衍生自精氨酸富集结构域的经修饰抗菌肽的制作方法

抗生素已被用于治疗细菌感染超过60年。近期，具抗生素抗性的细菌的数量增加已造成公共卫生的主要威胁。用于临床治疗的新抗生素的开发有急迫的需求。来自各种物种的抗菌肽(antimicrobialpeptide，amp)可作为宿主对抗病原微生物的防御武器。因为它们可经由不同的作用方式杀死细菌，抗菌肽被认为是克服抗生素抗性的潜在候选方式。

概述

在一个方面，本文描述了一种抗菌肽。所述肽包含2至20个可变结构域，每个可变结构域是2至20个连续碱性氨基酸的序列，其中(a)所述可变结构域通过可变接头而彼此分开，(b)所述可变接头除两个以上连续碱性氨基酸之外具有1至20个任意氨基酸，以及(c)所述序列具有不超过100个氨基酸。在一实施方案中，所述肽具有至少3个或4个可变结构域。所述肽具有c-端半胱氨酸。在一些实施方案中，在可变结构域中至少一个碱性氨基酸是精氨酸。例如，在所述肽的每个可变结构域中所有碱性氨基酸可为精氨酸残基。备选地或另外地，在该抗菌肽中至少一个可变结构域具有赖氨酸。在一实施方案中，至少一个可变结构域具有组氨酸。所述肽可以具有环状结构。

在该肽中至少一个碱性氨基酸可以是经化学修饰的氨基酸。在一实施方案中，该经化学修饰的氨基酸是d-氨基酸，例如d-精氨酸。所述可变结构域和所述可变接头可衍生自嗜肝dna病毒核心蛋白的精氨酸富集结构域(arginine-richdomainofahepadnaviruscoreprotein，hbcard)。在一实施方案中，该hbcard包含嗜肝dna病毒核心蛋白的残基147至c-端残基的序列。在该肽中每个可变结构域可具有3个或4个精氨酸残基并且在该肽中每个可变接头可具有2至4个氨基酸。该肽可对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、寄生虫、或病毒表现出广谱抗菌活性。

在一实施方案中，所述抗菌肽包含选自由以下各项组成的组的共有序列：

(i)(x1)grx2p(x3)x4px5p(x6)x7qx8p(x9)(seqidno：1)，其中x1、x3、x6、和x9中的每个独立地是可变结构域，并且x2、x4、x5、x7、和x8中的每个独立地是任意氨基酸或不存在，

(ii)(x1)grx2p(x3)x4px5p(x6)(seqidno：2)，其中x1、x3、和x6中的每个独立地是可变结构域，并且x2、x4、和x5中的每个独立地是任意氨基酸或不存在，以及

(iii)(x1)x2px3p(x4)x5qx6p(x7)(seqidno：3)，其中x1、x4、和x7中的每个独立地是可变结构域，并且x2、x3、x5、和x6中的每个独立地是任意氨基酸或不存在。每个可变结构域是2至20个连续碱性氨基酸的序列。

所述肽可以具有选自由以下各项组成的组的共有序列：

(i)(x1)grx2p(x3)x4px5p(x6)x7qx8p(x9)x10c(seqidno：4)，以及

(ii)(x1)grx2p(x3)x4px5p(x6)x7qx8p(x9)x10q(seqidno：5)，

其中x1、x3、x6、和x9中的每个独立地是可变结构域，并且x2、x4、x5、x7、x8和x10中的每个独立地是任意氨基酸或不存在。

在一实施方案中，所述抗菌肽包含选自由以下各项组成的组的序列：

(i)tvvrrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrsqsresqc(seqidno：6)，其中至少一个所述精氨酸残基是d-精氨酸，

(ii)rrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrsc(seqidno：7)，

(iii)rrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrsq(seqidno：8)，

(iv)rrrgrprrrpprrrrqprrrrc(seqidno：9)，

(v)rrrgrsprrrtpsprrrrc(seqidno：10)，

(vi)rrrgrprrrpprrrrc(seqidno：11)，

(vii)rrrtpsprrrrsqsprrrrc(seqidno：12)，以及

(viii)rrrpprrrrqprrrrc(seqidno：13)。

例如，所述抗菌肽可包含rrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrsc(seqidno：7)的序列，其中在该序列中每个精氨酸残基是l-精氨酸。备选地，所述肽可具有rrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrsc(seqidno：7)的序列，其中在该序列中至少一个所述精氨酸残基是d-精氨酸。

在一实施方案中，所述抗菌肽包含rrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrsc(seqidno：7)的序列，其中r是l-精氨酸并且r是d-精氨酸。备选地，所述肽可包含rrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrsc(seqidno：7)的序列，其中r是l-精氨酸并且r是d-精氨酸。

