包含CCL3变体的融合蛋白及其用途的制作方法

本发明涉及具有改善的体内持久性、蛋白质稳定性和药理活性的包含ccl3变体的融合蛋白，更具体地，涉及包含ccl3变体和免疫球蛋白fc区的融合蛋白，以及其作为用于淋巴细胞减少症、癌症或感染的治疗剂的用途，其中野生型ccl3α或ccl3β的n末端氨基酸被缺失并且在ccl3变体中在野生型ccl3α或ccl3β的相同位置处，特定位置的氨基酸被不同氨基酸取代。
背景技术：
：趋化因子以具有趋化性的细胞因子形式由各种免疫细胞分泌并且与免疫细胞中表达的趋化因子受体结合，以促进免疫细胞的体内移动性。在趋化因子中，cc型配体3(ccl3)是包括小噬细胞的免疫细胞中分泌的趋化因子并且已知涉及表达cc型受体ccr1/ccr5的免疫细胞的移动性，所述免疫细胞诸如树突细胞、t细胞、单核细胞和中性粒细胞(cytokine&growthfactorreviews(2002)13:455-481)。ccl3，被称为巨噬细胞炎性蛋白-1α(mip-1α)，在小鼠中仅有一种亚型，但在人类中有两种亚型(cytokine&growthfactorreviews(2002)13:455-481)。因此，ccl3包括与小鼠的ccl3具有同源性的α型(ld78α或ccl3α，在下文中为ccl3α)和通过进化过程中的基因突变产生的β型(ld78β或ccl3β，在下文中为ccl3β)。在相关技术中，已知ccl3抑制小鼠骨髓中未成熟血液干细胞的分裂和分化，并且可以增加血液中免疫细胞的浓度(natrevimmunol.(2006)6(2):159-64)。因此，ccl3已被用作用于治疗淋巴细胞减少症的治疗剂靶标，其存在于各种抗癌剂中(exp.hematol.(1999)27:195-202,cytokine&growthfactorreviews(2002)13:455-481)。此外，由于ccl3具有增加血液中树突细胞浓度的作用，所以已知当与能够将肿瘤特异性抗原暴露在血液中的治疗方法组合时，ccl3可能具有作为新型免疫抗癌剂的潜力(clincancerres.(2008)14(4):1159-1166,europeanjournalofcancer(1998)34(7):1023-1029)。同时，由于ccl3具有非常短的半衰期并且易于沉淀，所以ccl3在未经修饰的情况下不适合用作生物治疗剂。因为静脉内注射到人体内的ccl3的体内半衰期短至约1.7小时或更短，所以如果ccl3被开发为抗癌剂或淋巴细胞减少症的治疗剂，则需要每天施用药剂(europeanjournalofcancer(1998)34(7):1023-1029)。此外，即使在低至0.1mg/ml的浓度下，ccl3也通过形成聚合物质而沉淀。因此，为了开发ccl3作为药物或免疫抗癌剂，可以通过取代或去除野生型ccl3的一些氨基酸来制备ccl3变体(ccl3变体)，并且/或者可以通过将聚合物或另外的蛋白质与ccl3组合来制备融合蛋白。已知通过组合聚合物或另外的蛋白质可以增加半衰期。例如，可以将活性蛋白质与人白蛋白或聚乙二醇(peg)结合。然而，通过人白蛋白的结合仅略微增加驻留时间，并且受体结合亲和力可能由于peg结合中的空间位阻而降低。考虑到这一点，最近进行了研究和开发以通过使用免疫球蛋白(ig)制备的融合蛋白增加体内半衰期。人ig(hig)包括各种类别，诸如igg、igm、iga、igd和ige，并且可以进一步分类为被称为人igg1(higg1)、人igg2(higg2)、人igg3(higg3)和人igg4(higg4)的各种亚型。免疫球蛋白包括四条多肽链；两条重链和两条轻链通过二硫键连接形成四聚体。每条链包括可变区和恒定区。根据同种型，重链的恒定区进一步分类为三部分，即ch1、ch2和ch3，或四部分，即ch1、ch2、ch3和ch4，并且包括铰链，ch2、ch3和/或ch4结构域。在技术背景下，本发明的发明人证实，在包含ccl3变体和免疫球蛋白fc区的融合蛋白中，体内半衰期增加，稳定性得到改善，并且药物功效得到改善，其中野生型ccl3α或ccl3β的n末端氨基酸被缺失，并且在ccl3变体中在野生型ccl3α或ccl3β的相同位置处，特定位置的氨基酸被不同的氨基酸取代。发明概述本发明提供了包含ccl3变体和免疫球蛋白fc区的融合蛋白，其中在ccl3变体中野生型ccl3的一些氨基酸被取代和缺失。本发明提供了编码融合蛋白的核酸、包含核酸的载体，以及使用载体转化的细胞。本发明提供了制备融合蛋白的方法。本发明提供了包含融合蛋白的药物组合物。本发明提供了ccl3β变体，其中在ccl3β变体中野生型ccl3的一些氨基酸被取代和缺失。本发明提供了融合蛋白，其包含含有以下突变的ccl3变体和免疫球蛋白fc区，其中所述突变包括：(1)从野生型ccl3的n末端缺失一个或两个氨基酸；和(2)用丙氨酸取代自野生型ccl3的n末端起第27位氨基酸的天冬氨酸。本发明提供了编码融合蛋白的核酸。本发明提供了包含核酸的载体。本发明提供了用载体转化的细胞。本发明提供了用于制备融合蛋白的方法。本发明提供了包含融合蛋白的药物组合物。本发明提供了包含以下突变的cc型配体3β(ccl3β)变体：(1)从野生型ccl3β的n末端缺失一个或两个氨基酸；和(2)用丙氨酸取代自野生型ccl3的n末端起第27位氨基酸的天冬氨酸。包含ccl3变体的本发明融合蛋白具有所需的药代动力学分布，因为使ccl3变体的活性降低被最小化，免疫原性的风险较低，并且体内半衰期增加而没有稳定性问题，从而改善蛋白质的体内持久性、物理特性和药理功效。包含含有ccl3变体的融合蛋白的药物组合物可以用作用于淋巴细胞减少症、癌症或感染的治疗剂。附图简述图1是示出了通过使用thp-1细胞系测量ccl3变体融合蛋白ccl3b-h05和ccl3b-h40的体外趋化性的结果的曲线图。图2是示出了通过使用thp-1细胞系测量ccl3和ccl3变体融合蛋白ccl3a-h05和ccl3b-h05的体外趋化性的结果的曲线图。图3示出了通过使用表达ccr1的细胞系测量ccl3和ccl3变体融合蛋白ccl3a-h05和ccl3b-h05的体外活性的结果以便评价融合蛋白对ccr1受体的反应性。