针对CD40和CD137的多特异性抗体的制作方法

本发明涉及与cd40和cd137结合的多特异性抗体，以及此类多特异性抗体的用途，特别是用于治疗癌症的用途。

发明背景

cd40是肿瘤坏死因子(tnf)受体(tnfr)家族的成员，并且已知为在多种细胞类型上发现的共刺激蛋白。cd40由抗原呈递细胞(apc)(包括树突状细胞(dc)、b细胞和巨噬细胞)组成型表达。它也可以由内皮细胞、血小板、平滑肌细胞、成纤维细胞和上皮细胞表达。与其在正常细胞上的广泛表达一致，cd40也在多种肿瘤细胞上表达。

在mhcii类分子的背景中将肽抗原呈递至抗原特异性cd4⁺t细胞，连同共刺激信号(来自cd80和/或cd86)，导致cd4⁺t细胞的活化以及dc许可因子cd40配体(cd40l)和淋巴毒素-α1β2(ltα1β2)的上调。cd40l和ltα1β2在活化的抗原特异性cd4⁺t细胞上的表达通过cd40和ltβ受体(ltβr)诱导信号传导，并且这许可dc诱导cd8⁺t细胞应答。cd40信号传导导致白细胞介素-12(il-12)的产生和cd70、cd86、4-1bb配体(4-1bbl)、ox40配体(ox40l)和gitr配体(gitrl)的上调，而ltβr信号传导导致i型干扰素(ifn)的产生。控制核因子kappab(nf-kb)的活性的信号传导系统对几乎所有tnfr超家族成员都响应。病原体相关分子模式(pamp)和损伤相关分子模式(damp)也有助于这些事件。通过mhci类限制性肽引发cd8⁺t细胞导致cd27、4-1bb、ox40和糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白(gitr)的上调。通过其同源tnf超家族配体与il-12和i型ifn组合刺激cd8⁺t细胞上的这些受体，导致强大的cd8⁺t细胞活化、增殖和效应功能，以及cd8⁺t细胞记忆的形成和维持。cd40抗体可以发挥不同的作用，通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、补体依赖性细胞毒性(cdc)或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)来杀伤表达cd40的肿瘤细胞，诱导细胞信号传导以诱导直接细胞凋亡或生长停滞，并且不依赖于肿瘤细胞上的cd40表达通过许可apc刺激抗癌免疫反应。与cd40结合的抗体可以触发apc上的cd40以引发效应细胞毒性t淋巴细胞(ctl)并诱导这些细胞释放il-2，并间接活化nk细胞。刺激cd40的抗体已在现有技术中公开，包括cp-870,893，人igg2抗体(wo2003/040170)；达西珠单抗(dacetuzumab)，一种人源化igg1抗体(wo2000/075348)和chilob7/4，一种嵌合igg1抗体(us2009/0074711)。此外，已经公开了拮抗性cd40抗体鲁卡妥姆单抗(lucatumumab)，一种人igg1抗体(wo2002/028481)。

cd137(4-1bb)也是tnfr家族的成员。cd137是cd8⁺和cd4⁺t细胞、调节性t细胞(treg)、自然杀伤t细胞(nk(t)细胞)、b细胞和嗜中性粒细胞上的共刺激分子。在t细胞上，cd137不是组成型表达，而是在t细胞受体(tcr)激活后诱导(例如，在肿瘤浸润淋巴细胞(til)上(grosetal.,j.clininvest2014；124(5):2246-59))。经由其天然配体4-1bbl或激动剂抗体的刺激导致使用traf-2和traf-1作为衔接物的信号传导。通过cd137的早期信号传导涉及k-63多泛素化反应，其最终导致核因子(nf)-kb和丝裂原激活蛋白(map)-激酶途径的激活。信号传导导致增加的t细胞共刺激、增殖、细胞因子产生、成熟和延长的cd8⁺t细胞存活。已显示针对cd137的激动性抗体在各种临床前模型中促进t细胞的抗肿瘤控制(murilloetal.,clincancerres2008；14(21):6895-906)。刺激cd137的抗体可以诱导t细胞的存活和增殖，从而增强抗肿瘤免疫应答。刺激cd137的抗体已在现有技术中公开，包括乌瑞芦单抗(urelumab)，一种人igg4抗体(au2004279877)和乌托鲁单抗(utomilumab)，一种人igg2抗体(fisheretal.2012cancerimmunol.immunother.61:1721-1733)。

westwoodja,etal.,leukemiaresearch38(2014),948-954公开了“在小鼠myc驱动的血液癌症中的联合抗cd137和抗cd40抗体治疗(combinationanti-cd137andanti-cd40抗体therapyinmurinemyc-drivenhematologicalcancers)”。

us20090074711公开了“使用嵌合激动性抗人cd40抗体的人体治疗(hunmantherapiesusingchimericagonisticanti-humancd40antibody)”。

然而，尽管本领域有这些和其他进步，但仍需要可以结合cd40和cd137两者的多特异性抗体，同时结合表达cd40的apc和表达cd137的t细胞，从而使这些细胞类型紧密接触。这继而可以导致两种细胞类型的活化和抗肿瘤免疫的有效诱导。

发明概述

本发明人已经鉴定了可以结合cd40和cd137两者并引起t细胞和apc活化的多特异性抗体。

因此，一方面，本发明涉及多特异性抗体，其包含

(i)与人cd40结合的第一抗原结合区，和(ii)与人cd137结合的第二抗原结合区。

在一些实施方案中，本发明涉及此类多特异性抗体，其中第一抗原结合区包含重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，其包含特定氨基酸序列(任选地具有突变)，或与包含此类特定氨基酸序列的抗体竞争或具有包含此类特定氨基酸序列的抗体的特异性的抗体的氨基酸序列。在具体的实施方案中，第一抗原结合区包含重链和轻链可变序列，其包含抗cd40抗体001的cdr1、cdr2和cdr3，或与此类抗体竞争或具有此类抗体的特异性。

在一些实施方案中，本发明涉及此类多特异性抗体，其中第二抗原结合区包含重链和轻链可变序列，其中cdr1、cdr2和cdr3包含特定氨基酸序列或提供特定氨基酸序列，任选地具有突变，或者包含与包含此类特定氨基酸序列的抗体竞争或具有包含此类特定氨基酸序列的抗体的特异性的抗体的氨基酸序列。在具体的实施方案中，第二抗原结合区包含重链和轻链可变序列，其包含抗cd137抗体001、002、003、004、005、006、007、008、009、010、011或012的cdr1、cdr2和cdr3，或与任意此类抗体竞争或具有任意此类抗体的特异性。

以下进一步详细描述这些和其他方面和实施方案，包括编码此类多特异性抗体的氨基酸序列的核酸；包含此类核酸的表达载体；包含此类核酸或表达载体的宿主细胞；包含此类多特异性抗体的组合物；用于治疗癌症或其他疾病的此类组合物；用于生产此类多特异性抗体的方法；以及基于此类多特异性抗体的诊断方法和试剂盒。

附图的简要说明

图1：人类、非洲象和野猪cd137的序列比对。与人类序列中的氨基酸不同的非洲象或野猪cd137中的氨基酸以黑色突出显示。

图2：cd137改组构建体，包含非洲象(改组5)或野猪(改组1-4、6)cd137结构域。

图3：cd137改组构建体在hek293-t17细胞上的表达。用cd137改组构建体转染hek293-t17细胞。使用识别人、野猪和非洲象cd137的多克隆抗cd137抗体，通过流式细胞术测量构建体的细胞表面表达。

图4：cd137抗体克隆与在hek293-t17细胞上表达的cd137改组构建体的结合。如图所示，用cd137改组构建体，和用人cd137(hcd137wt)、非洲象或野猪cd137转染hek293-t17细胞。通过流式细胞术测量不同cd137抗体克隆与在hek293-t17细胞上表达的这些构建体的结合。用多克隆抗cd137抗体的染色显示为对照。

图5：用于自动化双特异性抗体发现的矩阵样混合网格。可以如所示铺板亲本抗体。然后可以使用简单的矩阵样混合网格组合亲本抗体以获得双特异性抗体。然后可以进行受控的fab臂交换以获得双特异性抗体。

图6：cd40和cd137在稳定转导的hek293-nfk-gfp-luc和k562细胞的细胞表面上的表达。用cd40或cd137稳定转导nf-κb/293/gfp-luc(a)和k562(b)细胞。通过流式细胞术测定cd40(左图)和cd137(右图)的表面表达(白色曲线：没有抗体的对照；灰色曲线：抗体染色)。

图7：同时靶向cd40和cd137的双特异性抗体(cd40xcd137)的分析。靶向cd40和cd137的双特异性抗体(cd40-fealxcd137-fear)在报告物测定中一式两份进行测试(a-l：cd40-001xcd137-001至cd40-001xcd137-012)。与所示的双特异性抗体温育后通过用cd137转导的nf-κb/293/gfp-luc(hek293_nfk_cd137_gfp_luc)的荧光素酶活性(相对发光单位，rlu)测量cd137的激活，并且用cd40转导的k562细胞(k562_cd40)用于反式激活，或用野生型k562细胞(k562_wt)作为对照。与所示的双特异性抗体温育后通过用cd40转导的nf-κb/293/gfp-luc(hek293_nfk_cd40_gfp_luc)的荧光素酶活性(rlu)测量cd40的激活，并且用cd137转导的k562细胞(k562_cd137)用于反式激活或用野生型k562细胞(k562_wt)作为对照。两种具有一个无关臂的单特异性单价抗体(b12-fealxcd137-fear、b12-fealxcd40-fear)用作双特异性cd40xcd137抗体的对照。

图8：在非抗原特异性t细胞测定中通过cd40xcd137双特异性抗体诱导cd8⁺t细胞增殖。将cfse标记的pbmc与cd40xcd137双特异性抗体或单特异性单价对照抗体温育4天。通过流式细胞术测量cd8⁺细胞的增殖。显示的数据是cfse绘图，其显示由0.02μg/ml的所示双特异性和对照抗体诱导的cd8⁺t细胞增殖(a)、cd40-001-fealxcd137-005-fear(b)、cd40-001-fealxcd137-009-fear(c)、cd40-001-fealxcd137-003-fear(d)和cd40-001-fealxcd137-011-fear(e)的分裂细胞的百分比和增殖指数(使用flowjo软件计算)。

图9：在抗原特异性t细胞测定中通过cd40xcd137双特异性抗体增强cd8⁺t细胞增殖。用密封蛋白(claudin)-6-特异性tcr转染并用cfse标记的t细胞在存在或不存在cd40xcd137双特异性抗体或对照抗体的情况下与密封蛋白-6ivt-rna电穿孔的未成熟dc温育5天。通过流式细胞术测量cd8⁺t细胞增殖。显示的数据是cfse绘图，其显示由0.02μg/ml的所示双特异性和对照诱导的cd8⁺t细胞增殖(a)、所示浓度下的所示双特异性抗体(b)及cd40-001-fealxcd137-005-fear和对照抗体(c)及cd40-001-fealxcd137-009-fear和对照抗体(d)的分裂细胞的百分比和增殖指数(使用flowjo软件计算)。还显示了连续稀释范围为6.4x10^-5至5μg/ml的所示双特异性抗体的增殖指数曲线(e)。使用graphpadprism5软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)通过非线性回归(具有可变斜率的s形剂量反应)分析曲线。cd40-001-fealxcd137-005-fear和cd40-001-fealxcd137-009-fear诱导t细胞增殖的ec50值分别为0.005和0.030μg/ml。

图10：在非抗原特异性t细胞测定中通过人源化的cd40xcd137双特异性抗体诱导cd8⁺t细胞增殖。将cfse标记的pbmc与人源化的cd40xcd137双特异性抗体、亲本双特异性抗体或igg1对照抗体温育4天。通过流式细胞术测量cd8⁺t细胞的增殖。显示的数据是如使用flowjo软件计算的分裂细胞的百分比和增殖指数。(n.d.＝未确定)。

图11：在抗原特异性t细胞测定中通过人源化的cd40xcd137双特异性抗体增强cd8⁺t细胞增殖。用密封蛋白-6-特异性tcr转染并用cfse标记的t细胞在存在或不存在人源化的cd40xcd137双特异性抗体(bisg1-cd40-001-h6lc1-fealxcd137-009-hc7lc2-fear)、亲本双特异性抗体或igg1对照抗体的情况下与密封蛋白-6ivt-rna电穿孔的未成熟dc温育4天。通过流式细胞术测量cd8⁺t细胞增殖。显示的数据是如使用flowjo软件计算的对于所示抗体的分裂细胞的百分比和增殖指数。(n.d.＝未确定)。

图12：通过cd40xcd137双特异性抗体从人黑色素瘤组织切除中离体扩增til。将来自切除的组织的肿瘤块用100u/mlil-2和所示浓度的cd40xcd137双特异性抗体(bisg1-cd40-001-fealxcd137-009-fear)培养。培养14天后，收获细胞并通过流式细胞术分析。显示了每个样品的相对活til计数(归一化至1,000个测量的计数珠)。每个数据点是指单个孔，表示在一个facs管中分析的两个肿瘤块中的til的扩增。线表示五个测量样品的平均值。

图13：通过cd40xcd137双特异性抗体从人非小细胞肺癌(nsclc)组织切除中离体扩增til。将来自切除的nsclc组织的肿瘤块用10u/mlil-2和所示浓度的cd40xcd137双特异性抗体(bisg1-cd40-001-fealxcd137-009-fear)培养。培养10天后，收获细胞并通过流式细胞术分析。显示了每个样品的相对活til计数(归一化至1,000个测量的计数珠)。每个数据点是指单个孔，表示在一个facs管中分析的两个肿瘤块中的til的扩增。线表示五个测量样品的平均值。

表1-序列

*根据eu编号的氨基酸位置118-447

发明详述

定义

本文所用的术语“cd40”是指cd40，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员5(tnfrsf5)，其是配体tnfsf5/cd40l的受体。已知cd40转导traf6-和map3k8介导的信号，其激活巨噬细胞和b细胞中的erk，导致诱导b细胞分泌免疫球蛋白。用于cd40的其他同义词包括但不限于b细胞表面抗原cd40、bp50、cd40l受体和cdw40。在一个实施方案中，cd40是人cd40，具有uniprot登录号p25942。人cd40的序列也显示在seqidno:115中。seqidno:115的氨基酸1-20对应于人cd40的信号肽；而seqidno:115的氨基酸21-193对应于人cd40的细胞外结构域；以及蛋白质的剩余部分；即自seqidno:115的氨基酸194-215和216-277分别是跨膜和细胞质结构域。

本文所用的术语“cd137”是指cd137(4-1bb)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员9(tnfrsf9)，其是配体tnfsf9/4-1bbl的受体。据信cd137(4-1bb)参与t细胞活化。用于cd137的其他同义词包括但不限于4-1bb配体受体、cdw137、t细胞抗原4-1bb同源物和t细胞抗原ila。在一个实施方案中，cd137(4-1bb)是人cd137(4-1bb)，具有uniprot登录号q07011。人cd137的序列也显示在seqidno:92中。seqidno:92的氨基酸1-23对应于人cd137的信号肽；而seqidno:92的氨基酸24-186对应于人cd137的细胞外结构域；以及蛋白质的剩余部分，即自seqidno:92的氨基酸187-213和214-255分别是跨膜和细胞质结构域。

如本文所用的术语“嵌合抗体”是指其中可变区衍生自非人物种(例如衍生自啮齿动物)并且恒定区衍生自不同物种(例如人)的抗体。嵌合抗体可以通过抗体工程化生成。“抗体工程化”是一般用于抗体的不同种类的修饰的术语，并且用于抗体工程化的方法是本领域技术人员公知的。特别地，可以通过使用描述于sambrooketal.,1989,molecularcloning:alaboratorymanual,newyork:coldspringharborlaboratorypress,ch.15的标准dna技术生成嵌合抗体。因此，嵌合抗体可以是遗传或酶工程化的重组抗体。生成嵌合抗体在本领域技术人员的知识范围内，并因此，嵌合抗体的生成可以通过除本文所述之外的其他方法进行。开发用于人类治疗应用的嵌合单克隆抗体以降低非人抗体(例如啮齿动物抗体)的预期抗体免疫原性。它们通常可含有非人(例如鼠或兔)可变区，其对感兴趣的抗原具有特异性，和人恒定抗体重链和轻链结构域。如在嵌合抗体的上下文中所用的术语“可变区”或“可变结构域”是指包含免疫球蛋白的重链和轻链两者的cdr和框架区的区域，如下所述。

如本文所用的术语“人源化抗体”是指遗传工程改造的非人抗体，其含有经修饰的人抗体恒定结构域和非人可变结构域，以含有与人可变结构域具有高水平的序列同源性。这可以通过将六个非人抗体cdr(其一起形成抗原结合位点)移植到同源人受体框架区(fr)上来实现(参见wo92/22653和ep0629240)。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可能需要将框架残基从亲本抗体(即非人抗体)置换到人框架区中(回复突变)。结构同源性建模可以帮助鉴定框架区中对抗体结合特性重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可以包含非人cdr序列，主要是人框架区，其任选地包含对非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变，和完全人恒定区。任选地，可以应用另外的氨基酸修饰(其不一定是回复突变)，以获得具有优选特征的人源化抗体，例如亲和力和生化特性和/或可以在恒定区引入另外的氨基酸突变。

如本文所用，“衍生自”另一种蛋白质(例如亲本蛋白质)的蛋白质意指蛋白质的一个或多个氨基酸序列与另一个或亲本蛋白质中的一个或多个氨基酸序列相同或相似。例如，在衍生自另一个或亲本抗体、结合臂、抗原结合区或恒定区的抗体、结合臂、抗原结合区、恒定区等中，一个或多个氨基酸序列与另一个或亲本抗体、结合臂、抗原结合区或恒定区的氨基酸序列相同或相似。此类一个或多个氨基酸序列的实例包括但不限于vh和vlcdr的那些和/或一个或多个或所有框架区、vh、vl、cl、铰链或ch区。例如，人源化抗体在本文中可以描述为“衍生自”非人亲本抗体，意指至少vl和vhcdr序列与所述非人亲本抗体的vh和vlcdr序列相同或相似。嵌合抗体在本文中可以描述为“衍生自”非人亲本抗体，意指通常vh和vl序列可以与非人亲本抗体的那些相同或相似。另一个实例是结合臂或抗原结合区，其在本文中可以描述为“衍生自”特定亲本抗体，意指所述结合臂或抗原结合区通常包含与所述亲本抗体的结合臂或抗原结合区相同或相似的vh和/或vlcdr，或vh和/或vl序列。然而，如本文其他地方所述，可以在抗体、结合臂、抗原结合区等中的cdr、恒定区或其他地方进行氨基酸修饰(例如突变)，以引入所需特征。当在衍生自第一或亲本蛋白质的一个或多个序列的上下文中使用时，“相似”氨基酸序列优选具有至少约50％，例如至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约97％、98％或99％的序列同一性。

非人抗体可以在许多不同物种中生成，例如小鼠、兔、鸡、豚鼠、美洲驼和山羊。

单克隆抗体可以通过多种技术产生，包括常规单克隆抗体方法，例如kohler和milstein,nature256:495(1975)的标准体细胞杂交技术。可以采用用于生产单克隆抗体的其他技术，例如b淋巴细胞的病毒或致癌转化或使用抗体基因文库的噬菌体展示技术，并且此类方法是本领域技术人员公知的。

在此类非人物种中产生杂交瘤是非常完善的规程。用于分离免疫动物/非人物种的脾细胞以进行融合的免疫方案和技术是本领域已知的。融合伴侣(fusionpartner)(例如小鼠骨髓瘤细胞)和融合规程也是已知的。

如本文所用的术语“人抗体”是指具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。人抗体可以包括氨基酸残基，其不由人种系免疫球蛋白序列所编码(例如，通过随机或位点特异性诱变在体外或通过体细胞突变在体内引入的突变)。然而，如本文所用的术语“人抗体”不意图包括以下抗体，其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的cdr序列已经移植至人框架序列上。

可以使用携带人免疫系统部分而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠生成人单克隆抗体。

术语“免疫球蛋白”指一类结构相关的糖蛋白，其由两对多肽链组成，一对轻(l)低分子量的链和一对重(h)链，所有四条通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已充分地表征。参见例如fundamentalimmunologych.7(paul,w.,ed.,2nded.ravenpress,n.y.(1989))。简而言之，每条重链(缩写为“hc”)通常由重链可变区(在本文中缩写为vh或vh)和重链恒定区(在本文中缩写为ch或ch)组成。重链恒定区通常由三个结构域，ch1、ch2、和ch3组成。重链通常可以进一步包含铰链区。每条轻链(缩写为“lc”)通常由轻链可变区(在本文中缩写为vl或vl)和轻链恒定区(在本文中缩写为cl或cl)组成。轻链恒定区通常由一个结构域，cl组成。vh和vl区可以进一步细分为高变的区域(或高变区，其可以是序列上和/或结构上定义的环的形式上高度可变的)，也称为互补决定区(cdr)，散布有更加保守、称为框架区(fr)的区域。每个vh和vl通常由三个cdr和四个fr构成，从氨基端到羧基端以以下的顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4(也参见chothiaandleskj.mol.biol.196,901917(1987))。除非另外声明或与上下文冲突，否则本文中的cdr序列是根据使用domaingapalign(程序版本：4.9.1；2013-12-19)的imgt规则鉴定的(lefrancmp.,nucleicacidsresearch1999；27:209-212,和ehrenmannf.,kaasq.andlefrancm.-p.nucleicacidsresearch2010；38,d301-307；也参见互联网http地址www.imgt.org/)。

除非另有说明或与上下文矛盾，否则提及本发明中恒定区中氨基酸位置是根据eu编号(edelmanetal.,procnatlacadsciusa.1969may；63(1):78-85；kabatetal.,序列sofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition.1991nihpublicationno.91-3242)。

在本发明的上下文中，术语“抗体”(ab)是指包含至少一个抗体可变结构域例如免疫球蛋白重链可变区、或免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区、或其片段、或其两者之一的衍生物，其具有在通常生理条件下以显著时间期间的半衰期特异性与抗原结合的能力，所述半衰期例如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约一小时、至少约两小时、至少约四小时、至少约8小时、至少约12小时、约24小时或更长、约48小时或更长，约3、4、5、6、7或更多天，等等，或任何其他相关的功能定义的期间(例如足以诱导、促进、增强、和/或调制与抗体结合抗原相关的生理反应的时间和/或足以使抗体募集效应物活性的时间)。特别地，抗体可以是免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其衍生物。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述组织或因子包括多种免疫系统的细胞(例如效应细胞)和补体系统的组成成分，例如c1q，其为补体活化的经典途径中的第一组成成分。如上所示，本文所用的术语抗体，除非另外声明或明显与上下文矛盾，包括为抗原结合片段(即保留与抗原特异性结合的能力)的抗体的片段。已经显示了抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段进行。术语“抗体”内所涵盖的抗原结合片段的实例包括(i)fab’或fab片段，由vl、vh、cl、和ch1结构域组成的单价片段，或如wo2007059782(genmab)中所述的单价抗体；(ii)f(ab’)2片段，包含由铰链区处的二硫桥联所连接的两个fab片段的二价片段；(iii)基本上由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)基本上由抗体的单个臂的vl和vh结构域组成的fv片段；(v)dab片段(wardetal.,nature341,544546(1989))，其基本上由vh结构域组成并且也称为结构域抗体(holtetal；trendsbiotechnol.2003nov；21(11):484-90)；(vi)驼类抗体(camelid)或纳米抗体(nanobody)(revetsetal；expertopinbiolther.2005jan；5(1):111-24)；以及(vii)分离的互补决定区(cdr)。此外，虽然fv片段的两个结构域，vl和vh是由不同的基因所编码的，可以通过合成接头使用重组方法将它们联结，所述合成接头使得可以将它们能够做成单一的蛋白质链，其中vl和vh和区配对以形成单价分子(称作单链抗体或单链fv(scfv)，见例如birdetal.,science242,423426(1988)和hustonetal.,pnasusa85,58795883(1988))。此类单链抗体是涵盖在术语抗体内的，除非另外注明或由上下文明显地指示。虽然此类片段一般包括在抗体的含义中，但是它们作为总体和作为独立个体都是本发明的独特特征，呈现不同的生物学性质和效用。对在本发明的上下文中的这些和其他有用的抗体片段，以及此类片段的双特异性形式在本文中进一步讨论。还应该理解，术语抗体，除非另外具体指明，还包括多克隆抗体、单克隆抗体(mab)、抗体样多肽，例如嵌合抗体和人源化抗体，以及通过任何已知技术所提供的保留特异性结合抗原能力的抗体片段(抗原结合片段)，所述技术如酶切割、肽合成和重组技术。所生成的抗体可以具有任何同种型和/或亚类。

常规抗体；例如在任何物种中产生的抗体通常是单特异性、二价抗体，其意指它们包含两个与相同表位结合的抗原结合区。

在本发明的上下文中，术语“多特异性抗体”是指具有由不同抗体序列定义的不同抗原结合区的抗体。因此，多特异性抗体可以具有两个、三个、四个、五个或更多个不同的抗原结合区。多特异性抗体的实例包括具有两个不同抗原结合区的抗体；即双特异性抗体。

包含三个或更多个不同抗原结合区的多特异性抗体的实例包括但不限于(i)双特异性抗体在其fc部分与另外的单链可变片段(scfv)偶联(weidleetal.,cancergenomicsproteomics.2013jan-feb；10(1):1-18)，(ii)由三种或更多种scfv组成的融合蛋白(三聚体(triabody)、四聚体(tetrabody)；chamesetal.,femsmicrobiollett.2000aug1；189(1):1-8)以及(iii)与scfv连接的融合蛋白(kermeret.al.molcancerther.2014jan；13(1):112-21)。

在本发明的上下文中，术语“双特异性抗体”是指具有由不同抗体序列定义的两个不同抗原结合区的抗体。

当在本文中使用时，除非与上下文相矛盾，否则术语“fab臂”或“臂”是指一个重链-轻链对并且与本文的“半分子”可互换使用。

术语“包含抗原结合区的结合臂”意指包含抗原结合区的抗体分子或片段。因此，结合臂可以包含例如六个vh和vlcdr序列、vh和vl序列、fab或fab’片段、或fab臂。

当在本文中使用时，除非与上下文相矛盾，否则术语“fc区”是指包含至少铰链区、ch2结构域和ch3结构域的抗体区。

如本文所用，术语“同种型”是指由hc(例如igg、igd、iga、ige和igm)或lc(kappa，κ或lambda，λ)基因编码的特定类型的免疫球蛋白。在每个同种型中，可以存在若干个亚类，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2等。

术语“单价抗体”在本发明的上下文中意指抗体分子能够结合抗原的单个分子，并因此不能进行抗原交联。

“cd40抗体”或“抗cd40抗体”是如上所述的抗体，其特异性与抗原cd40结合。

“cd137抗体”或“抗cd137抗体”是如上所述的抗体，其特异性与抗原cd137结合。

“cd40xcd137抗体”或“抗cd40xcd137抗体”是双特异性抗体，其包含两个不同的抗原结合区，其中一个与抗原cd40特异性结合，而其中一个与抗原cd137特异性结合。

术语“特异性结合”、或其他类似的措辞是指与其他抗原相比，抗体优先结合特定抗原的能力，或与相同抗原的其他部分相比优先结合抗原的特定部分(表位)的能力。

如本文所用，在抗体与预定抗原或表位结合的上下文中，术语“结合”通常是当通过例如使用抗体作为配体并且抗原作为分析物(反之亦然)的biacore3000仪器中的表面等离激元共振(spr)技术测定时，以对应于约10^-7m或更少的kd的亲和力的结合，例如约10^-8m或更少、例如约10^-9m或更少、约10^-10m或更少、或约10^-11m或甚至更少，并且与除了预定抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(例如，bsa、酪蛋白)结合的kd相比以对应于至少低十倍的kd的亲和力结合预定抗原，例如至少低100倍、例如至少低1,000倍、例如至少低10,000倍、例如至少低100,000倍。亲和力更高的量取决于抗体的kd，因此当抗体的kd非常低(即，抗体具有高度特异性)时，对抗原的亲和力高于对非特异性抗原的亲和力的量可以是至少10,000倍。

