用作对流感嗜血杆菌b型的疫苗的稳定耐水解的合成的聚核糖基核糖醇磷酸衍生物的制作方法

本发明提供稳定的合成糖，其是hib聚核糖基核糖醇磷酸(prp)衍生物及其缀合物。所述糖、所述缀合物及其药物组合物耐水解、长期稳定并且用于预防和/或治疗与流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)有关的疾病，和更特别是与流感嗜血杆菌b型有关的疾病。

发明背景

流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)b型(hib)是世界性的严重人类健康问题，其引起各种疾病包括脑膜炎、肺炎、会厌炎和呼吸道的其它疾病，特别是在5岁以下的儿童当中如此。疾病的存活者中30％具有从听觉问题到精神发育迟滞的各种后遗症。

纯化的流感嗜血杆菌荚膜多糖能够在成人中诱导保护性免疫。然而，免疫应答在儿童中很劣并且在2岁以下的婴儿中实际上不存在。从hib细菌分离的荚膜多糖具有核糖基核糖醇磷酸重复单元：

预防hib感染的各种疫苗已被开发并且由下述组成：合成的聚核糖基核糖醇磷酸(prp)或缀合至载体蛋白质的不同长度的合成prp的混合物(wo9210936a1，ep0276516a2，ep0320942a2，wo0116146a1)。数种疫苗最近在usa和其它地区被批准用于儿科应用。

合成hib低聚糖据报告是从细菌高成本和繁复分离hibprp的有用备择(in2013/del/02989，us6,765,091，wo2016044164a1和ep0320942a)。在journalofcarbohydratechemistry1992,11,265中描述hib低聚糖的固相合成。乙酰化的和甲基化的hib二糖在carbohydrateresearch1979,73,59中通过质谱测定法研究。

如上文所提及，聚核糖基核糖醇磷酸(prp)是各种疫苗中的活性成分，其已被证明成功预防由流感嗜血杆菌b型引起的疾病(hib)。

需要hib疫苗的长期稳定性来保持所述疫苗的免疫原性并且这能够是hib-缀合物疫苗的挑战，原因是prp聚合物中磷酸二酯键对水解裂解的潜在易感性。通常，疫苗荚膜多糖的代谢降低疫苗的免疫原性。已知的是，用作佐剂的氧化铝加速prp水解和prp解聚，导致hib疫苗不稳定和降低hib疫苗的免疫原性(vaccine19,1999,p1169-1178)。

导致的结果是，可商购的经批准的hib疫苗需要储存在2℃-8℃和通常在这些条件仅稳定24-36个月。此外，液体hib疫苗配制剂易受冷冻破坏，其原因假定是液体配制剂中存在的铝盐。冷冻破坏的敏感性阻碍必须被冷却的液体hib疫苗的贮藏和运输，原因是必须避免使用冰从而预防冷冻。

还报告的是，包含于可商购疫苗中的纯化的细菌细胞壁的天然多糖组分可以引起b受体抑制，导致增加的支气管狭窄。另外熟知的是，hib疫苗在3岁以下的婴儿中增加癫痫发作症状的风险。从而需要新hib疫苗，其具有增强的免疫原性、给予较小剂量和降低的副作用。

本发明的目的是提供hib聚核糖基核糖醇磷酸(prp)衍生物及其缀合物的合成糖，其应是在液体配制剂中贮存稳定的、耐水解的和代谢稳定的。所述糖、所述缀合物及其药物组合物具有增强的免疫原性和从而应特别地用于预防和/或治疗与流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)有关的疾病，和更特别是与流感嗜血杆菌b型有关的疾病。