所述抗菌肽可包含rrrgrprrrpprrrrqprrrrc(seqidno：9)的序列，其中在该序列中至少一个所述精氨酸残基(例如20％、30％、40％、或50％的所述精氨酸残基)是d-精氨酸。例如，所述序列可为rrrgrprrrpprrrrqprrrrc(seqidno：9)，其中r是l-精氨酸并且r是d-精氨酸。

在一实施方案中，所述抗菌肽还包含非hbcard肽(例如，亲和力标签、信号序列、配体、或另一抗菌肽或其片段)。所述非-hbcard肽可为多组氨酸(poly-histidine)或其类似物。在一实施方案中，所述肽具有选自由以下各项组成的组的序列：

(i)rrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrshhhhhh(seqidno：14)，

(ii)hhhhhhrrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrs(seqidno：15)，

(iii)rrrgrprrrpprrrrqprrrrhhhhhh(seqidno：16)，以及(iv)hhhhhhrrrgrprrrpprrrrqprrrr(seqidno：17)。

在另一个方面，本文描述了一种抗菌肽缀合物，其包含本文所述的抗菌肽以及非肽部分。

在另一个方面，本文描述了一种药物组合物。所述药物组合物包含所述抗菌肽或所述抗菌肽缀合物以及药用载体。

本文还预期一种治疗有此需要的受试者的感染的方法。所述方法包括向所述受试者施用本文所述的抗菌肽、抗菌肽缀合物或药物组合物。

以下的附图和说明书描述一个或多个实施方案的细节。实施方案的其他特征、目的和优点将由说明书和附图以及权利要求中理解。

附图简述

图1包含两组hbcard结构域的序列比对。(a)hbcard序列是人类(seqidno：6)、绒毛猴(seqidno：18)、地松鼠(seqidno：19)、土拨鼠(seqidno：20)以及蝙蝠(seqidno：21)中高度保守的序列。(b)还有在鸭(seqidno：22)、苍鹭(seqidno：23)、鹦鹉(seqidno：24)、罗斯雁(seqidno：25)以及雪雁乙型肝炎病毒(seqidno：26)的hbcc-端中分离的四个正电荷簇。

图2是显示l-和d-hbcard肽之间的血清抗性的比较的一组图。肽(l-hbcard以及d-hbcard)与含有5％胎牛血清(a)、5％小鼠血清(b)或人类血清(雄性或雌性)(c)的mbc缓冲液(10mm磷酸钠和50mm氯化钠，ph7.2)一起在37℃下培养3小时。使用sds-page电泳以及greenangel染色确定肽的量。(d)在mbc测定中肽d-hbcard表现出比l-hbcard肽高10,000倍的能力。肽(l-hbcard以及d-hbcard)与金黄色葡萄球菌(s.aureus)atcc19636以及5％小鼠血清或未加入5％小鼠血清在37℃下培养3小时。经由菌落形成测定确定抗菌活性，***p＜0.0001。

图3是显示l-和d-hbcard肽之间的溶血作用的比较的图。人红血球与不同浓度的所述肽一起培养。溶血表示为tritonx-100诱导的溶血的百分比。***p＜0.0001。

图4是显示感染金黄色葡萄球菌的小鼠败血症模型中l-和d-型hbcard肽之间体内保护活性的比较的一组图。(a)三周龄icr小鼠接种金黄色葡萄球菌(4×10⁶cfu/小鼠)并在接种两小时后腹腔注射(i.p.)pbs、l-hbcard、或d-hbcard。每组有十只小鼠。(b)和(c)三周龄icr小鼠分别在第0、3及6天以l-和d-hbcard肽(5mg/kg)进行免疫。在第14天，所述小鼠接种金黄色葡萄球菌(4×10⁶cfu/小鼠)并在接种1小时后分别腹腔注射(i.p.)pbs、l-hbcard或d-hbcard(10mg/kg)。另一组小鼠平行地以pbs处理作为对照组。每组动物含五只小鼠。*p＜0.05；***p＜0.0001；ns，无显著性。

图5是显示在icr小鼠败血症模型中不同剂量的各种经修饰的hbcard肽的体内保护效力的图。

图6是显示在balb/c小鼠肺部感染模型中150-177c和150-177q肽的体内保护效力的图。粘菌素抗性鲍氏不动杆菌(a.baumannii)经由气管内途径接种。

图7是显示hbcard肽d-150-177c与多粘菌素(polymyxin)b相比的较低的体内毒性的一组图。在第0天，雄性icr小鼠(5只小鼠/组)分别用不同剂量的d-150-177c肽(20-80mg/kg)和多粘菌素b(50mg/kg)腹腔(ip.)注射。(a)监控所有组的存活率持续7天。(b)在第1天确定自用d-150-177c及多粘菌素b治疗的小鼠收集的血清样本的丙氨酸氨基转移酶(alt)活性。实线表示icr小鼠(charlesriverlaboratories)的alt值的平均值(45u/l)。