如本文所用的术语“kd”(sec^-1)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也称作koff值。

如本文所用的术语“kd”(m)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。

如果两种抗体结合相同的抗原和相同的表位，则它们具有“相同的特异性”。待测抗体是否识别与某抗原结合抗体相同的表位，即抗体与相同表位结合，可以通过本领域技术人员熟知的不同方法进行测试。

可以通过交叉阻断测定来检测抗体之间的竞争。例如，竞争性elisa测定可以用作交叉阻断测定。例如，可以将靶抗原包被在微量滴定板的孔上，并且可以添加抗原结合抗体和候选竞争性测试抗体。与孔中的抗原结合的抗原结合抗体的量间接地与候选竞争性测试抗体的结合能力相关，所述竞争测试抗体与其竞争结合相同的表位。具体地，候选竞争性测试抗体对相同表位的亲和力越大，与抗原包被的孔结合的抗原结合抗体的量越小。与孔结合的抗原结合抗体的量可以通过用可检测或可测量的标记物质标记抗体来测量。

与另一种抗体竞争结合抗原的抗体，例如包含如本文所述的重链和轻链可变区的抗体，或对另一种抗体的抗原具有特异性的抗体，例如包含如本文所述的重链和轻链可变区的抗体，可以是包含如本文所述的所述重链和/或轻链可变区的变体的抗体，例如如本文所述的cdr中的修饰和/或一定程度的同一性。

如本文所用的“分离的多特异性抗体”意图指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的多特异性抗体(例如，特异性结合cd40和cd137的分离的双特异性抗体基本上不含特异性结合cd40或cd137的单特异性抗体)。

术语“表位”意指能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子(例如氨基酸或糖侧链)的表面分组组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者而非后者的结合丧失。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其他氨基酸残基，例如通过特异性抗原结合肽有效阻断或覆盖的氨基酸残基(换句话说，氨基酸残基位于特异性抗原结合肽的足迹内)。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指单分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组成显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。

当在本文中使用时，术语“第一和第二ch3区之间的异源二聚体相互作用”是指第一ch3/第二ch3异源二聚体抗体中第一ch3区和第二ch3区之间的相互作用。

当在本文中使用时，术语“第一和第二ch3区的同源二聚体相互作用”是指第一ch3/第一ch3同源二聚体抗体中第一ch3区和另一个第一ch3区之间的相互作用，以及第二ch3/第二ch3同源二聚体抗体中第二ch3区和另二个第二ch3区之间的相互作用。

当在本文中使用时，术语“同源二聚体抗体”是指包含两个第一fab臂或半分子的抗体，其中所述fab臂或半分子的氨基酸序列是相同的。

当在本文中使用时，术语“异源二聚体抗体”是指包含第一和第二fab臂或半分子的抗体，其中所述第一和第二fab臂或半分子的氨基酸序列是不同的。特别地，所述第一和第二fab臂/半分子的ch3区、或抗原结合区、或ch3区和抗原结合区是不同的。

术语“还原条件”或“还原环境”是指其中底物(例如抗体的铰链区中的半胱氨酸残基)比氧化更可能变得还原的条件或环境。

本发明还提供了多特异性抗体，例如双特异性抗体，其包含vl区、vh区、或实施例的双特异性抗体的一个或多个cdr的功能性变体。在双特异性抗体的上下文中使用的vl、vh或cdr的功能性变体仍然允许双特异性抗体的每个抗原结合区保留亲本双特异性抗体的至少相当大比例(至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)的亲和力和/或特异性/选择性，并且在某些情况下，与亲本双特异性抗体相比，此类双特异性抗体可以与更高的亲和力、选择性和/或特异性相关。

此类功能性变体通常保留与亲本双特异性抗体显著的序列同一性。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数(即同源性％＝相同位置的#/位置的总#x100)，考虑到空位的数量和每个空位的长度，其为了两个序列的最佳比对需要引入。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比可以例如使用已经并入align程序(版本2.0)中的e.meyersandw.miller,comput.appl.biosci4,11-17(1988)的算法测定，使用pam120权重残基表，12的空位长度罚分和4的空位罚分。此外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用needlemanandwunsch,j.mol.biol.48,444453(1970)算法测定。

在本发明的上下文中，除非另有说明，否则以下符号用于描述突变；突变的氨基酸的名称，接着是突变的位置编号，接着是突变所涵盖的内容。因此，如果突变是取代，则包括取代先前氨基酸的氨基酸的名称，如果氨基酸缺失，则用*表示，如果突变是添加，则在原始氨基酸之后包括添加的氨基酸。氨基酸名称可以是一个或三个字母的代码。因此，例如；用精氨酸取代409位的赖氨酸称为k409r，用任何氨基酸取代409位的赖氨酸称为k409x，409位赖氨酸的缺失称为k409*，而在k409位置处的赖氨酸后添加p称为k409kp。

示例性变体包括主要通过保守取代而不同于亲本序列的vh和/或vl和/或cdr的变体；例如变体中的12，例如11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代是保守氨基酸残基置换。

在本发明的上下文中，保守取代可以通过下文反映的氨基酸类别内的取代来定义：

保守取代的氨基酸残基类别：

酸性残基:asp(d)和glu(e)

碱性残基:lys(k)、arg(r)和his(h)

亲水不带电荷残基:ser(s)、thr(t)、asn(n)和gln(q)

脂肪族不带电荷残基:gly(g)、ala(a)、val(v)、leu(l)和ile(i)

非极性不带电荷残基:cys(c)、met(m)和pro(p)

芳香族残基:phe(f)、tyr(y)和trp(w)

本发明的第一和/或第二抗原结合区也可以分别是本文公开的第一和/或第二抗原结合区的变体。

本领域技术人员熟知如何引入修饰并且可以修饰cdr序列的某些氨基酸；例如通过氨基酸取代以例如增加抗体对其靶抗原的亲和力，降低用于人的非人抗体的潜在免疫原性和/或增加宿主细胞表达的抗体的产量。可以引入此类修饰而不影响抗体结合的靶抗原的表位。

如本文所用的术语“重组宿主细胞”(或简写为“宿主细胞”或“细胞”)意图指已经引入核酸例如表达载体的细胞，例如，核酸，如编码本发明的多特异性抗体的表达载体。重组宿主细胞包括，例如，转染瘤(transfectoma)，如cho、cho-s、hek、hek293、hek-293f、expi293f、per.c6或ns0细胞，和淋巴细胞。

术语“治疗”是指施用有效量的本发明的治疗活性多特异性抗体，目的是缓解、改善、阻止或根除(治愈)症状或疾病状态。

“有效量”或“治疗有效量”是指在所需的剂量和持续时间实现期望的治疗结果的有效的量。多特异性抗体的治疗有效量可以根据以下因素而改变：例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及多特异性抗体在个体中引起期望的反应的能力。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过多特异性抗体或其片段的任何毒性或有害作用的量。

术语“抗独特型抗体”是指识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特决定簇的抗体。

在本发明的上下文中，用于涉及抗体(包括多特异性抗体)的术语“在更小程度上诱导fc介导的效应功能”意指与人igg1抗体相比，抗体在更小程度上诱导fc介导的效应功能，此类功能特别地选自以下列表：iggfc受体(fcgammar，fcγr)结合、c1q结合、adcc或cdc，所述人igg1抗体包含(i)相同的cdr序列，特别是包含与所述抗体相同的第一和第二抗原结合区和(ii)两个重链，其包含人igg1铰链、ch2和ch3区。

fc介导的效应功能可以通过与fcγr结合、与c1q结合或经由fcγr诱导fc介导的交联来测量。

本发明的其他方面和实施方案

本发明涉及包含两个不同抗原结合区的分子，其中一个对人cd40具有特异性，而其中一个对人cd137具有特异性。

在具体的实施方案中，所述分子可以是多特异性抗体。

因此，本发明涉及多特异性抗体，其包含(i)与人cd40结合的第一抗原结合区；(ii)与人cd137结合的第二抗原结合区。

如本发明的发明人所示，根据本发明的双特异性抗体可以在与一种细胞上表达的cd40结合并与另一种细胞上表达的cd137结合时诱导细胞内信号传导。因此，根据本发明的多特异性抗体能够反式激活两种不同的细胞。在人中，cd40在许多细胞上表达，包括抗原呈递细胞(apc)，例如树突状细胞，而cd137在t细胞和其他细胞上表达。因此，根据本发明的结合cd40和cd137的多特异性抗体，例如双特异性抗体，能够同时结合表达这些受体的apc和t细胞。不受理论束缚，根据本发明的多特异性抗体，例如双特异性抗体，因此可以(i)通过受体结合介导apc和t细胞之间的细胞-细胞相互作用，和(ii)同时激活cd40和cd137两者，这主要是通过细胞与细胞相互作用时的交联和受体聚集诱导的，并且不一定依赖于亲本单特异性二价抗体的激动活性。因此，这些反式激活的多特异性抗体，例如双特异性抗体，在apc:t细胞相互作用的背景中发挥共刺激活性，并且可以引起针对肿瘤细胞的t细胞应答。因此，该作用机制可以反映通过活化的apc经由抗原呈递活化天然t细胞，允许apc向t细胞呈递多种肿瘤特异性抗原。不受理论限制，共刺激活性可以提供以下中的一种或多种：(i)仅活化特定的t细胞(即，与apc接触的那些)而不是任何t细胞和(ii)通过经由活化的apc和cd137触发的强共刺激重新活化耗尽的t细胞和(iii)通过活化的apc诱导抗原呈递并同时触发cd137来引发t细胞。

因此，本发明的多特异性、例如双特异性抗体可以用于治疗将受益于t细胞活化的疾病，例如癌症。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体包含

(i)与人cd40结合的第一抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含选自下组的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3：

a)具有seqidno:3所示的序列或其中在seqidno:3中修饰多达四个氨基酸的序列的重链可变区cdr3，以及具有seqidno:5所示的序列或其中在seqidno:5中修饰多达四个氨基酸的序列的轻链可变区cdr3；和

b)抗体的重链和轻链可变区cdr3，所述抗体(i)与包含根据a)的重链和轻链可变区cdr3的抗体竞争与人cd40结合和/或(ii)具有包含根据a)的重链和轻链可变区cdr3的抗体对cd40的特异性，

和

(ii)与人cd137结合的第二抗原结合区。

在进一步的实施方案中，第一抗原结合区可以进一步包含具有seqidno:1所示的序列或其中在seqidno:1中修饰多达2个氨基酸的序列的重链可变区cdr1，和/或具有seqidno:2中所示序列或其中在seqidno:2中修饰多达2个氨基酸的序列的重链可变区cdr2；和/或具有seqidno:4所示的序列或其中在seqidno:4中修饰多达2个氨基酸的序列的轻链可变区cdr1，和/或具有序列yts或其中在yts中修饰多达2个氨基酸的序列的轻链可变区cdr2。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及多特异性抗体，其包含

(i)与人cd40结合的第一抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含选自下组的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3：

a)分别具有seqidno:1、2和3所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:4、yts和5所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3；

b)具有总共一至十二个突变的根据a)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3；和

c)抗体的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，所述抗体(i)与包含根据a)或b)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体竞争与人cd40结合和/或(ii)具有包含根据a)或b)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体对cd40的特异性，和

(ii)与人cd137结合的第二抗原结合区。

在进一步的实施方案中，所述第一抗原结合区包含第一重链可变(vh)序列和第一轻链可变(vl)序列，并且所述第二抗原结合区包含第二重链可变(vh)序列和第二轻链可变(vl)序列，其中所述可变序列各自包含三个cdr序列，分别是cdr1、cdr2和cdr3，以及四个框架序列，分别是fr1、fr2、fr3和fr4。

在进一步的实施方案中，所述多特异性抗体包含(i)第一结合臂，其包含所述第一抗原结合区，和(ii)第二结合臂，其包含所述第二抗原结合区。

在一个实施方案中，第一结合臂包含所述第一抗原结合区和第一重链恒定序列，并且第二结合臂包含所述第二抗原结合区和第二重链恒定序列。

在进一步的实施方案中，(i)所述第一结合臂包含所述第一抗原结合区，其中第一结合臂包括包含第一重链可变(vh)序列和第一重链恒定(ch)序列的第一重链，以及包含第一轻链可变(vl)序列的第一轻链，并且(ii)所述第二结合臂包含所述第二抗原结合区，其中第二结合臂包括包含第二重链可变(vh)序列和第二重链恒定(ch)序列的第二重链，以及包含第二轻链可变(vl)序列的第二轻链。

在进一步的实施方案中，所述第一轻链进一步包含第一轻链恒定(cl)序列，并且所述第二轻链进一步包含第二轻链恒定(cl)序列。

在一个实施方案中，第一结合臂包括包含所述第一抗原结合区的第一fab臂，并且第二结合臂包括包含所述第二抗原结合区的第二fab臂。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体的所述第一和第二抗原结合区衍生自人源化抗体。在一个实施方案中，第一和第二结合臂可以衍生自人源化抗体。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体的第一和第二结合臂衍生自全长抗体。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体的第一和第二结合臂衍生自全长igg1，λ(lambda)或igg1，κ(kappa)抗体。

在一个实施方案中，第一和第二结合臂衍生自单克隆抗体。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体的第一和所述第二重链是igg同种型的。第一和第二重链的亚类可以例如分别选自下组：igg1、igg2、igg3和igg4。在一个实施方案中，第一和第二重链是相同igg亚类(例如igg1)的。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体是分离的抗体。

在进一步的实施方案中，所述第一和第二重链的每一个包含至少铰链区、ch2和ch3区。在进一步的实施方案中，所述第一和第二重链的ch3区包含不对称突变。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体是双特异性抗体。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体可以交联表达人cd40的一种细胞，例如第一细胞，和表达人cd137的另一种细胞，例如第二细胞。

在一个实施方案中，通过使用表达人cd40的第一细胞系和表达人cd137的第二细胞系的测定法测定所述交联，并且其中第一或第二细胞系包含在nf-κb活化后导致产生可测量的报告物的报告结构。

在一个实施方案中所述第一细胞可以是抗原呈递细胞并且所述第二细胞可以是t细胞，例如cd4⁺或cd8⁺t细胞。

可以使用不同的方法来测定表达cd40的第一细胞和表达cd137的第二细胞的交联，并且本发明不限于任何特定方法。

在一个实施方案中，所述交联可以通过例如如实施例4中所述的报告物测定法来测定。简而言之，所述测定法包含将表达第一靶抗原和用nf-κb应答元件驱动的报告基因(例如荧光素酶)转导的报告细胞系与表达第二靶抗原的第二细胞系共培养，将根据本发明的多特异性抗体以浓度100ng/ml至10,000ng/ml添加至细胞共培养物，并测量报告基因表达，例如荧光素酶生成，所述第一靶抗原是人cd40并且所述第二靶抗原是人cd137或反之亦然。

基于nf-κb途径激活时的报告基因表达，能够诱导在不同细胞上表达的cd40和cd137的交联的多特异性抗体将在该测定中导致第一靶抗原的可测量的活化。

在一个实施方案中，仅在添加表达第二靶抗原而没有nf-κb报告基因的第二细胞系时，根据本发明的多特异性抗体可以能够诱导在nf-κb活化时产生的报告基因表达。

在一个实施方案中，当添加表达第二靶抗原而没有nf-κb报告基因的第二细胞系时，与添加不表达第二靶抗原的第二细胞系相比，根据本发明的多特异性抗体可以能够诱导在nf-кb活化时产生的更高的报告基因表达。

在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，并且所述双特异性抗体在一个实施方案中可以：

(i)当添加至表达cd137的报告细胞系与表达cd40的第二细胞系的共培养物时诱导报告基因表达，或

(ii)与包含与人cd137结合的相同第二抗原结合区的参照双特异性抗体相比，当添加至表达cd137的报告细胞系与表达cd40的第二细胞系的共培养物时，诱导更高量的报告基因表达，但其中参照双特异性抗体的第一抗原结合区与不相关的靶抗原结合，例如其中第一抗原结合区包含分别具有seqidno:99、100和101所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:102、gvs和103所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3。

在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，并且所述双特异性抗体在一个实施方案中可以：

(i)当添加至表达cd40的报告细胞系与表达cd137的第二细胞系的共培养物时诱导报告基因表达，或

(ii)与包含与人cd40结合的相同第一抗原结合区的参照双特异性抗体相比，当添加至表达cd40的报告细胞系与表达cd137的第二细胞系的共培养物时，诱导更高量的报告基因表达，但其中参照双特异性抗体的第二抗原结合区包含分别具有seqidno:99、100和101所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:102、gvs和103所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体诱导和/或增强t细胞的增殖，例如其中所述t细胞是cd4⁺和/或cd8⁺t细胞。

可以使用用于测定或测量t细胞增殖的不同方法，并且本发明不限于任何特定方法。

在一个实施方案中，所述t细胞增殖的诱导或增强通过例如如实施例5中所述的非抗原特异性t细胞增殖测定法测定。因此，t细胞增殖的诱导和/或增强可以通过pbmc池(外周血单核淋巴细胞)中t细胞的次优活化来测定。次优活化可以通过滴定添加至pbmc池的抗cd3抗体的浓度、测量t细胞增殖和选择抗cd3抗体浓度来测定，所述抗cd3抗体的浓度导致低t细胞增殖但允许进一步增强t细胞增殖。该浓度是pbmc供体依赖性的，并且在进行测定法之前测定每个供体。

在一个实施方案中，通过活化具有所述次优浓度的抗cd3抗体的pbmc中的t细胞、使pbmc与多特异性抗体接触并测定t细胞的增殖来测定所述t细胞增殖的诱导或增强。在进一步的实施方案中，可以用cfse标记pbmc，可以通过温育4天进行pbmc与多特异性抗体的接触，并且可以通过流式细胞术测量t细胞的增殖。

诱导某种反应或效应如“诱导t细胞增殖”可以意指在诱导前没有此类反应或效应如t细胞的增殖，但它也可以意指在诱导之前存在一定水平的反应或效应如t细胞的增殖，并在诱导之后所述反应或效应如t细胞的增殖得以增强。因此，“诱导”还包括“增强”。

还可以使用感兴趣的测试抗原，通过例如如实施例6中所述的抗原特异性t细胞增殖测定法来测量t细胞的增殖。因此，t细胞增殖的诱导和/或增强可以通过共培养表达对主要组织相容性复合物(mhc)中呈现的测试抗原的肽具有特异性的tcr的t细胞和在mhc中呈递相应的肽的dc来测量，其然后被tcr识别。例如，t细胞可以是cd8+t细胞，而mhc可以是mhci类，或者t细胞可以是cd4+t细胞，而mhc可以是mhcii类。表达特定tcr的t细胞可以通过用编码tcr的mrna转导产生。可以通过用编码抗原的mrna转导dc来产生呈递相应肽的dc。tcr阳性t细胞与抗原呈递细胞的共培养诱导t细胞增殖；增殖的程度可以取决于dc呈递的抗原密度和/或共刺激信号的强度。在一个实施方案中，t细胞的增殖可以通过使用cfse标记的t细胞的此类抗原特异性t细胞测定法来测量，添加待测试的抗体并且在4天后通过流式细胞术测量t细胞增殖。

在一个实施方案中，在例如如实施例11中所述的离体扩增测定中使用肿瘤浸润淋巴细胞(til)测定所述t细胞增殖的诱导或增强。本发明的多特异性抗体对诱导或增强til增殖的效应可以通过将人肿瘤样品与白细胞介素-2(il-2)和所述抗体温育，并在温育约10至约14天的时间后回收和计数活til来评估。然后可以通过与适合的对照比较来测定til增殖的诱导或增强，所述对照例如，在没有任何多特异性抗体或具有参照(对照)多特异性抗体的情况下温育的人肿瘤样品。例如，可以分离人肿瘤组织的样品，例如，经由活组织检查或来自手术样品，在无血清培养基中洗涤，并将直径为约1-2mm的肿瘤块置于培养皿或孔中，例如，在1ml适合的培养基中的1或2个肿瘤块，并在37℃下温育。适合的培养基可以是，例如，补充有10％人血清白蛋白、1％pen/strep、1％fungizone和浓度范围为10至100u/ml，例如10u/ml或100u/ml的il-2的无血清培养基(例如x-vivo15)。然后可以在til培养基中以适合的浓度添加多特异性抗体。在10-14天的总培养期后，如果需要，在此期间任选地分裂细胞培养物，可以收获til并例如通过流式细胞术计数，使用例如抗cd3、抗cd4、抗cd8、抗cd56和7-aad抗体以允许检测活cd4+和cd8+t细胞以及nk细胞。

在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其与包含根据本文所述的任何方面或实施方案的第二抗原结合区的参照双特异性抗体相比，诱导和/或增强t细胞更多的增殖，但其中参照双特异性抗体的第一抗原结合区包含分别具有seqidno:99、100和101所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:102、gvs和103所示序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3。

在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其与包含根据本文所述的任何方面或实施方案的第一抗原结合区的参照双特异性抗体相比，诱导和/或增强t细胞更多的增殖，但其中参照双特异性抗体的第二抗原结合区包含分别具有seqidno:99、100和101所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:102、gvs和103所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3。

与cd40结合

如上所述，根据本发明的多特异性抗体包含与人cd40结合的第一抗原结合区。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体包含与人cd40结合的第一抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含选自下组的重链和轻链可变区cdr3：

a)具有seqidno:3所示的序列或其中在seqidno:3中修饰多达四个氨基酸的序列的重链可变区cdr3，以及具有seqidno:5所示的序列或其中在seqidno:5中修饰多达四个氨基酸的序列的轻链可变区cdr3，

b)抗体的重链和轻链可变区cdr3，所述抗体(i)与包含根据a)的重链和轻链可变区cdr3的抗体竞争与人cd40结合和/或(ii)具有包含根据a)的重链和轻链可变区cdr3的抗体对cd40的特异性。

在进一步的实施方案中，第一抗原结合区可以进一步包含具有seqidno:1所示的序列或其中在seqidno:1中修饰多达2个氨基酸的序列的重链可变区cdr1，和/或具有seqidno:2所示的序列或其中在seqidno:2中修饰多达2个氨基酸的序列的重链可变区cdr2；和/或具有seqidno:4所示的序列或其中在seqidno:4中修饰多达2个氨基酸的序列的轻链可变区cdr1，和/或具有序列yts或其中在yts中修饰多达2个氨基酸的序列的轻链可变区cdr2。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体包含与人cd40结合的第一抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含选自下组的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3：

a)分别具有seqidno:1、2和3所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:4、yts和5所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，

b)具有总共一至十二个突变的根据a)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3；和

c)抗体的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，所述抗体(i)与包含根据a)或b)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体竞争与人cd40结合和/或(ii)对包含根据a)或b)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体的cd40具有特异性。

在一个实施方案中，所述第一抗原结合区包含第一重链可变(vh)序列和第一轻链可变(vl)序列，其中所述可变序列各自包含三个cdr序列，分别是cdr1、cdr2和cdr3。

在一个实施方案中，所述第一抗原结合区包含第一重链可变(vh)序列和第一轻链可变(vl)序列，并且其中所述可变序列各自包含三个cdr序列，分别是cdr1、cdr2和cdr3，以及四个框架序列，分别是fr1、fr2、fr3和fr4。

在一个实施方案中，所述第一抗原结合区包含分别具有seqidno:1、2和3所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:4、yts和5所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3。因此第一抗原结合区可以包含具有如表1中所述的cd40抗体的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3。

包含此类第一抗原结合区的抗体的实例是本文公开的嵌合抗体chilob7/4和cd40-001。

在另一个实施方案中，所述第一抗原结合区包含分别具有seqidno:1、2和3所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:4、yts和5所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，其具有总共一至十二个突变,例如一至十一个突变、一至十个突变、一至八个突变、一至七个突变、一至六个突变、一至五个突变、一至四个突变、一至三个突变或一至两个突变。

在一个实施方案中，所述突变可以是氨基酸取代，例如保守氨基酸取代。

在一个实施方案中，所述突变分布在vhcdr1、2和3以及vlcdr1、2和3上使得vh和vlcdr3的每一个包含至多三个突变并且vh和vlcdr2及cdr1的每一个包含至多两个氨基酸突变。

在进一步的实施方案中，第一抗原结合区包含具有分别seqidno:1、2、3、4、yts和5所示的序列的重链和轻链cdr1、cdr2和cdr3，其具有总共一至十二个突变，并且其中vh和vlcdr3各自包含多达三个氨基酸突变，并且vh和vlcdr1及cdr2各自包含多达两个氨基酸突变。

在进一步的实施方案中，第一抗原结合区包含具有分别seqidno:1、2、3、4、yts和5所示的序列的重链和轻链cdr1、cdr2和cdr3，其具有总共一至十个突变，例如一至八个，并且其中vh和vlcdr1、cdr2和cdr3各自包含多达两个氨基酸突变。

在进一步的实施方案中，第一抗原结合区包含具有分别seqidno:1、2、3、4、yts和5所示的序列的重链和轻链cdr1、cdr2和cdr3，其具有总共一至六个突变，并且其中vh和vlcdr1、cdr2和cdr3各自包含至多一个氨基酸突变。

本领域技术人员熟知如何引入突变并且可以突变cdr序列的某些氨基酸；例如通过氨基酸取代以例如增加抗体对其靶抗原的亲和力，降低用于人的非人抗体的潜在免疫原性和/或增加宿主细胞表达的抗体的产量。可以引入此类突变而不影响抗体结合的靶抗原的表位。

在另一个实施方案中，所述第一抗原结合区包含抗体的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，所述抗体(i)与包含根据a)或b)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体竞争与人cd40结合和/或(ii)对包含根据a)或b)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体的cd40具有特异性。

在进一步的实施方案中，所述第一抗原结合区包含抗体的重链和轻链可变区，所述抗体(i)与包含根据a)或b)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体竞争与人cd40结合和/或(ii)对包含根据a)或b)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体的cd40具有特异性。

在该上下文中，术语“竞争”是指两种抗体之间竞争与靶抗原结合。如果两种抗体不相互阻断与靶抗原结合，则此类抗体是非竞争性的，并且这表明所述抗体不与相同的部分(即靶抗原的表位)结合。本领域技术人员熟知如何测试抗体与靶抗原结合的竞争。此类方法的实例是所谓的交叉竞争测定法，其可以是例如作为elisa或通过流式细胞术进行。

例如，可以通过用每种抗体包被elisa板孔来进行基于elisa的测定；添加竞争抗体和his标签的靶抗原细胞外结构域并温育；可以通过添加生物素化的抗his抗体，然后添加链霉抗生物素蛋白-poly-hrp，并进一步用abts发展反应并测量405nm处的吸光度来进行检测添加的抗体是否抑制his标签的蛋白质与包被的抗体的结合。例如，可以通过将表达靶抗原的细胞与过量的未标记抗体一起温育，用与次优浓度的生物素标记的抗体一起温育细胞，然后与荧光标记的链霉抗生物素蛋白一起温育并通过流式细胞术分析来进行流式细胞术测定。

在一个实施方案中，所述第一抗原结合区的vh序列包含与seqidno:117和seqidno:6的至少一个，例如seqidno:117具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述第一抗原结合区的vl序列包含与seqidno:121和seqidno:7的至少一个，例如seqidno:121具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述第一抗原结合区的vh和vl序列各自包含分别与seqidno:6和seqidno:7具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。

在一个实施方案中，所述第一抗原结合区的vh和vl序列各自包含分别与seqidno:117和seqidno:121具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。

在一个实施方案中，vh和vl序列仅分别在如seqidno:6和7所示的非cdr序列中偏离。

在一个实施方案中，vh和vl序列仅分别在如seqidno:117和121所示的非cdr序列中偏离。

在一个实施方案中，vh和vl序列仅在框架序列中偏离。

在一个实施方案中，第一抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与所述vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％氨基酸序列同一性。

在一个实施方案中，第一抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与如seqidno:6所示的vh序列和如seqidno:7所示的vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性。