本发明的目的通过独立权利要求的教导来解决。本发明的其它有利特征、方面和细节通过本申请的从属权利要求、说明书、附图和实施例变得明显。

发明详述

本发明的目的是提供通式(i)的糖

其中

a是

b是c是

d是e是

f是----o----,

t¹和t²代表-h，-l-nh2或-l-cooh；其中如果t¹是-l-nh2或-l-cooh则t²是-h而如果t¹是-h则t²是-l-nh2或-l-cooh，或其中t¹和t²中一个代表-h而t¹和t²中另一个代表-l-nh2或-l-cooh；

x1、x2、x3、x4、x5和x6相互独立地代表―h，―oh，―f，―cl，―ch3，―c2h5，―cn，―och3，―oc2h5，―och(ch3)2，―och2f，-ocf3，-oco-n(ch3)2，-o-c2h4-o-ch3，-o-ch2-cf3并且x1、x2、x3、x4、x5和x6中至少一个不是-oh；优选x1、x2、x3、x4、x5和x6中至少50％不是-oh；更优选x1、x2、x3、x4、x5和x6中至少两个不是-oh；最优选x1、x2、x3、x4、x5和x6全部不是-oh；

n是选自1，2，3或4的整数；

n1，n2，n3和n4相互独立地选自0和1；和n1+n2+n3+n4≥1；

条件是如果n1+n2+n3+n4＝1和如果n＝1和如果

a是则

f是

和

条件是如果n1+n2+n3+n4＝1和如果n＝1和如果

f是----o----，或则

a是

和

l选自：-l^a-，-l^a-l^e-，-l^a-l^b-l^e-，-l^a-l^b-l^d-l^c-l^e-，-l^a-l^d-l^e-，

其中-l^a-选自：-(ch2)a-，-(cf2)a-，-(ch2-ch2-o)a-c2h4-，-(ch2-ch2-o)a-ch2-，-(cr¹⁰r¹¹)a-,

-l^b-和-l^c-相互独立地选自：-o-，-s-，-nh-c(o)-nh-，-nh-c(s)-nh-，-nh-c(o)-，-c(o)-nh-，-s-s-，-nh-c(o)-o-，-nr⁹-，-nr¹⁸-，-so2-，-op(o)(oh)-o-,

-l^d-代表-(ch2)d-，-(cf2)d-，-(cr¹²r¹³)d-，-(ch2-ch2-o)d-c2h4-，-(ch2-ch2-o)d-ch2-,

-l^e-选自：-(ch2)e1-，-(cf2)e1-，-c2h4-(o-ch2-ch2)e2-，-ch2-(o-ch2-ch2)e2-，-(ch2)e1-o-(ch2)e2-，-(ch2)e1-s-(ch2)e2-，-(cr¹⁴r¹⁵)e1-，-(cr¹⁴r¹⁵)e1-o-(cr²¹r²²)e2-，-(cr¹⁴r¹⁵)e1-s-(cr²¹r²²)e2-,

r⁹和r¹⁸相互独立地选自：-ch3，-c2h5，-c3h7和-c(o)ch3；

r¹⁰，r¹¹，r¹²，r¹³，r¹⁴，r¹⁵，r¹⁶，r¹⁷，r¹⁹，r²⁰，r²¹和r²²相互独立地选自：-h，-f，-cl，-ch3，-c2h5，-c3h7，-c5h9，-c6h13，-och3，-oc2h5，-ch2f，-chf2，-cf3，-c(o)-nh2，-sch3，-sc2h5，-nhc(o)ch3，-n(ch3)2和-n(c2h5)2；