图8是显示在小鼠败血症模型中所有d-精氨酸或部分d-精氨酸取代的150-177c肽的体内保护效力的图。在接种两小时后，将小鼠(n＝10/组)分别用5mg/kg的各种肽d-、dl-、ld-150-177c和pbs治疗。肽d-和dl-150-177c保护所有感染金黄色葡萄球菌的小鼠免于死亡，而肽ld-150-177c仅保护80％的小鼠。

图9是显示在小鼠败血症模型中在不同剂量下从肽dl-150-177c缺失丝氨酸和苏氨酸残基改善体内保护效力的图。

详述

意外发现衍生自hbv核心蛋白的精氨酸富集结构域的某些经修饰的肽表现出广谱抗菌活性。

本文中描述了一种抗菌肽。其包含至少两个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个)可变结构域。所述可变结构域是串联的并且通过可变接头而彼此分开。所述抗菌肽可具有100个氨基酸的最大长度(例如，小于10、10、14、15、20、21、22、25、28、30、35、37、40、45、47、50、55、57、60、65、70、75、80、85、90、95、或100个氨基酸)。在一实施方案中，所述肽具有c-端半胱氨酸。

每个可变结构域独立地是至少两个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个)连续碱性氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸)的序列。每个可变结构域可包含相同的碱性氨基酸或不同的碱性氨基酸的序列。例如，所述抗菌肽可包含2至20个相同或不同的可变结构域，其各自是x1x2x3x4x5x6x7x8x9x10x11x12x13x14x15x16x17x18x19x20(seqidno：27)，其中x1-x20中的每个独立地是精氨酸、组氨酸或赖氨酸(天然的或经化学修饰的)并且x3-x20中的任何可以存在或不存在。例如，每个可变结构域可具有2至10个碱性氨基酸。

在一实施方案中，在所述肽中至少一个可变结构域仅由精氨酸残基组成。在另一实施方案中，所述肽中的所有可变结构域都仅含精氨酸残基。备选地，所述肽可包含至少一个具有一个或多个组氨酸或赖氨酸残基的可变结构域。

每个可变接头具有至少一个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个)并且可包含任何氨基酸。其不能具有两个以上连续的碱性氨基酸。

术语“氨基酸”是指20种标准氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷胺酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)中任一。该术语也可指非标准、非蛋白质原(non-proteinogenic)或经化学修饰的氨基酸或氨基酸类似物。氨基酸可处于l-或d-型立体异构体。

术语“碱性氨基酸”是指精氨酸、赖氨酸或组氨酸、其l-或d-型或其类似物。

非标准氨基酸包括硒代半胱氨酸(selenocysteine)、吡咯赖氨酸(pyrrolysine)、n-甲酰甲硫氨酸(n-formylmethionine)、非蛋白质原氨基酸、氨基酸类似物和经化学修饰的氨基酸。经化学修饰的氨基酸或氨基酸类似物通常具有与其天然存在的对应物不同的侧链。氨基酸类似物和将其并入至多肽的方法是本领域已知的。参见例如，nguyen等，biochemicaetbiophysicaacta1808(2011)，2297-2303；knappe，antimicrobialagentsandchemotherapy54(9)2010，4003-4005；us7879979；us5972940；us8835162；和us20080199964。氨基酸类似物也是市售的。氨基酸类似物可结合至所述抗菌肽中以改善其稳定性、生物利用度、药物动力学、组织分布、安全性、耐受性和/或功效。

任何本文所述的抗菌肽可包含一个或多个不是二十种标准氨基酸之一的残基。特别是，所述可变结构域中或整个抗菌肽中的碱性氨基酸中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2％、3％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％)可以是d-型的天然精氨酸、赖氨酸或组氨酸、或天然精氨酸、赖氨酸或组氨酸的类似物。

所述抗菌肽可以衍生自嗜肝dna病毒核心蛋白的精氨酸富集结构域(hbcard)。hbcard是核心蛋白(hbc)的高度保守精氨酸富集c端区域。参见图1。hbc可为哺乳类hbc或禽类hbc。哺乳类hbc可为人hbc、绒毛猴(woollymonkey)hbc、地松鼠(groundsquirrel)hbc、土拨鼠hbc和蝙蝠hbc。禽类hbc可为鸭、苍鹭、鹦鹉、罗斯雁(ross’sgoose)或雪雁(snowgoose)hbc。hbc可以来自任何基因型的嗜肝dna病毒。

例如，抗菌肽可包含hbcard的片段或其变体(例如，包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入)。可变结构域和接头可衍生自hbcard。例如，hbcard或其变体中的任两个精氨酸重复之间的序列可用作接头。

在一实施方案中，所述抗菌肽包含选自由以下各项组成的组的共有序列：

(i)(x1)grx2p(x3)x4px5p(x6)x7qx8p(x9)(seqidno：1)，其中x1、x3、x6、和x9中的每个独立地是可变结构域，并且x2、x4、x5、x7、和x8中的每个独立地是任意氨基酸或不存在，