在一个实施方案中，第一抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与如seqidno:6所示的vh序列和如seqidno:7所示的vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性，并且与分别具有如seqidno:1、2、3、4、yts和5所示的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3相比，第一抗原结合区的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3具有总共一至十二个突变。在进一步的实施方案中，所述突变可以如上所述。

在更进一步的实施方案中，第一抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与如seqidno:6所示的vh序列和如seqidno:7所示的vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性，并且第一抗原结合区包含分别具有如seqidno:1、2、3、4、yts和5所示的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3。

在一个实施方案中，第一抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与如seqidno:117所示的vh序列和如seqidno:121所示的vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％氨基酸序列同一性，并且与分别具有如seqidno:1、2、3、4、yts和5所示的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3相比，第一抗原结合区的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3具有总共一至十二个突变。在进一步的实施方案中，所述突变可以如上所述。

在更进一步的实施方案中，第一抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与如seqidno:117所示的vh序列和如seqidno:121所示的vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％氨基酸序列同一性，并且第一抗原结合区包含分别具有如seqidno:1、2、3、4、yts和5所示的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3。

在一个实施方案中，所述第一抗原结合区的vh序列包含seqidno:117的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述第一抗原结合区的vl序列包含seqidno:121的氨基酸序列。

在进一步的实施方案中，所述第一抗原结合区的vh和vl序列分别包含seqidno:117和seqidno:121的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述第一抗原结合区的vh序列包含seqidno:6的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述第一抗原结合区的vl序列包含seqidno:7的氨基酸序列。

在进一步的实施方案中，所述第一抗原结合区的vh和vl序列分别包含seqidno:6和seqidno:7的氨基酸序列。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体可以包括包含本文的任何方面或实施方案的所述第一抗原结合区的第一结合臂。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体包括包含所述第一抗原结合区和第一重链恒定序列的第一结合臂。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体包括包含所述第一抗原结合区的第一结合臂，其中第一结合臂包括包含第一重链可变(vh)序列和第一重链恒定(ch)序列的第一重链，以及包含第一轻链可变(vl)序列的第一轻链。

在一个实施方案中，所述第一轻链进一步包含第一轻链恒定(cl)序列。

在进一步的实施方案中，所述第一重链包含至少铰链区、ch2和ch3区。

在具体的实施方案中，根据本发明的多特异性抗体包括包含所述第一抗原结合区的第一fab臂。

在一个实施方案中，第一抗原结合区可以衍生自小鼠抗体。

在一个实施方案中，第一抗原结合区可以衍生自嵌合抗体，例如chilob7/4。

在一个实施方案中，第一抗原结合区可以衍生自人源化抗体。

在一个实施方案中，第一结合臂可以衍生自全长抗体。

在一个实施方案中，第一结合臂可以衍生自全长igg1，λ(lambda)或igg1，κ(kappa)抗体。

在一个实施方案中，第一结合臂可以衍生自单克隆抗体。

在一个实施方案中，所述第一重链可以是igg同种型的，任选地选自下组：igg1、igg2、igg3和igg4。

在一个实施方案中，第一结合臂可以衍生自包括包含seqidno:118的hc和包含seqidno:122的lc的抗体，任选地在hc的恒定区中具有一个或多个突变，例如1至10，例如1至5，例如1、2、3、4或5个突变。

在一个实施方案中，第一结合臂包括包含seqidno:118、119或120的hc和包含seqidno:122的lc。

与cd137结合

根据本发明的多特异性抗体包含与人cd137结合的第二抗原结合区。

在进一步的实施方案中，第二抗原结合区还与猕猴cd137结合。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区包含选自下组的重链和轻链可变区cdr3：

a)具有seqidno:10所示的序列或其中在seqidno:10中修饰多达四个氨基酸的序列的重链可变区cdr3，以及具有seqidno:12所示的序列或其中在seqidno:12中修饰多达四个氨基酸的序列的轻链可变区cdr3(cd137克隆001)，

b)具有seqidno:17所示的序列或其中在seqidno:17中修饰多达四个氨基酸的序列的重链可变区cdr3，以及具有seqidno:19所示的序列或其中在seqidno:19中修饰多达四个氨基酸的序列的轻链可变区cdr3(cd137克隆002)，

c)具有seqidno:24所示的序列或其中在seqidno:24中修饰多达四个氨基酸的序列的重链可变区cdr3，以及具有seqidno:26所示的序列或其中在seqidno:26中修饰多达四个氨基酸的序列的轻链可变区cdr3(cd137克隆003)，

d)具有seqidno:31所示的序列或其中在seqidno:31中修饰多达四个氨基酸的序列的重链可变区cdr3，以及具有seqidno:33所示的序列或其中在seqidno:33中修饰多达四个氨基酸的序列的轻链可变区cdr3(cd137克隆004)，

e)具有seqidno:38所示的序列或其中在seqidno:38中修饰多达四个氨基酸的序列的重链可变区cdr3，以及具有seqidno:40所示的序列或其中在seqidno:40中修饰多达四个氨基酸的序列的轻链可变区cdr3(cd137克隆005)，

f)具有seqidno:45所示的序列或其中在seqidno:45中修饰多达四个氨基酸的序列的重链可变区cdr3，以及具有seqidno:47所示的序列或其中在seqidno:47中修饰多达四个氨基酸的序列的轻链可变区cdr3(cd137克隆006)，

g)具有seqidno:52所示的序列或其中在seqidno:52中修饰多达四个氨基酸的序列的重链可变区cdr3，以及具有seqidno:54所示的序列或其中在seqidno:54中修饰多达四个氨基酸的序列的轻链可变区cdr3(cd137克隆007)，

h)具有seqidno:59所示的序列或其中在seqidno:59中修饰多达四个氨基酸的序列的重链可变区cdr3，以及具有seqidno:61所示的序列或其中在seqidno:61中修饰多达四个氨基酸的序列的轻链可变区cdr3(cd137克隆008)，

i)具有seqidno:66所示的序列或其中在seqidno:66中修饰多达四个氨基酸的序列的重链可变区cdr3，以及具有seqidno:68所示的序列或其中在seqidno:68中修饰多达四个氨基酸的序列的轻链可变区cdr3(cd137克隆009)，

j)具有seqidno:73所示的序列或其中在seqidno:73中修饰多达四个氨基酸的序列的重链可变区cdr3，以及具有seqidno:75所示的序列或其中在seqidno:75中修饰多达四个氨基酸的序列的轻链可变区cdr3(cd137克隆010)，

k)具有seqidno:80所示的序列或其中在seqidno:80中修饰多达四个氨基酸的序列的重链可变区cdr3，以及具有seqidno:82所示的序列或其中在seqidno:82中修饰多达四个氨基酸的序列的轻链可变区cdr3(cd137克隆011)，

l)具有seqidno:87所示的序列或其中在seqidno:87中修饰多达四个氨基酸的序列的重链可变区cdr3，以及具有seqidno:89所示的序列或其中在seqidno:89中修饰多达四个氨基酸的序列的轻链可变区cdr3(cd137克隆012)，和

m)抗体的重链和轻链可变区cdr3，所述抗体(i)与包含根据a)至l)中任一项的重链和轻链可变区cdr3的抗体竞争与人cd137结合和/或(ii)对包含根据a)至l)中任一项的重链和轻链可变区cdr3的抗体的cd137具有特异性。

在进一步的实施方案中，所述第二抗原结合区进一步包含选自下组的重链和/或轻链区cdr1和cdr2：

a)具有seqidno:8所示的序列或其中在seqidno:8中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr1，和/或具有seqidno:9所示的序列或其中在seqidno:9中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr2，和/或具有seqidno:11所示的序列或其中在seqidno:11中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr1，和/或具有序列kas或其中在kas中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr2(cd137克隆001)，

b)具有seqidno:15所示的序列或其中在seqidno:15中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr1，和/或具有seqidno:16所示的序列或其中在seqidno:16中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr2，和/或具有seqidno:18所示的序列或其中在seqidno:18中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr1，和/或具有序列kas或其中在kas中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr2(cd137克隆002)，

c)具有seqidno:22所示的序列或其中在seqidno:22中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr1，和/或具有seqidno:23所示的序列或其中在seqidno:23中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr2，和/或具有seqidno:25所示的序列或其中在seqidno:25中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr1，和/或具有序列rts或其中在rts中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr2(cd137克隆003)，

d)具有seqidno:29所示的序列或其中在seqidno:29中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr1，和/或具有seqidno:30所示的序列或其中在seqidno:30中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr2，和/或具有seqidno:32所示的序列或其中在seqidno:32中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr1，和/或具有序列gas或其中在gas中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr2(cd137克隆004)，

e)具有seqidno:36所示的序列或其中在seqidno:36中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr1，和/或具有seqidno:37所示的序列或其中在seqidno:37中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr2，和/或具有seqidno:39所示的序列或其中在seqidno:39中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr1，和/或具有序列sas或其中在sas中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr2(cd137克隆005)，

f)具有seqidno:43所示的序列或其中在seqidno:43中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr1，和/或具有seqidno:44所示的序列或其中在seqidno:44中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr2，和/或具有seqidno:46所示的序列或其中在seqidno:46中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr1，和/或具有序列aas或其中在aas中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr2(cd137克隆006)，

g)具有seqidno:50所示的序列或其中在seqidno:50中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr1，和/或具有seqidno:51所示的序列或其中在seqidno:51中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr2，和/或具有seqidno:53所示的序列或其中在seqidno:53中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr1，和/或具有序列kas或其中在kas中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr2(cd137克隆007)，

h)具有seqidno:57所示的序列或其中在seqidno:57中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr1，和/或具有seqidno:58所示的序列或其中在seqidno:58中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr2，和/或具有seqidno:60所示的序列或其中在seqidno:60中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr1，和/或具有序列ras或其中在ras中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr2(cd137克隆008)，

i)具有seqidno:64所示的序列或其中在seqidno:64中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr1，和/或具有seqidno:65所示的序列或其中在seqidno:65中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr2，和/或具有seqidno:67所示的序列或其中在seqidno:67中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr1，和/或具有序列gas或其中在gas中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr2(cd137克隆009)，

j)具有seqidno:71所示的序列或其中在seqidno:71中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr1，和/或具有seqidno:72所示的序列或其中在seqidno:72中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr2，和/或具有seqidno:74所示的序列或其中在seqidno:74中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr1，和/或具有序列kas或其中在kas中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr2(cd137克隆010)，

k)具有seqidno:78所示的序列或其中在seqidno:78中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr1，和/或具有seqidno:79所示的序列或其中在seqidno:79中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr2，和/或具有seqidno:81所示的序列或其中在seqidno:81中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr1，和/或具有序列dts或其中在dts中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr2(cd137克隆011)，

l)具有seqidno:85所示的序列或其中在seqidno:85中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr1，和/或具有seqidno:86所示的序列或其中在seqidno:86中修饰多达两个氨基酸的序列的重链可变区cdr2，和/或具有seqidno:88所示的序列或其中在seqidno:88中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr1，和/或具有序列sas或其中在sas中修饰多达两个氨基酸的序列的轻链可变区cdr2(cd137克隆012)。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区包含选自下组的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3：

a)分别具有seqidno:8、9和10所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:11、kas和12所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆001)，

b)分别具有seqidno:15、16和17所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:18、kas和19所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆002)，

c)分别具有seqidno:22、23和24所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:25、rts和26所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆003)，

d)分别具有seqidno:29、30和31所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:32、gas和33所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆004)，

e)分别具有seqidno:36、37和38所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:39、sas和40所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆005)，

f)分别具有seqidno:43、44和45所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:46、aas和47所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆006)，

g)分别具有seqidno:50、51和52所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:53、kas和54所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆007)，

h)分别具有seqidno:57、58和59所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:60、ras和61所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆008)，

i)分别具有seqidno:64、65和66所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:67、gas和68所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆009)，

j)分别具有seqidno:71、72和73所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:74、kas和75所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆010)，

k)分别具有seqidno:78、79和80所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:81、dts和82所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆011)，

l)分别具有seqidno:85、86和87所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:88、sas和89所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆012)，

m)具有总共一至十二个突变的根据a)至l)中任一项的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，和

n)抗体的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，所述抗体(i)与包含根据a)至m)中任一项的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体竞争与人cd137结合和/或(ii)具有包含根据a)至m)中任一项的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体对cd137的特异性。

因此，第二抗原结合区可以包含如表1中所述的cd137抗体的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；即cd137克隆001、cd137克隆002、cd137克隆003、cd137克隆004、cd137克隆005、cd137克隆006、cd137克隆007、cd137克隆008、cd137克隆009、cd137克隆010、cd137克隆011或cd137克隆012。特别地，第二抗原结合区可以包含来自相同的cd137抗体克隆的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，任选地其中框架区主要是人框架区，任选地包含对非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变。

在进一步的实施方案中，第二抗原结合区包含抗体的重链和轻链可变区，所述抗体(i)与包含根据a)至m)中任一项的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体竞争与人cd137结合和/或(ii)具有包含根据a)至m)中任一项的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体对cd137的特异性。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区与人cd137(seqidno:92)结合的程度高于其与突变体人cd137(seqidno:93)结合的程度。seqidno:93的突变体人cd137在本文中也称为改组6。

在另一个实施方案中，所述第二抗原结合区与人cd137(seqidno:92)结合的程度高于其与突变体人cd137(seqidno:94)结合的程度。seqidno:94的突变体人cd137在本文中也称为改组5。

在进一步的实施方案中，所述第二抗原结合区与人cd137(seqidno:92)结合的程度和其与突变体人cd137(seqidno:95)结合的程度相同。seqidno:95的突变体人cd137在本文中也称为改组4。

在本发明的上下文中，“更高程度”意指对于人cd137(seqidno:92)的第二抗原结合区的亲和力高于对于突变体人cd137(分别为seqidno:93和94，改组6和5)的。如果与突变体cd137没有结合，则对于人cd137的亲和力将无限高于所述突变体cd137。然而，在与所述突变体cd137结合的情况下，对于人cd137的亲和力可以是比相应突变体cd137高2倍，例如3倍、或4倍、或5倍、或6倍。

在本发明的上下文中，“相同程度”意指对于人cd137(seqidno:92)的第二抗原结合区的亲和力相似于对于突变体人cd137(seqidno:95，改组4)的。特别地，在该上下文中的“相似”可以意指对于人cd137和对于所述突变体cd137的亲和力相差至多2.5倍，例如2.2倍、或2.0倍、或1.8倍、或1.75倍或1.5倍。

seqidno:93中的突变体人cd137对应于人cd137的氨基酸序列，其中氨基酸24-47(改组6)由来自野猪cd137的相应氨基酸取代。

因此，在一个实施方案中，第二抗原结合区与人cd137的表位结合，所述人cd137包含或需要seqidno:92的24-47位的一个或多个氨基酸l、q、d、p、c、s、n、c、p、a、g、t、f、c、d、n、n、r、n、q、i、c、s和p(对应于seqidno:129)。

seqidno:94中的突变体人cd137对应于人cd137的氨基酸序列，其中氨基酸48-88(改组5)由来自非洲象cd137的相应氨基酸取代。

因此，在一个实施方案中，第二抗原结合区与人cd137的表位结合，所述人cd137包含或需要seqidno:92的48-88位的一个或多个氨基酸c、p、p、n、s、f、s、s、a、g、g、q、r、t、c、d、i、c、r、q、c、k、g、v、f、r、t、r、k、e、c、s、s、t、s、n、a、e、c、d和c(对应于seqidno:130)。

seqidno:95中的突变体人cd137对应于人cd137的氨基酸序列，其中氨基酸59-114(改组4)由来自非洲象cd137的相应氨基酸取代。

因此，在一个实施方案中，第二抗原结合区不与以下人cd137的表位结合，所述人cd137包含或需要seqidno:92的89-114位的一个或多个氨基酸t、p、g、f、h、c、l、g、a、g、c、s、m、c、e、q、d、c、k、q、g、q、e、l、t和k(对应于seqidno:131)。

在一个实施方案中，可以作为实施例2中描述的改组测定法进行与突变体和人cd137的结合。因此，可以通过制备衍生自人cd137的改组构建体来测定与人cd137(seqidno:92)和突变体人cd137(seqidno:93、94和95)的结合，其中人cd137的蛋白质结构域由来自不同物种的cd137的相应结构域取代，使用人cd137和不同物种的cd137作为参照构建体；分别用编码参照构建体或改组构建体的质粒转导细胞，并通过流式细胞术(例如facs)测量抗体与每种这些cd137构建体的结合。

与某些改组构建体的结合的丧失表明相应的区域可能参与抗体表位。因此，由此可以通过改组测定法来测定有助于抗人cd137抗体表位的人cd137的蛋白质结构域。应选择用于产生改组构建体的不同物种的cd137，以使单克隆抗人cd137抗体不与来自这些不同物种的整个cd137蛋白结合(参照构建体)。

与人cd137及其突变体的结合的测定可以特别地用包含两个根据本发明的第二抗原结合区的单克隆抗体进行。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区包含选自下组的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3：

a)分别具有seqidno:8、9和10所述的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:11、kas和12所述的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆001)，

b)分别具有seqidno:15、16和17所述的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:18、kas和19所述的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆002)，

c)分别具有seqidno:36、37和38所述的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:39、sas和40所述的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆005)，

d)分别具有seqidno:43、44和45所述的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:46、aas和47所述的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆006)，

e)分别具有seqidno:64、65和66所述的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:67、gas和68所述的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆009)，

f)分别具有seqidno:71、72和73所述的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:74、kas和75所述的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆010)，

g)分别具有seqidno:85、86和87所述的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:88、sas和89所述的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆012)，

h)具有总共一至十二个突变的根据a)至g)中任一项的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，和

i)抗体的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，所述抗体(i)与包含根据a)至h)中任一项的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体竞争与人cd137结合和/或(ii)具有包含根据a)至h)中任一项的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体对cd137的特异性。

因此，在一个实施方案中，所述第二抗原结合区包含选自下组的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3：

a)分别具有seqidno:64、65和66所述的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:67、gas和68所述的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆009)，

b)具有总共一至十二个突变的根据a)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3；

c)抗体的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，所述抗体(i)与包含根据a)或b)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体竞争与人cd137结合和/或(ii)具有包含根据a)或b)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体对cd137的特异性。

在另一个实施方案中，所述第二抗原结合区包含选自下组的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3：

a)分别具有seqidno:36、37和38所述的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:39、sas和40所述的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆005)，

b)具有总共一至十二个突变的根据a)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，和

c)抗体的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，所述抗体(i)与包含根据a)或b)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体竞争与人cd137结合和/或(ii)具有包含根据a)或b)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体对cd137的特异性。

在具体的实施方案中，所述第二抗原结合区包含分别具有seqidno:64、65和66所述的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:67、gas和68所述的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3。此类抗体的实例包括但不限于本文中称作cd137克隆009的抗体。

在另一个实施方案中，所述第二抗原结合区包含分别具有seqidno:36、37和38所述的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:39、sas和40所述的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3。此类抗体的实例包括但不限于本文中称作cd137克隆005的抗体。

在另一个实施方案中，所述第二抗原结合区包含分别具有seqidno:64、65和66所述的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:67、gas和68所述的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆009)，其具有总共一至十二个突变，例如一至十个突变、或一至八个突变、或一至六个突变、或一至四个突变、或一至两个突变。

在另一个实施方案中，所述第二抗原结合区包含分别具有seqidno:36、37和38所述的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:39、sas和40所述的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆005)，其具有总共一至十二个突变,例如一至十个突变、或一至八个突变、或一至六个突变、或一至四个突变、或一至两个突变。

在一个实施方案中，所述突变可以是氨基酸取代，例如保守氨基酸取代。

在一个实施方案中，所述突变分布在vhcdr1、2和3以及vlcdr1、2和3上使得vh和vlcdr3的每一个包含至多三个突变并且vh和vlcdr2及cdr1的每一个包含至多两个氨基酸突变。

因此，在进一步的实施方案中，第二抗原结合区包含分别具有seqidno:64、65、66、67、gas和68所示的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆009)，其具有总共一至十二个突变并且其中vh和vlcdr3各自包含多达三个氨基酸修饰，而vh和vlcdr1及cdr2各自包含多达两个氨基酸修饰。

在进一步的实施方案中，第二抗原结合区包含分别具有seqidno:64、65、66、67、gas和68所示的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆009)，其具有总共一至十个突变，例如一至八个，并且其中vh和vlcdr1、cdr2和cdr3各自包含多达两个氨基酸修饰。

在进一步的实施方案中，第二抗原结合区包含分别具有seqidno:64、65、66、67、gas和68所示的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆009)，其具有总共一至六个突变，并且其中vh和vlcdr1、cdr2和cdr3各自包含至多一个氨基酸修饰。

在另一个实施方案中，第二抗原结合区包含分别具有seqidno:36、37、38、39、sas和40所示的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆005)，其具有总共一至十二个突变并且其中vh和vlcdr3各自包含多达三个氨基酸修饰，而vh和vlcdr1及cdr2各自包含多达两个氨基酸修饰。

在进一步的实施方案中，第二抗原结合区包含分别具有seqidno:36、37、38、39、sas和40所示的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆005)，其具有总共一至十个突变，例如一至八个，并且其中vh和vlcdr1、cdr2和cdr3各自包含多达两个氨基酸修饰。

在进一步的实施方案中，第二抗原结合区包含分别具有seqidno:36、37、38、39、sas和40所示的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆005)，其具有总共一至六个突变，并且其中vh和vlcdr1、cdr2和cdr3各自包含至多一个氨基酸修饰。

在进一步的实施方案中，总共可以有一至十二个突变；例如一至十个突变、或一至八个突变、或一至六个突变、或一至四个突变、或一至两个突变；并且每个cdr序列包含至多两个氨基酸取代。

本领域技术人员熟知如何引入突变并且可以突变cdr序列的某些氨基酸；例如通过氨基酸取代以例如增加抗体对其靶抗原的亲和力，或降低用于治疗人的非人抗体的免疫原性。可以引入此类突变而不影响抗体结合的靶抗原的表位。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区包含第二重链可变(vh)序列和第二轻链可变(vl)序列，并且其中所述可变序列各自分别包含三个cdr序列，cdr1、cdr2和cdr3。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区包含第二重链可变(vh)序列和第二轻链可变(vl)序列，并且其中所述可变序列各自分别包含三个cdr序列，cdr1、cdr2和cdr3，以及四个框架序列，fr1、fr2、fr3和fr4。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vh序列包含与选自下组的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列：

a)如seqidno:123所示的vh序列(人源化cd137克隆009)

b)如seqidno:13所示的vh序列(cd137克隆001)

c)如seqidno:20所示的vh序列(cd137克隆002)

d)如seqidno:27所示的vh序列(cd137克隆003)

e)如seqidno:34所示的vh序列(cd137克隆004)

f)如seqidno:41所示的vh序列(cd137克隆005)

g)如seqidno:48所示的vh序列(cd137克隆006)

h)如seqidno:55所示的vh序列(cd137克隆007)

i)如seqidno:62所示的vh序列(cd137克隆008)

j)如seqidno:69所示的vh序列(cd137克隆009)

k)如seqidno:76所示的vh序列(cd137克隆010)

l)如seqidno:83所示的vh序列(cd137克隆011)

m)如seqidno:90所示的vh序列(cd137克隆012)

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vl序列包含与选自下组的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列：

a)如seqidno:127所示的vl序列(人源化cd137克隆009)

b)如seqidno:14所示的vl序列(cd137克隆001)

c)如seqidno:21所示的vl序列(cd137克隆002)

d)如seqidno:28所示的vl序列(cd137克隆003)

e)如seqidno:35所示的vl序列(cd137克隆004)

f)如seqidno:42所示的vl序列(cd137克隆005)

g)如seqidno:49所示的vl序列(cd137克隆006)

h)如seqidno:56所示的vl序列(cd137克隆007)

i)如seqidno:63所示的vl序列(cd137克隆008)

j)如seqidno:70所示的vl序列(cd137克隆009)

k)如seqidno:77所示的vl序列(cd137克隆010)

l)如seqidno:84所示的vl序列(cd137克隆011)

m)如seqidno:91所示的vl序列(cd137克隆012)

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vh和vl序列各自包含与选自下组的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列：

a)如seqidno:123所示的vh序列和如seqidno:127所示的vl序列(人源化cd137克隆009)

b)如seqidno:13所示的vh序列和如seqidno:14所示的vl序列(cd137克隆001)

c)如seqidno:20所示的vh序列和如seqidno:21所示的vl序列(cd137克隆002)

d)如seqidno:27所示的vh序列和如seqidno:28所示的vl序列(cd137克隆003)

e)如seqidno:34所示的vh序列和如seqidno:35所示的vl序列(cd137克隆004)

f)如seqidno:41所示的vh序列和如seqidno:42所示的vl序列(cd137克隆005)

g)如seqidno:48所示的vh序列和如seqidno:49所示的vl序列(cd137克隆006)

h)如seqidno:55所示的vh序列和如seqidno:56所示的vl序列(cd137克隆007)

i)如seqidno:62所示的vh序列和如seqidno:63所示的vl序列(cd137克隆008)

j)如seqidno:69所示的vh序列和如seqidno:70所示的vl序列(cd137克隆009)

k)如seqidno:76所示的vh序列和如seqidno:77所示的vl序列(cd137克隆010)

l)如seqidno:83所示的vh序列和如seqidno:84所示的vl序列(cd137克隆011)

m)如seqidno:90所示的vh序列和如seqidno:91所示的vl序列(cd137克隆012)。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vh序列包含与选自下组的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列：

a)如seqidno:123所示的vh序列(人源化cd137克隆009)

b)如seqidno:41所示的vh序列(cd137克隆005)

c)如seqidno:69所示的vh序列(cd137克隆009)

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vl序列包含与选自下组的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列：

a)如seqidno:127所示的vl序列(人源化cd137克隆009)

b)如seqidno:42所示的vl序列(cd137克隆005)

c)如seqidno:70所示的vl序列(cd137克隆009)

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vh和vl序列各自包含与选自下组的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列：

a)如seqidno:123所示的vh序列和如seqidno:127所示的vl序列(人源化cd137克隆009)

b)如seqidno:41所示的vh序列和如seqidno:42所示的vl序列(cd137克隆005)

c)如seqidno:69所示的vh序列和如seqidno:70所示的vl序列(cd137克隆009)

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vh序列包含与seqidno:41具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的氨基酸序列(cd137克隆005)。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vh序列包含与seqidno:69具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的氨基酸序列(cd137克隆009)。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vh序列包含与seqidno:123具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列(人源化cd137克隆009)。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vl序列包含与seqidno:42具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的氨基酸序列(cd137克隆005)。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vl序列包含与seqidno:70具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的氨基酸序列(cd137克隆009)。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vl序列包含与seqidno:127具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列(人源化cd137克隆009)。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的所述vh和所述vl序列各自分别包含与seqidno:41和seqidno:42具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的氨基酸序列(cd137克隆005)。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的所述vh和所述vl序列各自分别包含与seqidno:69和seqidno:70具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的氨基酸序列(cd137克隆009)。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的所述vh和所述vl序列各自分别包含与seqidno:123和seqidno:127具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列(人源化cd137克隆009)。

在一个实施方案中，所述vh和vl序列仅在框架序列中偏离。

在一个实施方案中，第一和/或第二抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与所述vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％氨基酸序列同一性。

在一个实施方案中，vh和vl序列仅分别在如seqidno:41和42所示的非cdr序列中偏离(cd137克隆005)。

在一个实施方案中，vh和vl序列仅分别在如seqidno:69和70所示的非cdr序列中偏离(cd137克隆009)。

在一个实施方案中，vh和vl序列仅分别在如seqidno:123和127所示的非cdr序列中偏离(人源化cd137克隆009)。

在一个实施方案中，vh和vl序列仅在框架序列中偏离。

在一个实施方案中，第一和/或第二抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与所述vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％氨基酸序列同一性。

在一个实施方案中，第二抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与如seqidno:41所示的vh序列和如seqidno:42所示的vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性。