a，d，e1和e2相互独立地是选自1，2，3，4，5，6，7，8，9和10的整数；

和上述化合物及其药学上可接受的盐的对映体，非对映体，对映体混合物，非对映体混合物，端基异构体，水合物，溶剂化物。

式(i)涵盖的最小糖是二糖，从而条件是如果n1+n2+n3+n4＝1和如果n＝1和如果

a是则

f是

和条件是如果n1+n2+n3+n4＝1和如果n＝1和如果f是----o----，或则

a是

的排除方式能用条件"通式(i)的糖是至少二糖"代替。

另选地，上文提及的排除条件能用下述条件代替：如果

n1+n2+n3+n4＝1则n≠1(n不等于1)和如果

n＝1则n1+n2+n3+n4≠1(n1+n2+n3+n4不等于1)。

从而，另选地优选的是通式(i)的糖

其中

a是

b是c是

d是e是

f是----o----,

t¹和t²代表-h，-l-nh2或-l-cooh；其中如果t¹是-l-nh2或-l-cooh则t²是-h而如果t¹是-h则t²是-l-nh2或-l-cooh，或其中t¹和t²中一个代表-h而t¹和t²中另一个代表-l-nh2或-l-cooh；

x1、x2、x3、x4、x5和x6相互独立地代表―h，―oh，―f，―cl，―ch3，―c2h5，―cn，―och3，―oc2h5，―och(ch3)2，―och2f，―ocf3，-oco-n(ch3)2，-o-c2h4-o-ch3，-o-ch2-cf3并且x1、x2、x3、x4、x5和x6中至少一个不是-oh；优选x1、x2、x3、x4、x5和x6中至少50％不是-oh；更优选x1、x2、x3、x4、x5和x6中80％不是-oh；最优选x1、x2、x3、x4、x5和x6全部不是-oh；

n是选自1，2，3或4的整数；

n1，n2，n3和n4相互独立地选自0和1；和n1+n2+n3+n4≥2；

l选自：-l^a-，-l^a-l^e-，-l^a-l^b-l^e-，-l^a-l^b-l^d-l^c-l^e-，-l^a-l^d-l^e-，

其中-l^a-选自：-(ch2)a-，-(cf2)a-，-(ch2-ch2-o)a-c2h4-，-(ch2-ch2-o)a-ch2-，-(cr¹⁰r¹¹)a-,

-l^b-和-l^c-相互独立地选自：-o-，-s-，-nh-c(o)-nh-，-nh-c(s)-nh-，-nh-c(o)-，-c(o)-nh-，-s-s-，-nh-c(o)-o-，-nr⁹-，-nr¹⁸-，-so2-,

-l^d-代表-(ch2)d-，-(cf2)d-，-(cr¹²r¹³)d-，-(ch2-ch2-o)d-c2h4-，-(ch2-ch2-o)d-ch2-,

-l^e-选自：-(ch2)e1-，-(cf2)e1-，-c2h4-(o-ch2-ch2)e2-，-ch2-(o-ch2-ch2)e2-，-(ch2)e1-o-(ch2)e2-，-(ch2)e1-s-(ch2)e2-，-(cr¹⁴r¹⁵)e1-，-(cr¹⁴r¹⁵)e1-o-(cr²¹r²²)e2-，-(cr¹⁴r¹⁵)e1-s-(cr²¹r²²)e2-,

r⁹和r¹⁸相互独立地选自：-ch3，-c2h5，-c3h7和-c(o)ch3；

r¹⁰，r¹¹，r¹²，r¹³，r¹⁴，r¹⁵，r¹⁶，r¹⁷，r¹⁹，r²⁰，r²¹和r²²相互独立地选自：-h，-f，-cl，-ch3，-c2h5，-c3h7，-c5h9，-c6h13，-och3，-oc2h5，-ch2f，-chf2，-cf3，-c(o)-nh2，-sch3，-sc2h5，-nhc(o)ch3，-n(ch3)2和-n(c2h5)2；

a，d，e1和e2相互独立地是选自1，2，3，4，5，6，7，8，9和10的整数；

和上述化合物及其药学上可接受的盐的对映体，非对映体，对映体混合物，非对映体混合物，端基异构体，水合物，溶剂化物。

更优选x1、x2、x3、x4、x5和x6相互独立地代表-h，-f，-ch3，-c2h5，-cn，-och3，-oc2h5，-och(ch3)2，-och2f，-ocf3，-oco-n(ch3)2，-o-c2h4-o-ch3，-o-ch2-cf3，和还更优选-h，-f，-ch3，-cn，-och3，-oc2h5，-och2f，-ocf3，-oco-n(ch3)2。

