用于降低治疗性蛋白的异质性的连续方法与流程
本公开涉及治疗性蛋白的生物制造技术领域。特别地，本公开涉及用于制造具有降低的异质性的治疗性蛋白的连续方法。
背景技术：
背景描述包括可能对理解本发明有用的信息。这并不是承认本文提供的任何信息是现有技术或者与本发明要求保护的发明相关，或者并不是承认具体或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
治疗性蛋白的重要性的确认已经引发了生物制药行业的新革命。然而，治疗性蛋白的生产通常观察到其带电荷的亚型，其在很大程度上干扰了获得产品的高产率和高质量所需的分离和纯化过程。
羧肽酶通常用于制备同质形式的治疗性蛋白，例如单克隆抗体，因为它催化c-末端肽键的水解。羧肽酶b是一种优先作用于碱性氨基酸(例如精氨酸和赖氨酸)的羧肽酶。
在现有技术中已经公开了多种方法以降低治疗性蛋白中的异质性的量。例如，us5126250公开了通过在纯化之前将大多数异质抗体转化为一种基本上同质的形式来降低来自抗体生成细胞的分泌抗体的异质性的方法。
wo20120147053公开了降低通过细胞培养获得的抗体的异质性的方法。
us9062337公开了利用肽酰甘氨酸α酰胺化单加氧酶(peptidylglycinealphaamidatingmonooxigenase)来截短肽的c末端残基。
多种现有技术文献还公开了用于纯化和生产治疗性蛋白的酶的固定化。chemuru等，biopolymers2014年3月；102(2):206-221公开了使用固定在琼脂糖珠上的羧肽酶b去除aβ肽的lys残基。
kudryavtseva等，pharmchemj(1995)29:70公开了将胰蛋白酶和羧肽酶b固定在改性二氧化硅上以将胰岛素原转化为胰岛素。yasuhara和ohashi，applbiochembiotechnol(1994)44:151公开了将羧基肽酶原b(pocarboxypeptidaseb)固定在琼脂糖凝胶上以除去肽的c末端残基。
us9657056公开了用于制造治疗性蛋白药物物质的整合且连续的方法，其中来自灌注生物反应器的液体培养基被转移到mccs1上以在四个柱中的前三个柱上捕获，并且来自这些柱的洗脱物在第四个柱上上样并孵育用于病毒灭活。将含有重组治疗性蛋白的mccs1的洗脱物连续进样到第二个多柱层析系统(mccs2)中；并且使用mccs2纯化和精细纯化(polishing)重组治疗性蛋白。
去除来自c-末端残基的异质性通常在补料分批培养中通过将羧肽酶直接添加到生物反应器的培养基中进行或在层析步骤后立即进行。然而，添加酶需要在孵育时间、温度、ph等方面的大量优化步骤。此外，酶的高成本导致总体工艺成本的增加。
由于如稳态操作、小设备尺寸、高容积生产率、流线型的工艺流程、低循环时间和降低的资金成本等各种优点，连续生物处理最近获得了大量关注。
尽管在现有技术中已经公开了许多用于降低治疗性蛋白的异质性的方法，但是没有一个描述用于生产具有降低的异质性的治疗性蛋白的连续方法。现有技术也没有提供能够在纯化前降低蛋白的异质性的方法。
技术实现要素：
本发明满足了现有需求以及其他需求，并且大体上克服了现有技术中发现的缺陷。
本文中的所有出版物均并入引作参考，其程度如同指明每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地并入引作参考。当并入的参考中术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，采用本文提供的该术语的定义，而不采用参考中该术语的定义。
发明目的
本公开的一个目的是提供一种生物制造方法，其能够连续生产具有降低的异质性的治疗性蛋白。
本公开的另一个目的是提供一种连续方法，其能够在纯化步骤之前降低治疗性蛋白的异质性。
本公开的另一个目的是提供一种用于降低治疗性蛋白的异质性而不损害治疗性蛋白生产的总产率的连续方法。
本公开的又一个另外的目的是提供高度灵活且经济的生物制造方法，其可以用于连续生产具有降低的异质性的治疗性蛋白。
概述
本公开的方面涉及能够连续生产具有降低的异质性的治疗性蛋白的生物制造方法。本文公开的生物制造方法利用多柱层析系统，该多柱层析系统进行降低治疗性蛋白的异质性、捕获治疗性蛋白和灭活病毒、纯化治疗性蛋白和精细纯化纯化的治疗性蛋白的单元操作。
在一个方面，本公开提供了用于降低治疗性蛋白的异质性的连续方法，所述方法包括在单个多柱层析系统中减少治疗性蛋白的一种或多种碱性亚型。
在一个实施方案中，所述多柱层析系统可以包括至少两个层析柱。
在一个实施方案中，所述多柱层析系统可以包括含有固定在琼脂糖凝胶上的羧肽酶b的柱。
在另一个方面，本公开提供了一种用于降低治疗性蛋白的异质性的连续方法，所述方法可以包括以下步骤：
(a)提供包括第一柱、第二柱、第三柱和第四柱的多柱层析系统；