(ii)(x1)grx2p(x3)x4px5p(x6)(seqidno：2)，其中x1、x3、和x6中的每个独立地是可变结构域，并且x2、x4、和x5中的每个独立地是任意氨基酸或不存在，以及

(iii)(x1)x2px3p(x4)x5qx6p(x7)(seqidno：3)，其中x1、x4、和x7中的每个独立地是可变结构域，并且x2、x3、x5、和x6中的每个独立地是任意氨基酸或不存在。每个可变结构域是2至20个连续碱性氨基酸的序列。

所述肽可以具有选自由以下各项组成的组的共有序列：

(i)(x1)grx2p(x3)x4px5p(x6)x7qx8p(x9)x10c(seqidno：4)，以及

(ii)(x1)grx2p(x3)x4px5p(x6)x7qx8p(x9)x10q(seqidno：5)，

其中x1、x3、x6、和x9中的每个独立地是可变结构域，并且x2、x4、x5、x7、x8和x10中的每个独立地是任意氨基酸或不存在。

所述抗菌肽可以是进一步包含非hbcard肽的融合或嵌合肽。非hbcard肽不衍生自任何hbcard并且不包含如上所述的通过接头连接的至少两个可变结构域。非hbcard肽可以是衍生自另一来源的肽(例如，来自除hbcard之外的蛋白)、改造的肽(例如，另一抗菌肽)、亲和力标签(例如，flag、多-his、myc、ha、cbp、hbh或v5标签)、信号序列(例如，前导序列或定位信号)或配体(例如，受体配体)。

例如，所述抗菌肽可具有高达100个氨基酸并包含选自由以下各项组成的组的序列：

(i)tvvrrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrsqsresqc(seqidno：6)，其中至少一个精氨酸残基是d-精氨酸，

(ii)rrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrsc(seqidno：7)，

(iii)rrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrsq(seqidno：8)，

(iv)rrrgrprrrpprrrrqprrrrc(seqidno：9)，

(v)rrrgrsprrrtpsprrrrc(seqidno：10)，

(vi)rrrgrprrrpprrrrc(seqidno：11)，

(vii)rrrtpsprrrrsqsprrrrc(seqidno：12)，

(viii)rrrpprrrrqprrrrc(seqidno：13)，

(ix)rrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrshhhhhh(seqidno：14)，

(x)hhhhhhrrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrs(seqidno：15)，

(xi)rrrgrprrrpprrrrqprrrrhhhhhh(seqidno：16)，以及

(xii)hhhhhhrrrgrprrrpprrrrqprrrr(seqidno：17)。

如本发明所述，所述抗菌肽可具有一个或多个经修饰氨基酸。例如，在任何上述序列或共有序列中，可变结构域或整个抗菌肽中的一个或多个碱性氨基酸可以是d-型的天然精氨酸、赖氨酸或组氨酸、或天然的精氨酸、赖氨酸或组氨酸的类似物。

任何上述序列或共有序列可位于抗菌肽的n-或c-端。

本文所述的抗菌肽也可缀合至n-或c-端的非肽部分(moiety)以形成肽缀合物。非肽部分可以是聚合物(例如，聚乙二醇聚合物)、寡糖、脂质、糖脂、固体支持物(例如，小珠或纳米粒)、小分子药物、生物素、核酸分子、抗体、维生素、载体蛋白质(例如，klh、bsa或ova)或可检测标记(例如，荧光、放射性或酶标记)。所述肽缀合物也表现抗菌活性。产生肽缀合物的方法是本领域中已知的。

本文所述的抗菌肽或肽缀合物可与药用载体混合以形成药物组合物。

所述组合物可用药用载体如磷酸盐缓冲盐水、碳酸氢盐溶液、和/或佐剂配制。其所使用的合适的药物载体和稀释液以及药物必需品是本领域中已知的。所述组合物可配制成可注射的液体溶液、乳状液、或另一合适的制剂。

上述组合物的有效剂量可通过鼻内吸入、局部施用或肠胃外途径(例如，静脉内注射、皮下注射或肌内注射)施用。备选地，包括栓剂和口服制剂在内的其他施用方式可以是理想的。就栓剂而言，可包含粘合剂和载体，例如，聚亚烷基二醇(polyalkaleneglycol)或甘油三酯。口服制剂可包括通常使用的成分如药物级糖精、纤维素、碳酸镁等。这些组合物的形式为溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉剂。

上述组合物可施用给受试者(例如，人、另一哺乳类、或实验动物)以治疗该受试者的微生物感染或抑制该受试者的微生物生长。所述组合物可用于治疗由革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌、真菌、寄生虫或病毒引起的感染，例如，铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumonlae)、痢疾志贺菌(shigelladysenteriae)、大肠杆菌(escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、假丝酵母(candida)、曲霉菌(aspergillus)、芽生菌(blastomyces)、新型隐球菌(cryptococcusneoformans)、cryptococcusgattii、球孢子菌(coccidioides)、组织胞浆菌(histoplasma)、肺囊虫(pneumocystisjirovecii)、癣菌(ringworm)、孢子丝菌(sporothrix)、明脐菌(exserohilum)或分枝孢子菌(cladosporium)。