图4示出了通过测量血液样品中ccl3b-h05的血液浓度直至分别在3mg/kg和10mg/kg剂量下向小鼠静脉内注射ccl3变体融合蛋白ccl3b-h05后144小时来计算药代动力学参数的结果。图5示出了ccl3变体融合蛋白ccl3b-h05对小鼠肝癌的肿瘤生长抑制的影响。图6示出了实验实施例4中的药物治疗方案。发明详述除非另外定义，否则本说明书中所用的全部技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。通常，本说明书中使用的命名法是熟知的并且是本领域中通常使用的。在用于增加一般蛋白质半衰期的各种长效技术中，fc融合技术被最广泛使用，因为所述技术可以增加体内半衰期而较少顾虑诸如毒性或诱导免疫应答的副作用。对fc融合ccl3和/或其变体作为连续治疗药物的开发应满足如下几个条件。首先，因融合对体外活性的降低需要很小。通常，当将小蛋白质诸如趋化因子与具有相对大尺寸的fc融合时，已知活性很大程度上取决于融合位置和接头。因此，ccl3和/或其变体和fc融合蛋白的活性可根据融合物或融合位置的存在而变化。其次，考虑到大多数生物药物可能在患者中引起免疫原性，融合接头或突变引起的免疫原性风险需要很低。第三，不应由于融合位置或引入突变而导致存在稳定性问题。第四，因为根据融合免疫球蛋白的同种型可能引起不希望的免疫应答，所以需要融合免疫球蛋白的同种型的替代形式。在本发明的发明人通过考虑上述条件努力改善ccl3的生理活性和物理特性的时候，发现人工去除n末端氨基酸、将突变引入到ccl3的特定位置，以及融合免疫球蛋白fc区可增加ccl3的活性从而增加体内暴露程度和半衰期并改善药理功效。基于此，本发明的一方面涉及融合蛋白，其包含含有以下突变的cc型配体3(ccl3)变体和免疫球蛋白fc区，其中所述突变是：(1)从野生型ccl3的n末端缺失一个或两个氨基酸；和(2)用丙氨酸取代自野生型ccl3的n末端起第27位氨基酸的天冬氨酸。ccl3是已知在树突细胞和免疫细胞(诸如t细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞)的移动性稳态中起重要作用的趋化因子，并且可以源自哺乳动物，诸如人类、小鼠、猪和猴。例如，人类中存在两种亚型。所述两种亚型是与小鼠的ccl3具有同源性的α型(在下文中被称为ccl3α)和通过进化过程中的基因突变产生的β型(在下文中被称为ccl3β)。具体地，野生型ccl3可以是，例如，包含seqidno:1序列的人野生型ccl3α蛋白或包含seqidno:3序列的人野生型ccl3β蛋白。在一个实例中，ccl3变体可以包括ccl3α变体，其中ccl3α变体通过缺失为自n末端起第一位氨基酸的丙氨酸并且通过在包含seqidno:1的序列的人野生型ccl3α中用丙氨酸取代为自n末端起第27位氨基酸的天冬氨酸来制备。ccl3α变体可以包括例如seqidno:2的序列。在另一个实例中，ccl3变体可以包括ccl3β变体，其中ccl3β变体通过缺失为来自n末端的两个氨基酸的丙氨酸和脯氨酸(ap)并且通过在包含seqidno:3的序列的人野生型ccl3β中用丙氨酸取代作为自n末端起第27位氨基酸的天冬氨酸来制备。ccl3β变体可以包含例如seqidno:4的序列。术语“fc区”在本文中意指没有重链和轻链中的可变区和免疫球蛋白的轻链(cl1)中的恒定区1的蛋白质，并且fc区可以是包含至少一个选自以下的fc区的杂交fc：igg1、igg2、igg3、igg4和igd及其片段或其组合。在一个实例中，例如，杂交fc可以包括igg4区和igd区。此外，杂交fc区可以包括igdfc的部分铰链序列和ch2，以及igg4fc的ch2和ch3序列，例如seqidno:14的序列。杂交fc可以等同于例如韩国专利登记号0897938中公开并且作为参考引入到本说明书的杂交fc形式。在又另一个实例中，fc区可以是包含至少一个选自以下的fc区的杂交fc：igg1、igg2、igg3和igg4的及其片段或其组合。fc区可以包括构成免疫球蛋白的完整fc区，或者可以包括其片段或fc区变体。fc区还可以包括通过取代一些氨基酸或组合不同类型的fc区而制备的fc区变体。可以修饰fc区变体以防止铰链区处的裂解。此外，可以取代fc的铰链序列的氨基酸序列的一部分，以减少抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)或补体依赖性细胞毒性(cdc)。此外，在fc的铰链序列中，可以取代氨基酸序列的一部分，以抑制fab区的重排。此外，可以去除fc区c末端的赖氨酸(k)。此外，本发明的fc片段可以是野生型糖链、与野生型相比糖链增加、与野生型相比糖链减少，或去除糖链的形式。糖链的增加、减少或去除可以通过本领域已知的通用方法，诸如化学方法、酶促方法和使用微生物的遗传工程方法进行。免疫球蛋白fc区可以是其中ccl3变体直接连接到fc区的n末端或c末端或通过接头连接到fc区的n末端或c末端的形式。例如在本发明中，当免疫球蛋白fc区直接连接到ccl3变体时，seqidno:2的ccl3α变体或seqidno:4的ccl3β变体可以连接到seqidno:14的fc区的n末端或c末端。ccl3和fc的连接形式可以适当地是ccl3连接到fc区的n末端的形式。当免疫球蛋白fc区通过接头连接时，接头可以连接到fc片段的n末端、c末端或自由基，并且可以连接到ccl3变体的n末端、c末端或自由基。当接头是肽接头时，连接可以在任何部分发生。例如，接头可以连接到免疫球蛋白fc区的c末端和ccl3变体的n末端。在接头和fc单独表达后，然后彼此连接，接头可以是本领域已知的交联剂。交联剂可以是，例如，n-羟基琥珀酰亚胺酯，诸如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛和4-叠氮水杨酸；酰亚胺酯，包括二琥珀酰亚胺基酯，诸如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)；和双官能马来酰亚胺，诸如双-n-马来酰亚胺基-1,8-辛烷，但不限于此。此外，接头可以是肽。具体地，接头可以是由10至30个氨基酸残基组成的肽。在一个实例中，免疫球蛋白fc区可以通过如下式1中所示的接头连接到ccl3变体。