(b)将包含治疗性蛋白的细胞培养收获物进样到第一柱中，从而降低所述治疗性蛋白的异质性；其中所述第一柱包含固定在琼脂糖凝胶上的羧肽酶b，
(c)将来自第一柱的流通物进样到第二柱中，从而捕获第一柱的流通物中的所述治疗性蛋白；
(d)将来自第二柱的包含治疗性蛋白的洗脱物进样到第三柱中以纯化所述治疗性蛋白；以及
(e)将来自第三柱的包含治疗性蛋白的流通物进样到第四柱中以精细纯化所述治疗性蛋白。
在一个实施方案中，可以收集来自第二柱的包含治疗性蛋白的洗脱物并将其在低ph下保存在贮存器中用于病毒灭活。在病毒灭活后，在将来自第二柱的洗脱物进样到第三柱之前可以对其进行ph和电导率调节。
在一个实施方案中，在将来自第三柱的包含治疗性蛋白的流通物进样到第四柱之前，可以对所述流通物进行ph和电导率调节。
在一个实施方案中，所述多柱层析系统的所述第一柱、第二柱、第三柱和第四柱可以按串联依次连接或并联连接。
在一个实施方案中，所述第一柱通过降低治疗性蛋白的碱性亚型的比例来降低治疗性蛋白的异质性。
在一个实施方案中，所述第二柱可以是亲和层析柱。
在一个实施方案中，所述第三柱和所述第四柱中的每一个可以选自由阴离子交换层析柱、阳离子交换层析柱、疏水相互作用层析柱和多峰层析柱组成的组。
在一个实施方案中，可以通过本公开的方法制备的治疗性蛋白或用于本公开的方法的治疗性蛋白可以包括但不限于抗体、抗体片段、单克隆抗体、酶、工程化蛋白、免疫原性蛋白、蛋白片段、免疫球蛋白及其任意组合。
根据本公开的实施方案，可以将由本公开的方法处理的治疗性蛋白或由本公开的方法得到的治疗性蛋白配制成药物组合物而无需任何进一步的纯化和/或净化步骤。
根据本公开的实施方案，在本发明的方法中使用的多柱层析系统可以以连续模式和在稳态下操作。
从以下优选实施方案的详细描述中，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显。
附图说明
包括了附图以提供对本公开的进一步理解，并且附图并入本说明书中并且构成本说明书的一部分。附图示出了本公开的示例性实施方案，并且与说明书一起用于解释本公开的原理。
图1示出了根据本公开的实施方案，用于在四个柱上连续处理治疗性蛋白的示例性工艺流程。
图2显示了在一个纯化系统中连续连接的两个柱的色谱图。
图3显示了针对maba以连续模式、大约25分钟的rt运行的之后接有蛋白a柱的cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱的色谱图谱。
图4显示了当在相同的流速下操作时柱1和柱2的连续处理设置。
图5显示了针对maba以连续模式、大约20分钟的rt运行的之后接有蛋白a柱的cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱的色谱图谱。
图6描绘了对照和cpb-pa洗脱物的wcex分析数据的叠加。
图7显示了当在不同的流速下操作时柱1和柱2的连续处理设置。
图8显示了针对maba以连续模式、2分钟的rt运行的之后接有蛋白a柱的cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱的色谱图谱。
图9描绘了对照和在2分钟rt下的cpb-pa洗脱物的wcex分析数据的叠加。
图10显示了对于maba，在柱1上分别在20分钟rt和2分钟rt下的cpb-pa洗脱物的wcex分析数据的叠加。
图11显示了针对mabb以连续模式、2分钟rt运行的之后接有蛋白a柱的cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱的色谱图谱。
图12显示了mabb对照和2分钟rt下mabbcpb-pa洗脱物的wcex分析数据的重加。
图13显示了在
图14显示了在
图15显示了在
图16描绘了针对单个上样密度的中和的cpb-pa洗脱物与对照的wcex分析数据的叠加。
图17描绘了针对maba，在柱1上的不同上样密度下的cpb-pa洗脱物与对照的wcex分析数据的叠加。
图18显示了用于连续处理maba的
图19显示了在
图20描绘了对照与来自连续处理的柱2洗脱物和柱4洗脱物的wcex分析数据的叠加。
具体实施方式
以下是本公开的实施方案的详细描述。实施方案详细到能清楚地传达本公开。然而，所提供的细节的量并非旨在限制实施方案的预期变化；相反，目的是涵盖落入由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的所有变型、等同物和替代物。
除非上下文另有要求，否则在整个说明书中，词语“包括(comprise)”及其变体(例如“包含(comprises)”和“含有(comprising)”应被解释为如同“包括，但不限于”的开放性的、包含性的意思。