式(i)的糖是至少二糖，而优选至少三糖和通式(i)的糖更优选是至少四糖。

本发明的糖携带碱性和/或酸性基团和它们可以与有机或无机的酸或碱成盐。所述酸加成盐形成的适宜酸的实例是盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，乙酸，柠檬酸，草酸，丙二酸，水杨酸，对-氨水杨酸，苹果酸，富马酸，丁二酸，抗坏血酸，马来酸，磺酸，膦酸，高氯酸，硝酸，甲酸，丙酸，葡萄糖酸，乳酸，酒石酸，羟基马来酸，丙酮酸，苯乙酸，苯甲酸，对-氨苯甲酸，对-羟基苯甲酸，甲磺酸，乙磺酸，亚硝酸，羟基乙磺酸，乙二磺酸(ethylenesulphonicacid)，对-甲苯磺酸，萘磺酸，对氨基苯磺酸，樟脑磺酸，金鸡纳酸，扁桃酸，邻-甲基扁桃酸，氢-苯磺酸，苦味酸，己二酸，d-邻-甲苯基酒石酸，丙醇二酸，(o、m、p)-甲苯甲酸，萘基胺磺酸，和本领域技术人员熟知的其它无机酸或羧酸。通过将游离碱形式与足量的希望酸接触产生盐以常规方式制备盐。

适宜无机或有机碱的实例是例如naoh，koh，nh4oh，三烷基胺，四乙基胺，四烷基氢氧化铵，赖氨酸或精氨酸等。盐可以以常规方式用本领域熟知方法来制备，例如通过用选自上述组的碱溶液处理通式(i)糖的溶液。

最优选，通式(i)糖的磷酸基团与钠或三乙基铵阳离子构造盐或两性离子形式。

优选与无机阳离子的盐和更优选与具有单个正电荷无机阳离子比如li⁺、na⁺和k⁺的盐。最优选的是na⁺盐。

令人惊讶地发现，通式(i)的糖在碱性含水介质以及含有磷酸铝或氢氧化铝的悬浮液比如一般使用的佐剂alhydrogel中稳定。虽然天然hibprp在碱性含水介质中或在铝盐存在下在1天内水解，但是通式(i)的糖及其缀合物在数天内稳定、甚至在升高的温度下亦如此。增加的稳定性对其用于流感嗜血杆菌疫苗特别有利。从而，通式(i)的糖及其缀合物特别用于针对流感嗜血杆菌的贮存稳定的液体疫苗，其能够在环境温度储存并且不易受到可以例如在运输期间发生的冷冻破坏。

令人惊讶地，还发现缀合至免疫原性载体的通式(i)糖能够提供在人类和/或动物宿主中对流感嗜血杆菌的保护性免疫应答。额外地，缀合至免疫原性载体的通式(i)糖能够在兔子中引起实质的igm和igg应答，其在动力学和igg产生方面可以与相应的可商购hibprp缀合物疫苗比拟。缀合至免疫原性载体的通式(i)糖引起的抗体与天然hibprp交叉反应，从而指示这些抗体结合至流感嗜血杆菌并针对流感嗜血杆菌感染赋予保护的能力。

优选的是式(ii-1)的糖

其中

a是f是

b，c，d，e，l，n1，n2，n3和n4具有如前文所定义的含义；

n是1或2；和

x2-x6是-h，-f或-och3；

和上述化合物及其药学上可接受的盐的对映体，非对映体，对映体混合物，非对映体混合物，端基异构体，水合物，溶剂化物。

还优选的是式(ii-2)的糖

其中

a是f是----o----；

b，c，d，e，l，n1，n2，n3和n4具有如前文所定义的含义；

n是1或2；和

x1-x5是-h，-f或-och3；

和上述化合物及其药学上可接受的盐的对映体，非对映体，对映体混合物，非对映体混合物，端基异构体，水合物，溶剂化物。

还优选的是式(ii-3)的糖

h-f-[-(e)n4--(d)n3--(c)n2--(b)n1-]n-a-l-cooh

(ii-3)