(式1)(rnt)ngrgg(eekkk)m在式1中，n和m分别为1至5。在式1中，n表示精氨酸-天冬酰胺-苏氨酸氨基酸的重复次数，m表示谷氨酸-谷氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸氨基酸的重复次数，并且优选地，n和m可以分别为1至3。在一个实例中，通过考虑n和m可以分别为1至3，接头可以包括选自seqidno:5至13的任何一种序列。本发明的一个具体实例包括其中免疫球蛋白fc区通过包含rntgrggeekkk序列(seqidno:5)的接头连接到ccl3变体的结构。本发明的一个实验实施例显示通过包含seqidno:5的序列的接头与免疫球蛋白fc结合的ccl3变体融合蛋白具有优异的趋化活性。融合蛋白可以是二聚体或多聚体ccl3变体与免疫球蛋白fc区结合的形式，其中二聚体或多聚体ccl3变体在一个或多个ccl3变体彼此结合时形成。此外，融合蛋白可以是二聚体或多聚体形式，其中二聚体或多聚体形式可以是两个或更多个fc区连接，其中免疫球蛋白fc区具有与其连接的ccl3变体。本发明的另一方面涉及编码包含ccl3变体的融合蛋白的核酸。可以分离编码包含ccl3变体的融合蛋白的核酸，以重组产生包含ccl3变体的融合蛋白。分离核酸并将其插入到可复制载体中以再进行克隆或表达。基于此，本发明的另一方面涉及包含核酸的载体。本文使用的术语“核酸”具有包括dna(gdna和cdna)和rna分子的全面含义，并且作为核酸的基本构造块的核苷酸不仅包括天然核苷酸，还包括其包含修饰的糖或碱基位点的类似物。编码包含ccl3变体的融合蛋白的核酸的序列可以是修饰的。所述修饰包括核苷酸的添加、缺失或非保守取代或保守取代。在本发明中，术语“核酸”包含相对于所述序列具有基本同一性的核苷酸序列。基本同一性意指在通过将本发明的核酸序列比对以与另一任意序列尽可能多地对应并然后使用本领域通常使用的算法分析比对的序列进行的分析中，氨基酸序列具有至少80％同源性，更优选至少90％同源性，且最优选至少95％同源性。编码包含ccl3变体的融合蛋白的dna易于通过使用本领域常用的方法分离或合成。本文使用的术语“载体”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的手段，并且包括质粒载体；粘粒载体；病毒载体，诸如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体；等等。可接受的载体组分通常包括以下项中的一者或多者：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，但不限于此。在载体中，编码包含ccl3变体的融合蛋白的核酸与启动子可操作地连接。本文使用的术语“可操作地连接”意指核酸表达调控序列(例如，启动子、信号序列或转录调控因子的结合位点处的阵列)与不同核酸序列之间的功能性结合，并且调控序列通过功能性结合调控不同核酸序列的转录和/或翻译。在将原核细胞用作宿主的情况下，一般来讲，通常包括强启动子(例如，tac启动于、lac启动子、lacuv5启动子、lpp启动子、plλ启动子、rac5启动子、amp启动子、reca启动子、sp6启动子、trp启动子、t7启动子等)、用于启动翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。此外，例如，在将真核细胞用作宿主的情况下，可以使用源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人肝母细胞启动子和人肌肉肌酸启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、hsvtk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、hivltr启动子、莫洛尼(moloney)启动子、eb病毒(ebv)启动子和rosacekoma病毒(rsv)启动子)，并且通常包括聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。在一些情况下，可以将载体与不同的序列融合以便有利于纯化由其表达的包含ccl3变体的融合蛋白。融合序列包括，例如，谷胱甘肽s-转移酶(pharmacia，usa)、麦芽糖结合蛋白(neb，usa)、flag(ibi，usa)、6xhis(六聚组氨酸；quiagen，usa)等。载体包括本领域作为选择性标记的常用的抗生素抗性基因，所述抗生素抗性基因诸如针对氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素具有抗性的基因。本发明的另一方面涉及通过上述载体转化的细胞。细胞可以是原核生物、酵母或高等真核细胞，但不限于此。可以使用大肠杆菌、芽孢杆菌属物种菌株，诸如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和苏云金芽孢杆菌(bacillustulignensis)，以及原核宿主细胞，诸如链霉菌属(streptomyces)、假单胞菌属(pseudomonas)(例如恶臭假单胞菌(pseudomonasputida))、奇异变形杆菌(proteusmirabilis)和葡萄球菌属(staphylococcus)(例如肉葡萄球菌(staphylocuscarnosus))。然而，对动物细胞的兴趣最大，并且可用的宿主细胞系的实例可以是cos-7、bhk、cho、chok1、dxb-11、dg-44、cho/-dhfr、cv1、cos-7、hek293、bhk、tm4、vero、hela、mdck、brl3a、w138、hepg2、sk-hep、mmt、tri、mrc5、fs4、3t3、rin、a549、pc12、k562、per.c6、sp2/0、ns-0、u20s或ht1080，但不限于此。本发明的另一方面涉及制备包含ccl3变体的融合蛋白的方法，其中所述方法包括(a)培养细胞；和(b)收集培养细胞中的融合蛋白。可以在各种培养基中培养细胞。可商购的培养基可以无限制地用作培养基。可以以适当的浓度包括本领域技术人员已知的所有其他必需补充物。