了如表2所述的碱基序列及氨基酸序列。[表1]“未查明蛋白质lgg_02452”的引物序列正向5’-atggaggtaatcattatggcaac-3’反向5’-cttcttgagaaccttttctg-3’[表2]实施例1-3.源自乳酸菌的蛋白质的活性部位鉴定为了追踪实施例1-1中精制的p8蛋白质的活性部位，搜索了与p8蛋白质序列相似的源自乳酸菌的蛋白质，并将其结果记载于表3中。分析p8蛋白质和表3中记载的蛋白质之间的序列同源性，将由此获得的3处活性部位的序列记载于表4中。所述源自乳酸菌的蛋白质之间的共有活性部位序列模式图记载于图4中。[表3][表4]实施例1-4.源自乳酸菌的蛋白质的活性部位的抗癌效果的确认在96孔板中以1×104细胞(cells)/孔的密度培养大肠癌细胞株dld-1细胞，并以10μg/ml的浓度添加实施例1～3的活性部位1～3(seqidno：8～10)。阴性对照组使用了对蛋白质进行精制时所使用的缓冲溶液的0.1％的pbs。将其培养24小时，然后分别用10μl的用于测量细胞存活率的试剂盒(同仁化学研究所细胞计数试剂盒wst-8(dojindocellcountkitwst-8))处理每个孔后反应2小时。利用酶标仪(microplatereader，安玛西亚(amersham)公司，伯乐(biorad)公司，美国，日本)在450nm下测量其吸光度，并将测量值计算为细胞存活率(cellsurvivalrate)。其结果，确认了与阴性对照组相比，用活性部位1～3进行处理的实验组中，大肠癌细胞株dld-1的细胞生长显著地得到抑制。实施例2.在试管内(invitro)的源自乳酸菌的蛋白质(p8蛋白质)的抗癌效果的确认实施例2-1.细胞存活率的确认在96孔板中以1×104细胞(cells)/孔的密度分别培养大肠癌细胞株dld-1和ht-29细胞，并以0.39μg/ml～100μg/ml的浓度添加实施例1的p8蛋白质。阴性对照组使用了对蛋白质进行精制时所使用的缓冲溶液的0.1％的pbs。将其培养24小时，然后分别用10μl的用于测量细胞存活率的试剂盒(同仁化学研究所细胞计数试剂盒wst-8(dojindocellcountkitwst-8))处理每个孔后反应2小时。利用酶标仪(microplatereader，安玛西亚(amersham)公司，伯乐(biorad)公司，美国，日本)在450nm下测量其吸光度，并将测量值计算为细胞存活率(cellsurvivalrate)。上述结果示于图5中。实验结果，相对于大肠癌细胞株dld-1和ht-29，p8蛋白质显示出约20％的抑制细胞生长的效果，从而确认了其具有抑制癌细胞生长的效果。实施例2-2.抗癌效果的确认在6孔板中以1.5×106细胞(cells)/孔的密度培养大肠癌细胞株dld-1细胞，并以1μg/ml或10μg/ml的浓度添加实施例1的p8蛋白质。将其培养24小时至48小时，然后用磷酸缓冲液洗涤2次，并用1ml的live/dead存活性/细胞毒性染色试剂盒(live/deadviability/cytotoxicitystainingkit)处理后反应20～40分钟。通过上述染色，活细胞被染为绿色，死细胞被染为红色。在荧光显微镜下确认上述细胞而确认抑制存活性的程度，并将其结果示于图6中。实验结果，用p8蛋白质处理大肠癌细胞时，与阴性对照组(cont.)相比，显示出减少的细胞存活率，并且确认了所处理的p8蛋白质的浓度越高，或者用p8蛋白质处理的时间越长，越会阻碍大肠癌细胞株的存活能力。实施例2-3.细胞毒性的确认为了确认实施例1的p8蛋白质是否具有细胞毒性，进行了在nih3t3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblastcell))中大量表达的p8蛋白质和阳性对照组bsa(牛血清白蛋白(bovineserumalbumin))的细胞毒性实验。首先，在96孔板中分别以1×104细胞(cells)/孔的密度培养nih3t3细胞，并以0.39μg/ml～100μg/ml的浓度添加bsa和通过大量表达而进行精制的p8蛋白质。将其培养24小时，然后分别用10μl的用于测量细胞存活率的试剂盒(同仁化学研究所细胞计数试剂盒wst-8(dojindocellcountkitwst-8))处理每个孔后反应2小时。利用酶标仪(microplatereader，安玛西亚(amersham)公司，伯乐(biorad)公司，美国，日本)在450nm下测量其吸光度，并将测量值计算为细胞存活率(cellsurvivalrate)。上述结果示于图7中。实验结果，与用bsa处理的细胞相比，用p8蛋白质处理的细胞的存活率没有显著的差异，因此，确认了没有因p8蛋白质自身而引起的细胞毒性。实施例2-4.抑制大肠癌细胞迁移性的效果的确认每天以1μg/ml浓度的实施例1的p8蛋白质处理大肠癌细胞dld-1细胞1天、3天或7天，然后将各个细胞分株于6孔板中。将分株的dld-1细胞培养一夜，然后利用200μl的尖端(tip)向正在培养细胞的板中施加划痕。为了去除所述划痕产生的浮游物质，用pbs洗涤两次后进一步培养24小时。将其结果示于图8中。实验结果，在没有用p8蛋白质处理的对照组中，划痕部位几乎由细胞填充，反之，在用p8蛋白质处理的实验组中，确认了划痕的填充速度会降低。尤其，确认了细胞的迁移速度与用p8蛋白质处理的时间的持续性(1天、3天或7天)成比例地显著减少。对其进行统计处理确认时，确认了与没有用p8蛋白质处理的对照组中的由细胞填充的面积相比，用p8蛋白质处理1天时细胞的迁移速度降低15.7％，用p8蛋白质处理3天时细胞的迁移速度降低45.9％，用p8蛋白质处理7天时细胞的迁移速度降低58.3％。实施例3.源自乳酸菌的蛋白质(p8蛋白质)在体内(invivo)的抗癌效果的确认实施例3-1.大肠癌异种移植模型的制备将源自人类的大肠癌细胞株(dld-1)移植到裸小鼠的皮下，由此制备异种移植模型(xenograftmodel)，并利用其评价实施例1的p8蛋白质的抗癌活性。首先，为了制备大肠癌异种移植模型，将1×107细胞(cells)/100μl的dld-1细胞移植到裸小鼠的皮下。