以下具体内容将被解释为仅是说明性质，而非以任何方式限制本文的其余部分。未进一步的阐述，相信本领域技术人员可以基于本文的描述，利用本文至最大范围。本文引述的所有出版物经由引用整体并入本文中。

衍生自人hbcard的修饰的抗菌肽

先前鉴定了来自人乙型肝炎病毒(hbv)核心蛋白(hepatitisbviruscoreprotein，hbc)精氨酸富集结构域(ard)的新的抗菌肽。参见chen等(2013)，plospathog9：e1003425doi：10.1371/journal.ppat.1003425，和chen等(2016)，applmicrobiolbiotechnol.100(21)：9125-9132。所述hbcard肽对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌表现出广谱抗菌活性。在我们的小鼠败血症模型中，接种后2小时注射hbcard肽可保护40％感染金黄色葡萄球菌的小鼠免于死亡。参见chen等(2013)。

所述hbcard肽在不同物种的嗜肝dna病毒中是高度保守的。为改善hbcard的抗菌功效，我们比较了哺乳类、啮齿类和禽类嗜肝dna病毒的多种hbcard肽的序列及抗菌活性。人嗜肝dna病毒的hbcard肽表现出最强的抗菌活性。

为进一步改善我们先导化合物hbcard的效力，我们测试几种hbcard衍生物(包括通过截短和用d-精氨酸取代l-精氨酸修饰的肽)的各自的抗菌活性。参见表1。

表1.测试多种hbcard肽的序列的杀菌活性

r：l-精氨酸；r：d-精氨酸

比较人及非人hbcard肽的序列及抗菌活性

通过多重序列比对，我们比较了多种嗜肝dna病毒的hbcard肽的序列，包括人(aap31571.1)、绒毛猴(aao74859.1)、地松鼠(aab08031.1)、土拨鼠(aaa46761.1)、蝙蝠(agt17576.1)、鸭(aao49490.1)、苍鹭(aaa45737.1)、鹦鹉(afy97786.1)、罗斯雁(aar89928.1)以及雪雁(aad22001.1)。参见图1。与人嗜肝dna病毒的hbcard肽类似，其他哺乳类嗜肝dna病毒的hbcard肽(绒毛猴、地松鼠、土拨鼠以及蝙蝠)含四个簇集的精氨酸富集结构域。虽然禽类及哺乳类嗜肝dna病毒的hbcard同源序列较少，但它们都含四个高度正电荷的结构区。为比较其各自的抗菌活性，我们测定了来源于蝙蝠、绒毛猴、鸭及苍鹭嗜肝dna病毒的四种hbcard肽的最小杀菌浓度。结果显示来源于蝙蝠和绒毛猴嗜肝dna病毒的肽表现出与来源于人乙型肝炎病毒的肽相当的抗菌活性。参见表2。相反地，来源于禽类嗜肝dna病毒的肽表现出较低的抗菌活性。因为来自人hbv的hbcard肽在长度上较短(147-183；37个氨基酸)，我们在我们后续的修饰及优化实验中聚焦于该肽。

表2.人、蝙蝠、土拨鼠、鸭及苍鹭hbcard肽对革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌的抗菌活性

^aatcc：美国典型培乔物保藏中心；nd：无法检测

比较l-和d-hbcard肽的抗菌活性

我们使用peptidecutter来预测hbcard147-183肽(37-mer)上的潜在蛋白酶切割位点。结果显示超过70％的蛋白酶切割位点被定位至hbcard肽的精氨酸残基(数据未显示)。为改善在血清中的肽稳定性，我们通过d-氨基酸取代合成了经修饰的肽，d-hbcard147-183肽，其所有的精氨酸残基都被d-异构体取代。

为了研究d-精氨酸取代是否会改善抗菌活性，将l-和d-hbcard肽(37-mer)一起针对多种细菌进行测试，所述细菌包括铜绿假单胞菌(p.aerugmosa)、肺炎克雷伯菌(k.pneumoniae)、鲍氏不动杆菌(a.baumannii)、大肠杆菌(e.coli)、痢疾志贺菌(s.dysenteriae)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)。相对于l-hbcard，d-hbcard肽对鲍氏不动杆菌(a.baumannii)显示相似的抗菌活性(mbc＝2.3-4.6mg/l)，并且对铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)(mbc＝4.6mg/l)、肺炎克雷伯菌(k.pneumonlae)(mbc＝4.6mg/l)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)(mbc＝4.6-9.2mg/l)显示更好的抗菌活性。然而，仍不清楚原因为何，d-hbcard肽对大肠杆菌以及痢疾志贺菌的抗菌活性从18.4下降至73.6mg/l。参见表3。