在一个实施方案中，第二抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与如seqidno:41所示的vh序列和如seqidno:42所示的vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性，并且与分别具有如seqidno:36、37、38、39、sas和40所示的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3相比，第二抗原结合区的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3具有总共一至十二个突变。在进一步的实施方案中，所述突变可以如上所述。

在更进一步的实施方案中，第二抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与如seqidno:41所示的vh序列和如seqidno:42所示的vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性，并且第二抗原结合区包含分别具有如seqidno:36、37、38、39、sas和40所示的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3。

在一个实施方案中，第二抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与如seqidno:69所示的vh序列和如seqidno:70所示的vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性。

在一个实施方案中，第二抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与如seqidno:69所示的vh序列和如seqidno:70所示的vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性，并且与分别具有如seqidno:64、65、66、67、gas和68所示的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3相比，第二抗原结合区的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3具有总共一至十二个突变。在进一步的实施方案中，所述突变可以如上所述。

在更进一步的实施方案中，第二抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与如seqidno:69所示的vh序列和如seqidno:70所示的vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性，并且第二抗原结合区包含分别具有如seqidno:64、65、66、67、gas和68所示的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3。

在一个实施方案中，第二抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与如seqidno:123所示的vh序列和如seqidno:127所示的vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％氨基酸序列同一性。

在一个实施方案中，第二抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与如seqidno:123所示的vh序列和如seqidno:127所示的vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％氨基酸序列同一性，并且与分别具有如seqidno:64、65、66、67、gas和68所示的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3相比，第二抗原结合区的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3具有总共一至十二个突变。在进一步的实施方案中，所述突变可以如上所述。

在更进一步的实施方案中，第二抗原结合区的vh和vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列具有与如seqidno:123所示的vh序列和如seqidno:127所示的vl序列的各自的fr1、fr2、fr3和fr4框架序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％氨基酸序列同一性，并且第二抗原结合区包含分别具有如seqidno:64、65、66、67、gas和68所示的序列的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vh序列包含seqidno:123(人源化cd137克隆009)。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vl序列包含seqidno:127(人源化cd137克隆009)。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vh和vl序列分别包含seqidno:123和seqidno:127。

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vh序列包含选自下组的vh序列：

a)seqidno:41(cd137克隆005)

b)seqidno:69(cd137克隆009)

在一个实施方案中，所述第二抗原结合区的vl序列包含选自下组的vl序列：

a)seqidno:42(cd137克隆005)

b)seqidno:70(cd137克隆009)

在一个实施方案中，所述第二抗原结合的vh和vl序列选自下组：

a)如seqidno:41所示的vh序列和如seqidno:42所示的vl序列(cd137克隆005)，

b)如seqidno:69所示的vh序列和如seqidno:70所示的vl序列(cd137克隆009)。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体包括包含所述第二抗原结合区的第二结合臂。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体包括包含所述第二抗原结合区和第二重链恒定序列的第二结合臂。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体包括包含所述第二抗原结合区的第二结合臂，其中第二结合臂包括包含第二重链可变(vh)序列和第二重链恒定(ch)序列的第二重链，以及包含第二轻链可变(vl)序列的第二轻链。

在一个实施方案中，所述第二轻链进一步包含第二轻链恒定序列。

在进一步的实施方案中，所述第二重链包含至少铰链区、ch2和ch3区。

在具体的实施方案中，根据本发明的多特异性抗体包括包含所述第二抗原结合区的第二fab臂。

在一个实施方案中，第二抗原结合区衍生自兔抗体，例如本文公开的抗cd137克隆1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一项，特别是克隆5和9中的任一项。

在一个实施方案中，第二抗原结合区可以衍生自嵌合抗体，例如本文公开的包含来自抗cd137克隆1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一项，特别是克隆5和9中的任一项的可变区的抗体。

在一个实施方案中，第二抗原结合区衍生自人源化抗体。

在一个实施方案中，第二结合臂衍生自全长抗体。

在一个实施方案中，第二结合臂衍生自全长igg1，λ(lambda)或igg1，κ(kappa)抗体。

在一个实施方案中，第二结合臂衍生自单克隆抗体。

在一个实施方案中，所述第二重链可以是igg同种型的，任选地具有选自下组的亚类：igg1、igg2、igg3和igg4。

在一个实施方案中，第一结合臂可以衍生自包括包含seqidno:124的hc和包含seqidno:128的lc的抗体，任选地在hc的恒定区中具有一个或多个突变，例如1至10，例如1至5，例如1、2、3、4或5个突变。

在一个实施方案中，第一结合臂包括包含seqidno:124、125或126的hc和包含seqidno:128的lc。

与cd40和cd137结合

在一些实施方案中，本发明涉及多特异性抗体，其包含

(i)与人cd40结合的第一抗原结合区，其所示第一抗原结合区包含选自下组的重链和轻链可变区：

a)分别具有seqidno:1、2和3所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:4、yts和5所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，

b)具有总共一至十二个突变的根据a)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3；和

c)抗体的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，所述抗体(i)与包含根据a)或b)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体竞争与人cd40结合和/或(ii)具有包含根据a)或b)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体对cd40的特异性，和

(ii)与人cd137结合的第二抗原结合区，其中所述第二抗原结合区包含选自下组的重链和轻链可变区：

x)分别具有seqidno:64、65和66所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:67、gas和68所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆009)，

y)具有总共一至十二个突变的根据x)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3；和

z)抗体的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，所述抗体(i)与包含根据x)或y)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体竞争与人cd137结合和/或(ii)具有包含根据x)或y)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体对cd137的特异性。

在另一个实施方案中，本发明涉及多特异性抗体，其包含

(i)与人cd40结合的第一抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含选自下组的重链和轻链可变区：

a)分别具有seqidno:1、2和3所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:4、yts和5所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，

b)具有总共一至十二个突变的根据a)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3；和

c)抗体的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，所述抗体(i)与包含根据a)或b)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体竞争与人cd40结合和/或(ii)具有包含根据a)或b)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体对cd40的特异性，和

(ii)与人cd137结合的第二抗原结合区，其中所述第二抗原结合区包含选自下组的重链和轻链可变区：

x)分别具有seqidno:36、37和38所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:39、sas和40所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆005)，

y)具有总共一至十二个突变的根据x)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3；和

z)抗体的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3，所述抗体(i)与包含根据x)或y)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体竞争与人cd137结合和/或(ii)具有包含根据x)或y)的重链和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的抗体对cd137的特异性。

因此，在一个实施方案中，所述第一抗原结合区包含分别具有seqidno:1、2和3所示的氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:4、yts和5所示的氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3；并且所述第二抗原结合区包含

a)分别具有seqidno:64、65和66所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:67、gas和68所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆009)，或

b)分别具有seqidno:36、37和38所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:39、sas和40所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆005)。

在另一个实施方案中，所述第一抗原结合区包含分别具有seqidno:1、2和3所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:4、yts和5所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3；并且所述第二抗原结合区包含分别具有seqidno:64、65和66所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:67、gas和68所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆009)。

在另一个实施方案中，所述第一抗原结合区包含分别具有seqidno:1、2和3所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:4、yts和5所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3；并且所述第二抗原结合区包含分别具有seqidno:36、37和38所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:39、sas和40所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆005)。

在进一步的实施方案中，根据本发明的多特异性抗体的所述第一抗原结合区包含第一重链可变(vh)序列和第一轻链可变(vl)序列，并且根据本发明的多特异性抗体的所述第二抗原结合区包含第二vh序列和第二vl序列，并且其中所述可变序列各自包含三个cdr序列，分别是cdr1、cdr2和cdr3，以及四个框架序列，分别是fr1、fr2、fr3和fr4。

在进一步的实施方案中，所述第一抗原结合区的vh和vl序列各自包含分别与如seqidno:6所示的vh序列和如seqidno:7所示的vl序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列，并且所述第二抗原结合区的所述vh和所述vl序列各自分别包含与如seqidno:41所示的vh序列和如seqidno:42所示的vl序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列(cd137克隆005)。

在另一个进一步的实施方案中，所述第一抗原结合区的vh和vl序列各自包含分别与如seqidno:6所示的vh序列和如seqidno:7所示的vl序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列，并且所述第二抗原结合区的所述vh和所述vl序列各自分别包含与如seqidno:69所示的vh序列和如seqidno:70所示的vl序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列(cd137克隆009)。

在另一个进一步的实施方案中，所述第一抗原结合区的vh和vl序列各自包含分别与如seqidno:117所示的vh序列和如seqidno:121所示的vl序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列，并且所述第二抗原结合区的所述vh和所述vl序列各自分别包含与如seqidno:123所示的vh序列和如seqidno:127所示的vl序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列(人源化cd137克隆009)。

在具体的实施方案中，本发明涉及双特异性抗体，其包含

(i)包括包含第一重链可变(vh)序列和第一重链恒定(ch)序列的第一重链，以及包含第一轻链可变(vl)序列和第一轻链恒定(cl)序列的第一轻链的第一结合臂，并且其中所述第一重链可变序列包含分别具有seqidno:1、2和3所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3，并且所述第一轻链序列包含分别具有seqidno:4、yts和5所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3，和

(ii)包括包含第二重链可变(vh)序列和第二重链恒定(ch)序列的第二重链的第二结合臂，并且第二轻链进一步包含第二轻链恒定(cl)序列和第二轻链可变(vl)序列，其中所述第二重链可变序列包含分别具有seqidno:64、65和66所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3，并且所述第二轻链序列包含分别具有seqidno:67、gas和68所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆009)；

其中第一和第二重链是人igg1同种型的并且其中第一和第二轻链是igg1，κ的，并且其中第一和第二恒定重链两者对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置分别是f、e和a，并且其中(a)第一恒定重链对应于根据eu编号的人igg1重链中f405的位置是l，而第二恒定重链对应于根据eu编号的人igg1重链中k409的位置是r；或(b)第一恒定重链对应于根据eu编号的人igg1重链中k409的位置是r，而第二恒定重链对应于根据eu编号的人igg1重链中f405的位置是l。

在进一步具体的实施方案中，本发明涉及双特异性抗体，其包含

(i)包括包含第一重链可变(vh)序列和第一重链恒定(ch)序列的第一重链，以及包含第一轻链可变(vl)序列和第一轻链恒定(cl)序列的第一轻链的第一结合臂，并且其中所述第一重链可变序列包含分别具有seqidno:1、2和3所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3，并且所述第一轻链序列包含分别具有seqidno:4、yts和5所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3，和

(ii)包括包含第二重链可变(vh)序列和第二重链恒定(ch)序列的第二重链的第二结合臂，并且第二轻链进一步包含第二轻链恒定(cl)序列第二轻链可变(vl)序列，其中所述第二重链可变序列包含分别具有seqidno:36、37和38所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3，并且所述第二轻链序列包含分别具有seqidno:39、sas和40所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆005)；和

其中第一和第二重链是人igg1同种型的并且其中第一和第二轻链是igg1，κ的，并且其中第一和第二恒定重链两者对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置分别是f、e和a，并且其中(a)第一恒定重链对应于根据eu编号的人igg1重链中f405的位置是l，而第二恒定重链对应于根据eu编号的人igg1重链中k409的位置是r；或(b)第一恒定重链对应于根据eu编号的人igg1重链中k409的位置是r，而第二恒定重链对应于根据eu编号的人igg1重链中f405的位置是l。

在具体的实施方案中，本发明涉及双特异性抗体，其包含

(i)包括包含第一重链可变(vh)序列和第一重链恒定(ch)序列的第一重链，以及包含第一轻链可变(vl)序列和第一轻链恒定(cl)序列的第一轻链的第一结合臂，并且其中所述第一vh和vl序列各自包含分别与如seqidno:117所示的vh序列和如seqidno:121所示的vl序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列，和

(ii)包括包含第二重链可变(vh)序列和第二重链恒定(ch)序列的第二重链的第二结合臂，并且第二轻链进一步包含第二轻链恒定(cl)序列和第二轻链可变(vl)序列，其所示第二vh和vl序列各自分别包含与如seqidno:123中所述的vh序列和如seqidno:127所示的vl序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列(人源化cd137克隆009)。

在进一步具体的实施方案中，本发明涉及双特异性抗体，其包含

(i)包括包含第一重链可变(vh)序列和第一重链恒定(ch)序列的第一重链，以及包含第一轻链可变(vl)序列和第一轻链恒定(cl)序列的第一轻链的第一结合臂，并且其中所述第一vh序列包含seqidno:117而所述第一vl序列包含seqidno:121，和

(ii)包括包含第二重链可变(vh)序列和第二重链恒定(ch)序列的第二重链的第二结合臂，并且第二轻链进一步包含第二轻链恒定(cl)序列和第二轻链可变(vl)序列，其中所述第二vh序列包含seqidno:123而所述第二vl序列包含seqidno:127(人源化cd137克隆009)。

在具体的实施方案中，本发明涉及双特异性抗体，其包含

(i)包括包含第一重链可变(vh)序列和第一重链恒定(ch)序列的第一重链，以及包含第一轻链可变(vl)序列和第一轻链恒定(cl)序列的第一轻链的第一结合臂，并且其中所述第一vh和vl序列各自包含分别与如seqidno:117中所述的vh序列和如seqidno:121中所述的vl序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列，和

(ii)包括包含第二重链可变(vh)序列和第二重链恒定(ch)序列的第二重链的第二结合臂，并且第二轻链进一步包含第二轻链恒定(cl)序列和第二轻链可变(vl)序列，其中所述第二vh和vl序列各自分别包含与如seqidno:123中所述的vh序列和如seqidno:127中所述的vl序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列(人源化cd137克隆009)，

其中第一和第二重链是人igg1同种型的并且其中第一和第二轻链是igg1，κ的，并且其中第一和第二恒定重链两者对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置分别是f、e和a，并且其中(a)第一恒定重链对应于根据eu编号的人igg1重链中f405的位置是l，而第二恒定重链对应于根据eu编号的人igg1重链中k409的位置是r；或(b)第一恒定重链对应于根据eu编号的人igg1重链中k409的位置是r，而第二恒定重链对应于根据eu编号的人igg1重链中f405的位置是l。

在进一步具体的实施方案中，本发明涉及双特异性抗体，其包含

(i)包括包含第一重链可变(vh)序列和第一重链恒定(ch)序列的第一重链，以及包含第一轻链可变(vl)序列和第一轻链恒定(cl)序列的第一轻链的第一结合臂，并且其中所述第一vh序列包含seqidno:117而所述第一vl序列包含seqidno:121，和

(ii)包括包含第二重链可变(vh)序列和第二重链恒定(ch)序列的第二重链的第二结合臂，并且第二轻链进一步包含第二轻链恒定(cl)序列和第二轻链可变(vl)序列，其中所述第二vh序列包含seqidno:123而所述第二vl序列包含seqidno:127(人源化cd137克隆009)，

其中第一和第二重链是人igg1同种型的并且其中第一和第二轻链是igg1，κ的，并且其中第一和第二恒定重链两者对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置分别是f、e和a，并且其中(a)第一恒定重链对应于根据eu编号的人igg1重链中f405的位置是l，而第二恒定重链对应于根据eu编号的人igg1重链中k409的位置是r；或(b)第一恒定重链对应于根据eu编号的人igg1重链中k409的位置是r，而第二恒定重链对应于根据eu编号的人igg1重链中f405的位置是l。

在另一个方面，本发明涉及双特异性抗体，其包含与人cd40结合的第一结合臂和与人cd137结合的第二结合臂，其中

(i)所述第一结合臂包含重链(hc)氨基酸序列(包含seqidno:118或由seqidno:118组成)和轻链(lc)氨基酸序列(包含seqidno:122或由seqidno:122组成)，并且

(ii)所述第二结合臂包含hc氨基酸序列(包含seqidno:124或由seqidno:124组成)和lc氨基酸序列(包含seqidno:128或由seqidno:128组成)，

任选地其中seqidno:118、seqidno:124或其两者包含在hc的恒定区中的一个或多个突变，例如1至10，例如1至5，例如1、2、3、4或5个突变

在另一个方面，本发明涉及双特异性抗体，其包含与人cd40结合的第一结合臂和与人cd137结合的第二结合臂，其中

(i)所述第一结合臂包含hc氨基酸序列(包含seqidno:119或由seqidno:119组成)和lc氨基酸序列(包含seqidno:122或由seqidno:122组成)，并且

(ii)所述第二结合臂包含hc氨基酸序列(包含seqidno:125或由seqidno:125组成)和lc氨基酸序列(包含seqidno:128或由seqidno:128组成)。

在另一个方面，本发明涉及双特异性抗体，其包含与人cd40结合的第一结合臂和与人cd137结合的第二结合臂，其中

(i)所述第一结合臂包含hc氨基酸序列(包含seqidno:120或由seqidno:120组成)和lc氨基酸序列(包含seqidno:122或由seqidno:122组成)，并且

(ii)所述第二结合臂包含hc氨基酸序列(包含seqidno:126或由seqidno:126组成)和lc氨基酸序列(包含seqidno:128或由seqidno:128组成)。

双特异性形式

在具体的实施方案中，根据本发明的多特异性抗体是双特异性抗体。

本发明提供了双特异性cd40xcd137抗体，其能够交联表达cd40的细胞和表达cd137的细胞；分别例如抗原呈递细胞和t细胞。取决于用于特定用途的所需功能特性，特定的抗原结合区可以选自本发明提供的抗体或抗原结合区的组。双特异性抗体的许多不同形式和用途是本领域已知的，并综述于kontermann；drugdiscovtoday,2015jul；20(7):838-47和；mabs,2012mar-apr；4(2):182-97。

根据本发明的双特异性抗体不限于任何特定的双特异性形式或生产它的方法。

可以用于本发明的双特异性抗体分子的实例包括(i)单个抗体，其具有包含不同抗原结合区的两个结合臂；(ii)单链抗体，其对两个不同的表位具有特异性，例如，通过由额外的肽接头串联连接的两个scfv；(iii)双重可变结构域抗体(dvd-ig)，其中每条轻链和重链含有通过短肽连接串联的两个可变结构域(wuetal.,generationandcharacterizationofadualvariabledomainimmunoglobulin(dvd-ig^tm)molecule,in:antibodyengineering,springerberlinheidelberg(2010))；(iv)化学连接的双特异性(fab’)2片段；(v)tandab，其是两个单链双抗体的融合体，产生对每个靶抗原具有两个结合位点的四价双特异性抗体；(vi)flexibody，其是scfv与双价抗体(diabody)的组合，产生多价分子；(vii)所谓的“对接和锁定(dockandlock)”分子，基于蛋白激酶a中的“二聚化和对接结构域”，其当应用于fab时，可以产生三价双特异性结合蛋白，其由与不同fab片段连接的两个相同的fab片段组成；(viii)所谓的scorpion分子，包含例如与人fab臂的两个末端融合的两个scfv；以及(ix)双价抗体。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体是经由受控的fab臂交换获得的双价抗体、交叉抗体(cross-body)或双特异性抗体(例如wo2011131746(genmab)中描述的)。

不同类别的双特异性抗体的实例包括但不限于(i)具有互补ch3结构域的igg样分子强制异源二聚化；(ii)重组igg样双重靶向分子，其中分子的两侧各自含有fab片段或至少两种不同抗体的fab片段的一部分；(iii)igg融合分子，其中全长igg抗体与额外的fab片段或fab片段的部分融合；(iv)fc融合分子，其中单链fv分子或稳定的双价抗体与重链恒定结构域、fc区或其部分融合；(v)fab融合分子，其中不同的fab片段融合在一起，与重链恒定结构域、fc区或其部分融合；以及(vi)基于scfv和基于双价抗体的抗体和重链抗体(例如，结构域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链fv分子或不同的双价抗体或不同的重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)彼此融合或融合至与重链恒定结构域、fc区或其部分融合的另一蛋白质或载体分子。

具有互补ch3结构域分子的igg样分子的实例包括但不限于，triomab/quadroma分子(trionpharma/freseniusbiotech；roche，wo2011069104)、所谓的结进孔(knobs-into-holes)分子(genentech，wo9850431)、crossmab(roche，wo2011117329)和静电匹配的分子(amgen，ep1870459和wo2009089004；chugai，us201000155133；oncomed，wo2010129304)、luz-y分子(genentech，wraniketal.j.biol.chem.2012,287(52):43331-9,doi:10.1074/jbc.m112.397869.epub2012nov1)、dig-body和pig-body分子(pharmabcine，wo2010134666，wo2014081202)、链交换工程化结构域抗体(strandexchangeengineereddomainbody)(seedbody)分子(emdserono，wo2007110205)、biclonics分子(merus，wo2013157953)、fcδadp分子(regeneron,wo201015792)、双特异性igg1和igg2分子(pfizer/rinat，wo11143545)、azymetric支架分子(zymeworks/merck，wo2012058768)、mab-fv分子(xencor，wo2011028952)、双价双特异性抗体(wo2009080254)以及分子(genmaba/s，wo2011131746)。

重组igg样双重靶向分子的实例包括但不限于，双重靶向(dt)-ig分子(wo2009058383)、二合一抗体(genentech；bostrom,etal2009.science323,1610–1614.)、交联mab(karmanoscancercenter)、mab2(f-star,wo2008003116)、zybody分子(zyngenia；lafleuretal.mabs.2013mar-apr；5(2):208-18)、具有共同轻链的方法(crucell/merus,us7,262,028)、κλ抗体(novimmune,wo2012023053)以及covx-body(covx/pfizer；doppalapudi,v.r.,etal2007.bioorg.med.chem.lett.17,501–506.)。

igg融合分子的实例包括但不限于，双重可变结构域(dvd)-ig分子(abbott,us7,612,181)、双重结构域双头抗体(unilever；sanofiaventis,wo20100226923)、igg样双特异性分子(imclone/elililly,lewisetal.natbiotechnol.2014feb；32(2):191-8)、ts2ab(medimmune/az；dimasietal.jmolbiol.2009oct30；393(3):672-92)和bsab分子(zymogenetics,wo2010111625)、hercules分子(biogenidec,us007951918)、scfv融合分子(novartis)、scfv融合分子(changzhouadambiotechinc,cn102250246)以及tvab分子(roche,wo2012025525,wo2012025530)。

fc融合分子的实例包括但不限于，scfv/fc融合蛋白(pearceetal.,biochemmolbiolint.1997sep；42(6):1179-88)、scorpion分子(emergentbiosolutions/trubion,blankenshipjw,etal.aacr100thannualmeeting2009(abstract#5465)；zymogenetics/bms,wo2010111625)、双亲和重靶向技术(dualaffinityretargetingtechnology)(fc-dart)分子(macrogenics,wo2008157379,wo2010080538)以及双重(scfv)2-fab分子(nationalresearchcenterforantibodymedicine–china)。

fab融合双特异性抗体的实例包括但不限于，f(ab)2分子(medarex/amgen；deoetaljimmunol.1998feb15；160(4):1677-86.)、双重作用(dual-action)或bis-fab分子(genentech,bostrom,etal2009.science323,1610–1614.)、对接和锁定(dock-and-lock)(dnl)分子(immunomedics,wo2003074569,wo2005004809)、二价双特异性分子(biotecnol,schoonjans,jimmunol.2000dec15；165(12):7050-7.)以及fab-fv分子(ucb-celltech,wo2009040562a1)。

基于scfv、基于双价抗体和结构域抗体的实例包括但不限于，双特异性t细胞衔接(bispecifictcellengager)(bite)分子(micromet,wo2005061547)、串联双价抗体分子(tandemdiabody)(tandab)(affimed)legalletal.,proteinengdessel.2004apr；17(4):357-66.)、双亲和重靶向技术(dart)分子(macrogenics,wo2008157379,wo2010080538)、单链双价抗体分子(lawrence,febslett.1998apr3；425(3):479-84)、tcr样抗体(ait,receptorlogics)、人血清白蛋白scfv融合蛋白(merrimack,wo2010059315)和combody分子(epigenbiotech,zhuetal.immunolcellbiol.2010aug；88(6):667-75.)、双重靶向纳米抗体(ablynx,hmilaetal.,fasebj.2010)以及双重靶向重链仅结构域抗体。

在一个实施方案中，所述第一和第二重链中的每一个包含至少铰链区、ch2和ch3区。

在进一步的实施方案中，第一和第二重链的ch3区包含不对称突变，例如产生稳定的异源二聚体抗体的不对称突变(本文也称为修饰)。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包括包含第一ch3区的第一重链和包含第二ch3区的第二重链，其中第一和第二ch3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二ch3区之间的异源二聚体相互作用强于所述第一和第二ch3区的同源二聚体相互作用的每一个。关于这些相互作用及其如何实现的更多细节在例如wo2011/131746和wo2013/060867(genmab)中提供，其通过引用并入本文。

如本文进一步所述，可以使用基于一种同源二聚体亲本cd40抗体和一种同源二聚体亲本cd137抗体(其在ch3区仅含有少量相当保守的不对称突变)的特定方法以高产率获得稳定的双特异性cd40xcd137抗体。不对称突变意指所述第一和第二ch3区的序列在不相同的位置含有氨基酸取代。

因此，在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的一个实施方案中，所述第一和第二重链ch3区的序列含有不对称突变，例如，在ch3区之一中对应于根据eu编号的人igg1重链中位置405的位置处的突变，和在其他ch3区中对应于根据eu编号的人igg1重链中位置409的位置处的突变。

在一个方面，在本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体包含第一和第二重链，其中在所述第一重链中，在对应于根据eu编号的人igg1重链中选自下组的位置的位置中的至少一个氨基酸已经被取代：t366、l368、k370、d399、f405、y407和k409，并且在所述第二重链中，在对应于根据eu编号的人igg1重链中选自下组的位置的位置中的至少一个氨基酸已经被取代：t366、l368、k370、d399、f405、y407和k409，并且其中所述第一和所述第二重链不在相同的位置中被取代。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的一个实施方案中，第一重链在根据eu编号的人igg1重链中选自下组的位置处具有氨基酸取代：366、368、370、399、405、407和409，而第二重链在根据eu编号的人igg1重链中选自下组的位置处具有氨基酸取代：366、368、370、399、405、407和409，并且其中第一和第二重链不在相同的位置中被取代。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的一个实施方案中，第一重链在位置366处具有氨基酸取代，而第二重链在选自下组的位置处具有氨基酸取代：368、370、399、405、407和409。在一个实施方案中，位置366处的氨基酸选自ala、asp、glu、his、asn、val或gln。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的一个实施方案中，第一重链在位置368处具有氨基酸取代，而第二重链在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366、370、399、405、407和409。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的一个实施方案中，第一重链在位置370处具有氨基酸取代，而第二重链在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366、368、399、405、407和409。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的一个实施方案中，第一重链在位置399处具有氨基酸取代，而第二重链在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366、368、370、405、407和409。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的一个实施方案中，第一重链在位置405处具有氨基酸取代，而第二重链在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366、368、370、399、407和409。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的一个实施方案中，第一重链在位置407处具有氨基酸取代，而第二重链在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366、368、370、399、405和409。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的一个实施方案中，第一重链在位置409处具有氨基酸取代，而第二重链在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366、368、370、399、405和407。