其中

a是f是

b，c，d，e，l，n1，n2，n3和n4具有如前文所定义的含义；

n是1或2；和

x2-x6是-h，-f或-och3；

和上述化合物及其药学上可接受的盐的对映体，非对映体，对映体混合物，非对映体混合物，端基异构体，水合物，溶剂化物。

还优选的是式(ii-4)的糖

hooc-l-f-[-(e)n4--(d)n3--(c)n2--(b)n1-]n-a-h

(ii-4)

其中

a是f是----o----；

b，c，d，e，l，n1，n2，n3和n4具有如前文所定义的含义；

n是1或2；和

x1-x5是-h，-f或-och3；

和上述化合物及其药学上可接受的盐的对映体，非对映体，对映体混合物，非对映体混合物，端基异构体，水合物，溶剂化物。

还优选的是式(iii-1)的糖

其中

l具有如前文所定义的含义；

m是选自1至9的整数；和

xa是-h，-f或-och3。

还优选的是式(iii-2)的糖

其中

l具有如前文所定义的含义；

m是选自1至9的整数；和

xb是-h，-f或-och3。

更优选的是式(iv-1)的糖

其中

m是选自1至9的整数；和

xa是-h，-f或-och3。

还更优选的是式(iv-2)的糖

其中

m是选自1至9的整数；和

xb是-h，-f或-och3。

最优选的是选自下述的糖：

化合物8f：

合成途径

1.本发明糖的分步合成。

被适当保护基团保护的具有核糖基核糖醇骨架的二糖重复单元a1*-3-a1*-5、b1*-1-b1*-6、c*1-3，具有核糖或核糖醇骨架的半重复单元a1*-1、a1*-2、c1*-1、c1*-2，和包含连接体l的末端单元或t1*-t3*能够用于本发明糖的各种合成路线。a1*-1-a1*-5，b1*-1-b1*-6，c1*-1-c1*-3和t1*-t3*具有下述结构：

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；

p¹，p²，p³，p⁴和p⁵代表保护基团，其在结合至-o-的情况下不能等同于xi和/或xj；

l具有如前文所定义的含义；和

m⁺代表na⁺，k⁺，nh4⁺，h⁺或et3nh⁺。

本领域技术人员可以预见的是，在本发明通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)的糖及其与免疫原性载体的缀合物的合成中所用的p¹至p⁵保护基团在结合至氧原子的情况下不能等同于xi和/或xj。

有用合成路线中的某些可以通过组合上述构造单元而获得。

在本发明的实施方式中，下述构造单元a1*-3，b1*-1和t1*或t3*可以用于合成本发明糖(方案1)。

作为初始构造单元可以使用a1*-3。

合成方法a包括下述步骤：

i)提供初始构造单元a1*-3

其中xi代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹，p²和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi；

ii)从a1*-3除去p³基团；

iii)在步骤ii)之后于所得化合物的核糖c-3位引入膦酸氢根基团；

iv)在步骤iii)之后将构造单元b1*-1与所得化合物偶联

其中xi代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi；

v)任选地将步骤i)-iv)重复t次：在步骤iv)之后使用所得化合物而不是步骤i)中的初始构造单元a1*-3，其中t是整数0至20；

vi)在步骤v)之后从所得化合物除去p²保护基团；

vii)在步骤vi)之后将化合物t1*与所得化合物偶联；

viii)除去p¹和p³保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在上述合成方法a中，在步骤vii)中也能够使用化合物t3*而不是t1*。在步骤viii)中，除去p¹和p³保护基团和将叠氮基转化为胺基能够分步进行，但是优选在相同的反应条件下同时进行。