在培养宿主细胞中选择最佳培养条件，例如温度、ph等对于本领域技术人员是显而易见的。包含ccl3变体的融合蛋白的回收可以通过以下方式进行：通过例如离心或超滤去除杂质，并且通过使用例如亲和色谱法等纯化所得产物。可以使用其他另外的纯化技术，例如阴离子或阳离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、羟基磷灰石色谱法等。本发明的另一方面涉及包含含有ccl3变体的融合蛋白的药物组合物。药物组合物可以包含治疗有效量的包含ccl3变体的融合蛋白和药学上可接受的载剂。术语“药学上可接受的载剂”是指可以添加到活性组分中以帮助配制或稳定制剂，并且不会对患者产生显著有害毒性作用的材料。载剂意指既不刺激患者又不抑制生物活性和特征的载剂或稀释剂。对于配制成液体溶液的组合物可接受的药物载剂适于灭菌并且是生物相容的。可以使用盐水溶液、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇和其中的一种或多种的混合物，并且如果需要，可以添加其他通用添加剂，诸如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。此外，通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，可以将药物载剂配制成可注射溶液(诸如水性溶液、悬浮液、乳液等)、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。药学上可接受的载剂包括无菌水性溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。用于药物活性物质的这种介质和药剂的使用在本领域中是已知的。优选地将组合物配制用于肠胃外注射。可以将组合物配制成溶液、微乳剂、脂质体或适用于较高药物浓度的其他有序结构。载剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合的混合物。在一些情况下，在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇和山梨糖醇)或氯化钠。无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：根据需要将所需量的活性化合物在合适的溶剂中与上述组分中的一种或组合混合，并且对所得混合物进行无菌微过滤。通常，通过将活性化合物添加到含有基本分散介质和上述那些中的其他所需组分的无菌媒介物中来制备分散剂。通过使用无菌粉末制备无菌可注射溶液的一些方法包括真空干燥和冷冻干燥，以由其已被灭菌和过滤的溶液制备活性组分和任何附加所需组分的粉末。此外，本发明涉及用于治疗或预防ccl3相关病症的组合物，所述组合物包含含有ccl3变体的融合蛋白，或者涉及用于治疗或预防ccl3相关病症的方法，所述方法包括将包含ccl3变体的融合蛋白施用至需要治疗的受试者中。ccl3相关病症可以包括例如淋巴细胞减少症、各种癌症和感染。根据本发明的包含ccl3变体的融合蛋白可以由于激活与由辐射引起的癌细胞死亡相关联的免疫应答来诱导癌组织和/或癌细胞死亡。基于此，在本发明的一个实例中，融合蛋白可以是结合或辅助放射治疗用于治疗或预防的组合物。放射射线可以是例如伽马射线或x射线，并且不限于此，但是可以以0.1至50gy并且优选以0.1至10gy的剂量辐射。通过考虑由于辐射副作用引起的免疫劣化等，可以将辐射射线的剂量调节在适当的范围内。包含ccl3变体的融合蛋白可以通过任何途径施用。例如，可以将包含ccl3变体的融合蛋白直接地(例如，通过将融合蛋白注射、植入或局部施用至组织部分中，即局部地)或通过任何适当手段系统地(例如，肠胃外或口服)提供至动物。在肠胃外施用，诸如静脉内、皮下、眼、腹膜内、肌肉内、口服、直肠、眶内、脑内、颅内、脊柱内、心室内、鞘内、脑池内(intracistenal)、囊内、鼻内，或气雾剂施用的情况下，例如，可以包含一部分的水性或生理学相容的体液悬浮液或溶液。因此，由于载剂或媒介物是生理学上可接受的，所以可以将载剂或媒介物添加到待转移到患者体内的融合蛋白。因此，作为用于配制的载剂诸如体液，通常可以包含盐溶液。剂量频率根据所用制剂中包含ccl3变体的融合蛋白的药代动力学参数而变化。通常，临床医生可以将融合蛋白施用至达到实现所需效果的剂量。因此，融合蛋白可以作为单剂量施用、作为两个或更多个剂量(包含或不包含相同量的靶融合蛋白)以一定时间间隔施用，或通过移植装置或导管以连续注射形式施用。对适当剂量的额外细化由本领域技术人员常规地实现并且对应于由本领域技术人员常规进行的工作领域。在人体内单位剂量为0.01μg/kg至100mg/kg，具体地是1μg/kg重量至30mg/kg重量。剂量是最佳剂量，但可以取决于待治疗的疾病和副作用的存在，并且可以通过进行通常进行的实验来确定最佳剂量。融合蛋白的施用可以通过定期推注注射或从外部储库(例如，静脉内输液袋)或内部储库(例如，生物可蚀性植入物)连续静脉内、皮下或腹膜内施用来进行。施用频率根据疾病的严重程度而变化。施用频率可以是在每周三次至每周一次或每两周一次的范围内。在一些情况下，可以将包含ccl3变体的融合蛋白与其他生物活性分子一起施用至靶受体。然而，可以通过本领域熟知的常见实验确定融合蛋白和其他分子的最佳组合、剂型和量。本文使用的术语“治疗有效量”是指以适用于医学治疗的合理益处/风险比治疗疾病的足够量，并且意指根据本发明的包含ccl3变体的融合蛋白的量。精确量根据包括治疗组合物的组分和物理特征、预期患者群体、个体患者考虑因素等的许多因素而变化，但不限于此，并且可以由本领域技术人员容易地确定。当完全考虑这些因素时，重要的是施用足以实现最大效果而没有副作用的最小量，并且本领域的专家可以容易地确定剂量。本发明的药物组合物的剂量没有特别限制，但是依据各种因素改变，所述因素包括患者的健康状况和体重、疾病严重程度、药物种类、施用途径和施用时间。组合物可以通过通常可接受的途径(例如以口服、直肠、静脉内、皮下、子宫内或脑血管内方式)每天一次或多次地施用至哺乳动物(包括大鼠、小鼠、家畜、人等)中。