贯穿本说明书提及“一个实施方案(oneembodiment)”或“一种实施方案(anembodiment)”意味着结合实施方案描述的特定的特征、结构或特性包括在至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明书在多个地方出现的短语“在一个实施方案中”或“在一种实施方案中”不一定都指的是相同的实施方案。此外，特定的特征、结构或特性可以在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合。
如在本文的描述和贯穿随后的权利要求中所使用的，“一个(a)”、“一种(an)”和“该”的含义包括复数指代，除非上下文另有明确说明。此外，如本文的描述中所使用的，“在……中(in)”的含义包括“在……中(in)”和“在……上(on)”，除非上下文另有明确说明。
在一些实施方案中，用于描述和要求保护本发明的某些实施方案的表示组分的量、性质(如浓度、工艺条件)等的数字应理解为在某些情况下通过术语“约”来调整。因此，在一些实施方案中，在书面描述中显示的数值参数是近似值，其可以根据通过特定的实施方案寻求获得的所需性质而变化。在一些实施方案中，数值参数应根据报告的有效数字的数值并且通过应用普通的舍入法来解释。尽管显示本发明的一些实施方案的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实施例中所示的数值是尽可能精确地报告的。
本文中数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值被并入说明书中，如同其在本文中单独引用一样。
本文所述的所有方法可以以合适的顺序进行，除非本文另有说明或上下文另有明显矛盾。关于本文中某些实施方案提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如“如”)的使用仅旨在更好地说明发明，而不对另外要求保护的发明的范围构成限制。说明书中的语言都不应被解释为表示任何对于本发明的实践必不可少的不要求保护的要素。
本文提供的发明的标题和摘要仅是为了方便，并不解释实施方案的范围或含义。
本文使用多种术语。如果权利要求中使用的术语没有在以下定义，则应该给予其相关领域的人员已经给予该术语的最广泛的定义，如在提交时在印刷出版物和授权专利中反映的。
本文所用的术语“连续方法”是指具有两个或更多个的一系列处理步骤的任何方法，其中来自上游步骤(单元操作)的输出连续转移至下游步骤(单元操作)直至最终层析步骤，并且其中在下一个处理步骤开始之前，上游处理步骤不必运行完成。在连续方法中，目标产品的某些部分总是在处理系统中移动。理想地，调节连续方法，以便在可能的最大程度上，连续方法的每个步骤或单元操作同时并且以基本相同的生产速率运行。以这种方式，循环时间的压缩被最大化并且实现了尽可能短的完成时间。
术语“连续转移”是指从上游单元操作移动到下游单元操作的产品流，意味着两个单元操作之间的连接或链接使得上游单元操作转移产品流(直接地或通过其他组件)到第二(下游)单元操作，并且下游单元操作在上游单元操作运行完成之前开始(即，对于整个处理运行(该两个单元操作构成其一部分)的至少一部分，该两个连续的单元操作同时处理流入它们的产品流)。
本文所用的术语“灌注细胞培养方法”是指灌注培养，其通过将新鲜培养基连续进料至生物反应器并持续除去无细胞的用过的培养基同时将细胞保留在反应器中来进行；因此，与连续培养物相比，可以在灌注培养物中获得更高的细胞密度，因为细胞通过细胞保留装置保留在反应器内。灌注速率取决于细胞系的需要、进料中营养素的浓度和毒性水平。
术语“细胞培养基”是指在培养细胞的背景下使用的所有种类的培养基。通常，细胞培养基包含氨基酸、作为能源的至少一种碳水化合物、微量元素、维生素、盐和可能的其他组分(例如，为了影响细胞生长和/或生产力和/或产品质量
术语“治疗性蛋白”是指已经从液体培养基中存在的污染蛋白质、脂质和核酸或从宿主细胞(例如，从哺乳动物、酵母或细菌宿主细胞)和生物污染物(例如，病毒和细菌污染物)充分纯化或分离并且可以配制成药物产品的重组蛋白。治疗性蛋白的代表性实例包括但不限于抗体、抗体片段、单克隆抗体、酶、工程化蛋白、免疫原性蛋白、蛋白片段和免疫球蛋白。
术语“抗体”是指血清的功能组分，通常作为多个分子的集合(多个抗体或多个免疫球蛋白、多个片段等)或作为单个分子被提及。抗体分子能够结合特定的抗原决定簇或与特定的抗原决定簇反应，这继而可以导致特异性免疫效应或机制。
术语“单克隆抗体”是指由细胞或细胞系的单个克隆产生并且由相同抗体分子组成的抗体。
术语“亚型”是指两种或更多种功能相似的蛋白中的任何一种，所述两种或更多种功能相似的蛋白具有相似但不相同的氨基酸序列，并且由不同基因或由来自相同基因、已移除不同外显子的rna转录物编码。