因此，在本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的一个实施方案中，所述第一和第二ch3区的序列含有不对称突变，即在两个ch3区中不同的位置处的突变，例如，在一个ch3区的位置405处的突变和在另一个ch3区的位置409处的突变。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的一个实施方案中，第一重链在位置409处具有lys、leu或met以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、phe、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys，并且所述第二重链在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366、368、370、399、405和407。在一个此类实施方案中，所述第一重链在位置409处具有lys、leu或met以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、phe、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys，并且所述第二重链在位置405处具有phe以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、lys、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr、cys、lys或leu。在本文进一步的实施方案中，所述第一重链在位置409处具有lys、leu或met以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、phe、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys，并且所述第二重链在位置405处具有phe、arg或gly以外的氨基酸，例如leu、ala、val、ile、ser、thr、met、lys、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一重链包含在位置405处的phe以及在位置409处的lys、leu或met以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、phe、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys，并且所述第二重链包含在位置405处的phe以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、lys、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr、leu、met或cys以及在位置409处的lys。在本文进一步的实施方案中，所述第一重链包含在位置405处的phe以及在位置409处的lys、leu或met、例如gly、ala、val、ile、ser、thr、phe、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys以外的氨基酸，并且所述第二重链包含在位置405处的phe、arg或gly以外的氨基酸，例如leu、ala、val、ile、ser、thr、met、lys、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys，以及在位置409处的lys。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一重链包含在位置405处的phe以及在位置409处的lys、leu或met以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、phe、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys，并且所述第二重链包含在位置405处的leu以及在位置409处的lys。在本文进一步的实施方案中，所述第一重链包含在位置405处的phe以及在位置409处的arg，并且所述第二重链包含在位置405处的phe、arg或gly以外的氨基酸，例如leu、ala、val、ile、ser、thr、lys、met、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys以及在位置409处的lys。在另一个实施方案中，所述第一重链包含在位置405处的phe以及在位置409处的arg，并且所述第二重链包含在位置405处的leu以及在位置409处的lys。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的进一步的实施方案中，所述第一重链包含在位置409处的lys、leu或met以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、phe、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys，并且所述第二重链包含在位置409处的lys、在位置370处的thr以及在位置405处的leu。在进一步的实施方案中，所述第一重链包含在位置409处的arg，并且所述第二重链包含在位置409处的lys、在位置370处的thr以及在位置405处的leu。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的更进一步的实施方案中，所述第一重链包含在位置370处的lys、在位置405处的phe以及在位置409处的arg，并且所述第二重链包含在位置409处的lys、在位置370处的thr以及在位置405处的leu。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一重链包含在位置409处的lys、leu或met以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、phe、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys，并且所述第二重链包含在位置409处的lys以及：a)在位置350处的ile和在位置405处的leu或b)在位置370处的thr和在位置405处的leu。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一重链包含在位置409处的arg，并且所述第二重链包含在位置409处的lys以及：a)在位置350处的ile和在位置405处的leu或b)在位置370处的thr和在位置405处的leu。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一重链包含在位置350处的thr、在位置370处的lys、在位置405处的phe以及在位置409处的arg，并且所述第二重链包含在位置409处的lys以及：a)在位置350处的ile和在位置405处的leu或b)在位置370处的thr和在位置405处的leu。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一重链包含在位置350处的thr、在位置370处的lys、在位置405处的phe以及在位置409处的arg，并且所述第二重链包含在位置350处的ile、在位置370处的thr、在位置405处的leu以及在位置409处的lys。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的一个实施方案中，所述第一重链在位置409处的具有lys、leu或met以外的氨基酸，并且所述第二重链在位置405处的具有phe以外的氨基酸，例如在位置405处的phe、arg或gly以外的；或所述第一ch3区在位置409处的具有lys、leu或met以外的氨基酸，并且所述第二ch3区在位置407处的具有tyr、asp、glu、phe、lys、gln、arg、ser或thr以外的氨基酸。

在一个实施方案中、本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体包含具有在位置409处的lys、leu或met以外的氨基酸的第一重链和具有在位置407处的tyr、asp、glu、phe、lys、gln、arg、ser或thr以外的氨基酸的第二重链。

在一个实施方案中、本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体包含具有在位置407处的tyr以及在位置409处的lys、leu或met以外的氨基酸的第一重链和具有在位置407处的tyr、asp、glu、phe、lys、gln、arg、ser或thr以外的氨基酸位置处407以及在位置409处的lys的第二重链。

在一个实施方案中，本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体包含具有在位置407处的tyr以及在位置409处的arg的第一重链和具有在位置407处的tyr、asp、glu、phe、lys、gln、arg、ser或thr以外的氨基酸以及在位置409处的lys的第二重链。

在另一个实施方案中，所述第一重链在位置409处具有lys、leu或met以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、phe、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys，并且所述第二重链在位置407处具有tyr、asp、glu、phe、lys、gln、arg、ser或thr以外的氨基酸，例如leu、met、gly、ala、val、ile、his、asn、pro、trp或cys。在另一个实施方案中，所述第一重链在位置409处具有lys、leu或met以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、phe、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys，并且所述第二重链在位置407处具有ala、gly、his、ile、leu、met、asn、val或trp。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一重链在位置409处具有lys、leu或met以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、phe、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys，并且所述第二重链在位置407处具有gly、leu、met、asn或trp。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一重链具有在位置407处的tyr以及在位置409处的lys、leu或met以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、phe、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys，并且所述第二重链具有在位置407处的tyr、asp、glu、phe、lys、gln、arg、ser或thr以外的氨基酸，例如leu、met、gly、ala、val、ile、his、asn、pro、trp或cys以及在位置409处的lys。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一重链具有在位置407处的tyr以及在位置409处的lys、leu或met以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、phe、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys，并且所述第二重链具有在位置407处的ala、gly、his、ile、leu、met、asn、val或trp以及在位置409处的lys。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一重链具有在位置407处的tyr以及在位置409处的lys、leu或met以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、phe、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys，并且所述第二重链具有在位置407处的gly、leu、met、asn或trp以及在位置409处的lys。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一重链具有在位置407处的tyr以及在位置409处的arg，并且所述第二重链具有在位置407处的tyr、asp、glu、phe、lys、gln、arg、ser或thr以外的氨基酸，例如leu、met、gly、ala、val、ile、his、asn、pro、trp或cys以及在位置409处的lys。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一重链具有在位置407处的tyr以及在位置409处的arg，并且所述第二重链具有在位置407处的ala、gly、his、ile、leu、met、asn、val或trp以及在位置409处的lys。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一重链具有在位置407处的tyr以及在位置409处的arg，并且所述第二重链具有在位置407处的gly、leu、met、asn或trp以及在位置409处的lys。

在如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体的另一个实施方案中，第一重链在位置409处具有lys、leu或met以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、phe、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys，并且第二重链具有

(i)位置368处的phe、leu和met以外的氨基酸，例如gly、ala、val、ile、ser、thr、lys、arg、his、asp、asn、glu、gln、pro、trp、tyr或cys，或

(ii)位置370处的trp，或

(iii)位置399处的asp、cys、pro、glu或gln以外的氨基酸，例如phe、leu、met、gly、ala、val、ile、ser、thr、lys、arg、his、asn、trp、tyr或cys，或

(iv)位置366处的lys、arg、ser、thr或trp以外的氨基酸，例如phe、leu、met、ala、val、gly、ile、asn、his、asp、glu、gln、pro、tyr或cys。

在一个实施方案中，第一重链在位置409处具有arg、ala、his或gly，并且第二重链具有

(i)位置368处的lys、gln、ala、asp、glu、gly、his、ile、asn、arg、ser、thr、val或trp，或

(ii)位置370处的trp，或

(iii)位置399处的ala、gly、ile、leu、met、asn、ser、thr、trp、phe、his、lys、arg或tyr，或

(iv)位置366处的ala、asp、glu、his、asn、val、gln、phe、gly、ile、leu、met或tyr。

在一个实施方案中，第一重链在位置409处具有arg，并且第二重链具有

(i)位置368处的asp、glu、gly、asn、arg、ser、thr、val或trp，或

(ii)位置370处的trp，或

(iii)位置399处的phe、his、lys、arg或tyr，或

(iv)位置366处的ala、asp、glu、his、asn、val、gln。

在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体包含第一和第二重链，其中(i)在所述第一重链中对应于根据eu编号的人igg1重链中的f405的位置中的氨基酸是l，并且在所述第二重链中对应于根据eu编号的人igg1重链中的k409的位置中的氨基酸是r，或(ii)在所述第一重链中对应于根据eu编号的人igg1重链中的k409的位置中的氨基酸是r，并且在所述第二重链中对应于根据eu编号的人igg1重链中的f405的位置中的氨基酸是l。

在进一步的实施方案中所述第一和第二重链是人igg1同种型的。

在另一个进一步的实施方案中所述第一和第二重链是人igg2同种型的。

在另一个进一步的实施方案中所述第一和第二重链是人igg3同种型的。

在另一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体包含人igg4同种型的第一和第二重链，其中(i)在所述第一重链中对应于根据eu编号的人igg4重链中的s228的位置中的氨基酸是p，并且在所述第二重链中对应于根据eu编号的人igg4重链中的s228、f405和r409的位置中的氨基酸分别是p、l和k，或(ii)在所述第一重链中对应于根据eu编号的人igg4重链中的s228、f405和r409的位置中的氨基酸是p、l和k，并且在所述第二重链中对应于根据eu编号的人igg4重链中的s228的位置中的氨基酸是p。

如果在本文中提及第一重链的某些位置处的氨基酸和/或第二重链的某些位置处的氨基酸，则此类提及应理解为包括以下实施方案，其中第一重链的某些位置的氨基酸存在于第二重链而不是第一重链的相应位置和/或第二重链的某些位置的氨基酸存在于第一重链而不是第二重链的相应位置。

除了上述氨基酸取代之外，所述第一和第二重链可以包含相对于野生型重链序列的其他氨基酸取代、缺失或插入。

在进一步的实施方案中，包含第一和第二重链的所述第一和第二fab臂(或重链恒定结构域)除了指定的突变外，还包含独立地选自以下的ch3序列：

(igg1m(a))(seqidno:106)、(igg1m(f))(seqidno:107)和(igg1m(ax)(seqidno:108)。

在一个实施方案中，所述第一或所述第二重链在(核心)铰链区都不包含cys-pro-ser-cys序列。

在进一步的实施方案中，所述第一和所述第二重链两者在(核心)铰链区都包含cys-pro-pro-cys序列。

在分开的和具体的实施方案中，一个或两个fab臂包含独立地选自seqidno:109、110、111、112、113和116的重链恒定区序列(见表1)。

制备双特异性抗体的方法

传统方法如杂交杂交瘤和化学缀合方法(marvinandzhu(2005)actapharmacolsin26:649)可以用于制备本发明的双特异性抗体。在宿主细胞中共表达由不同重链和轻链组成的两种抗体，产生除了所需的双特异性抗体外可能的抗体产物的混合物，其然后可以通过例如亲和层析或类似方法分离。

也可以使用在共表达不同抗体构建体时有利于形成功能性双特异性产物的策略，例如，通过lindhofer等(1995jimmunol155:219)描述的方法。由于优先的物种限制的重/轻链配对，产生不同抗体的大鼠和小鼠杂交瘤的融合导致有限数量的异源二聚体蛋白质。促进形成异源二聚体超过同源二聚体的另一种策略是“结进孔(knob-into-hole)”策略，其中在第一重链多肽和第二重链多肽中的相应空腔(cavity)中引入突起(protuberance)，使得突起可以位于这两条重链界面处的空腔中，以促进异源二聚体的形成并阻碍同源二聚体的形成。通过用较大的侧链取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链来构建“突起”。通过用较小的氨基酸侧链取代较大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面中产生与突起相同或相似大小的补偿性“空腔”(us专利5,731,168)。ep1870459(chugai)和wo2009/089004(amgen)描述了在宿主细胞中共表达不同抗体结构域时有利于异源二聚体形成的其他策略。在这些方法中，用带电荷的氨基酸取代构成两个ch3结构域中ch3-ch3界面的一个或多个残基，使得同源二聚体形成是静电不利的，而异源二聚化是静电有利的。wo2007110205(merck)描述了另一种策略，其中利用iga和iggch3结构域之间的差异来促进异源二聚化。

制备本发明的双特异性cd40xcd137抗体的优选方法包括描述于wo2011/131746和wo2013/060867(genmab)的方法，其包括以下步骤：

a)提供包含fc区的第一抗体，所述fc区包含第一ch3区；

b)提供包含第二fc区的第二抗体，所述fc区包含第二ch3区，

其中所述第一抗体是包含两个如本文所述的第一抗原结合区的cd40抗体，并且所述第二抗体是包含两个如本文所述的第二抗原结合区的cd137抗体，或反之亦然；以及其中所述第一和第二ch3区的序列是不同的并且使得所述第一和第二ch3区之间的异源二聚体相互作用强于所述第一和第二ch3区的同源二聚体相互作用的每一个；

c)在还原条件下将所述第一抗体与所述第二抗体一起温育；和

d)获得所述双特异性cd40xcd137抗体。

在一个实施方案中，在足以允许铰链区中的半胱氨酸进行二硫键异构化的还原条件下，将所述第一抗体与所述第二抗体一起温育，其中所得的异源二聚体抗体中所述第一和第二抗体之间的异源二聚体相互作用使得在37℃下24小时后在0.5mmgsh下不发生fab臂交换。

不受理论限制，在步骤c)中，亲本抗体(步骤a)和b)中的第一和第二抗体)的铰链区中的重链二硫键减少，然后所得的半胱氨酸能够与另一个亲本抗体分子(最初具有不同的特异性)的半胱氨酸残基形成重链间二硫键。在该方法的一个实施方案中，步骤c)中的还原条件包括添加还原剂，例如选自下组的还原剂：2-巯基乙胺(2-mea)、二硫苏糖醇(dtt)、二硫赤藓糖醇(dte)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(tcep)、l-半胱氨酸和beta-巯基乙醇，优选地选自下组的还原剂：2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦。在进一步的实施方案中，步骤c)包括将条件恢复为非还原或较少还原，例如通过去除还原剂，例如通过脱盐。在一个具体的实施方案中，如下生成双特异性抗体：将两种相同量的亲本互补抗体与75mm2-巯基乙胺-hcl(2-mea)在缓冲液(例如pbs或tris-edta)中于31℃温育5小时；通过使用离心柱(例如microconcentrifugalfilters,30k,millipore)去除还原剂2-mea来终止还原反应(labrijnetal.natureprotocols,vol9no10,p2450-2463；2014)。在另一个具体的实施方案中，该方法是实施例3的方法。

对于该方法，可以使用本文公开的任何cd40和cd137抗体。在一个具体实施方案中，可以分别选择与人cd40和cd137结合的第一和第二抗体，以便获得如本文所述的双特异性抗体。

在该方法的一个实施方案中，所述第一和/或第二抗体是全长抗体。

第一和第二抗体的fc区可以是任何同种型的，包括但不限于具有选自下组的亚类的igg同种型：igg1、igg2、igg3和igg4。在该方法的一个实施方案中，所述第一和所述第二抗体两者的fc区均是igg1同种型的。在另一个实施方案中，所述抗体的fc区之一是igg1同种型的，而另一个是igg4同种型的。在后一实施方案中，所得的双特异性抗体包含igg1的fc区和igg4的fc区。

在进一步的实施方案中，亲本抗体之一已经工程化改造以不与蛋白质a结合，因此通过使产物通过蛋白质a柱，允许异源二聚体抗体与所述亲本同源二聚体抗体分离。

如上所述，同源二聚体亲本抗体的第一和第二ch3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二ch3区之间的异源二聚体相互作用强于所述第一和第二ch3区的同源二聚体相互作用的每一个。关于这些相互作用及其如何实现的更多细节在例如wo2011/131746和wo2013/060867(genmab)中提供，其通过引用整体并入本文。

特别地，可以使用基于两种同源二聚体抗体(其分别结合cd40和cd137，并在ch3区仅含有少量相当保守的不对称突变)的特定方法以高产率获得稳定的双特异性cd40xcd137抗体。不对称突变意指所述第一和第二ch3区的序列在不相同的位置含有氨基酸取代。

本发明的双特异性抗体还可以通过在单个细胞中共表达编码第一和第二多肽的构建体而获得。因此，在进一步的方面，本发明涉及用于生产双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供编码第一多肽的第一核酸构建体，所述第一多肽包含根据本文的任何方面或实施方案的第一fc区和与人cd40结合的第一抗原结合区，所述第一fc区包含第一ch3区，

b)提供编码第二多肽的第二核酸构建体，所述第二多肽包含根据本文的任何方面或实施方案的第二fc区和与人cd137结合的第二抗原结合区，所述第二fc区包含第二ch3区，

其中所述第一和第二ch3区的序列是不同的并且使得所述第一和第二ch3区之间的异源二聚体相互作用强于所述第一和第二ch3区的同源二聚体相互作用的每一个，并且其中在所述第一ch3区中，在对应于选自下组的位置中的至少一个氨基酸已经被取代：根据eu编号的人igg1重链中的位置t366、l368、k370、d399、f405、y407和k409，并且在所述第二ch3区中，在对应于选自下组的位置的至少一个氨基酸已经被取代：根据eu编号的人igg1重链中的位置t366、l368、k370、d399、f405、y407和k409，并且其中所述第一和所述第二重链不在相同的位置中被取代，

任选地其中所述第一和第二核酸构建体编码所述第一和第二抗体的轻链序列，

c)在宿主细胞中共表达所述第一和第二核酸构建体，和

d)从细胞培养物获得所述异源二聚体蛋白质。

因此，本发明还涉及产生本发明双特异性抗体的重组真核或原核宿主细胞。

在本发明的一个实施方案中，双特异性抗体通过根据本发明的任何方法获得。

适合的表达载体(包括启动子、增强子等)和用于产生抗体的适合的宿主细胞是本领域熟知的。宿主细胞的实例包括酵母、细菌和哺乳动物细胞，例如cho或hek细胞。

在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体包含第一和第二ch3区，其除了指定的突变外，包含seqidno:107(igg1m(f))的序列。

在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体包含第一fc区和第二fc区，其中所述第一或所述第二fc区在铰链区都不包含cys-pro-ser-cys序列。

在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体包含第一fc区和第二fc区，其中所述第一和所述第二fc区两者在铰链区都包含cys-pro-pro-cys序列。

在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体包含第一fc区和第二fc区，其中第一和第二fc区是人抗体fc区。

在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体包含第一fc区和第二fc区，其中所述第一和第二fc区，除了指定的突变外，包含独立地选自下组的序列：seqidno:109、110、111、112、113和116。

在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体包含第一fc区和第二fc区，其中第一和第二抗原结合区来自重链抗体。

在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的双特异性抗体包含第一fc区和第二fc区，其中第一和第二抗原结合区包含第一和第二轻链。

在进一步的实施方案中，根据本发明的共表达方法包括在上述体外方法中描述的任何其他特征。

惰性形式

由抗体的fc区介导的效应功能允许破坏外来实体，例如杀死病原体以及清除和降解抗原。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)通过fc区与携带fc受体(fcr)的细胞结合而起始，而补体依赖性细胞毒性(cdc)和补体依赖性细胞介导的细胞毒性(cdcc)通过fc区与c1q的结合而起始，其启动了补体激活的经典途径。

已经提出fc介导的效应功能，例如adcc和补体激活，以有助于用于治疗癌症的单克隆抗体的治疗功效(weineretal.cell2012,148:1081-1084)。

根据本发明的多特异性抗体，例如双特异性抗体，与在t细胞(例如cd4⁺和/或cd8⁺t细胞)上表达的cd137结合。通过抗体与例如在抗原呈递细胞(apc)上表达的cd40的伴随结合，对表达cd40的apc和表达cd137的t细胞提供刺激，从而例如可以增加t细胞增殖。

通常，抗体与细胞表达的靶抗原的结合可以导致与效应分子如fc受体或补体蛋白的相互作用，其可以诱导fc介导的效应功能，例如adcc或补体激活，其可以导致杀死表达所述靶抗原的细胞。

根据本发明的多特异性抗体(例如双特异性抗体)的使用基于其向apc和t细胞提供共刺激的能力。

在具体的实施方案中，优选多特异性抗体不与fcr(例如fcγr)结合，并因此不诱导fcr介导的交联。

在进一步的实施方案中，优选多特异性抗体不参与效应功能，以避免杀死表达cd40和/或cd137的细胞。

在本发明的一个方面，根据本发明的多特异性cd40xcd137抗体包含(i)第一结合臂，其包含第一重链和第一抗原结合区，以及(ii)第二结合臂，其包含第二重链和第二抗原结合区，根据本文所述的任何方面或实施方案。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体包含第一和第二重链，其中所述抗体与以下多特异性抗体相比以较少的程度诱导fc介导的效应子功能，所述多特异性抗体包含与所述抗体相同的第一和第二抗原结合区并且包含两条包含人igg1铰链、ch2和ch3区的重链。

在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体包含第一和第二抗原结合区以及第一和第二重链，第一和第二重链中的每一个包含人igg1铰链、ch2和ch3区，其中第一和第二重链中的至少一个包含修饰，以便与参照多特异性抗体相比，在较小程度上诱导和/或增强fc介导的效应子功能，所述参照多特异性抗体包含与所述抗体相同的第一和第二抗原结合区并且包含两条包含人igg1铰链、ch2和ch3区的重链而没有所述修饰。

在一个实施方案中，修饰所述第一和第二重链，使得多特异性抗体与除了包含未修饰的第一和第二重链以外是相同的多特异性抗体相比，以较少的程度诱导和/或增强fc介导的效应功能。

在一个实施方案中，所述fc介导的效应功能可以通过与fcγ-受体结合、与c1q结合或诱导fc介导的fcr的交联来测量。

在一个实施方案中，所述fc介导的效应功能通过与c1q结合来测量。

在一个实施方案中，已修饰所述第一和第二重链和轻链恒定序列，使得与野生型多特异性抗体相比，c1q与所述多特异性抗体的结合降低至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％，其中通过elisa测定c1q结合。

已知人igg1具有诱导fc介导的效应功能的能力，而其他人同种型如igg4不太能够诱导fc介导的效应功能。

第一和第二重链可各自是任何同种型的，包括但不限于选自下组的igg1同种型：igg1，igg2，igg3和igg4，并且可以任选地包含一个或多个突变或修饰。在一个实施方案中，第一和第二重链中的每一个是igg4同种型的或由其衍生，任选地具有一个或多个突变或修饰。在一个实施方案中，第一和第二重链中的每一个是igg1同种型的或由其衍生，任选地具有一个或多个突变或修饰。在另一个实施方案中，重链之一是igg1同种型的而另一个是igg4同种型的，或者衍生自此类相应的同种型，任选地具有一个或多个突变或修饰。

在一个实施方案中，第一和第二重链中的一条或两条使得包含两条第一或两条第二重链的抗体是效应功能缺陷的。例如，第一和第二重链可以是igg4同种型的，或非igg4型的，例如igg1、igg2或igg3，其已经突变，使得与非突变的重链相比，已经减少或甚至消除了介导效应功能(例如adcc)的能力。此类突变已经例如描述于dall'acquawfetal.,jimmunol.177(2):1129-1138(2006)和hezarehm,jvirol.；75(24):12161-12168(2001)。与野生型人igg1序列相比，根据本发明的多特异性抗体可以包含第一和第二重链中的修饰。在抗体的fc区中包含此类修饰的多特异性抗体可以变成惰性或非活化的多特异性抗体。本文所用的术语“惰性”或“非活化”是指至少不能与任何fcγ(gamma)受体结合、不能与c1q结合或不能诱导fc介导的fcr的交联。可以用包含所述fc区，或两条第一重链或两条第二重链的二价单特异性抗体测试fc区或本发明的多特异性抗体的第一和/或第二重链的惰性。还可以用包含第一和第二重链的多特异性抗体进行测试。

可以构建若干变体以使抗体的fc区对与fcγ受体和c1q的相互作用无活性以用于治疗性抗体开发。本发明不限于与降低fc介导的效应功能相关的任何特定突变。本文描述了此类变体的实例。

因此，可以修饰fc区中在与c1q和fcγ受体的相互作用中起主要作用的氨基酸。可以修饰的氨基酸位置的实例包括位置l234、l235和p331。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中l234、l235和p331的至少一个位置中的氨基酸可以分别是a、a和s。(xuetal.,2000,cellimmunol.200(1):16-26；oganesyanetal.,2008,actacryst.(d64):700-4)。此外，l234f和l235e氨基酸取代可以导致fc区具有与fcγ受体和c1q的消除相互作用(canfieldetal.,1991,j.exp.med.(173):1483-91；duncanetal.,1988,nature(332):738-40)。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中的l234和l235的位置中的氨基酸可以分别是f和e。d265a氨基酸取代可以降低与所有fcgamma受体的结合并防止adcc(shieldsetal.,2001,j.biol.chem.(276):6591-604)。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中的d265的位置中的氨基酸可以是a。可以通过突变位置d270、k322、p329和p331消除与c1q的结合。将这些位置突变为d270a或k322a或p329a或p331a可以使抗体缺乏cdc活性idusogieee,etal.,2000,jimmunol.164:4178-84)。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中的d270、k322、p329和p331的至少一个位置中的氨基酸可以分别是a、a、a和a。

使fc区与fcγ受体和c1q的相互作用最小化的另外的方法是去除抗体的糖基化位点。将位置n297突变为例如q、a或e去除了对igg-fcγ受体相互作用至关重要的糖基化位点。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中的氨基酸可以是g、q、a或e(leabmanetal.,2013,mabs；5(6):896-903)。通过以下突变可以获得使fc区与fcγ受体的相互作用最小化的另一种另外的方法；p238a、a327q、p329a或e233p/l234v/l235a/g236del(shieldsetal.,2001,j.biol.chem.(276):6591-604)。

或者，人igg2和igg4亚类在其与c1q和fcgamma受体的相互作用中认为是天然缺陷的，尽管报道了与fcγ受体的相互作用(parrenetal.,1992,j.clininvest.90:1537-1546；bruhnsetal.,2009,blood113:3716-3725)。可以在两种同种型中进行消除这些残基相互作用的突变，导致与fcr结合相关的不想要的副作用的减少。对于igg2，这些包括v234a和g237a，以及对于igg4，l235e。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，例如在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg2重链中的v234和g237的位置中的氨基酸可以分别是a和a。在一个实施方案中，对应于根据eu编号的人igg4重链中的l235的位置中的氨基酸可以是e。

进一步最小化与igg2抗体中的fcγ受体和c1q的相互作用的其他方法包括描述于wo2011066501和lightle,s.,etal.,2010,proteinscience(19):753-62的那些。

抗体的铰链区对于与fcγ受体和补体的相互作用也是重要的(brekkeetal.,2006,jimmunol177:1129-1138；dall’acquawf,etal.,2006,jimmunol177:1129-1138)。因此，铰链区的突变或缺失可以影响抗体的效应功能。

在一个实施方案中，多特异性抗体包含第一和第二重链，其中在所述第一和第二免疫球蛋白重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中的位置l234、l235、d265、n297和p331的位置中的一个或多个氨基酸分别不是l、l、d、n和p。

在一个实施方案中，在第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中的位置l234、l235、d265、n297和p331的位置中的一个或多个氨基酸分别不是l、l、d、n和p。

在另一个实施方案中，在第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中的位置l234、l235和d265的位置中的一个或多个氨基酸分别不是l、l和d，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中的位置n297和p331的位置中的氨基酸分别是n和p。

在一个实施方案中，一条或两条重链包含去除用于asn连接的糖基化的受体位点的突变，或者以其他方式操作以改变糖基化特性。例如，在igg1fc区中，n297q突变可以用于去除asn连接的糖基化位点。因此，在具体的实施方案中，一条或两条重链包含具有n297q突变的igg1野生型序列。

本文所用的术语“对应于位置的氨基酸”是指人igg1重链中的氨基酸位置编号。通过与人igg1比对，可以发现其他免疫球蛋白中相应的氨基酸位置。除非另有说明或与上下文相矛盾，否则恒定区序列的氨基酸在本文中根据eu索引编号来编号(描述于kabat,e.a.etal.,1991,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.5thedition-usdepartmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242,pp662,680,689)。因此，一个序列中“对应于”另一个序列中的氨基酸或区段的氨基酸或区段是使用标准序列比对程序(例如align、clustalw或类似物)与另一个氨基酸或区段对齐的氨基酸或区段，通常在默认设置下并且与人igg1重链具有至少50％、至少80％、至少90％或至少95％同一性。认为本领域熟知如何比对序列中的序列或区段，并从而确定序列中对应于根据本发明的氨基酸位置的位置。

在本发明的上下文中，氨基酸位置可以如上所述定义。

当提及重链中的氨基酸时，术语“氨基酸不是”或类似的措辞应理解为意指氨基酸是除所述特定氨基酸之外的任何其他氨基酸。例如，对应于人igg1重链中的l234的位置的氨基酸不是l，意指氨基酸可以是除l以外的任何其他天然或非天然存在的氨基酸。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸不是d。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸不是d，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中的位置n297和p331的位置中的氨基酸分别是n和p。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸是疏水性或极性氨基酸。