本发明的另一方面涉及包含以下突变的cc型配体3β(ccl3β)变体：(1)从野生型ccl3β的n末端缺失一个或两个氨基酸；和(2)用丙氨酸取代自野生型ccl3的n末端起第27位氨基酸的天冬氨酸。在本发明的一个实例中，ccl3β变体可以包含例如seqidno:4的序列。本发明的ccl3β变体同样包括上述结构，并且对于复式构型的描述甚至同样适用于ccl3β变体的发明。除非在本发明中使用的技术和科学术语中另外定义，否则本发明具有本领域技术人员通常理解的含义。此外，将省略对与相关技术中的技术配置和操作相同的技术配置和操作的重复描述。实施例在下文中，将通过实施例对本发明更详细地描述。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，本发明不限于以下实施例，并且可以在本发明的构思和范围内进行各种修改和改变。制备实施例1.对包含ccl3变体的融合蛋白的制备和纯化对ccl3进行突变研究以改善ccl3-fc结构中ccl3的物理特性和活性分布。具体地，为了确定甚至在fc融合后是否保持ccl3蛋白的α型(在下文中被称为ccl3α)和β型(在下文中被称为ccl3β)之间的活性差异，构建了各种变体。此外，为了抑制fc融合蛋白类型中ccl3的沉淀，设计了第27位天冬氨酸被丙氨酸取代的变体。引入到ccl3中的每个突变的位置、序列信息、目标和预期效果概述在下表1中。[表1]将氨基酸在表达载体中编码以从n末端至c末端按ccl3变体、接头和融合载体的顺序表达三种组成元件。下表2概述了ccl3变体融合蛋白、引入到ccl3中的突变序列、融合载体序列和接头序列的符号。[表2]为了产生ccl3变体融合蛋白，基于ccl3变体融合蛋白的氨基酸序列编码的核苷酸序列由bioneerco.,ltd.(korea)合成。将nhei和noti限制性酶序列分别添加到编码每种ccl3变体融合蛋白的核苷酸序列的5'-末端和3'-末端，并且在5'-末端的限制性酶序列之后插入用于蛋白质翻译的起始密码子和用于在细胞外分泌表达的蛋白质的诱导序列。在编码每种ccl3变体融合蛋白的核苷酸序列之后后插入终止密码子。通过使用两种限制性酶序列nhei和noti将编码每种ccl3变体融合蛋白的核苷酸序列克隆在ptrans空表达载体中。从德国ceveccorporation获得的ptrans空表达载体是具有cmv启动子、puc来源的复制起点、sv40来源的复制起点和氨苄青霉素抗性基因的简单结构性表达载体。制备实施例1-2.对用于表达ccl3变体融合蛋白的质粒dna的制备通过将制备实施例1-1中制备的每种表达载体转化到大肠杆菌，获得大量用于表达的质粒dna。通过热休克将每种表达载体转导到具有弱化细胞壁的大肠杆菌中，并且将所得的转导的大肠杆菌涂抹在lb板上以获得菌落。将获得的菌落接种到lb培养基中并在37℃下培养16小时，并且分别获得100ml的在细胞中具有相应表达载体的大肠杆菌。通过离心去除培养基后，将溶液p1、p2和p3(qiagen，目录号12963)添加到大肠杆菌中，以通过破坏细胞壁并分离蛋白质和dna来获得dna混浊溶液。通过使用qiagendna纯化柱从获得的dna混浊溶液中纯化质粒dna。通过琼脂糖凝胶电泳确认洗脱的质粒dna，并且在使用nanodrop装置(thermoscientific，nanodroplite)测量浓度和纯度后将其用于表达。制备实施例1-3.融合蛋白在cap-t细胞中的表达用制备实施例1-2中分离的每种质粒dna转化人细胞系。通过使用pei溶液(polyplus，目录号101-10n)将每种质粒dna转导到同时在pem培养基(lifetechnologies)中培养的cap-t细胞(cevec)。通过使用invitrogencorporation的freestyle293表达培养基将dna和pei溶液的混合溶液与悬浮细胞混合，将其在37℃下培养5小时，然后加入pem培养基。在37℃培养5至7天后，离心去除细胞，获得包含ccl3变体融合蛋白的上清液。制备实施例1-4.对ccl3变体融合蛋白的纯化通过使用0.2μm过滤器从包含ccl3变体融合蛋白的培养上清液中去除杂质，然后用1xpbs(ph7.4)缓冲液平衡蛋白a亲和色谱柱(gehealthcare)。用1xpbs(ph7.4)缓冲液洗涤柱，然后用100mm甘氨酸(ph3.0)缓冲液洗脱蛋白质。将通过亲和色谱法获得的ccl3a-h05融合蛋白(seqidno:15)通过使用i型羟基磷灰石柱(i型陶瓷羟基磷灰石，40μm，bio-rad)纯化，并且将ccl3b-h05融合蛋白(seqidno:16)和ccl3b-h40融合蛋白(seqidno:17)通过使用i型羟基磷灰石柱(ii型陶瓷羟基磷灰石，40μm，bio-rad)纯化。用20mm磷酸钠(ph7.2)缓冲液平衡羟基磷灰石柱，然后将洗脱的ccl3变体融合蛋白加载到亲和色谱上。具体地，用20mm磷酸钠(ph7.2)缓冲液洗涤柱，使20mm磷酸钠(ph7.2)缓冲液以一定浓度梯度流动，然后分析洗脱的级分。通过使用尺寸排阻色谱(sec-hplc)测定法分析每种级分，并且收集包含高纯度ccl3变体融合蛋白的部分，然后在4℃下用最终缓冲液1xpbs透析过夜。通过使用30,000分子量截断离心过滤器，将通过透析获得的蛋白质粗溶液在4℃下以3,000rpm浓缩。通过bca定量分析测量ccl3变体融合蛋白的浓度。实验实施例1.融合蛋白体外活性的测量结果实验实施例1-1.根据接头序列的活性的测量结果测量在上述制备实施例中制备的ccl3变体融合蛋白ccl3b-h05(seqidno:16)和ccl3b-h40(seqidno:17)的体外活性。具体地，为了评价融合蛋白的体外活性，使用表达ccl3的受体ccr1和ccr5的thp-1细胞系atcc。为了评价活性，将包含在制备实施例中获得的融合蛋白的浓缩物通过使用分析培养基(在rpmi1640培养基中的0.01％bsa)进行两次系列稀释并且制备成100μg/ml的浓度，并且将thp-1细胞系转移至分析培养基，然后以5,000,000个细胞/ml稀释。使用聚碳酸酯transwell系统(costar，目录号3422)用600μl稀释的融合蛋白处理底部孔，并且用100μl稀释的thp-1细胞系处理顶部插入物，然后将系统保持在37℃下的5％co2培养箱中进行反应。