术语“异质性”是指其中分泌的抗体具有多种不连续的生物化学形式的现象，例如但不限于抗体重链中的一个或两个的羧基末端上具有一个或多个额外的氨基酸。
本文所用的术语“降低异质性”是指将异质形式的单克隆抗体转化为基本上纯的、同质形式的过程。
本文所用的术语“保留时间”是指一半的溶质的量从层析系统中洗脱的时间。它由柱的长度和溶质的迁移速度决定；其可以在1-30分钟的范围内。
术语“多柱层析系统”或“mccs”是指总共两个或更多个互连或切换的层析柱和/或层析膜的系统。多柱层析系统的非限制性实例包括包含总共两个或更多个互连或切换的层析柱和/或层析膜的周期性逆流层析系统(pcc)。
术语“洗脱物/滤液”是本领域的术语，是指从含有可检测量的重组治疗性蛋白的层析柱或层析膜排出的流体。
本公开的实施方案涉及能够连续生产具有降低的异质性的治疗性蛋白的生物制造方法。本文公开的生物制造方法利用多柱层析系统，所述多柱层析系统进行降低治疗性蛋白的异质性、捕获治疗性蛋白和灭活病毒、纯化治疗性蛋白和精细纯化纯化的治疗性蛋白的单元操作。
在一个方面，本公开提供了一种用于降低治疗性蛋白的异质性的连续方法，所述方法包括在单个多柱层析系统中降低治疗性蛋白的一种或多种碱性亚型。
在一个实施方案中，所述多柱层析系统可以包括至少两个层析柱。
在一个实施方案中，所述多柱层析系统可以包括含有固定在琼脂糖凝胶上的羧肽酶b的柱。
在另一个方面，本公开提供了一种用于降低治疗性蛋白的异质性的连续方法，所述方法可以包括以下步骤：
(a)提供包括第一柱、第二柱、第三柱和第四柱的多柱层析系统；
(b)将包含治疗性蛋白的细胞培养收获物进样到第一柱中，从而降低所述治疗性蛋白的异质性；其中所述第一柱包含固定在琼脂糖凝胶上的羧肽酶b，
(c)将来自第一柱的流通物进样到第二柱中，从而捕获第一柱的流通物中的所述治疗性蛋白；
(d)将来自第二柱的包含治疗性蛋白的洗脱物进样到第三柱中以纯化所述治疗性蛋白；以及
(e)将来自第三柱的包含治疗性蛋白的流通物进样到第四柱中以精细纯化所述治疗性蛋白。
在一个实施方案中，所述多柱层析系统的所述第一柱、第二柱、第三柱和第四柱可以按串联依次连接或并联连接。
在一个实施方案中，所述第一柱通过降低治疗性蛋白的碱性亚型的比例来降低治疗性蛋白的异质性。
在一个实施方案中，所述第二柱可以是亲和层析柱。
在一个实施方案中，所述第三柱和所述第四柱中的每一个可以选自由阴离子交换层析柱、阳离子交换层析柱、疏水相互作用层析柱和多峰层析柱组成的组。
根据本公开的实施方案，在本发明的方法中使用的多柱层析系统可以以连续模式和在稳态下操作。
在连续方法的一个优选的实施方案中，将包含具有降低的异质性的重组蛋白的来自第一柱的流通物收集或连续上样到第二柱上。收集来自第二柱的洗脱物，使得其ph值在低ph病毒灭活所需的范围内，并将其保持在贮存器中持续所需的孵育时间。在病毒灭活后，将来自多柱层析系统的第二柱的洗脱物的ph调节至通过在线(in-line)缓冲液/溶液添加上样到第三柱上所需的ph和电导率。将来自第二柱的洗脱物上样到预平衡的第三柱上用于中间纯化步骤，以除去其他杂质，例如hcp、hcdna和病毒。第三柱可以以流通或结合和洗脱模式操作。将来自第三柱的流通物收集在贮存器中，然后在上样到第四柱之前在系统上在线(inline)调节ph和电导率。如果样品条件与相应治疗性蛋白的连续方法的条件相同，则它也可以直接上样到第四柱上。然后，如果以结合和洗脱模式操作，则可以从第四柱洗脱治疗性蛋白，或者如果以流通模式操作，则可以收集流通物。因此，可以在多柱层析系统的单个单元操作上完成制备治疗性重组蛋白的整个连续方法。从该方法获得的治疗性蛋白是纯的、具有高容积生产率、流线型工艺流程、低循环时间和降低的资金成本。用于在四个柱上连续处理治疗性蛋白的示例性工艺流程示于图1。
在一个实施方案中，所述多柱层析系统的第一柱通过去除治疗性蛋白的碱性带电荷亚型来进行降低治疗性蛋白的异质性的单元操作。
在一个实施方案中，可以使用任何可在其上连接多个柱的层析系统进行异质性去除过程，所述层析系统包括aktaavant150、aktapcc2柱、aktapcc3柱、aktapcc4柱和biosmbpall。
在一个实施方案中，中间纯化和精细纯化步骤可以使用不同的层析方法以连续方式进行，所述层析方法例如阴离子交换层析、阳离子交换色谱、疏水相互作用层析或多峰层析。可以基于工艺参数、期望的质量、纯度、回收率和生产率来选择合适的层析。
可以通过本公开的方法制备的治疗性蛋白或用于本公开的方法的治疗性蛋白的实例可以包括但不限于抗体、抗体片段、单克隆抗体、酶、工程化蛋白、免疫原性蛋白、蛋白片段、免疫球蛋白及其任意组合。
在一个实施方案中，单克隆抗体选自天然存在的抗体或选自单克隆抗体、修饰的抗体、抗体的衍生物和抗体的片段的重组抗体或其任意组合。