在半重复单元a1*-1用作初始构造单元而不是上述合成方法a中的初始构造单元a1*-3的情况下，则在步骤v)之后可以进行下述步骤vi′)和vii′)而不是步骤vi)-viii)：

vi′)在步骤v)之后将所得化合物与t2*偶联；

vii′)除去p¹和p³保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在上述合成方法a中在步骤v)之后半重复单元c1*-1能够用作终点构造单元，则可以进行下述步骤vi″)-xi″)而不是步骤vi)-viii)：

vi″)在步骤v)之后从所得化合物除去p³保护基团；

vii″)在步骤vi′)之后在所得化合物的核糖c-3位引入膦酸氢根基团；

viii″)在步骤vii″)之后将所得化合物与c1*-1偶联；

其中p¹和p⁵是保护基团；

ix″)在步骤viii″)之后从所得化合物除去p²保护基团；

x″)在步骤ix″)之后将化合物t1*与所得化合物偶联；

xi″)除去p¹和p⁵保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在合成方法a步骤iii)和vii″)中，还能够在步骤ii)或步骤vi″)之后所得化合物的核糖c-3位引入亚磷酰胺基团而不是膦酸氢根基团。t1*则用双(二异丙基氨基)苄氧基膦和ho-l-n3替换。

在本发明的又一实施方式中，下述构造单元a1*-4或a1*-5和b1*-1可以用于合成本发明糖(方案2)。

作为初始构造单元可以使用a1*-4或a1*-5。

合成方法b包括下述步骤：

i)提供初始构造单元a1*-4或a1*-5

其中l是连接体和具有如前文所定义的相同含义；

xi代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi；

其中l是连接体和具有如前文所定义的相同含义；

xi代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi；

ii)从a1*-4或a1*-5除去p³基团

iii)在步骤ii)之后于所得化合物的核糖c-3位引入膦酸氢根基团；

iv)在步骤iii)之后将构造单元b1*-1与所得化合物偶联

其中xi代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi；

v)任选地将步骤i)-iv)重复t次：在步骤iv)之后使用所得化合物而不是步骤i)中的初始构造单元a1*-4或a1*-5，其中t是整数0至20；

vi)除去p¹和p³保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在步骤vi)中，除去p¹和p³保护基团和将叠氮基转化为胺基能够分步进行，但是优选在相同的反应条件下同时进行。

在上述合成方法b中在步骤v)之后半重复单元c1*-1能够用作终点构造单元，则可以进行下述步骤vi″)-ix″)而不是步骤vi)：

vi″)在步骤v)之后从所得化合物除去p³保护基团；

vii``)在步骤vi″)之后于所得化合物的核糖c-3位引入膦酸氢根基团；

viii″)在步骤vii″)之后将所得化合物与c1*-1偶联；

其中p¹和p⁵是保护基团；

ix″)除去p¹和p⁵保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在合成方法b步骤iii)和vii″)中，还能够在步骤ii)或步骤vi″)之后所得化合物的核糖c-3位引入亚磷酰胺基团而不是膦酸氢根基团。初始构造单元a1*-5则用a1*-5'或a1*-5”替换。

方案2.通过合成方法b合成hib荚膜低聚糖衍生物

在本发明的实施方式中，下述构造单元a1*-3、b1*-1和t1*或t3*可以用于合成本发明糖(方案1)。

作为初始构造单元可以使用a1*-3。

合成方法c包括下述步骤：

i)提供初始构造单元a1*-3

其中xi代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹，p²和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi；

ii)从a1*-3除去p³基团；

iii)在步骤ii)之后于所得化合物的核糖c-3位引入膦酸氢根基团；

iv)在步骤iii)之后将构造单元b1*-1与所得化合物偶联

其中xi代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi；

v)任选地将步骤i)-iv)重复t次：在步骤iv)之后使用所得化合物而不是步骤i)中的初始构造单元a1*-3，其中t是整数0至20；

vi)在步骤v)之后从所得化合物除去p³保护基团；

vii)在步骤vi)之后将化合物t1*或t3*与所得化合物偶联；

viii)除去p¹和p²保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在步骤viii)中，除去p¹和p³保护基团和将叠氮基转化为胺基能够分步进行，但是优选在相同的反应条件下同时进行。