表3.野生型hbcard147-183肽l-hbcard和d-hbcard之间最小杀菌浓度(mbc)的比较

^aatcc：美国典型培养物保藏中心

^b粘菌素抗性株a.baumannii(实验室诱导并且自慈济综合医院临床分离chen等plospathog.2013；9(6)：e1003425.)

ccaliperlifesciences公司

l-hbcard和d-hbcard之间血清抗性的比较

为比较37-merl-和d-hbcard对抗血清蛋白酶分解的稳定性，我们进行了蛋白酶抗性测定。在用5％胎牛血清在37℃下孵育3小时后，通过利用greenangel在sds-page上的染色，超过80％的l-hbcard肽不能再被检测到。相反地，d-hbcard肽的信号强度在相同的条件下不会减少。参见图2a，当将l-hbcard与5％小鼠或人(雄性或雌性)血清孵育时，会获得类似的结果。参见图2b和c。这些结果表明d-hbcard比l-hbcard更能抵抗胎牛、小鼠及人血清的蛋白酶消化。

此外，我们测定了l-和d-hbcard肽在血清存在时的体外抗菌活性。结果显示在mbc测定中l-hbcard和d-hbcard肽两者在18.4mg/l浓度能杀死金黄色葡萄球菌(s.aureus)。参见图2d。在加入5％小鼠血清后，l-和d-hbcard肽之间的抗菌活性存在显著差别(p＜0.0001)。在5％小鼠血清存在时用l-hbcard肽处理会产生10⁷个细菌菌落，而用d-hbcard肽处理产生约10³个菌落。因此，在5％小鼠血清存在时，我们的d-hbcard肽比l-hbcard肽表现出更高的抗菌活性。此观察结果显示d-hbcard对蛋白水解分解更稳定且更具抗性。

d-hbcard肽的溶血活性(hemolyticacitvity)

在溶血测定中，将人rbc与连续稀释剂量(0至460mg/l)的d-hbcard、l-hbcard或蜂毒素在37℃孵育1小时。如图3所示，蜂毒素在8.9mg/l的浓度引起100％溶血。相反地，没有检测到d-和l-hbcard肽两者(高达460mg/l)的溶血活性(p＜0.0001)。

感染金黄色葡萄球菌的小鼠败血症模型中l-和d-型hbcard肽之间体内保护功效的比较

为研究37-merl-和d-hbcard肽的体内保护功效，我们进行了感染金黄色葡萄球菌(s.aureus)的小鼠败血症模型。icr小鼠首先腹腔注射(i.p.)接种金黄色葡萄球菌(4×10⁶cfu/小鼠)，接着在接种两小时后单次腹腔注射l-hbcard、d-hbcard和pbs。所有给予pbs的小鼠(n＝10)在第1天死亡。参见图4a。在接种后7天，用l-hbcard(10mg/kg)处理的小鼠中有40％存活。参见图4a。形成对比的是，d-hbcard肽能达到高得多的存活率(5mg/kg剂量达60％，10mg/kg剂量达100％)。参见图4a。结果显示通过d-精氨酸替代策略可改善hbcard的体内功效(p＜0.0001)。

感染金黄色葡萄球菌的小鼠败血症模型中l-和d-型hbcard肽之间的免疫原性的比较

为研究在体内利用37-merhbcard肽的重复治疗是否会通过诱导中和抗体而有损功效，我们在细菌感染前分别用l-和d-hbcard肽免疫3周龄小鼠三次。第一次免疫后两周，给被免疫的小鼠接种金黄色葡萄球菌(s.aureus)，之后在接种后1小时，用l-或d-hbcard肽进行腹腔(i.p.)注射。与我们之前的报道一致(chen等，2013)，无论之前是否用l-hbcard免疫，l-hbcard仍保护所有小鼠免于死亡。参见图4b。用pbs免疫并用pbs治疗的对照组小鼠在细菌攻击后24小时内显示接近80％的死亡率(p＜0.05)。接种后7天，无论之前是否用d-hbcard免疫，用l-和d-hbcard(10mg/kg)治疗的全部小鼠均存活于细菌攻击。参见图4c。因此，之前用d-型或l-型肽进行免疫不引起针对随后利用hbcard肽的治疗的体内抗菌活性的中和活性。

末端半胱氨酸的重要性

我们测试了其他hbcard衍生物的抗菌活性。参见表1。该些肽的抗菌活性通过最小杀菌浓度(mbc)来确定。与亲本(parental)肽hbcard147-183(37-mer)不同(参见chen等，2013)，衍生肽hbcard150-177q(28-mer)显示未检测出对金黄色葡萄球菌(s.aureus)的杀菌活性。参见表4。为模拟在羧基末端具有半胱氨酸的亲本肽hbcard147-183，我们通过用c(半胱氨酸)替换hbcard150-177q的末端q(谷胺酰胺)残基设计了另一28-mer衍生物hbcard150-177c。参见表1。有趣的是，该q至c的取代有效恢复了对金黄色葡萄球菌的杀菌活性。参见表4。