在一个实施方案中，所述治疗性蛋白可以选自但不限于帕尼单抗、奥马珠单抗(omalizumab)、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗、阿克托克单抗(actoxumab)、阿达木单抗、阿德木单抗(adecatumumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、阿芙土珠单抗(afutuzumab)、阿拉西马单抗(alacizumab)、阿拉西马单抗(alacizumab)、阿仑单抗、阿利库单抗(alirocumab)、阿妥莫单抗、阿麦妥昔单抗(amatuximab)、阿麦妥昔单抗(amatuximab)、anatumomab、安鲁单抗(anrukinzumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿西莫单抗、阿缇努单抗(atinumab)、托珠单抗、basilizimab、贝妥莫单抗、贝利单抗(belimumab)、贝伐珠单抗、贝索单抗(besilesomab)、bezlotoxumab、比西单抗、博纳吐单抗(blinatumomab)、康纳单抗(canakinumab)、赛妥珠单抗(canakinumab)、西妥昔单抗、西妥木单抗(cixutumumab)、达克珠单抗(daclizumab)、地诺单抗(denosumab)、依库丽单抗(eculizumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、依芬古单抗(efungumab)、epratuzumab、厄妥索单抗(ertumaxomab)、埃达珠单抗(etaracizumab)、figitumumab、戈利木单抗(golimumab)、替坦异贝莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、伊戈伏单抗(igovomab)、英加妥珠单抗(imgatuzumab)、英夫利西单抗(infliximab)、伊诺莫单抗、伊珠单抗(inotuzumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、来瑞珠单抗(lebrikizumab)、moxetumomab、那他珠单抗、纳武单抗(nivolumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗、苏金单抗、托珠单抗、托西莫单抗(tositumomab)、tralokinumab、妥可妥珠单抗(tucotuzumab)、曲妥珠单抗、优特克单抗(ustekinumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、zatuximab、酶(例如，半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶)、myozyme或伊米苷酶(cerezyme))、蛋白(例如，人促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(tnf)或干扰素α或β)或免疫原性或抗原蛋白或蛋白片段(例如，用于疫苗的蛋白)、阿糖苷酶α(alglucosidasealfa)、拉罗尼酶(laronidase)、阿巴西普(abatacept)、加硫酶、促黄体素α、抗血友病因子、半乳糖苷酶β(agalsidasebeta)、干扰素β-1a、达依泊汀α(darbepoetinalfa)、替奈普酶、依那西普、凝血因子ix、促卵泡激素、干扰素β-1a、伊米苷酶、链道酶α、依泊汀α(epoetinalfa)、胰岛素或胰岛素类似物、美卡舍明、因子viii、因子viia、抗凝血酶iii、蛋白c、人白蛋白、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白介素-11、拉罗尼酶(laronidase)、idursuphase、galsulphase、α-1-蛋白酶抑制剂、乳糖酶、腺苷脱氨酶、组织纤溶酶原激活物、促甲状腺激素α、酸性β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、神经氨酸酶、己糖胺酶a和己糖胺酶b。
在优选的实施方案中，治疗性蛋白的培养基可以源自任何来源。例如，但不限于，来自重组细胞培养物(例如，重组细菌、酵母或哺乳动物细胞培养物)。培养基可以获自补料分批细胞培养物、含有分泌重组治疗性蛋白的细胞的培养物的补料分批生物反应器或灌注细胞培养物。液体培养基也可以是来自分泌重组治疗性蛋白的细菌或酵母细胞的培养物的澄清液体培养基。