本文所用的与氨基酸残基有关的术语“疏水性”是指选自下组的氨基酸残基：a、c、f、g、h、i、l、m、r、t、v、w和y。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自由以下组成的氨基酸的组：a、c、f、g、h、i、l、m、r、t、v、w和y。

本文所用的与氨基酸残基有关的术语“极性”是指选自下组的任何氨基酸残基：c、d、e、h、k、n、q、r、s和t。因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：c、e、h、k、n、q、r、s和t。

在另一个实施方案中，在所述第一和第二重链中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸是是脂肪族不带电荷的、芳香族或酸性氨基酸。

本文所用的与氨基酸残基有关的术语“脂肪族不带电荷的”是指选自下组的任何氨基酸残基：a、g、i、l和v。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：a、g、i、l和v。

本文所用的与氨基酸残基有关的术语“芳香族”是指选自下组的任何氨基酸残基：f、t和w。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：f、t和w。

本文所用的与氨基酸残基有关的术语“酸性”是指选自下组的任何氨基酸残基：d和e。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：d和e。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：d和e。

在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：a、e、f、g、i、l、t、v和w。

在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：a、e、f、g、i、l、t、v和w。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸不是d。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸不是d。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中d265的位置中的氨基酸不是d，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置n297和p331的位置中的氨基酸分别是n和p。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中d265的位置中的氨基酸不是d，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置n297和p331的位置中的氨基酸分别不是n和p。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸是疏水性或极性氨基酸。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸是疏水性或极性氨基酸。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自由以下组成的氨基酸的组：a、c、f、g、h、i、l、m、r、t、v、w和y。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：c、e、h、k、n、q、r、s和t。在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自由以下组成的氨基酸的组：a、c、f、g、h、i、l、m、r、t、v、w和y。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：c、e、h、k、n、q、r、s和t。

在另一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸是脂肪族不带电荷的、芳香族或酸性氨基酸。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：a、g、i、l和v。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：f、t和w。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：d和e。

在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：a、e、f、g、i、l、t、v和w。

在另一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸是脂肪族不带电荷的、芳香族或酸性氨基酸。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：a、g、i、l和v。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：f、t和w。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：d和e。

在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：a、e、f、g、i、l、t、v和w。

在进一步的实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置n297的位置中的氨基酸不是n。

在一个实施方案中，在第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中n297的位置中的氨基酸不是n，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置p331的位置中的氨基酸是p。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置n297的位置中的氨基酸不是n。

在一个实施方案中，在第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中n297的位置中的氨基酸不是n，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置p331的位置中的氨基酸是p。

在进一步的实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸分别不是l和l。

在一个实施方案中，在第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中l234和l235的位置中的氨基酸分别不是l和l，并且和对应于根据eu编号的人igg1重链中位置n297和p331的位置中的氨基酸分别是n和p。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的氨基酸选自下组：a、c、d、e、f、g、h、i、k、m、n、p、q、r、s、t、y、v。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸是疏水性或极性氨基酸。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自下组：a、c、f、g、h、i、m、r、t、v、w和y。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自由以下组成的氨基酸的组：c、d、e、h、k、n、q、r、s和t。

在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自下组：a、c、d、e、f、g、h、i、k、m、n、q、r、s、t、v、w和y。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸分别不是l和l。

在一个实施方案中，在第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中l234和l235的位置中的氨基酸分别不是l和l，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置n297和p331的位置中的分别是n和p。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中l234和l235的位置中的氨基酸是疏水性或极性氨基酸。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自下组：a、c、f、g、h、i、m、r、t、v、w和y。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自由以下组成的氨基酸的组：c、d、e、h、k、n、q、r、s和t。

在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自下组：a、c、d、e、f、g、h、i、k、m、n、q、r、s、t、v、w和y。

在另一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸是脂肪族不带电荷的、芳香族或酸性氨基酸。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自下组：a、g、i和v。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自下组：f、t和w。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自下组：d和e。

在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于l234和l235的位置中的氨基酸各自选自下组：a、d、e、f、g、i、t、v和w。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸分别是f和e；或a和a。

在一个实施方案中，在第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中l234和l235的位置中的氨基酸分别是f和e；或a和a，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置n297和p331的位置中的氨基酸分别是n和p。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸分别是f和e；或a和a。

在一个实施方案中，在第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中l234和l235的位置中的氨基酸分别是f和e；或a和a，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置n297和p331的位置中的氨基酸分别是n和p。

在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸分别是f和e。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸分别是f和e。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中atleast位置中的氨基酸对应于位置l234和l235在根据eu编号的人igg1重链中、area和a、respectively。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，至少对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸分别是a和a。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置中的氨基酸分别不是l、l和d。

在一个实施方案中，在第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中l234、l235和d265的位置中的氨基酸分别不是l、l和d，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置n297和p331的位置中的氨基酸分别是n和p。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的氨基酸选自下组：a、c、d、e、f、g、h、i、k、m、n、p、q、r、s、t、y、v和w，并且对应于位置d265的氨基酸选自下组：a、c、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、y、v和w。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于位置根据eu编号的人igg1重链中l234、l235和d265的位置中的氨基酸是疏水性或极性氨基酸。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自由以下组成的氨基酸的组：a、c、f、g、h、i、l、m、r、t、v、w和y，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自下组：a、c、f、g、h、i、m、r、t、v、w和y。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自由以下组成的氨基酸的组：c、d、e、h、k、n、q、r、s和t，对应于根据eu编号的人重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：c、e、h、k、n、q、r、s和t。

在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自下组：a、c、d、e、f、g、h、i、k、m、n、q、r、s、t、v、w和y，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：a、c、e、f、g、h、i、k、l、m、n、q、r、s、t、v、w和y。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中l234、l235和d265的位置中的氨基酸是疏水性或极性氨基酸。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自由以下组成的氨基酸的组：a、c、f、g、h、i、l、m、r、t、v、w和y，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自下组：a、c、f、g、h、i、m、r、t、v、w和y。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自由以下组成的氨基酸的组：c、d、e、h、k、n、q、r、s和t，对应于根据eu编号的人重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：c、e、h、k、n、q、r、s和t。

在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自下组：a、c、d、e、f、g、h、i、k、m、n、q、r、s、t、v、w和y，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：a、c、e、f、g、h、i、k、l、m、n、q、r、s、t、v、w和y。

在另一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置中的氨基酸是脂肪族不带电荷的、芳香族或酸性氨基酸。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：a、g、i、l和v，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自下组：a、g、i和v。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置中的氨基酸各自选自下组：f、t和w。

因此，在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置中的氨基酸各自选自下组：d和e。

在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：a、e、f、g、i、l、t、v和w，并且对应于l234和l235的位置中的氨基酸各自选自下组：a、d、e、f、g、i、t、v和w。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置中的氨基酸分别不是l、l和d。

在一个实施方案中，在第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中l234、l235和d265的位置中的氨基酸分别不是l、l和d，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置n297和p331的位置中的氨基酸分别是n和p。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中l234、l235和d265的位置中的氨基酸是脂肪族不带电荷的、芳香族或酸性氨基酸。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：a、g、i、l和v，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置中的氨基酸各自选自下组：a、g、i和v。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置中的氨基酸各自选自下组：d和e。

在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置d265的位置中的氨基酸选自下组：a、e、f、g、i、l、t、v和w，并且对应于l234和l235的位置中的氨基酸各自选自下组：a、d、e、f、g、i、t、v和w。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置中的氨基酸分别是f、e和a；或a、a和a。

在一个实施方案中，在第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中l234、l235和d265的位置中的氨基酸分别是f、e和a；或a、a和a，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置n297和p331的位置中的氨基酸分别是n和p。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置中的氨基酸分别是f、e和a；或a、a和a。

在一个实施方案中，在第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中l234、l235和d265的位置中的氨基酸分别是f、e和a；或a、a和a，并且对应于根据eu编号的人igg1重链中位置n297和p331的位置中的氨基酸分别是n和p。

在具体的实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置中的氨基酸分别是f、e和a。

在特别优选的实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置中的氨基酸分别是f、e和a。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置中的氨基酸分别是a、a和a。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置中的氨基酸分别是a、a和a。

在另一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235、d265、n297和p331的位置中的氨基酸分别是f、e、a、q和s。

在一个实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235、d265、n297和p331的位置中的氨基酸分别是f、e、a、q和s。

在具体的实施方案中，所述第一抗原结合区包含分别具有seqidno:1、2和3所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:4、yts和5所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3；并且所述第二抗原结合区包含分别具有seqidno:64、65和66所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:67、gas和68所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆009)，并且在第一和第二重链中的至少一个，例如所述第一和第二重链两者中，对应于人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置中的氨基酸分别是f、e和a。

在另一个实施方案中，所述第一抗原结合区包含分别具有seqidno:1、2和3所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:4、yts和5所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3；并且所述第二抗原结合区包含分别具有seqidno:36、37和38所示的序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，以及分别具有seqidno:39、sas和40所示的序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3(cd137克隆005)，并且在第一和第二重链中的至少一个，例如所述第一和第二重链两者中，对应于人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置中的氨基酸分别是f、e和a。

非活化fc区阻止抗体与血细胞(例如单核细胞)上存在的fc受体或与c1q相互作用以激活经典补体途径。在包含fc区中氨基酸取代的不同组合的抗体变体中测试fc活性的降低。在本发明的亲本抗体中引入了三个氨基酸取代，其包括突变l234f、l235e和d265a。将这三个氨基酸位置的取代引入k409r和/或f405ligg1主链中。所得的非活化抗体变体分别用后缀“fear”或“feal”表示。如实施例中所述，所述亲本抗体用于生成本发明的双特异性抗体。

在一个方面，可以在轻链和/或重链中修饰根据本发明的多特异性抗体以增加表达水平和/或产量。在一个实施方案中，可以在轻链中修饰根据本发明的抗体。此类修饰是本领域已知的，并且可以根据描述于例如zheng,l.,goddard,j.-p.,baumann,u.,&reymond,j.-l.(2004).expressionimprovementandmechanisticstudyoftheretro-diels-alderasecatalyticantibody10f11bysite-directedmutagenesis.journalofmolecularbiology,341(3),807–14的方法进行。

在本发明的进一步的实施方案中，形成本发明的多特异性抗体的一部分的一种或两种抗体已经工程化改造以减少或增加与新生儿fc受体(fcrn)的结合，以操纵多特异性抗体的血清半衰期。增加或减少血清半衰期的技术在本领域中是众所周知的。参见例如dall’acquaetal.2006,j.biol.chem.,281:23514-24；hintonetal.2006,j.immunol.,176:346-56；和zalevskyetal.2010nat.biotechnol.,28:157-9。

在一个方面，如本文公开的任何实施方案中所定义的多特异性抗体包含第一恒定重链(hc)和第一恒定轻链(lc)，其中第一重链和第二重链两者对应于seqidno:109的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置分别是f、e和a。

在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的多特异性抗体包含第一和第二恒定重链(hc)以及第一和第二恒定轻链(lc)，其中第一重链和第二重链两者对应于seqidno:109的人igg1重链中位置l234和l235的位置分别是f和e。

在一个实施方案中，多特异性抗体包含第一和第二重链，其中第一重链和第二重链两者对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234和l235的位置分别是f和e，并且其中(i)第一重链对应于根据eu编号的人igg1重链中f405的位置是l，并且第二重链对应于根据eu编号的人igg1重链中k409的位置是r，或(ii)第一重链对应于根据eu编号的人igg1重链中k409的位置是r，并且第二重链对应于根据eu编号的人igg1重链中f405的位置是l。

在一个实施方案中，多特异性抗体包含第一和第二重链，其中第一重链和第二重链两者对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置分别是f、e和a，并且其中第一重链对应于根据eu编号的人igg1重链中f405的位置是l，并且第二重链对应于根据eu编号的人igg1重链中k409的位置是r。因此在进一步的实施方案中，所述第一重链包含如seqidno:113所示的恒定重链序列；并且第二重链包含如seqidno:112所示的恒定重链序列。

在一个实施方案中，多特异性抗体包含第一和第二重链，其中第一重链和第二重链两者对应于根据eu编号的人igg1重链中位置l234、l235和d265的位置分别是f、e和a，并且其中第一重链对应于根据eu编号的人igg1重链中k409的位置是r，并且第二重链对应于根据eu编号的人igg1重链中f405的位置是l。因此在进一步的实施方案中，所述第一重链包含如seqidno:112所示的恒定重链序列；并且第二重链包含如seqidno:113所示的恒定重链序列。

核酸

本发明还涉及编码根据本文公开的任何方面或实施方案的一种或多种氨基酸序列的核酸。

本发明还涉及编码如本文公开的任何方面或实施方案中所定义的多特异性抗体的核酸。

本发明还涉及包含本发明的核酸的表达载体。

本发明还涉及包含根据本发明的核酸或表达载体的宿主细胞。

在一个实施方案中，所述宿主细胞是重组真核、重组原核或重组微生物宿主细胞。

在进一步的实施方案中，表达载体进一步包含编码抗体(例如人抗体)的轻链、重链或轻链和重链两者的恒定区的核苷酸序列。

在本发明的上下文中的表达载体可以是任何适合的载体，包括染色体、非染色体和合成的核酸载体(包含一组适合的表达控制元件的核酸序列)。此类载体的实例包括sv40的衍生物、细菌质粒、噬菌体dna、杆状病毒、酵母质粒、获得自质粒和噬菌体dna的组合的载体，以及病毒核酸(rna或dna)载体。在一个实施方案中，核酸包含在裸dna或rna载体中，所述载体包括例如线性表达元件(如描述于例如sykesandjohnston,natbiotech17,35559(1997))、包装的核酸载体(如描述于例如us6,077,835和/或wo00/70087)、质粒载体例如pbr322、puc19/18或puc118/119、“midge”最小尺寸的核酸载体(如描述于例如schakowskietal.,molther3,793800(2001))、或作为沉淀的核酸载体构建体，例如cap04-沉淀的构建体(如描述于例如wo200046147,benvenistyandreshef,pnasusa83,955155(1986),wigleretal.,cell14,725(1978),和coraroandpearson,somaticcellgenetics7,603(1981))。此类核酸载体及其用途是本领域熟知的(参见例如us5,589,466和us5,973,972)。

在一个实施方案中，载体适合于在细菌细胞中表达cd40抗体和/或cd137抗体。此类载体的实例包括表达载体，例如bluescript(stratagene)、pin载体(vanheeke&schuster,jbiolchem264,55035509(1989)、pet载体(novagen,madisonwi)等)。

表达载体也可以或可选地是适于在酵母系统中表达的载体。可以采用适合在酵母系统中表达的任何载体。适合的载体包括例如，包含组成型或诱导型启动子的载体，例如alpha因子、醇氧化酶和pgh(综述于：f.ausubeletal.,ed.currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingandwileyintersciencenewyork(1987),和grantetal.,methodsinenzymol153,516544(1987))。

表达载体也可以或可选地是适于在哺乳动物细胞中表达的载体，例如包含谷氨酰胺合成酶作为可选择标记的载体，例如描述于bebbington(1992)biotechnology(ny)10:169-175中的载体。

核酸和/或载体还可以包含编码分泌/定位序列的核酸序列，其可以将多肽(例如新生多肽链)靶向周质空间或细胞培养基中。此类序列是本领域已知的，并且包括分泌前导或信号肽。

表达载体可以包含任何适合的启动子、增强子和其他促进表达的元件或与之相关。此类元件的实例包括强表达启动子(例如，人cmvie启动子/增强子以及rsv、sv40、sl33、mmtv和hivltr启动子)、有效的poly(a)终止序列、大肠杆菌中质粒产物的复制起点、作为可选择标记的抗生素抗性基因，和/或方便的克隆位点(例如，多接头)。核酸也可以包含与组成型启动子(如cmvie)相反的诱导型启动子。

在一个实施方案中，编码cd40和/或cd137抗体的表达载体可以经由病毒载体定位于和/或递送至宿主细胞或宿主动物。

在更进一步的方面，本发明涉及包含上文所述的第一和第二核酸构建体的宿主细胞。

因此，本发明还涉及产生本发明的多特异性抗体的重组真核或原核宿主细胞，例如转染瘤。

第一cd40特异性抗体可以在重组真核或原核宿主细胞(例如转染瘤)中表达，其产生如本文所定义的抗体。第二cd137特异性抗体同样可以在重组真核或原核宿主细胞，其产生抗体。此类抗体可以用于制备根据本发明的多特异性抗体。根据本发明的多特异性抗体也可以在重组真核或原核宿主细胞(例如转染瘤)中表达。

宿主细胞的实例包括酵母、细菌、植物和哺乳动物细胞，例如cho、cho-s、hek、hek293、hek-293f、expi293f、per.c6或ns0细胞或淋巴细胞。例如，在一个实施方案中，宿主细胞可以包含稳定整合到细胞基因组中的第一和第二核酸构建体。在另一个实施方案中，本发明提供了包含非整合核酸(例如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件)的细胞，其包含如上所述的第一和第二核酸构建体。

在更进一步的方面，本发明涉及转基因非人动物或植物，其包含编码一组或两组人重链和人轻链的核酸，其中所述动物或植物产生本发明的多特异性抗体。

第一cd40特异性抗体和/或第二cd137特异性抗体也可以由杂交瘤、转基因非人动物或植物产生，其包含编码一组或两组人重链和人轻链的核酸，其中动物或植物产生用于本发明的多特异性抗体的抗体或本发明的多特异性抗体。

在一个方面，本发明涉及编码表1中列出的一种或多种氨基酸序列的核酸。

在一个方面，本发明涉及表达载体，其包含

(i)编码根据本文公开的任一个实施方案的第一结合臂的重链序列的核酸；

(ii)编码根据本文公开的任一个实施方案的第一结合臂的轻链序列的核酸；

(iii)编码根据本文公开的任一个实施方案的第二结合臂的重链序列的核酸；

(iv)编码根据本文公开的任一个实施方案的第二结合臂的轻链序列的核酸；

(v)(i)中所述的核酸以及(ii)中所述的核酸；

(vi)(iii)中所述的核酸以及(iv)中所述的核酸；

(vii)(i)、(ii)、(iii)和(iv)中所述的核酸。

在具体的实施方案中，核酸可以编码列于表1中的包含cd40抗体的vhcdr1、cdr2和cdr3的重链可变区并且编码具有选自下组的序列的人igg1重链：seqidno:110、111、112、113和116。

在另一个实施方案中，核酸可以编码列于表1中的包含cd137抗体的vhcdr1、cdr2和cdr3的重链可变区(即克隆001-012中任一项)并且编码具有选自下组的序列的人igg1重链：seqidno:110、111、112、113和116。

在分开的和具体的实施方案中，根据本发明的核酸、核酸构建体、第一和第二核酸构建体的组合、表达载体、或第一和第二表达载体的组合可以编码

(a)hc，其包含(i)vh，其包含表1中的cd40抗体的vhcdr1、cdr2和cdr3，以及主要地人框架区，任选地包含突变为非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变，和(ii)具有选自下组的序列的人igg1重链：seqidno:110、111、112、113和116；

(b)hc，其包含(i)vh，其包含列于表1中的cd137抗体之一(即克隆001-012中任一项)的vhcdr1、cdr2和cdr3，以及主要地人框架区，任选地包含突变为非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变，和(ii)具有选自下组的序列的人igg1重链：seqidno:110、111、112、113和116；

(c)lc，其包含(i)vl，其包含表1中的cd40抗体的vlcdr1、cdr2和cdr3，以及主要地人框架区，任选地包含突变为非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变，和(ii)具有seqidno:114的序列的轻链恒定区；

(d)lc，其包含(i)vl，其包含列于表1中的cd137抗体之一(即克隆001-012中任一项)的vlcdr1、cdr2和cdr3，以及主要地人框架区，任选地包含突变为非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变，和(ii)具有seqidno:114的序列的轻链恒定区；

(e)(a)和(b)两者；

(f)(a)和(c)两者；

(g)(b)和(d)两者；

(h)(c)和(d)两者；或

(i)(a)、(b)、(c)和(d)两者。

在其他分开的和具体的实施方案中，根据本发明的核酸、核酸构建体、第一和第二核酸构建体的组合、表达载体、或第一和第二表达载体的组合可以编码

(a)hc，其包含(i)vh，其包含seqidno:1、2和3的vhcdr1、cdr2和cdr3，以及主要地人框架区，任选地包含突变为非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变，和(ii)具有选自下组的序列的人igg1重链：seqidno:110、111、112、113和116；

(b)hc，其包含(i)vh，其包含seqidno:64、65和66的vhcdr1、cdr2和cdr3，以及主要地人框架区，任选地包含突变为非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变，和(ii)具有选自下组的序列的人igg1重链：seqidno:110、111、112、113和116；

(c)lc，其包含(i)vl，其包含seqidno:4、yts和seqidno:5的vlcdr1、cdr2和cdr3，以及主要地人框架区，任选地包含突变为非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变，和(ii)具有seqidno:114的序列的轻链恒定区；

(d)lc，其包含(i)vl，其包含seqidno:67、gas和seqidno:68的vlcdr1、cdr2和cdr3，以及主要地人框架区，任选地包含突变为非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变，和(ii)具有seqidno:114的序列的轻链恒定区；

(e)(a)和(b)两者；

(f)(a)和(c)两者；

(g)(b)和(d)两者；

(h)(c)和(d)两者；或

(i)(a)、(b)、(c)和(d)两者。

在其他分开的和具体的实施方案中，根据本发明的核酸、核酸构建体、第一和第二核酸构建体的组合、表达载体、或第一和第二表达载体的组合可以编码

(a)hc，其包括包含seqidno:117的vh和具有选自下组的序列的人igg1重链：seqidno:110、111、112、113和116；

(b)hc，其包括包含seqidno:123的vh和具有选自下组的序列的人igg1重链：seqidno:110、111、112、113和116；

(c)lc，其包括包含seqidno:121的vl和具有seqidno:114的序列的轻链恒定区；

(d)lc，其包括包含seqidno:127的vl和具有seqidno:114的序列的轻链恒定区；

(e)(a)和(b)两者；

(f)(a)和(c)两者；

(g)(b)和(d)两者；

(h)(c)和(d)两者；或

(i)(a)、(b)、(c)和(d)两者。

在其他分开的和具体的实施方案中，根据本发明的核酸、核酸构建体、第一和第二核酸构建体的组合、表达载体、或第一和第二表达载体的组合可以编码

(a)包含seqidno:118的hc(cd40-001-hc6,igg1)；

(b)包含seqidno:119的hc(cd40-001-hc6-feal)；

(c)包含seqidno:120的hc(cd40-001-hc6-fear)；

(d)包含seqidno:124的hc(cd137-009-hc7)；

(e)包含seqidno:125的hc(cd137-009-hc7-fear)；

(f)包含seqidno:126的hc(cd137-009-hc7-feal)；

(g)包含seqidno:122的lc(cd40-001-lc1)；

(h)包含seqidno:128的lc(cd137-009-lc2)；

(i)(a)和(g)两者；

(j)(b)和(g)两者；

(k)(c)和(g)两者；

(l)(d)和(h)两者；

(m)(e)和(h)两者；

(n)(f)和(h)两者；

(o)(b)和(e)两者；

(p)(c)和(f)两者；

(q)(g)和(h)两者；

(r)(b)、(e)、(g)和(h)两者；

(s)(c)、(f)、(g)和(h)两者。

在一个方面，本发明涉及用于生产根据本文公开的任何实施方案的双特异性抗体的方法，其包括以下步骤

a)培养如本文所公开的宿主细胞，其包含表达本文公开的第一抗体的本文公开的表达载体，并从培养基中纯化所述抗体；

b)培养如本文所公开的宿主细胞，其包含表达本文公开的第二抗体的本文公开的表达载体，并从培养基中纯化所述抗体；

c)在足以允许铰链区中的半胱氨酸进行二硫键异构化的还原条件下，将所述第一抗体与所述第二抗体一起温育，和

d)获得所述双特异性抗体。

在一个方面，本发明涉及包含如上所定义的表达载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是重组真核、重组原核或重组微生物宿主细胞。

组合物

本发明还涉及包含根据本发明的多特异性抗体、根据本发明的核酸、根据本发明的表达载体或根据本发明的宿主细胞的组合物。

在进一步的实施方案中，根据本发明的组合物是药物组合物。

在更进一步的实施方案中，根据本发明的药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。

在进一步的方面，本发明涉及药物组合物，其包含：

-如本文公开的任何实施方案中所定义的多特异性cd40xcd137抗体，和

-药学上可接受的载体。

本发明的药物组合物可以含有本发明的一种多特异性抗体或本发明的不同的多特异性抗体的组合。

可以根据常规技术配制药物组合物，所述常规技术例如公开于remington:thescienceandpracticeofpharmacy,19thedition,gennaro,ed.,mackpublishingco.,easton,pa,1995中的那些。本发明的药物组合物可以例如包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、洗涤剂(例如，非离子洗涤剂，例如tween-20或tween-80)、稳定剂(例如，糖或无蛋白质的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或适合于包含在药物组合物中的其他材料。

药学上可接受的载体包括与本发明的多特异性抗体在生理学上相容的任何和所有适合的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等。可以用于本发明的药物组合物的适合的水性和非水性载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、右旋糖、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合的混合物、植物油，羧甲基纤维素胶体溶液、黄蓍胶和可注射的有机酯，例如油酸乙酯，和/或各种缓冲液。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。

本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、卵磷脂、没食子酸丙酯、alpha-生育酚等；(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

本发明的药物组合物还可以在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇，例如甘露醇、山梨糖醇、甘油或氯化钠。

本发明的药物组合物还可以含有一种或多种适于所选施用的途径的佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂，其可以增强药物组合物的贮存期(shelflife)或有效性。本发明的药物组合物可以用保护多特异性抗体免于快速释放的载体制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。此类载体可以包括明胶、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、可生物降解的、生物相容的聚合物如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和单独的或具有蜡的聚乳酸，或本领域熟知的其他材料。用于制备此类制剂的方法通常是本领域技术人员已知的。

无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物与一种或多种成分的组合掺入适当的溶剂中来制备，例如如上列举的，根据需要，然后进行灭菌微滤。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和所需的其他成分，例如来自上面列举的那些。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外的所需成分。

药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得对于特定患者、组合物和施用的方式有效实现所需治疗反应，而对患者无毒的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括采用的本发明的特定组合物的活性、施用的途径、施用的时间、采用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与采用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域中众所周知的相似因素。

药物组合物可以通过任何适合的途径和方式施用。在一个实施方案中，肠胃外施用本发明的药物组合物。本文所用的“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用的方式，通常通过注射，并且包括表皮、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、颅内、胸内、硬膜外和胸骨内注射以及输注。

在一个实施方案中，药物组合物通过静脉内或皮下注射或输注施用。

用途

本发明还涉及用作药物的根据本发明的多特异性抗体、根据本发明的核酸、根据本发明的表达载体、根据本发明的宿主细胞、根据本发明的组合物、或根据本发明的药物组合物。

本发明还涉及用于治疗疾病(例如癌症或传染性疾病)的根据本发明的多特异性抗体、根据本发明的核酸、根据本发明的表达载体、根据本发明的宿主细胞、根据本发明的组合物或根据本发明的药物组合物。

根据本发明，术语“疾病”是指任何病理状态，特别是癌症、传染性疾病、炎性疾病、代谢性疾病、自身免疫性病症、退行性疾病、凋亡相关疾病和移植排斥。

如本文所用，术语“癌症”包括以异常调节的细胞生长、增殖、分化、粘附和/或迁移为特征的疾病。“癌细胞”是指通过快速、不受控制的细胞增殖而生长的异常细胞，并且在引发新生长的刺激停止后继续生长。

根据本发明的术语“癌症”包括白血病、精原细胞瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、头颈癌、胃肠癌、淋巴结癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ent)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌及其转移。其实例是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、宫颈癌或上述癌症类型或肿瘤的转移。