移植10～15天后确认肿瘤细胞的移植状态，并持续观察显示出稳定的移植状态的小鼠。在发生肿瘤的中心坏死(centralnecrosis)之前，筛选出通过充足的血液供给而显示出癌的急速生长的小鼠，从而获得癌组织。在获得的癌组织中，将主要发生急速的细胞分裂的外周部位切成一定的尺寸(3×3×3mm)，从而制作癌组织切片(tumorfragment)。之后，将癌组织切片置于套管针(trocar)的末端进行准备，在动物的左后肢的侧前方切开约4mm，并通过此处插入准备好的套管针，使末端达到左前肢的后方的躯干侧面部分。将套管针轻轻地快速旋转360度的同时拿掉，使癌组织切片位于目标位置，并对切口部位进行消毒。在皮肤上方进行触诊，从而确认癌组织切片的位置，每周观察癌的生长2次以上，并仅筛选显示出成功的移植状态的小鼠用于实验。实施例3-2.抗癌效果的确认如表5所示，将通过实施例3-1的方法制备的大肠癌异种移植模型进行分组，以每周2次的频率向腹腔施用药物4周，共施用8次。[表5]在施用药物的期间，以每2天1次的频率，使用游标卡尺测量肿瘤的尺寸，并根据表6中记载的公式将测量的值计算为体积。完成共8次的施用后，摘取肿瘤并拍摄照片，将上述计算出的体积图表及从小鼠中摘取的肿瘤的照片记载于图9中。[表6]肿瘤的体积{长轴的长度×(短轴的长度×短轴的长度)}/2实验结果，与阴性对照组相比，经过处理的所有浓度的p8蛋白质实验组具有显著水平的抑制癌生长的效果，并且确认了用10mg/kg以上的浓度的p8蛋白质进行处理时，能够期待胜过现有抗癌剂的水平的抑制癌生长的效果。工业实用性本发明涉及源自乳酸菌的蛋白质及其制备方法，本发明的源自乳酸菌的蛋白质是从治疗大肠癌的效果优异的乳酸菌(鼠李糖乳杆菌)中分离的精制蛋白质，其对大肠疾病的显著的效果得到验证，因此，期待在医学领域中其作为天然蛋白质大肠疾病治疗剂的广泛的应用。序列目录自由文本(freetext)seqidno：1(鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)，dna)gcaacagtagatcctgaaaagacattgtttctcgatgaaccaatgaacaaggtatttgactggagcaacagcgaagcacctgtacgtgatgcgctgtgggattattacatggaaaagaacagccgtgataccatcaagactgaagaagaaatgaaaccagtcctagacatgtccgacgatgaggtcaaagccctagcagaaaaggttctcaagaagtaaseqidno：2(鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)，prt)alathrvalaspproglulysthrleupheleuaspgluprometasnlysvalpheasptrpserasnserglualaprovalargaspalaleutrpasptyrtyrmetglulysasnserargaspthrilelysthrglugluglumetlysprovalleuaspmetseraspaspgluvallysalaleualaglulysvalleulyslysseqidno：3(嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)，prt)alaaspgluileilelysthralaleuleuasparghismetlysglualapheasptrpseraspseraspmetprovalargaspalaleutrpasptyrphemetglulysasnglygluaspmetleupropheleuargaspthrmetlysthrglulysaspseraspglulysileglualaphevalasngluasnleulyslysseqidno：4(副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)，prt)alaservalaspproglulysthrleupheleuaspgluprometasnlysvalpheasptrpseraspserglualaprovalargaspalaleutrpasptyrtyrmetglulysasnserargaspthrilelysthrglugluglumetlysprovalleuaspmetseraspaspgluvallysalaleualaglulysvalleulyslysseqidno：5(植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，prt)alaalaalavalglumetasnsermetleuaspglulysmetthraspvalpheasptrpseraspserlysleuprovalargaspalailetrpasnhisphemetaspalaaspserhisaspthrasplysthralaaspgluvalalaprotyrmetsermetaspglualalysleulyssergluvalglulysleuleulysalaseqidno：6(戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)，prt)alathrthrleulysthrgluleuleuaspglnlysmetthrgluvalpheasptrpserasnaspglnthrproleuargaspalamettrpasnhisvalmetaspaspasnglyhisaspthrmetlysthrilealaglualalyslystrpgluasnmetasnaspalagluleulyslysthralagluglnmetleulysseqidno：7(短乳杆菌(lactobacillusbrevis)，prt)alavalvalglulysthralaleuleuaspglulysmetasngluvalpheasptrpseraspserlysgluprovalargaspalaleutrpasnhisphemetgluserasnglyhisasnthraspgluthrglualasermetlysgluileaspalalysseraspalaaspvalargsertyrvalgluaspasnleulyslysseqidno：8(鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)，prt)alathrvalaspproglulysthrleupheleuaspgluprometasnlysvalpheasptrpserasnsergluseqidno：9(鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)，prt)metasnlysvalpheasptrpserasnserglualaprovalargaspalaleutrpasptyrtyrmetglulysasnserargaspthrilelysthrseqidno：10(鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)，prt)alaprovalargaspalaleutrpasptyrtyrmetglulysasnserargaspthrilelysthrglugluglumetlysprovalleumetseraspaspgluvallysalaleualaglulysvalleulyslys序列表<110>细胞生物技术公司<120>源自乳酸菌的蛋白质及其制备方法<130>khp182110720.2<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>222<212>dna<213>鼠李糖乳杆菌()<400>1atggcaacagtagatcctgaaaagacattgtttctcgatgaaccaatgaacaaggtattt60gactggagcaacagcgaagcacctgtacgtgatgcgctgtgggattattacatggaaaag120aacagccgtgataccatcaagactgaagaagaaatgaaaccagtcctagacatgtccgac180gatgaggtcaaagccctagcagaaaaggttctcaagaagtaa222<210>2<211>73<212>prt<213>鼠李糖乳杆菌()<400>2metalathrvalaspproglulysthrleupheleuaspglupromet151015asnlysvalpheasptrpserasnserglualaprovalargaspala202530leutrpasptyrtyrmetglulysasnserargaspthrilelysthr354045glugluglumetlysprovalleuaspmetseraspaspgluvallys505560alaleualaglulysvalleulyslys6570<210>3<211>72<212>prt<213>嗜酸乳杆菌()<400>3metalaaspgluileilelysthralaleuleuasparghismetlys151015glualapheasptrpseraspseraspmetprovalargaspalaleu202530trpasptyrphemetglulysasnglygluaspmetleupropheleu354045argaspthrmetlysthrglulysaspseraspglulysilegluala505560phevalasngluasnleulyslys6570<210>4<211>73<212>prt<213>副干酪乳杆菌()<400>4metalaservalaspproglulysthrleupheleuaspglupromet151015asnlysvalpheasptrpseraspserglualaprovalargaspala202530leutrpasptyrtyrmetglulysasnserargaspthrilelysthr354045glugluglumetlysprovalleuaspmetseraspaspgluvallys505560alaleualaglulysvalleulyslys6570<210>5<211>72<212>prt<213>植物乳杆菌()<400>5metalaalaalavalglumetasnsermetleuaspglulysmetthr151015aspvalpheasptrpseraspserlysleuprovalargaspalaile202530trpasnhisphemetaspalaaspserhisaspthrasplysthrala354045aspgluvalalaprotyrmetsermetaspglualalysleulysser505560gluvalglulysleuleulysala6570<210>6<211>70<212>prt<213>戊糖片球菌()<400>6metalathrthrleulysthrgluleuleuaspglnlysmetthrglu151015valpheasptrpserasnaspglnthrproleuargaspalamettrp202530asnhisvalmetaspaspasnglyhisaspthrmetlysthrileala354045glualalyslystrpgluasnmetasnaspalagluleulyslysthr505560alagluglnmetleulys6570<210>7<211>71<212>prt<213>短乳杆菌()<400>7metalavalvalglulysthralaleuleuas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