在本公开的一个实施方案中，单克隆抗体重链上的c-末端赖氨酸残基可以通过将从灌注细胞培养物回收的收获物通过具有固定在琼脂糖凝胶上的羧肽酶b酶的柱子而在连续过程中截短。将由所述反应产生的均质收获物以连续方式进一步转移至亲和层析柱，用于进一步纯化单克隆抗体。
在本公开的一个实施方案中，本文公开的连续方法可以降低减少单克隆抗体的c末端残基所需的酶的量。
在本公开的一个实施方案中，通过交替切向过滤(alternativetangentialfiltration)连续来自生物反应器的收获的细胞培养液可以在一定ph下上样到羧肽酶b固定化柱上，然后可以将它连续上样到连续层析系统中串联连接的亲和柱或在mccs上串联或并联连接的亲和柱上。
在某些优选的实施方案中，培养的细胞中的蛋白浓度在50-2500mg/l收获的细胞培养液的浓度范围内。
在一个实施方案中，单克隆抗体的碱性亚型可以减少50-100％。
根据本公开的实施方案，可以将由本公开的方法处理的治疗性蛋白或/由本公开的方法得到的治疗性蛋白配制成药物组合物而无需任何进一步的纯化和/或净化步骤。
根据本公开的实施方案，本文公开的方法形成用于治疗性蛋白的连续生物制造系统。
本公开还提供了用于羧肽酶偶联的琼脂糖凝胶柱的树脂的制备方法和用于处理治疗性蛋白的树脂的稳定性。
实施例
通过以下实施例进一步说明本公开，这些实施例决不应被解释为进一步限制。本领域技术人员将容易理解，所描述的具体方法和结果仅仅是说明性的。
实施例1：用于该方法的树脂的制备
通过以下方法制备树脂：
1)将cnbr活化的sepharosetm4b冻干粉末在水中溶胀并用1mmhcl洗涤。用0.1m碳酸氢钠缓冲液(ph10.0)进一步洗涤树脂。
2)将缓冲液交换的酶羧肽酶b与树脂以2:1(cpb:树脂)的比例在ph10.0下温育，在2-8℃下温和搅拌过夜。
3)使反应混合物达到环境温度，并以4mg/ml偶联树脂的比例加入硼氢化钠。将悬浮液在环境温度下温育1小时。
4)将树脂装载到柱上，并用50mm磷酸钠缓冲液(ph7.0)充分洗涤。
5)在使用前，将柱用20mmtrishcl，150mmnacl，ph9.0进一步洗涤。
自有的cpb-cnbr活化的sepharosetm4b树脂的稳定性和储存：
发现该树脂尽管经过很多次循环在超过一年内是稳定的，当在2-8℃下储存时仍然可用。该树脂可在室温下用于连续处理，用于连续处理而不降低性能。
实施例2：用于减少抗体变体的方法
在一个纯化系统中连续连接两个柱，其中cpb-sepharose柱的入口连接到系统，并且该柱的出口用作蛋白a柱的入口。将来自cpb-sepharose柱的流通物直接上样到蛋白a柱上用于捕获步骤。最后使用洗脱缓冲液洗脱蛋白(图2)。
1.将cpb-sepharose柱与亲和柱串联连接，将来自灌注细胞培养物的澄清的细胞培养收获物上样到ph7.0的预平衡的柱上，其中在柱1上可以将其在ph6.5-9.0下平衡超过约25分钟的接触时间。
2.将来自cpb-sepharose柱的流通物直接上样到与cpb-sepharose树脂的出口连接的亲和柱上，用于捕获治疗性蛋白。
3.在第二柱(亲和柱)上捕获的抗体最后用0.1m乙酸(ph3.0)洗脱，并用2mtris碱中和。
用来自灌注生物反应器的相同收获物进行一次对照运行，直接上样到蛋白a上用于捕获步骤。通过wcex-hplc分析两种蛋白a洗脱样品以分析带电荷变体。
图2显示了在一个纯化系统中连续连接的两个柱的色谱图。
图3显示了针对maba以连续模式、大约25分钟的rt运行之后接有蛋白a柱的cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱的色谱图谱。
实施例3：治疗性蛋白(maba)的连续处理
保留时间研究1：
由于初期的层析运行是在柱1上以大约25分钟的接触时间进行的，因此多进行了几次运行以评估获得治疗性蛋白异质性的最佳降低的最小接触时间。
使用之后接有蛋白a(mabselectsuretmpcc)柱(柱2，cv＝1ml)的自有cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱(柱1，cv＝10ml)(串联的cpb-pa)以连续模式进行层析运行(图4)。该过程在aktaavant150过程层析系统(aktaavant150processchromatographysystem)(gehealthcare)上进行，治疗性蛋白(maba)澄清的细胞培养液(约40mg)的流速为0.5ml/min，分别在柱1上保持20分钟的保留时间，在柱2上保持2分钟的保留时间。aktaavant系统可以用aktapcc系统代替。
图4显示了当在相同的流速下操作时柱1和柱2的连续处理设置。
将中和的样品(cpb-pa洗脱物)与对照(仅蛋白a洗脱，没有cpb)一起进行wcex分析(图5)。