根据本发明的术语“癌症”还包括癌症转移。“转移”意指癌细胞从其原始部位扩散到身体的另一部分。转移的形成是非常复杂的过程，并取决于自原发性肿瘤的恶性细胞的脱离、细胞外基质的侵入、内皮基底膜的渗透进入体腔和血管，以及然后，通过血液运输，靶器官的浸润。最后，靶位点处新肿瘤(即继发性肿瘤或转移性肿瘤)的生长取决于血管生成。肿瘤转移甚至在去除原发性肿瘤后也经常发生，因为肿瘤细胞或组分可以保留并发展出转移潜力。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”涉及“远处转移”，其涉及远离原发性肿瘤和区域性淋巴结系统的转移。

术语“传染性疾病”是指可以从个体传播到个体或从生物体传播到生物体的任何疾病，并且是由微生物(例如普通感冒)引起的。

传染性疾病的实例包括病毒感染性疾病，如aids(hiv)、甲型、乙型或丙型肝炎、疱疹、带状疱疹(鸡痘)、德国麻疹(风疹病毒)、黄热病、登革热等黄病毒、流感病毒、出血性传染病(马尔堡或埃博拉病毒)、以及严重急性呼吸综合征(sars)、细菌感染性疾病，如军团病(军团菌)、性传播疾病(如衣原体或淋病)、胃溃疡(幽门螺杆菌)、霍乱(弧菌)、结核、白喉、大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌或链球菌感染(破伤风)；原生动物病原体感染，如疟疾、昏睡病、利什曼病；弓形虫病，即疟原虫、锥虫、利什曼原虫和弓形虫感染；或真菌感染，其由例如新型隐球酵母、荚膜组织胞浆菌(histoplasmacapsulatum)、粗球孢子菌(coccidioidesimmitis)、皮肤芽生菌(blastomycesdermatitidis)或白假丝酵母(candidaalbicans)引起。

术语“炎性疾病”是指任何疾病，其特征在于组织特别是结缔组织中的高水平炎症或这些组织的退变，或与之相关。慢性炎性疾病是特征在于持续性炎症的医学状况。(慢性)炎性疾病的实例包括乳糜泻、血管炎、狼疮、慢性阻塞性肺病(copd)、肠易激综合征、动脉粥样硬化、关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、结肠炎、慢性活动性肝炎、皮炎和牛皮癣。

术语“代谢性疾病”是指破坏正常代谢的任何疾病或病症。实例包括胱氨酸病、糖尿病、血脂异常、甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、高脂血症、低脂血症、半乳糖血症、戈谢病、肥胖症和苯丙酮尿症。

术语“自身免疫性病症”是指任何疾病/病症，其中身体对其自身组织的某些成分产生免疫原性(即免疫系统)反应。换句话说，免疫系统失去了其将身体内一些组织或系统识别为自身的能力，并靶向且攻击它就好像它是外来的一样。自身免疫性疾病可以分为其中主要影响一个器官的疾病(例如溶血性贫血和抗免疫性甲状腺炎)，以及其中自身免疫性疾病过程通过许多组织扩散的疾病(例如系统性红斑狼疮)。例如，多发性硬化症认为是由t细胞攻击围绕脑和脊髓的神经纤维的鞘而引起的。这导致失去协调感、虚弱和视力模糊。自身免疫性疾病是本领域已知的并且包括例如桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、狼疮、多发性硬化症、风湿性关节炎、溶血性贫血、抗免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮、乳糜泻、克罗恩病、结肠炎、糖尿病、硬皮病、牛皮癣等。

术语“退行性疾病”是指任何疾病，其中受影响的组织或器官的功能或结构将随着时间的推移而逐渐恶化。实例包括阿尔茨海默病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化症(als)、亨廷顿病、黄斑变性、多发性硬化症、肌营养不良症、尼曼皮克病、骨质疏松症和类风湿性关节炎。

术语“凋亡相关疾病”是指任何疾病，其中涉及凋亡的改变。实例包括癌症，神经系统病症，例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症(als)和中风，心脏病，例如缺血再灌注和慢性心力衰竭，传染性疾病和自身免疫性疾病。

术语“移植排斥”是指受体的免疫系统对移植的组织或器官的排斥，其可以最终破坏移植的组织或器官。

在一个实施方案中，根据本发明使用的多特异性抗体、核酸、表达载体、宿主细胞或组合物的用途可以用于治疗癌症。

在一个实施方案中，根据本发明使用的多特异性抗体、核酸、表达载体、宿主细胞或组合物可用于治疗传染性疾病。

本发明还涉及治疗疾病(如癌症或传染性疾病)的方法，包括对有此需要的受试者施用根据本发明的多特异性抗体、根据本发明的核酸、根据本发明的表达载体、根据本发明的宿主细胞、根据本发明的组合物或根据本发明的药物组合物。

本发明还涉及用于制备药物的根据本发明的多特异性抗体、根据本发明的核酸、根据本发明的表达载体、根据本发明的宿主细胞、根据本发明的组合物或根据本发明的药物组合物。

在一个实施方案中，根据本发明的方法或用途与一种或多种其他治疗剂(例如化学治疗剂)组合使用。

在一个方面，本发明涉及根据本文公开的任一个实施方案的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、本文公开的组合物或本文公开的药物组合物用作药物。

在另一个方面，本发明涉及根据本发明的多特异性抗体在制备用于治疗疾病(例如癌症或传染性疾病)的药物中的用途。

在一个方面，本发明涉及根据本文公开的任一个实施方案的多特异性抗体、本文公开的组合物或本文公开的药物组合物用于治疗疾病，例如癌症或传染性疾病。

在一个方面，本发明涉及治疗疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用根据本文公开的任一个实施方案的多特异性抗体、本文公开的组合物或本文公开的药物组合物。

本发明的多特异性抗体可以用于许多目的。特别地，本发明的多特异性抗体可以用于治疗各种形式的癌症，包括转移性癌症和难治性癌症。

在一个实施方案中，根据本发明的用途与一种或多种其他治疗剂(例如化学治疗剂)组合。

特别地，根据本发明的多特异性抗体可以在与t细胞增殖增加相关的治疗环境中有用。此类治疗环境的实例包括但不限于癌症或肿瘤，例如血液学和实体瘤，例如黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、结肠癌、肾癌、宫颈癌和前列腺癌，例如黑色素瘤或nsclc。其实例是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、宫颈癌或此类癌症类型或肿瘤的转移。

本发明还涉及用于治疗癌症的方法，其包括

a)选择患有癌症的受试者，和

b)向受试者施用本发明的多特异性抗体或本发明的药物组合物。

此外，本发明涉及与人cd40和人cd137结合的多特异性抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述癌症例如本文提及的特定癌症适应症之一。

本发明进一步涉及用于治疗癌症的多特异性抗体，所述癌症例如上述癌症适应症之一。

在一个实施方案中，根据本发明的方法或用途与一种或多种其他治疗剂(例如化学治疗剂)组合使用。

对于上述用途，可以使用本发明的任何多特异性抗体，例如双特异性抗体。

在一个方面，本发明涉及诊断组合物，其包含根据本文公开的任一个实施方案的多特异性抗体。

在一个实施方案中，诊断组合物是伴随诊断(companiondiagnostic)，其用于筛选和选择将受益于多特异性抗体治疗的那些患者。

在本发明的治疗方法的进一步的实施方案中，在治疗期间监测治疗的功效，例如在预定的时间点，通过测定肿瘤负荷。

调整上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的期望反应(例如治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用若干个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。肠胃外组合物可以以剂量单位形式配制，以便于施用和剂量均匀性。

多特异性抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可以由本领域技术人员确定。本发明的多特异性抗体的治疗有效量的示例性非限制性范围是约0.001-30mg/kg。

具有本领域普通技能的医生或兽医可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以以低于实现所需治疗效果所需的水平开始采用的药物组合物中多特异性抗体的剂量，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。通常，本发明的多特异性抗体的适合的每日剂量是有效产生治疗效果的最低剂量。施用施用可以例如是肠胃外的，如静脉内、肌肉内或皮下的。在一个实施方案中，多特异性抗体可以通过输注以mg/m²计算的每周剂量施用。此类剂量可以例如基于上文提供的mg/kg剂量，根据以下：剂量(mg/kg)×70：1.8。可以重复施用此类施用，例如1至8次，例如3至5次。施用可以通过连续输注进行2至24小时，例如2至12小时。在一个实施方案中，多特异性抗体可以通过长时间(例如超过24小时)的缓慢连续输注施用，以减少毒副作用。

在一个实施方案中，多特异性抗体可以以每周剂量施用，以固定剂量计算多达8次，例如当每周一次施用给予时4至6次。此类方案可以根据需要重复一次或多次，例如，在6个月或12个月后。此类固定剂量可以例如基于上面提供的mg/kg剂量，体重估计为70kg。可以在施用时通过例如取出生物样品并使用靶向本发明的多特异性抗体的cd137抗原抗原结合区的抗独特型抗体，通过测量血液中本发明的多特异性抗体的量来确定或调节剂量。

在一个实施方案中，多特异性抗体可以作为维持治疗施用，例如每周一次，持续6个月或更长时间。

多特异性抗体还可以预防性施用，以降低患癌症的风险，延迟癌症进展中事件发生的起始，和/或降低癌症缓解时复发的风险。

本发明的多特异性抗体也可以联合治疗施用，即与其他与治疗疾病或病症相关的治疗剂组合施用。因此，在一个实施方案中，含有多特异性抗体的药物用于与一种或多种其他治疗剂组合，例如细胞毒性剂、化学治疗剂或抗血管生成剂。

此类组合施用可以是同时的、分开的或顺序的。对于同时施用，药剂可以适当地作为一种组合物或作为分开的组合物施用。因此，本发明还提供了用于治疗病症的方法，该方法包括施用与一种或多种如下所述的另外的治疗剂组合的本发明的多特异性抗体。

在一个实施方案中，本发明提供用于治疗病症的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的多特异性抗体和任选地至少一种另外的治疗剂。

在一个实施方案中，本发明提供用于治疗或预防癌症的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的多特异性抗体和至少一种另外的治疗剂。

本发明的药物组合物还可以在联合治疗中施用，即与其他药剂组合，或与其他治疗方案组合。例如，多特异性抗体可以与放射疗法和/或手术和/或自体或同种异体外周干细胞或骨髓移植组合。

生物标志物

因此，在一个方面，本发明还涉及多特异性抗体作为生物标志物的用途。

另一方面，本发明涉及用于检测获得自患者的样品(例如血液样品、淋巴结样品或骨髓样品)中表达cd40和cd137的细胞之间的交联的试剂盒，其包含

i)根据本文公开的任一个实施方案的多特异性抗体；和

ii)使用所述试剂盒的说明书。

在进一步的方面，本发明涉及在施用根据本文公开的任一个实施方案的双特异性抗体时，用于检测表达cd40和cd137的细胞之间的交联是否在获得自患者的样品(例如血液样品、淋巴结样品或骨髓样品)中发生的方法，其包括以下步骤：

(i)在允许所述多特异性抗体与表达cd40和cd137的细胞之间形成复合物的条件下，使样品与根据本文公开的任一个实施方案的多特异性抗体接触；和

(ii)分析是否已形成复合物。

复合物的检测可以通过本领域已知的方法进行，例如在实施例4、5、6、10、11或12中进行的。

抗独特型抗体

在另一方面，本发明涉及抗独特型抗体，其与如本文公开的任一个实施方案中所定义的第一和/或第二抗原结合区结合。

在具体的实施方案中，抗独特型抗体与多特异性抗体的第一和/或第二抗原结合区结合，其中

-第一抗原结合区包含如seqidno:117所述的vh序列和如seqidno:121所述的vl序列，并且

-第二抗原结合区包括包含seqidno:123的vh序列和包含seqidno:127的vl序列。

在一个实施方案中，抗独特型抗体与本文公开的任一个实施方案中所定义的第一抗原结合区结合。在具体的实施方案中，第一抗原结合区包括包含seqidno:117的vh序列和包含seqidno:121的vl序列。

在另一个实施方案中，抗独特型抗体与本文公开的任一个实施方案中所定义的第二抗原结合区结合。在具体的实施方案中，第二抗原结合区包括包含seqidno:123的vh序列和包含seqidno:127的vl序列。

通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：抗体的生成

生产上述表1中提到的cd40和每种cd137抗体(即克隆1-12)，其具有表1中所述的vh和vl序列以及具有人κ轻链以及具有人igg1重链。生产具有两种不同的人igg1重链的cd40抗体；1)含有以下氨基酸突变的人igg1重链：l234f、l235e、d265a和f405l(feal)，其中氨基酸位置编号是根据eu编号(对应于seqidno:113)；和2)含有以下氨基酸突变的人igg1重链：l234f、l235e、d265a和k409r(fear)，其中氨基酸位置编号是根据eu编号(对应于seqidno:112)。

生产cd137抗体，其全部具有含有以下氨基酸突变的人igg1重链：l234f、l235e、d265a和k409r(fear)，其中氨基酸位置编号是根据eu编号(对应于seqidno:112)。

类似地，生产b12抗体，其包含表1中提及的vh和vl序列，以及具有人igg1轻链和含有以下氨基酸突变的人igg重链：l234f、l235e、d265a和f405l(feal)，其中氨基酸位置编号是根据eu编号(对应于seqidno:113)。

根据制造商的说明，通过使用expifectamine^tm293(thermofisher目录号a14525)在expi293f^tm细胞(thermofisher目录号a14527)中共转染相关的重链和轻链表达载体，在无血清条件下生产抗体。通过蛋白质a亲和层析纯化抗体，并将缓冲液交换成12.6mmnah2po4，140mmnacl，ph7.4缓冲液(b.braun或thermofisher)中。在缓冲液交换后，将样品在0.2μm死端过滤器上无菌过滤。通过ce-sds和hp-sec分析纯化的蛋白质。通过280nm处的吸光度测量浓度。将纯化的抗体储存在2-8℃。

实施例2：在野猪或象和人cd137之间进行dna改组以确定抗cd137抗体的对结合重要的结构域

为了确定对抗cd137抗体与人cd137结合重要的结构域，在人和野猪cd137(susscrofa；xp_005665023)之间或人和非洲象cd137(loxodontaafricana；xp_003413533)之间进行dna改组。通过用野猪(改组构建体1-4、6)或象(改组构建体5)结构域替换人结构域，从编码人cd137的dna制备改组构建体。如果人cd137中的结构域对于抗cd137抗体的结合是重要的，则在用野猪或非洲象结构域替换该结构域时将丧失结合。要求是抗体不与整个cd137象或野猪序列结合。人和野猪之间以及人和非洲象cd137之间的同源性分别为70.2％和74.5％。图1显示了人、野猪和非洲象cd137的序列比对。图2显示了含有野猪cd137或非洲象结构域的人cd137的构建体，如图所示。

将3×10⁶个hek293t-17细胞接种在t75培养瓶(greinerbio-one，目录号658175)中的含有10％fcs(biochrom，目录号s0115)的20mlrpmi1640glutamax培养基中的。在o/n温育后，根据制造商的说明书，使用转染试剂，mirusbio(vwrinternational，目录号731-0029)，用编码改组构建体或组成型活性人延伸因子-1alpha(ef-1alpha)启动子下游的野猪、非洲象或人cd137的表达载体瞬时转导细胞。第二天，使用1.5mlaccutase(sigmaaldrich，目录号a6964)(在37℃温育5分钟)收获细胞，并且基本上如实施例4中所述进行流式细胞术，以测量改组构建体和人、非洲象和野猪cd137的表面表达，并测量抗体克隆与不同改组构建体的结合。为了测量构建体的细胞表面表达，将转导的细胞与1μg/ml山羊多克隆抗人cd137(r&dsystems，目录号af838)在facs缓冲液(补充有5mmedta的d-pbs[sigmaaldrich，目录号03690]和5％(v/v)胎牛血清[fbs，biochrom，目录号s0115])温育(4℃，20分钟)，然后与apc标记的抗山羊igg(h+l)(r&dsystems，目录号f0108)(4℃，20分钟)温育。通过将转导的细胞与1μg/ml的抗体克隆一起温育，然后用apc标记的affinipuref(ab’)2片段(1:50最终稀释；jackson，目录号109-136-127)来测量不同cd137抗体克隆与表达改组构建体的细胞的结合。

所有cd137改组构建体以及人、非洲象和野猪cd137以相似的表达水平在细胞表面上表达(图3)。

表2和图4显示除克隆1外的所有克隆至少丧失与非洲象或野猪cd137的结合。克隆2、3、4、5、6、7、8、9、10和11显示丧失与至少一种改组构建体的结合。与结合人cd137相比，克隆1显示与非洲象和改组构建体5的结合降低。克隆12未显示与任何改组构建体的结合丧失，但显示与改组构建体5的结合降低。没有一个克隆显示与改组构建体1和2的结合丧失或结合减少。

表2：cd137抗体与改组构建体结合的概要

实施例3：通过2-mea诱导的fab臂交换生成双特异性抗体

生产稳定的基于igg1的双特异性抗体的方法描述于wo2011131746(genmab)。通过下述方法产生的双特异性抗体产物将不再参与fab臂交换。该方法的基础是使用互补的ch3结构域，其在特定的试验条件下促进异源二聚体的形成。为了能够通过该方法生产双特异性抗体，生成了在ch3结构域中携带某些突变的igg1分子：在一个亲本igg1抗体中是t350i、k370t和f405l突变(或最低限度f405l)，在另一个亲本igg1抗体中是k409r突变。

使用在280nm处的吸光度来测量至少含有f405l或k409r点突变的亲本igg1抗体的浓度。基于氨基酸序列的特定消光系数用于推断蛋白质浓度。

cube系统是genmab的灵活机器人工作单元(genmab’sflexibleroboticworkcell)。该系统是与farnboroughuk的peakanalysisandautomation(paa)合作设计和建造的。

通过组合来自实施例1的以下抗体生成双特异性抗体：

-与每种cd137-fear抗体组合的cd40-feal抗体，

-与b12-feal抗体组合的cd40-fear抗体，以及

-与b12-feal抗体组合的每种cd137-fear抗体

双特异性抗体发现过程在cube系统上以自动方式进行，如图5所示并如下所述。

为了生成双特异性抗体，进行以下(自动)步骤：

-取决于所需的体积、将深孔源板(96孔透明v型底2ml聚丙烯深孔板，corning，目录号3960；48孔sw5ml，ritter，目录号43001-1062；24孔riplatesw10ml，ritter，目录号43001-1066)用浓度为1.0mg/ml的亲本抗体(不同的板中含有f405l和含有k409r的抗体)填充(在1xpbs中，b.braun)(图5，左面板)。

-根据图5，通过cube从这些源板预网格化板(96孔v形底，corning)制备中间面板。对于交换网格(exchangegrid)中的与亲本抗体的每个组合，将67.5μl亲本抗体添加至适当的预网格化板。

-预网格化后，进行交换。在此，将各自来自不同预网格化板的两种亲本抗体(67.5μl，1.0mg/ml)添加至交换板(96孔圆底聚丙烯板，greiner，目录号650293)，每种抗体最终浓度为0.5mg/ml(等摩尔浓度)(图5，右板)。

-通过向交换板中加入15μl75mm2-巯基乙胺-hcl(2-mea)(在1xpbs中，b.braun)开始交换反应。交换板中的总体积现在为150μl(最终浓度2-mea7.5mm)

-将交换板在cytomat6000自动培养箱(thermoscientific)中于31℃温育5小时。

-通过使用脱盐柱(phytip脱盐柱，600μl树脂，phynexus，目录号pdr91-60-06)去除还原剂2-mea，其流动基于重力。

ο通过将具有96个柱的适配器放置在废液位置，添加450μl1xpbs(b.braun)两次，并允许溶液流过色谱柱进入废液中来调节柱子。

ο调节后，加入来自交换板的100μl样品，从而将剩余的pbs推出柱子。

ο在允许溶液流过柱子进入废液后，将具有柱子的适配器放在脱盐(或目标)板上(96孔圆底，greiner)。

ο将来自交换板的剩余样品添加到柱子中。

ο在允许样品流过柱进入脱盐板后，将225μl1xpbs(b.braun)加入到柱子中，并将样品洗脱到脱盐板中。

ο2-mea保留在柱子内。在适当的情况下，可以通过用1xpbs(b.braun)洗涤来再生柱子。

-将脱盐板储存在8℃的cytomat6001自动培养箱(thermoscientific)中。这些板现在含有双特异性抗体。

将最终的双特异性抗体样品在0.2μm死端滤器上过滤，并测量双特异性产物的280nm(a280)处的吸光度以确定最终浓度。在进一步使用之前，将样品在2-8℃下储存至少24小时。

使用高压液相色谱(hplc)-使用butyl-npr，2.5μm，4.6x35mmhic-hplc柱(tosohbioscience)的疏水相互作用色谱(hic)定量双特异性抗体交换效率，流速为1ml/分钟。将亲本抗体和分析样品的浓度标准化，并用hic洗脱液a(15.4mmk2hpo4，9.6mmkh2po4，1.5m(nh4)2so4；ph7.0)稀释2倍。注入50μl样品，用12分钟hic洗脱液a至hic洗脱液b(15.4mmk2hpo4，9.6mmkh2po4；ph7.0)的梯度进行洗脱，在280nm处检测。或者，使用hplc-分析阳离子交换色谱(ciex)定量测量双特异性抗体交换效率。将流动相a(10mmnapo4，ph7.0)中1mg/ml的亲本抗体和分析样品注入hplc上。通过使用propacwcx-10，4mm×250mm，分析柱以1ml/min的流速分离不同电荷的igg分子。注入50μl样品并用从流动相a(10mmnapo4，ph7.0；由0.1m储备磷酸钠缓冲液制备，其通过添加10.3gna2hpo4·2h2o和5.07gnah2po4每升milli-q获得)至流动相b(10mmnapo4，ph7.0，0.25mnacl)的梯度进行洗脱，在280nm处检测。使用empower3软件(waters)将峰指定为亲本抗体或双特异性反应产物，并整合峰面积以定量双特异性抗体交换反应的程度。根据制造商的说明，使用分析尺寸排阻色谱法，其使用tskhp-sec柱(g3000swxl；tosohbiosciences，viaomnilabo，breda，thenetherlands)和毛细管电泳-使用在ht蛋白质快速实验室芯片(caliperlifesciences，ma)上的labchipgxii(caliperlifesciences，ma)的十二烷基硫酸钠(ce-sds)在还原和非还原条件下进一步分析双特异性抗体反应产物。

实施例4：测量与cd40和cd137结合的双特异性抗体的反式激活的报告物试验(reporterassay)

cd40主要在抗原呈递细胞(apc)(例如树突状细胞)上表达，而cd137主要在活化的t细胞上表达。因此，与cd40和cd137结合的双特异性抗体可以同时结合表达这些受体的apc和t细胞。从而，这些双特异性抗体可以通过受体结合介导apc和t细胞之间的细胞-细胞接触并激活两种受体。这种受体激活可以通过细胞-细胞相互作用下的交联和受体聚集来诱导，并且不一定依赖于亲本单特异性二价抗体的激动活性。因此，这些反式激活的双特异性抗体可以在apc和t细胞之间的相互作用的背景中发挥共刺激活性。

建立报告物试验系统以测量双特异性抗体对每种受体的激活。nf-κb/293/gfp-luc^tm转录报告物细胞系(systembiosciences；目录号tr860a-1)是设计用于体外监测nf-κb信号转导途径的报告物细胞系。可以通过检测绿色荧光蛋白(gfp)荧光以及荧光素酶活性来监测nf-κb途径的激活，用于定量转录激活报告物试验。根据制造商的说明，使用转染试剂mirusbio(vwrinternational，目录号731-0029)，用编码组成型活性人延伸因子-1alpha(ef-1alpha)启动子下游的全长人cd40或cd137的表达载体稳定转导nf-κb/293/gfp-luc细胞。使用10mg/ml杀稻瘟素(invivogen，目录号ant-bl-1)选择稳定的克隆。另外，如上所述，用人cd40和cd137稳定转导k562细胞，以生成可以为双特异性抗体的另一臂提供相应靶抗原的细胞系。通过流式细胞术测量受体的细胞表面表达。将0.3×10⁶个细胞离心(460×g，5分钟)并在facs缓冲液(补充有5mmedta[sigmaaldrich，目录号03690]和5％(v/v)胎牛血清[fbs，biochrom，目录号s0115]的d-pbs)中洗涤)(460×g，5分钟)。将50μl1:50稀释的别藻蓝蛋白(apc)标记的抗人cd40(bdbiosciences，克隆5c3，目录号555591)或藻红蛋白(pe)标记的抗人cd137(bdbiosciences，克隆4b4-1，目录号555956)加入到细胞团粒中并在4℃下在黑暗中温育20分钟。用facs缓冲液洗涤三次后，将细胞重悬于100μlfacs缓冲液中，并在facscantoii(bdbiosciences)上通过流式细胞术检测抗体的结合。转导的nf-κb/293/gfp-luc细胞(图6a)和k562细胞(图6b)上的cd40和cd137的细胞表面表达很好地显示出来。

测量反式激活的报告物试验设置如下：将表达两种所示tnf受体之一的nf-κb/293/gfp-luc细胞以10,000个细胞/孔接种于白色不透明的384孔细胞培养板(perkinelmer，目录号6007680)中的含有glutamax补充剂的30μlrpmi1640培养基(lifetechnologies，目录号61870)中。将单臂与cd40和另一臂与cd137结合的双特异性抗体和相应的单特异性单价(含有一个无关对照臂[b12])对照抗体以10μl/孔加入到(培养基中)连续稀释的报告细胞中，最终浓度范围为0.078μg/ml至10μg/ml，包括缓冲液对照。将10μl培养基中的17,000个表达第二tnf受体的k562细胞或野生型k562(k562_wt)细胞加入各孔中，并在37℃和5％co2下温育18小时。因此，双特异性抗体能够与nf-κb/293/gfp-luc细胞系上的第一tnf受体结合，同时与k562细胞系上的第二tnf受体结合。通过nf-κb信号传导诱导的荧光素酶活性仅测量nf-κb/293/gfp-luc细胞上第一tnf受体的受体激活。因此，通过两个报告物试验来分析靶向cd40和cd137的双特异性抗体：第一个试验测量cd137的活化，其通过同时结合物报告细胞系上的cd137和k562细胞上的cd40诱导(hek293_nfk_cd137_gfp_luc+k562_cd40)，第二个试验测量cd40的活化，其通过同时结合报告细胞系上的cd40和k562细胞上的cd137诱导(hek293_nfk_cd40_gfp_luc+k562_cd137)。加入50μl/孔在glolysis缓冲液(promega；目录号e266a)中重建的试剂(promega；目录号e2520)并在室温下温育30分钟后，在envision酶标仪(platereader)(perkinelmer)上测量作为相对发光单位的荧光素酶活性。

在反式激活条件下(分别与k562-cd40或k562-cd137温育)，只有双特异性cd40xcd137抗体(图7a-l，下面板，第一和第三图)在用cd137或cd40转导的nf-κb/293/gfp-luc细胞中诱导荧光素酶活性(浓度约为100ng/ml和更高)。单特异性单价(含有一个无关的对照臂[b12])对照抗体均未在转导的nf-κb/293/gfp-luc细胞中诱导荧光素酶活性(上面板)。此外，在不存在反式激活条件(使用野生型k562细胞)的情况下，双特异性cd40xcd137抗体(下面板，第二和第四图)未诱导荧光素酶活性。

实施例5：用于测量与cd40和cd137结合的双特异性抗体的反式激活的非抗原特异性t细胞增殖试验

为了测量非抗原特异性增殖，将外周血单核细胞(pbmc)群体中的t细胞与次优浓度的抗cd3抗体(克隆ucht1)一起温育，并与cd40xcd137双特异性或对照抗体组合。在该pbmc群体中，表达cd40的抗原呈递细胞可以通过双特异性抗体的cd40特异性臂结合，而群体中的t细胞可以通过cd137特异性臂结合。经由双特异性抗体与抗原呈递细胞交联诱导的t细胞的反式激活测量为t细胞增殖。