24小时后，去除插入物，并且用台盼蓝溶液(sigma，目录号t8154-100ml)染色细胞并用细胞计数器(invitrogen，luna细胞计数器)测定转移细胞数。通过计算与用分析培养基处理的对照组中的细胞数相比的最大迁移细胞数增加来比较活性，并且结果示出在图1中。如图1所示，根据接头的活性的测量结果显示融合蛋白ccl3b-h05的趋化性高于ccl3b-h40的趋化性。实验实施例1-2.根据ccl3变体的活性的测量结果测量在上述制备实施例中制备的seqidno:15序列的融合蛋白ccl3a-h05和seqidno:16序列的融合蛋白ccl3b-h05的体外活性。具体地，在包含在制备实施例中获得的融合蛋白的浓缩物中，通过与实验实施例1-1相同的方法测量融合蛋白的趋化性，并且结果示出在图2中。实验实施例1-3.根据ccl3变体的活性的测量结果测量在上述制备实施例中制备的seqidno:15序列的融合蛋白ccl3a-h05和seqidno:16序列的融合蛋白ccl3b-h05的体外活性。具体地，为了评价对融合蛋白的受体ccr1的反应性，使用表达融合蛋白的受体ccr1的tangotmccr1-blau2osda细胞系和分析试剂盒(invitrogen，目录号k1793)。为了评价活性，将tangotmccr1-blau2osda细胞系用基础培养基(freestyletm表达培养基)稀释至312,500个细胞/ml的浓度，将32μl稀释的细胞系添加到384孔板(corning，目录号3712)，然后在5％co2培养箱中储存16至24小时。使用分析培养基(在freestyletm表达培养基中的0.5％dmso)将包含在制备实施例中获得的融合蛋白的浓缩物针对ccl3稀释至10μm浓度和针对ccl3a-h05稀释至25μm浓度，这比处理浓度高5倍。将制备的融合蛋白以每孔8μl添加到包含细胞的孔，以用两次系列稀释的融合蛋白处理细胞，ccl3的实际浓度为2μm并且ccl3a-h05和ccl3b-h05的实际浓度为5μm，并且将处理的细胞在37℃下的5％co2培养箱中保持5小时进行反应。使用包含在分析试剂盒中的溶液制备6x底物混合溶液(6μl的1mmliveblazertm-fretb/g(ccf4-am)底物+60μl溶液b+904μl溶液c+30μl溶液d)，然后将8μl所得混合溶液添加到用融合蛋白处理的384孔板中的每个孔，然后将细胞在室温下保持2小时进行反应。通过酶标仪(molueculardevices，flexstation3)测量并计算反应细胞和未反应细胞的比率(蓝光/绿光发射比)，并且结果示出在图3中。如图3所示，ccr1受体的反应性水平对于ccl3为0.63nm，对于ccl3a-h05为16.0nm，对于ccl3b-h05为11.6nm。实验实施例2.对融合蛋白的物理特性的评价实验实施例2-1.评价稳定性的实验方法为了确定样品初始状态下蛋白质聚集体的量，通过使用尺寸排阻色谱(sec-hplc)方法测量高分子量聚集体的含量(％hmw)。具体地，sec-hplc方法通过使用tosoh型号tsk-gelg3000swxl柱进行。将缓冲液1xpbs以1ml/min的流速流入到柱中以平衡柱。通过使用30,000分子量截断离心过滤器，将制备实施例1-4中获得的ccl3b-h05蛋白质储备溶液在3000rpm和4℃下浓缩至目标浓度9.5mg/ml或更高。通过bca定量分析测量每个样品的浓度，然后将样品在-70℃下储存5周以进行稳定性评价。为了测量高分子量聚集体比率(％hmw)，将9.57mg/ml样品用1xpbs稀释至1mg/ml的浓度，并且通过将100μl稀释的样品注射到sec-hplc柱中来分析高分子量聚集体比率。如表3所示，结果证实ccl3b-h05的％hmw较低并且ccl3变体融合蛋白的物理特性得到改善而不受fc融合的干扰，因为引入了d27a突变体，因此％hmw显著降低。[表3]浓度为9.5mg/ml的ccl3b-h05的稳定性(％hmw)第0天的ccl3b-h05第5周的ccl3b-h05(37℃)1.2％1.0％如表3所示，储存初始阶段(储存第0天)的％hmw的量没有增加，但在-70℃下储存5周后仍保持。显示出，无论突变如何，融合蛋白ccl3b-h05的稳定性都得以保持。实验实施例3.融合蛋白的药代动力学测量测试实施例3-1.药代动力学测量的实验方法对从韩国orientbiocorporation购买的7周龄雄性c57bl/6小鼠进行分组(每次采血时间n＝3)，以在药物治疗前一天具有相似的平均体重，然后将3mg/kg和10mg/kg的样品分别静脉内施用一次，并且在0.083、0.5、1、4、8、12、24、48、72、96和144小时收集血液样品。为了测量融合蛋白的血液浓度，在该实验中使用对ccl3具有免疫反应性的人ccl3/mip-1αquantikineelisa试剂盒(r&dsystems，目录号sma00)。通过测量血液样品中ccl3b-h05的血液浓度直至将每种融合蛋白静脉内注射到小鼠中后144小时来计算药代动力学参数。实验实施例3-2.测量药代动力学活性的结果在将融合蛋白静脉内施用至小鼠后，基于随时间推移的血液浓度曲线图(图4)计算药代动力学参数，并且计算结果示出在下表4中。[表4]参数3mg/kg10mg/kgauc最后一次(μg·h/ml)1639403.76549244.7半衰期(小时)20.445.6总清除率(ml/h/kg)0.00180.0018vdss(ml/kg)0.06350.0636c0(μg/ml)46741.6227907.4基于表明对药物的暴露程度的曲线下面积(auc)比较和评价融合蛋白的药代动力学分布。如表4所示，当将ccl3b-h05以3和10mg/kg的剂量静脉内施用至小鼠时，身体暴露通常与剂量成比例地增加，并且清除率(cl)和分布容积(vdss)不是显著依赖于剂量，因此在3至10mg/kg的剂量范围内发现线性pk。结果还显示，ccl3b-h05的半衰期(t1/2)对于3和10mg/kg中的每一种剂量为20.4小时和45.6小时，并且比ccl3的半衰期(在人体内静脉内施用期间在1.7小时内)增加约12至27倍。考虑到小鼠内半衰期通常短于人体内半衰期，预期ccl3b-h05半衰期相比于ccl3半衰期的增加在小鼠内更大。