图5显示了针对maba以连续模式、20分钟rt运行的之后接有蛋白a柱的cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱的色谱图谱。
如在wcex分析比较数据中所示，与对照相比，cpb-pa洗脱物显示出maba中碱性变体的消化/去除(图6)。
图6显示了对照和cpb-pa洗脱物的wcex分析数据的叠加。该实验得出结论，柱上的cpb在20分钟保留时间下显示出活性或对碱性变体的切割/消化。
保留时间研究2：
为了评估柱上的最小保留时间(rt)，在cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱(柱1)上将流速从0.5ml/min改变为10ml/min，保持rt为2分钟，而在蛋白a柱(柱2)上的流速为0.5ml/min，保持rt为2分钟。在这种情况下，收集柱1的流通物，然后以连续模式再上样到柱2上，以便在柱体积不同时保持不同的rt和流速(图7)。
图7显示了当在不同的流速下操作时柱1和柱2的连续处理设置。将中和的样品(2分钟rt的cpb-pa洗脱物)与对照(仅蛋白a洗脱，没有cpb)和20分钟rt下的cpb-pa洗脱物一起进行wcex分析。(图8)。
图8显示了针对maba以连续模式、2分钟rt运行的之后接有蛋白a柱的cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱的色谱图谱。
如在wcex分析比较数据中所示，与对照相比，在柱1上同样为2分钟rt的cpb-pa洗脱物显示出maba中碱性变体的消化/去除(图9)。
图9显示了对于对照和在2分钟rt下的cpb-pa洗脱物的wcex分析数据的叠加。
两种不同rt下减少的比较
在柱1上在2分钟保留时间下，消化与柱1上在20分钟rt下的消化显著相当(图10)。图10显示了对于maba，在柱1上分别在20分钟rt和2分钟rt下的cpb-pa洗脱物的wcex分析数据的叠加。因此，层析运行在2分钟保留时间下也可以连续操作。还可以评估低于2分钟的保留时间。
实施例4：用于减少mabb的碱性亚型的方法
由于羧肽酶b优先作用于碱性氨基酸，例如精氨酸和赖氨酸。因此，该树脂可以用于去除属于任何类别的igg或单克隆抗体的带电荷亚型。以连续模式在第一步自身中除去这些带电荷亚型可以产生具有高质量、高纯度和高回收率的产物。使用之后接有蛋白a柱的cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱以连续模式、2分钟保留时间评估带电荷亚型/碱性变体的去除的另一种mab模型是mabb(图11)。
图11显示了针对mabb以连续模式、2分钟rt运行的之后接有蛋白a柱的cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱的色谱图谱。
如在wcex分析比较数据中所示，与对照(仅中和的蛋白a洗脱物，没有cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱)相比，cpb-pa洗脱物显示出mabb中的碱性变体的消化/去除(图12)。因此，可以得出结论，该策略适用于属于所有igg类别的任何单克隆抗体的碱性带电荷变体的去除。
实施例5：用于在三个柱上以不同上样密度减少maba的碱性亚型的方法：
为了评估cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱的最大上样容量，使用表1中提到的maba澄清的细胞培养液以连续模式评估不同的上样密度。使用之后接有蛋白a(mabselectsurelx)柱(柱2)的自有cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱(柱1)(串联的cpb-pa)以连续模式进行层析运行。该过程在
表1：柱1和柱2上的上样详细说明
*初期进行了按照序号1中提到的条件的层析运行(图5)
π对照运行
如表1中所提到的，仅使用蛋白a柱进行对照运行以进行wcex分析比较。按照序号3、4、5和6所提到的条件连续地进行层析运行，其中柱1上的上样密度分别为10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml和80mg/ml。在该层析运行中，将一个cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱(柱1)和两个蛋白a柱(柱2)平行连接，并且柱1和柱2串联运行(图13和图14，显示色谱图谱)。对中和的样品wcex分析以与对照比较。
图13显示了在
图14显示了在
图15显示了在