使用ficoll梯度(vwr，目录号17-5446-02)从健康供体(transfusionszentrale，universityhospital，mainz，germany)的血沉棕黄层获得pbmc。根据制造商的说明，使用pbs中的1.6μm羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)(thermofisher，目录号c34564)标记pbmc。在96孔圆底板(sigmaaldrich，cls3799-50ea)中每孔接种75,000个cfse标记的pbmc，并在补充有5％人ab血清的150μlimdmglutamax中与对每个供体预先确定的次优浓度的抗cd3抗体(r&dsystems，克隆ucht1，目录号mab100；0,01-0,1μg/ml终浓度)以及双特异性或对照抗体在37℃，5％co2中温育四天。通过流式细胞术分析cd4⁺和cd8⁺t细胞的增殖，基本上如上所述。含有pe标记的cd4抗体(bdbiosciences，目录号555347；1:80最终稀释度)、pe-cy7标记的cd8α抗体(克隆rpa-t8，ebioscience，目录号25-0088-41；1:80最终稀释度)、apc标记的cd56抗体(ebiosciences，目录号17-0567；1:80最终稀释度)和7-aad(beckmancoulter，目录号a07704；1:80最终稀释度)的30μlfacs缓冲液用于染色细胞并从分析中排除自然杀伤(nk)细胞(cd56)和死细胞(7-aad)。在facscantoii(bdbiosciences)上测量样品。通过flowjo7.6.5软件基于指示细胞分裂的cfse峰进行t细胞增殖的详细分析。计算进入分裂的t细胞的平均百分比(分裂的细胞％)和进入分裂的细胞的平均分裂数(增殖指数)。

图8a显示仅cd40xcd137双特异性抗体有效增强cd8⁺t细胞的增殖。对照单特异性单价抗体(b12xcd40；b12xcd137)和单特异性单价cd40与单特异性单价cd137抗体的组合(b12xcd40+b12xcd137)未诱导出比对照中观察到的更多增殖(仅弱活化的pbmc，ctrl，w/o)。如上所述，对不同浓度的不同抗体的流式细胞术直方图进行定量，以指示分裂细胞的百分比(图8b)和增殖指数(图8c)。这些图显示只有双特异性抗体能够诱导cd8⁺细胞的增殖，最优值在0.04和0.2μg/ml之间。

实施例6：用于测量与cd40和cd137结合的双特异性抗体的反式激活的抗原特异性cd8⁺t细胞增殖试验

为了测量抗原特异性试验中双特异性抗体对增殖的诱导，用密封蛋白6体外转录的rna(ivt-rna)转染树突状细胞(dc)以表达密封蛋白6抗原。用密封蛋白-6特异性hla-a2限制性t细胞受体(tcr)转染t细胞。该tcr可以识别dc上hla-a2中存在的密封蛋白-6衍生的表位。cd40xcd137双特异性抗体可以交联树突状细胞上的cd40和t细胞上的cd137，导致dc的活化和对t细胞的共刺激信号，导致t细胞增殖。

hla-a2⁺pbmc获得自健康供体(transfusionszentrale，universityhospital，mainz，germany)。根据制造商的说明书，使用抗cd14microbeads(miltenyi；目录号130-050-201)通过磁激活细胞分选(macs)技术从pbmc分离单核细胞。将外周血淋巴细胞(pbl，cd14-阴性级分)冷冻用于将来的t细胞分离。为了分化成未成熟的dc(idc)，将1×10⁶个单核细胞/ml在含有5％人ab血清(sigma-aldrichchemiegmbh，目录号h4522-100ml)、丙酮酸钠(lifetechnologiesgmbh，目录号11360-039)、非必需氨基酸(lifetechnologiesgmbh，目录号11140-035)、100iu/ml青霉素-链霉素(lifetechnologiesgmbh，目录号15140-122)、1000iu/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf；miltenyi，目录号130-093-868)和1000iu/ml白细胞介素4(il-4；miltenyi，目录号130-093-924)的rpmiglutamax(lifetechnologiesgmbh，目录号61870-044)中培养五天。在这五天期间，用新鲜培养基替换一半培养基一次。通过收集非贴壁细胞收获idc；通过与含有2mmedta的pbs在37°温育10分钟来分离贴壁细胞。洗涤后，将idc在含有10％v/vdmso(applichemgmbh，目录号a3672,0050)和50％v/v人ab血清的rpmiglutamax中冷冻，用于未来的抗原特异性t细胞试验。

在t细胞试验开始前一天，解冻来自相同供体的冷冻pbl和idc。根据制造商的说明，使用抗cd8microbeads(miltenyi，目录号130-045-201)，通过macs技术将pbl用于分离cd8⁺t细胞。使用btx830电穿孔系统设备(btx；500v,1x3ms脉冲)，在4-mm电穿孔比色皿(vwrinternationalgmbh，目录号732-0023)中的250μlx-vivo15(biozymscientificgmbh，目录号881026)中，用编码alpha链的10μgivt-rna加编码密封蛋白-6特异性小鼠tcr的beta链的10μgivt-rna电穿孔约10-15×10⁶个cd8⁺t细胞(hla-a2限制性；描述于wo2015150327a1中)。电穿孔后，立即将细胞转移到补充有5％人ab血清的新鲜imdm培养基(lifetechnologiesgmbh，目录号12440-061)中，并在37℃，5％co2下静置至少1小时。根据制造商的说明，使用pbs中的1,6μm羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse；invitrogen，目录号c34564)标记t细胞，并在补充有5％人ab血清的imdm培养基中温育，o/n。

使用如上所述的电穿孔系统(300v，1x12ms脉冲)，在250μlx-vivo15培养基中，用编码全长密封蛋白6(uniprotp56747)的0.4-5μgivt-rna电穿孔多达5x10⁶个解冻的idc，并在补充有5％人ab型血清的imdm培养基中温育，o/n。

第二天，收获细胞。通过流式细胞术检查dc上的密封蛋白6和t细胞上的tcr的细胞表面表达。因此，用alexa647-缀合的cldn6特异性抗体(不可商购；内部生产)染色dc，用抗小鼠tcrβ链抗体(bectondickinsongmbh，目录号553174)染色t细胞。在96孔圆底板中的补充有5％人ab血清的imdmglutamax(lifetechnologies，目录号12440-061)中，，在双特异性或对照抗体存在下，将50,00个电穿孔的dc与50,000个电穿孔的cfse标记的t细胞一起温育。通过流式细胞术在5天后测量t细胞增殖。通过flowjo7.6.5软件基于指示细胞分裂的cfse峰进行t细胞增殖的详细分析。计算进入分裂的t细胞的平均百分比(分裂的细胞％)和进入分裂的细胞的平均分裂数(增殖指数)。

图9a显示仅cd40xcd137双特异性抗体有效增强cd8⁺t细胞的增殖。对照单特异性单价抗体(b12xcd40；b12xcd137)和单特异性单价cd40与单特异性单价cd137抗体的组合(b12xcd40+b12xcd137)未诱导出比对照中观察到的更多增殖(仅弱活化的pbmc，ctrl，w/o)。同样的结果也反映在分裂细胞的百分比中(图9b)，并且从增殖指数中非常清楚(图9c)。图9d显示cd40xcd137双特异性抗体对抗原特异性增殖的诱导是浓度依赖性的，在该试验中最优值约为0.1μg/ml。

实施例7：小鼠和兔抗体的人源化

来自抗体小鼠抗cd40-001和兔抗cd137-009的人源化抗体序列在antitope(cambridge，uk)生成。使用种系人源化(cdr-移植)技术生成人源化抗体序列。基于人种系序列设计人源化v区基因，所述序列与小鼠和兔抗体的vh和vκ氨基酸序列具有最接近的同源性。针对每种非人亲本抗体设计一系列4至6个vh和4或5个vκ(vl)种系人源化v区基因。使用swisspdb产生非人亲本抗体v区的结构模型并进行分析以鉴定v区框架中可以对抗体的结合特性重要的氨基酸。注意到这些氨基酸掺入一种或多种变体cdr-移植的抗体中。用作人源化设计基础的最接近的匹配种系序列示于表3中。

表3：最接近匹配的人种系v区段和j区段序列。

然后使用antitope专有的计算机技术，itope^tm和tced^tm(t细胞表位数据库)选择具有最低潜在t细胞表位发生率的变体序列(perry,l.c.a,jones,t.d.andbaker,m.p.newapproachestopredictionofimmuneresponsestotherapeuticproteinsduringpreclinicaldevelopment(2008).drugsinr&d9(6):385-396；20；bryson,c.j.,jones,t.d.andbaker,m.p.predictionofimmunogenicityoftherapeuticproteins(2010).biodrugs24(1):1-8)。最后，对设计的变体的核苷酸序列进行密码子优化以在人细胞中表达。

人源化cd40和cd137抗体的可变区序列显示在序列表和上表1中。

实施例8：用于抗体的表达构建体、瞬时表达和纯化

对于抗体表达，将vh和vl序列克隆到表达载体(pcdna3.3)中，所述表达载体含有在vh的情况下，相关的恒定重链(hc)，在某些情况下含有f405l或k409r突变和/或l234f、l235e和d265a，以及在vl的情况下，轻链(lc)区。抗体表达为igg1，κ。使用293fectin(lifetechnologies)在expi293f细胞(lifetechnologies，usa)中瞬时转染编码抗体的重链和轻链两者的质粒dna混合物，基本上如vink等人所述(vinketal.,methods,65(1),5-102014)。接下来，通过固定化蛋白质g色谱法纯化抗体。

实施例9：用于测试与cd40和cd137结合的人源化双特异性抗体的功能性的非特异性t细胞增殖试验

为了测量与cd40和cd137结合的人源化双特异性抗体的功能性，如上所述进行非抗原特异性t细胞增殖试验。简而言之，一个供体的pbmc被cfse标记并与次优浓度的抗cd3抗体(克隆ucht1；对该供体确定为0.01μg/ml)和0.008、0.04、0.2或1μg/ml人源化cd40xcd137双特异性抗体、亲本双特异性抗体或igg1对照抗体一起温育。

通过流式细胞术分析cd8⁺t细胞的增殖，基本上如上所述。通过flowjo7.6.5软件基于指示细胞分裂的cfse峰进行t细胞增殖的详细分析。计算进入分裂的t细胞的平均百分比(分裂的细胞％)和进入分裂的细胞的平均分裂数(增殖指数)。

图10显示人源化cd40xcd137双特异性抗体(bisg1-cd40-001-hc6lc1-fealxcd137-009-hc7lc2-fear)有效地增强了cd8⁺t细胞的增殖。人源化双特异性抗体增强了分裂细胞的百分比和cd8⁺细胞的平均分裂数两者。人源化双特异性抗体的功效与亲本双特异性抗体(cd40-001xcd137-009)的功效相当。

实施例10：用于测试与cd40和cd137结合的人源化双特异性抗体的功能性的抗原特异性cd8⁺t细胞增殖试验

为了测量与cd40和cd137结合的人源化双特异性抗体的功能性，如上所述进行抗原特异性cd8⁺t细胞增殖试验。简而言之，在人源化cd40xcd137双特异性抗体、亲本抗体或igg1对照抗体的存在下，将cfse标记的cldn6-tcr转染的cd8⁺t细胞与cldn6rna电穿孔的dc一起温育。4天后通过流式细胞术测量t细胞增殖。通过flowjo7.6.5软件基于指示细胞分裂的cfse峰进行t细胞增殖的详细分析。计算进入分裂的t细胞的平均百分比(分裂的细胞％)和进入分裂的细胞的平均分裂数(增殖指数)。

图11显示人源化cd40xcd137双特异性抗体(bisg1-cd40-001-h6lc1-fealxcd137-009-hc7lc2-fear)有效地增强了cd8⁺t细胞的增殖。人源化双特异性抗体的功效与亲本双特异性抗体(cd40-001xcd137-009)的功效相当。在该试验中，人源化和亲本双特异性抗体两者均提高了分裂细胞的百分比以及cd8⁺细胞的增殖指数。

实施例11：用于评估cd40xcd137双特异性抗体对肿瘤浸润淋巴细胞的作用的离体til扩增试验

为了评估cd40xcd137双特异性抗体(bisg1-cd40-001-feal/cd137-009-fear)对肿瘤浸润淋巴细胞(til)的作用，如下进行人肿瘤组织的离体培养。通过使用刮刀或血清移液管将分离的肿瘤块从六孔板(fisherscientific目录号10110151)的一个含有洗涤培养基的孔转移到下一个孔中，将新鲜切除的人肿瘤组织洗涤三次。洗涤培养基由补充有1％pen/strep(thermofisher，目录号15140-122)和1％fungizone(thermofisher，目录号15290-026)的x-vivo15(biozym，目录号881024)组成。接下来，用手术刀(braun/roth，目录号5518091ba223)解剖肿瘤并切成直径约1-2mm的肿瘤块。将两块各自放入含有所示浓度的1mltil培养基(x-vivo15，10％人血清白蛋白(hsa，cslbehring，目录号pzn-6446518)、1％pen/strep、1％fungizone和il-2(novartispharma,目录号02238131)的24孔板(vwrinternational，目录号701605)的一个孔中。以所示的最终浓度加入与cd40和cd137结合的双特异性抗体。将培养板在37℃和5％co2下温育72小时，并向每个孔中加入1ml含有所示il-2浓度和所示浓度的双特异性抗体的新鲜til培养基。每隔一天使用配备有500万像素相机的leicadmi1显微镜监测孔的til簇的发生。当检测到超过25个til微团簇时，将孔基于独立地团簇分开。为了分离til培养物，将细胞重新悬浮并转移到6孔板的孔中并补充另外2mltil培养基。

在10-14天的总培养期后，收获til并通过流式细胞术分析。为了允许不同处理组的定量比较，在最后一次洗涤步骤后，用补充有bd^tmcompbeads(bdbiosciences，目录号51-90-9001291)的facs缓冲液重悬细胞团粒。在bdfacscanto^tmii流式细胞仪(bectondickinson)上进行流式细胞术分析，并使用flowjo7.6.5软件分析获得的数据。计算每个孔的相对活til计数(7-aad-阴性细胞)/1,000个珠子。

图12显示了来自人黑色素瘤组织的til扩增的分析。其中，100u/mlil-2用作til培养基的补充物。此外，加入以下浓度的与cd40和cd137结合的双特异性抗体(bisg1-cd40-001-feal/cd137-009-fear)：0.016、0.08、0.4、2.0和10.0μg/ml；没有添加抗体的孔充当阴性对照。培养14天后，收获til并通过流式细胞术分析。测量来自24孔板的不同孔的每种抗体浓度的五个样品。在与结合cd40和cd137的双特异性抗体一起培养的所有样品中，与没有抗体的对照样品相比，活til的计数显著增加。总体而言，观察到平均相对活til计数约100倍的增加(图12)。

图13显示了来自非小细胞肺癌(nsclc)组织的til扩增的分析。其中，10u/mlil-2用作til培养基的补充物。此外，施用以下最终浓度的与cd40和cd137结合的双特异性抗体(bisg1-cd40-001-feal/cd137-009-fear)：0.01、0.1和1.0μg/ml；没有添加抗体的孔充当阴性对照。培养10天后，收获til并通过流式细胞术分析。测量来自24孔板的不同孔的每种抗体浓度的五个样品。在与结合cd40和cd137的双特异性抗体一起培养的所有样品中，与没有抗体的对照样品相比，活til计数显著增加。总体而言，在0.1或1μg/ml时观察到平均相对活til计数高达10倍的增加(图13)。

序列表

<110>健玛保

<120>针对cd40和cd137的多特异性抗体

<130>p/0101-wo

<160>136

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>8

<212>prt

<213>小鼠

<400>1

glytyrthrphethrglutyrile

15

<210>2

<211>8

<212>prt

<213>小鼠

<400>2

ileileproasnasnglyglythr

15

<210>3

<211>15

<212>prt

<213>小鼠

<400>3

thrargarggluvaltyrglyargasntyrtyralaleuasptyr

151015

<210>4

<211>6

<212>prt

<213>小鼠

<400>4

glnglyileasnasntyr

15

<210>5

<211>9

<212>prt

<213>小鼠

<400>5

glnglntyrserasnleuprotyrthr

15

<210>6

<211>122

<212>prt

<213>小鼠

<400>6

gluvalglnleuglnglnserglyproaspleuvallysproglyala

151015

servallysilesercyslysthrserglytyrthrphethrglutyr

202530

ilemethistrpvallysglnserhisglylysserleuglutrpile

354045

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859095

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100105110

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115120

<210>7

<211>107

<212>prt

<213>小鼠

<400>7

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151015

aspargvalthrilethrcysseralaserglnglyileasnasntyr

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105

<210>8

<211>8

<212>prt

<213>兔

<400>8

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15

<210>9

<211>7

<212>prt

<213>兔

<400>9

iletrpasnasnglyalathr

15

<210>10

<211>14

<212>prt

<213>兔

<400>10

alaargseralaasnaspalatrpserthrtyrseraspleu

1510

<210>11

<211>6

<212>prt

<213>兔

<400>11

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15

<210>12

<211>14

<212>prt

<213>兔

<400>12

glnasntyrtyrtyrglyserserserglytyrglypheval

1510

<210>13

<211>117

<212>prt

<213>兔

<400>13

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151015

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202530

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65707580

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100105110

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115

<210>14

<211>112

<212>prt

<213>兔

<400>14

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151015

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202530

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354045

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100105110

<210>15

<211>8

<212>prt

<213>兔

<400>15

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15

<210>16

<211>7

<212>prt

<213>兔

<400>16

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15

<210>17

<211>14

<212>prt

<213>兔

<400>17

alaargseralaasnasnalatrpserthrtyrserasnleu

1510

<210>18

<211>6

<212>prt

<213>兔

<400>18

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15

<210>19

<211>14

<212>prt

<213>兔

<400>19

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1510

<210>20

<211>117

<212>prt

<213>兔

<400>20

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151015

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202530

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115

<210>21

<211>112

<212>prt

<213>兔

<400>21

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151015

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100105110

<210>22

<211>8

<212>prt

<213>兔

<400>22

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15

<210>23

<211>8

<212>prt

<213>兔

<400>23

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15

<210>24

<211>17

<212>prt

<213>兔

<400>24

alaargalaargtyrserglyglysertyralaasntyrvalpheasn

151015

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<210>25

<211>6

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<213>兔

<400>25

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15

<210>26

<211>14

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<213>兔

<400>26

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1510

<210>27

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<213>兔

<400>27

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151015

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<213>兔

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100105110

<210>29

<211>8

<212>prt

<213>兔

<400>29

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15

<210>30

<211>7

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<213>兔

<400>30

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15

<210>31

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<213>兔

<400>31

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1510

<210>32

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<213>兔

<400>32

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15

<210>33

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<213>兔

<400>33

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1510

<210>34

<211>114

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<213>兔

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100105110

<210>36

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<213>兔

<400>36

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15

<210>37

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<213>兔

<400>37

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15

<210>38

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<400>38

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151015

<210>39

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<213>兔

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15

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<213>兔

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505560

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glnseraspaspalaalathrtyrtyrcysleuglysertyraspcys

859095

aspseralaaspcysphealapheglyglyglythrgluvalvalval

100105110

glu

<210>43

<211>8

<212>prt

<213>兔

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glypheserleusersertyrala

15

<210>44

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<212>prt

<213>兔

<400>44

ileserthrserglyilethr

15

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<211>15

<212>prt

<213>兔

<400>45

alaargleuasnglypheaspasptyrvalargtyrpheaspphe

151015

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<211>6

<212>prt

<213>兔

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gluserilealaserasn

15

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<212>prt

<213>兔

<400>47

glnseralaphetyrvalserserseraspasnala

1510

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<211>118

<212>prt

<213>兔

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glnservalglugluserglyglyargleuvalthrproglythrpro

151015

leuthrleuthrcysthrvalserglypheserleusersertyrala

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argphethrileserlysthrserthrmetvalaspleulysilethr

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serprothrthrgluaspthralathrtyrphecysalaargleuasn

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100105110

leuvalthrvalserser

115

<210>49

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<212>prt

<213>兔

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alailegluleuthrglnthrproserservalseralaalavalgly

151015

glythrvalthrileasncysglnalasergluserilealaserasn

202530

leualatrptyrglnglnlysproglyglnproprolysleuleuile

354045

tyralaalasertyrleualaserglyvalproserargphelysgly

505560

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65707580

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seraspasnalapheglyglyglythrgluvalvalvallys

100105110

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<212>prt

<213>兔

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glypheserleusersertyrasp

15

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<212>prt

<213>兔

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ileglyseraspglyserala

15

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<212>prt

<213>兔

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alaargasptrpasnasptyrtrpalahisaspleu

1510

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<212>prt

<213>兔

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glnilevalthrserlysserala

15

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<211>12

<212>prt

<213>兔

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alaglyglytyrtyrasnserglyaspleuasnpro

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<212>prt

<213>兔

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151015

leuthrleuthrcysthralaserglypheserleusersertyrasp

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valsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutyrilegly

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100105110

valserser

115

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<211>112

<212>prt

<213>兔

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alaglnvalleuthrglnthrthrserprovalseralaalavalgly

151015

glythrvalthrileasncysglnalaserglnilevalthrserlys

202530

seralaleusertrptyrglnglnlysproglyglnproproargleu

354045

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505560

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65707580

gluseraspaspalaalathrtyrtyrcysalaglyglytyrtyrasn

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serglyaspleuasnpropheglyglyglythrgluvalvalvallys

100105110

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<212>prt

<213>兔

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glypheserleusersertyrasp

15

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<212>prt

<213>兔

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ileserserserglyasnthr

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<212>prt

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<212>prt

<213>兔

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<212>prt

<213>兔

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glnserleuglugluserglyglyargleuvalthrproglythrpro

151015

leuthrleuthrcysthralaserglypheserleusersertyrasp

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metsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutyrilegly

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asptyrtrpasppheasnleutrpglyproglythrleuvalthrval

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serser

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<211>110

<212>prt

<213>兔

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alaglnvalleuthrglnthrproserservalseralaalavalgly

151015

glythrvalthrileasncysglnalaserglnserileserasnleu

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leualatrptyrglnglnlysproglyglnargproargleuleuile

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tyrargalaserthrleualaserglyvalproserargphelysgly

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<213>兔

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glypheserleuasnasptyrtrp

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ileaspvalglyglyserleu

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histyrtyralathrileserglyleuglyvalala

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glnserleuglugluserglyglyargleuvalthrproglythrpro

151015

leuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuasnasptyrtrp

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metsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpilegly

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serser

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<211>110

<212>prt

<213>兔

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aspilevalmetthrglnthrproalaservalsergluprovalgly

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leualatrptyrglnglnlysproglyglnargprolysargleuile

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tyrglyalaseraspleualaserglyvalproserargpheserala

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65707580

alaaspalaalathrtyrtyrcyshistyrtyralathrilesergly

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100105110

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<212>prt

<213>兔

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glypheserleuserthrtyrala

15

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<212>prt

<213>兔

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valtyraspasnglytyrile

15

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<212>prt

<213>兔

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<212>prt

<213>兔

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15

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<212>prt

<213>兔

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glnthrasntyrcyscysserserseraspasnglypheala

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<212>prt

<213>兔

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glnservalglugluserglyglyargleuvalthrproglythrpro

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valthrvalserser

115

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<212>prt

<213>兔

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151015

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seraspasnglyphealapheglyglyglythrgluvalvalvallys

100105110

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<213>兔

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glyileaspleusersertyrhis

15

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<213>兔

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<212>prt

<213>兔

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<213>兔

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1510

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<212>prt

<213>兔

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151015

leuthrleuthrcysthrvalserglyileaspleusersertyrhis

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valserser

115

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<212>prt

<213>兔

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aspaspalaalathrtyrtyrcysglnglnasptyrglyileilephe

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valaspasnilepheglyglyglythrgluvalvalvallys

100105110

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<213>兔

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glypheserleuserasptyrtyr

15

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<213>兔

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metserglyserglyserthr

15

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asppro

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<212>prt

<213>兔

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alaalavalleuthrglnthrproserprovalseralaalavalgly

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glythrvalthrilesercysglnalaserglnservalvalglyasn

202530

serleuleusertrppheglnlyslysproglyglnproprolysleu

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<213>人

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proproasnserpheserseralaglyglyglnargthrcysaspile

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cysargglncyslysglyvalpheargthrarglysglucysserser

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alaglycyssermetcysgluglnaspcyslysglnglyglngluleu

100105110

thrlyslysglycyslysaspcyscyspheglythrpheasnaspgln

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lysargglyilecysargprotrpthrasncysserleuaspglylys

130135140

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145150155160

serproalaaspleuserproglyalaserservalthrproproala

165170175

proalaarggluproglyhisserproglnileileserphepheleu

180185190

alaleuthrserthralaleuleuglyglycysgluleu

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proalaarggluproglyhisserproglnileileserphepheleu

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proalaarggluproglyhisserproglnileileserphepheleu

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cyssercysargpheproglugluglugluglyglycysgluleu

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

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gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysthrserglytyrthrphethrglutyr

202530

ilemethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet

354045

glyglyileileproasnasnglyglythrsertyrasnglnlysphe

505560

glnglyargvalthrmetthrvalasplysserthrserthrglytyr

65707580

metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys

859095

thrargarggluvaltyrglyargasntyrtyralaleuasptyrtrp

100105110

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alaalaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthr

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alavalleuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthr

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valasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysserval

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methisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleu

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serproglylys

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245250255

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serproglylys

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aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcysseralaserglnglyileasnasntyr

202530

leuasntrptyrglnglnlysproglylysalavallysleuleuile

354045

tyrtyrthrserserleuhisserglyvalproserargphesergly

505560

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65707580

gluaspilealathrtyrtyrcysglnglntyrserasnleuprotyr

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thrpheglyglyglythrlysvalgluilelysargthrvalalaala

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serleuargleusercysthralaserglypheserleuasnasptyr

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trpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

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glytyrileaspvalglyglyserleutyrtyralaalaservallys

505560

glyargphethrileserargaspaspserlysserilealatyrleu

65707580

glnmetasnserleulysthrgluaspthralavaltyrtyrcysala

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argglyglyleuthrtyrglypheaspleutrpglyglnglythrleu

100105110

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180185190

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trpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

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505560

glyargphethrileserargaspaspserlysserilealatyrleu

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argglyglyleuthrtyrglypheaspleutrpglyglnglythrleu

100105110

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alaproserserlysserthrserglyglythralaalaleuglycys

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leuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnser

145150155160

glyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnser

165170175

serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserser

180185190

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glyargphethrileserargaspaspserlysserilealatyrleu

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alaproserserlysserthrserglyglythralaalaleuglycys

130135140

leuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnser

145150155160

glyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnser

165170175

serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserser

180185190

leuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasn

195200205

thrlysvalasplysargvalgluprolyssercysasplysthrhis

210215220

thrcysproprocysproalaprogluphegluglyglyproserval

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245250255

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vallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalys

275280285

thrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalser

290295300

valleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlys

305310315320

cyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrile

325330335

serlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleupro

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hisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

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65707580

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<210>128

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>n/a

<400>128

aspilevalmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcysglnalasergluaspilesersertyr

202530

leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysargleuile

354045

tyrglyalaseraspleualaserglyvalproserargpheserala

505560

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65707580

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valalaalaproservalpheilepheproproseraspgluglnleu

115120125

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145150155160

asnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyr

165170175

serleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshis

180185190

lysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserserproval

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thrlysserpheasnargglyglucys

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<212>prt

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151015

asnargasnglnilecysserpro

20

<210>130

<211>41

<212>prt

<213>人

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202530

serthrserasnalaglucysaspcys

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<212>prt

<213>人

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thrproglyphehiscysleuglyalaglycyssermetcysglugln

151015

aspcyslysglnglyglngluleuthrlys

2025

<210>132

<211>24

<212>prt

<213>人

<400>132

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<210>133

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<213>人

<400>134

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151015

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2025

<210>135

<211>255

<212>prt

<213>野猪

<400>135

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<212>prt

<213>非洲象

<400>136

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