表4.修饰的hbcard肽对多种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的最小杀菌浓度(mbc)

-，未确定；nd，无可检测的抗菌活性

长度或精氨酸含量的重要性

基于末端半胱氨酸显示对杀菌活性的重要性的事实，我们想知道是否可进一步减少hbcard105-177c肽(28-mer)的总长度。我们比较了肽150-177c(20-mer)、157-177c(21-mer)和164-177c(14-mer)对抗金黄色葡萄球菌的能力。如表4所示，没有肽显示可检测的活性。结果显示精氨酸数目减少的短肽显示对金黄色葡萄球菌不具有抗菌活性。参见表4。另一方面，我们证明含有3个可变结构域的较短肽足以杀死其他细菌(数据未显示)。

在败血症小鼠模型中28-mer肽d-150-177c改善保护功效

我们比较了含d-型或l-型精氨酸的hbcard150-177c肽(28-mer)的体内保护活性。参见表1和图5。icr小鼠(n＝10/组)腹腔注射(i.p.)接种金黄色葡萄球菌atcc19636(4×10⁶/小鼠)，接着在接种两小时后用经修饰的肽治疗。所有pbs对照小鼠在第1天死亡，且用对照肽(150-177q)治疗的小鼠中仅有20％存活。以5和10mg/kg的剂量施用l-150-177c肽分别保护30％和70％的小鼠免于死亡。参见图5。当用5mg/kg的d-150-177c治疗时，所有小鼠(100％)存活。

28-mer肽d-150-177c保护小鼠不受粘菌素抗性鲍氏不动杆菌(colistin-resistanta.baumannii)的肺部感染

balb/c小鼠(n＝8/组)气管内接种粘菌素抗性鲍氏不动杆菌tcgh46709(3.4×10⁸cfu/小鼠)。这些肺部感染的小鼠分别用粘菌素(5mg/kg/天)或d-150-177c(5和10mg/kg/天)腹腔注射治疗。所有用粘菌素治疗的小鼠在接种药物抗性鲍氏不动杆菌后60小时死亡。参见图6。形成对比的是，d-150-177c具有剂量依赖性的保护作用。当用10mg/kg/天的d-150-177c肽治疗小鼠时观察到显著差异(p＜0.05)。参见图6。

肽d-150-177c和多粘菌素b之间的体内毒性比较

使用败血症小鼠模型，我们检测了用28-merd-150-177c肽(20-80mg/kg体重)和多粘菌素b(粘菌素相关化合物)(50mg/kg体重)腹膜内(i.p.)注射的icr小鼠的存活率。参见图7a。所有用多粘菌素b(50mg/kg)治疗的小鼠在第1天死亡，如由粘菌素和多粘菌素b对肾脏的众所皆知的肾毒性所预期的。参见图7a。相反地，用20和40mg/kgd-150-177c治疗的小鼠没有观察到急性毒性。参见图7a。当增加剂量至60和80mg/kg时，小鼠的存活率分别降低至80％和40％。参见图7a。通过血清alt水平可检测肝损伤。与多粘菌素b相比，用d-150-177c治疗的小鼠在20至40mg/kg的剂量范围内显示较高的alt水平，但p值不显著。参见图7b。用60mg/kg治疗的小鼠的alt水平明显高于用20mg/kg多粘菌素b治疗的那些(p＜0.01)。参见图7b。

多种经修饰的150-177c肽之间体内保护功效的比较

28-merd-150-177c肽含有所有14个l-精氨酸被14个d-精氨酸取代。参见表1以及图6。d-精氨酸的成本远高于l-精氨酸。为减少肽合成的成本，我们比较了含有全部或部分d-精氨酸取代的肽之间的体内保护功效。参见表1和图8。肽dl-150-177c仅进行部分d-精氨酸取代，且显示与全部d-精氨酸取代的肽d-150-177c(100％取代)非常类似的保护功效。参见图8。相反地，肽ld-150-177c(也为部分取代)的保护功效表现为小于dl-150-177c。参见图8。

丝氨酸和苏氨酸是非必要的

我们改造了一个新的22-mer肽，dl-dst-150-177c(参见表1)，其具有两个主要修饰：(1)通过使用肽dl-150-177c的主链的部分d-精氨酸取代；和(2)从亲本28-mer肽dl-150-177c缺失5个丝氨酸和1个苏氨酸残基。该22-mer肽dl-dst-150-177c相较于28-merdl-150-177c和l-150-177c显示显著改善的保护功效。参见图9。