图16显示了针对单个上样密度的中和的cpb-pa洗脱物与对照的wcex分析数据的叠加。如在图16中所观察到的，当与对照相比时，树脂显示出活性或降低碱性带电荷亚型。因此，在柱1上的上样密度超过80mg/ml下，该树脂仍可以发挥作用，其中，如果蛋白a树脂的柱体积仍与cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱保持相同，那么，将需要平行的2个蛋白a柱以满足一个柱1的输出量。
图17显示了针对maba，在柱1上不同上样密度下的cpb-pa洗脱物与对照的wcex分析数据的叠加。当比较针对所有不同上样密度的wcex分析数据的叠加时，观察到尽管所有样品中的碱性带电荷亚型减少，但是在柱1上80mg/ml的上样密度的情况下观察到酸性变体的稍微增加(图17)。这可能是由于较高的上样密度，即较高的蛋白质:cpb比率或由于较长的上样时间引起的。但是，由于在所有运行中的保留时间相同(1.7分钟)，以及具有表1中提到的条件1(其中柱1的上样时间为80分钟)的一个相当的数据，酸性亚型没有增加(图5)。因此，可能的原因可能是柱1上上样的总蛋白当在柱2上向前移动(流通模式)时，随着时间流逝和上样蛋白的数量增加，酸性变体可能逐渐增加，并在柱2上累积(结合和洗脱模式)，洗脱的总蛋白含有增加的酸性形式。因此，如果在我们获得所需质量和数量的运行之间用含有50mm乙酸钠(ph5.0)、ph不低于ph3.0的缓冲液或其他类似缓冲液再生柱1将更好。
实施例6：在一个单元操作中在4个柱上减少治疗性蛋白(maba)的异质性的连续方法
在
图18显示了用于连续处理maba的
以下示出了使用的柱缓冲液(columnwisebuffer)。为了所需的质量和生产率，也可以使用具有相同的ph和电导率范围的其他缓冲液组合。
1)柱1：柱体积＝8.5ml，上样密度＝60mg/ml
平衡和上样后洗涤：50mmtrsihcl，ph7.0±0.2，电导率4.0±1.0ms/cm
再生：50mm乙酸钠，ph5.0±0.2，电导率3.6±1.0ms/cm
2)柱2：柱体积＝22ml，上样密度＝23mg/ml
平衡和上样后洗涤：50mmtrsihcl，ph7.0±0.2，电导率4.0±1.0ms/cm
洗脱：100mm乙酸，ph3.0±0.2
再生：500mm氢氧化钠
3)柱3：柱体积＝20ml，上样密度＝25mg/ml
平衡和上样后洗涤：50mmtrsihcl，ph7.0±0.2，电导率4.0±1.0ms/cm
再生：500mm氢氧化钠
4)柱4：柱体积＝20ml，上样密度＝25mg/ml
平衡和上样后洗涤：50mm乙酸钠，ph5.0±0.2，电导率3.6±1.0ms/cm
洗脱：50mm乙酸钠，150mmnaclph5.0电导率15.0±1.0ms/cm
再生：500mm氢氧化钠
在该连续方法中，柱1在8.5mlcv柱上以60mg/ml的上样密度进行上样，并且将流通物连续通过柱2以捕获maba。用cv体积的100mm乙酸洗脱结合的蛋白，使得洗脱物的ph等于病毒灭活所需的ph。在ph≤3.6下进行病毒灭活，保持1小时，然后通过在线添加所需体积的2mtris碱进行蛋白a洗脱物的中和。中和的蛋白a洗脱物的ph和电导率等于上样到柱3上所需的ph和电导率，柱3要求hcp、hcdna和病毒去除，ph7.0±0.2且电导率小于10ms/cm，并且发现约为4.5±1.0ms/cm。将该中和的蛋白a洗脱物通过预平衡的柱3，以流通模式操作，并收集其流通物。当柱4在ph5.0和电导率≤6.0ms/cm(但不仅仅限于这些条件)下以结合和洗脱模式操作时，再次在线添加所需量的酸，在该案例中进行100mm乙酸的在线添加作为柱4上样的上样准备步骤。发现上样的ph为5.0±0.2且电导率≤3.5ms/cm并上样在柱4上，并用50mm乙酸钠、150mmnacl、ph5.0、电导率15.0±1.0ms/cm洗脱结合的蛋白并且将样品进行wcex分析用于在去除带电荷亚型上的比较。进行所有柱的再生和下一次运行的准备。色谱图谱和分析数据分别显示在图18和19中。
图19显示了在
柱2洗脱物样品(中和的蛋白a洗脱样品)和柱4洗脱物样品二者与属于上样密度实验的对照样品一起进行wcex分析(图20)。
图20显示了对照与来自连续处理的柱2洗脱物和柱4洗脱物的wcex分析数据的叠加。柱2和柱4显示相同的wcex谱，并显示出碱性亚型的去除，其中与在80mg/ml的上样密度下观察到的相比，该上样密度(60mg/ml)下的酸性变体没有增加。因此，该自有cpb-cnbr活化的sepharosetm4b柱的最佳操作条件可包括≤80mg/ml的上样密度，对于maba的约为1-2小时的上样时间，以及≥1.7分钟的rt，但不限于这些条件，在这些条件之后，可以在运行之间引入再生以获得一致的结果。
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