实验实施例4.对融合蛋白在小鼠中的活性的评价实验实施例4-1.在bnl1mea.7r.1肝癌同种异体移植物小鼠中的抗癌功效的实验方法将购自韩国orientbiocorporation的7周龄雄性balb/c小鼠适应1周，然后将1×107个bnl1mea.7r.1(atcc)细胞(为小鼠肝癌细胞系)注射到右后肢中。在肿瘤体积为120至150mm3时，分离各组以使肿瘤体积变得相似。实验组和各组的药物治疗方案分别示出在表5和图6中。从药物治疗的第一天起，每3至4天使用卡尺测量肿瘤体积，以观察药物的肿瘤生长抑制功效(肿瘤体积＝长轴x(短轴)2/2)。[表5]实验实施例4-2.在bnl1mea.7r.1肝癌同种异体移植物小鼠中的抗癌功效的评价结果在bnl1mea.7r.1小鼠肝癌上证实在上述制备实施例中制备的包含seqidno:15序列的融合蛋白ccl3a-h05和包含seqidno:16序列的融合蛋白ccl3b-h05的肿瘤生长抑制活性。如图5所示，与仅用6.5gy单一辐射治疗的辐射一个月后的组相比，肿瘤生长抑制功效在用ccl3a-h0510mg/kg治疗的组中为大约25％，在用ccl3b-h0510mg/kg治疗的组中为大约72％。尽管已经详细描述了本发明的具体部分，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这样的具体描述仅是优选实施方案，并且本发明的范围不受限制。因此，本发明的实质范围将由所附的权利要求书及其等同物限定。序列表文本文件参见所附电子文本。<110>株式会社柳韩洋行<120>包含ccl3变体的融合蛋白及其用途<130>pe05022a<150>kr10-2016-0053018<151>2016-04-29<160>17<170>kopatentin2.0<210>1<211>70<212>prt<213>人ccl3alpha<400>1alaserleualaalaaspthrprothralacyscysphesertyrthr151015serargglnileproglnasnpheilealaasptyrphegluthrser202530serglncysserlysproglyvalilepheleuthrlysargserarg354045glnvalcysalaaspprosergluglutrpvalglnlystyrvalser505560aspleugluleuserala6570<210>2<211>69<212>prt<213>人工序列<220><223>ccl3alpha变体<400>2serleualaalaaspthrprothralacyscysphesertyrthrser151015argglnileproglnasnpheilealaalatyrphegluthrserser202530glncysserlysproglyvalilepheleuthrlysargserarggln354045valcysalaaspprosergluglutrpvalglnlystyrvalserasp505560leugluleuserala65<210>3<211>70<212>prt<213>人ccl3beta<400>3alaproleualaalaaspthrprothralacyscysphesertyrthr151015serargglnileproglnasnpheilealaasptyrphegluthrser202530serglncysserlysproservalilepheleuthrlysargglyarg354045glnvalcysalaaspprosergluglutrpvalglnlystyrvalser505560aspleugluleuserala6570<210>4<211>68<212>prt<213>人工序列<220><223>ccl3beta变体<400>4leualaalaaspthrprothralacyscysphesertyrthrserarg151015glnileproglnasnpheilealaalatyrphegluthrsersergln202530cysserlysproservalilepheleuthrlysargglyargglnval354045cysalaaspprosergluglutrpvalglnlystyrvalseraspleu505560gluleuserala65<210>5<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>接头<400>5argasnthrglyargglyglygluglulyslyslys1510<210>6<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>接头<400>6argasnthrglyargglyglygluglulyslyslysgluglulyslys151015lys<210>7<211>22<212>prt<213>人工序列<220><223>接头<400>7argasnthrglyargglyglygluglulyslyslysgluglulyslys151015lysgluglulyslyslys20<210>8<211>15<212>prt<213>人工序列<220><223>接头<400>8argasnthrargasnthrglyargglyglygluglulyslyslys151015<210>9<211>20<212>prt<213>人工序列<220><223>接头<400>9argasnthrargasnthrglyargglyglygluglulyslyslysglu151015glulyslyslys20<210>10<211>25<212>prt<213>人工序列<220><223>接头<400>10argasnthrargasnthrglyargglyglygluglulyslyslysglu151015glulyslyslysgluglulyslyslys2025<210>11<211>18<212