细菌分离株

利用多种菌株测试hbcard肽的抗菌活性，所述菌株包括铜绿假单胞菌migula菌株(atcc27853，氨苄青霉素抗性，以及atcc9027，氨苄青霉素抗性)、肺炎克雷伯菌菌株(atcc13884)、痢疾志贺菌xen27(caliperco.)、大肠杆菌菌株(atcc25922)、金黄色葡萄球菌亚种菌株(atcc25923，甲氧西林抗性，atcc29213，甲氧西林抗性，以及atcc19636，甲氧西林抗性)和鲍氏不动杆菌菌株(atcc17978、atcc17978cr、atcc19606、atcc19606cr、tcgh45530和tcgh46709)。临床分离株tcgh45530和tcgh46709获得自台湾慈济佛教综合医院(tcgh)并且使用vitek系统(biomerieuxvitek，inc.，hazelwood，usa)鉴定。参见chang等(2012)，jmicrobiolimmunolinfect45：37-42doi：10.1016/j.jmii.2011.09.019。

抗菌测定

l-和d-hbcard肽购自yao-hongbiotechnologyinc.(台北，台湾)。如所述地测定抗菌活性。参见chen等2013。简言之，在37℃在mh肉汤(difco公司)中培养细菌至中间对数期，并且在磷酸盐缓冲液(10mm磷酸钠和50mm氯化钠，ph7.2)中稀释至10⁶cfu(菌落形成单位)/ml。在相同缓冲液中将肽连续稀释。将五十微升(μl)细菌与五十μl不同浓度的肽混合，接着在37℃在无震荡下孵育3小时。在孵育结束时，将细菌置于mueller-hinton肉汤琼脂板上，并且允许在37℃过夜生长以测量最小杀菌浓度(mbc)。显示无细菌生长(零菌落)的最低肽浓度定义为mbc。所有肽一式三份地进行测试。

对蛋白酶的稳定性

将l-和d-hbcard肽(0.5nmol)与mbc缓冲液在存在或不存在收集自胎牛、小鼠和人来源的5％血清的情况下混合。在37℃下孵育3小时后，通过sds-page电泳和利用greenangel染色来确定蛋白酶分解下存活的肽的量。使用图像j软件对图像进行定量并且用无血清对照对强度进行标准化。为了研究血清对hbcard肽的抗菌活性的作用，将处于其各自mbc浓度的l-和d-hbcard肽与金黄色葡萄球菌atcc19636菌株(10⁶cfu/ml)在37℃孵育3小时。将细菌置于mh琼脂上并且通过菌落形成确定抗菌活性。

溶血活性

通过针对人红血球(hrbc)的溶血作用确定肽的溶血活性。人血液获得于含edta的管中并且以450g离心10分钟。用pbs缓冲液清洗沉淀物三次，并且制备10％hrbc溶液。将hrbc溶液与在pbs缓冲液中的肽的连续稀释液混合，并将反应混合物在37℃孵育1小时。以450g离心10分钟后，通过测量上清液在405nm波长处的吸光度来确定溶血的百分比。分别确定在pbs缓冲液中以及在1％tritonx-100存在下空白及100％溶血。

体内动物研究

三周龄雄性icr小鼠(19至21g)购自biolasco(台湾)。为测试hbcard肽的体内保护功效，所有小鼠腹膜内接种金黄色葡萄球菌atcc19636(4×10⁶cfu/小鼠)。在细菌接种后2小时，分别腹膜内施用hbc147-183(l-或d-hbcard)或pbs对照。每组含10只小鼠。细菌接种后7天每天监测死亡率。

为研究hbcard肽的潜在免疫原性，我们在肽免疫小鼠中确定了hbcard肽的体内抗菌活性。简言之，三周龄雄性小鼠分别在第0、3及6天用0.2ml的l-和d-hbcard肽(5mg/kg)免疫。在第14天，给免疫的小鼠接种金黄色葡萄球菌atcc19636(4×10⁶cfu/小鼠)并在接种后1小时施用0.2ml的pbs或l-hbcard和d-hbcard肽(10mg/kg)。另一组小鼠以相同方式给予pbs做为对照。每组含5只小鼠。细菌接种后7天每天监测死亡率。

统计分析

使用graphpad软件进行统计分析。数据以平均值±sd表示，个体组之间的差异通过studentt-test分析。存活曲线以kaplan-meier方法绘制并通过log-rank检测分析。

其他实施方案

本说明书公开的所有特征可以任意组合方式结合。说明书中所公开的每一特征可被取代为其他具有相同、等效或相似目的的特征。因此，除非有其他明确阐述，公开的各特征仅为等效或相似特征的上位系列的实例。

由以上说明书，本领域技术人员可轻易地确定所述实施方案的必要特征，并且在不背离本发明的精神和范围的情况下，可对所述实施方案作多种变化和修饰以使其适应于不同用途和条件。因此，其它实施方案也在权利要求的范围内。