>prt<213>人工序列<220><223>接头<400>11argasnthrargasnthrargasnthrglyargglyglygluglulys151015lyslys<210>12<211>23<212>prt<213>人工序列<220><223>接头<400>12argasnthrargasnthrargasnthrglyargglyglygluglulys151015lyslysgluglulyslyslys20<210>13<211>28<212>prt<213>人工序列<220><223>接头<400>13argasnthrargasnthrargasnthrglyargglyglygluglulys151015lyslysgluglulyslyslysgluglulyslyslys2025<210>14<211>233<212>prt<213>人工序列<220><223>hyfc<400>14glulysglulysglugluglnglugluarggluthrlysthrproglu151015cysproserhisthrglnproleuglyvalpheleupheproprolys202530prolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysval354045valvalaspvalserglngluaspprogluvalglnpheasntrptyr505560valaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglu65707580glnpheasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhis859095glnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlys100105110glyleuproserserileglulysthrileserlysalalysglygln115120125proarggluproglnvaltyrthrleuproproserglngluglumet130135140thrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrpro145150155160seraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasn165170175tyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleu180185190tyrserargleuthrvalasplysserargtrpglngluglyasnval195200205phesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrgln210215220lysserleuserleuserleuglylys225230<210>15<211>314<212>prt<213>人工序列<220><223>ccl3a-h05<400>15serleualaalaaspthrprothralacyscysphesertyrthrser151015argglnileproglnasnpheilealaalatyrphegluthrserser202530glncysserlysproglyvalilepheleuthrlysargserarggln354045valcysalaaspprosergluglutrpvalglnlystyrvalserasp505560leugluleuseralaargasnthrglyargglyglygluglulyslys65707580lysglulysglulysglugluglnglugluarggluthrlysthrpro859095glucysproserhisthrglnproleuglyvalpheleuphepropro100105110lysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcys115120125valvalvalaspvalserglngluaspprogluvalglnpheasntrp130135140tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu145150155160gluglnpheasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleu165170175hisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn180185190lysglyleuproserserileglulysthrileserlysalalysgly195200205glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserglngluglu210215220metthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr225230235240proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn245250255asntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphephe260265270leutyrserargleuthrvalasplysserargtrpglngluglyasn275280285valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr290295300glnlysserleuserleuserleuglylys3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