在上述合成方法c步骤i)中半重复单元a1*-1能够用作初始构造单元

而不是的a1*-3，则在步骤viii)中增加除去p⁴保护基团的步骤。

在上述合成方法c中在步骤v)之后半重复单元c1*-1能够用作终点构造单元，则可以进行下述步骤vi″)-xi″)而不是步骤vi)-viii)：

vi″)在步骤v)之后从所得化合物除去p³保护基团；

vii″)在步骤vi″)之后于所得化合物的核糖c-3位引入膦酸氢根基团；

viii″)在步骤vii″)之后将所得化合物与c1*-1偶联；

其中p¹和p⁵是保护基团；

ix″)在步骤viii″)之后从所得化合物除去p⁵保护基团；

x″)在步骤ix″)之后将化合物t1*或t3*与所得化合物偶联；

xi″)除去p¹保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在合成方法c步骤iii)和vii″)中，还能够在步骤ii)或步骤vi″)之后所得化合物的核糖c-3位引入亚磷酰胺基团而不是膦酸氢根基团。t1*则用双(二异丙基氨基)苄氧基膦和ho-l-n3替换。

在本发明的又一实施方式中，下述构造单元a1*-3b1*-1，和c1*-2或c1*-3可以用于合成本发明糖。

作为初始构造单元可以使用a1*-3。

合成方法d包括下述步骤：

i)提供初始构造单元a1*-3

其中l是连接体和具有如前文所定义的相同含义；

xi代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹，p²和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi；

ii)从a1*-3除去p³基团；

iii)在步骤ii)之后于所得化合物的核糖c-3位引入膦酸氢根基团；

iv)在步骤iii)之后将构造单元b1*-1与所得化合物偶联

其中xi代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi；

v)任选地将步骤i)-iv)重复t次：在步骤iv)之后使用所得化合物而不是步骤i)中的初始构造单元a1*-3，其中t是整数0至20；

vi)在步骤v)之后从所得化合物除去p³基团；

vii)在步骤vi)之后将构造单元c1*-2或c1*-3与所得化合物偶联

其中p¹是保护基团；

其中xj代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xj；

viii)除去p¹和p²保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在步骤viii)中，除去p¹和p²保护基团和将叠氮基转化为胺基能够分步进行，但是优选在相同的反应条件下同时进行。

在步骤iii)中，还能够在步骤ii)之后所得化合物的核糖c-3位引入亚磷酰胺基团而不是膦酸氢根基团。初始构造单元c1*-3则用c1*-3'或c1*-3”替换。

在一种本发明的实施方式中，由两个重复单元组成的下述构造单元用于通过[2+2]合成途径合成本发明糖：

合成方法e-1包括下述步骤(方案4)：

i)提供选自a2*-2，a2*-3或a2*-4的初始构造单元

其中l是连接体和具有如前文所定义的相同含义；

xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹代表保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；和

ii)将构造单元b2*-3与选自a2*-2，a2*-3或a2*-4的初始构造单元偶联

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

iii)在步骤ii)之后从所得化合物除去p³基团；

iv)在步骤iii)之后于所得化合物的核糖c-3位引入膦酸氢根；

v)任选地将步骤i)-iv)重复t次：在步骤iv)之后使用所得化合物而不是步骤i)的初始构造单元，其中t是0至10的整数；

vi)在步骤v)之后从所得化合物除去p¹和p³保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在步骤vi)中，除去p¹和p³保护基团和将叠氮基转化为胺基能够分步进行，但是优选在相同的反应条件下同时进行。

在合成方法e-1步骤v)之后，另外的构造单元b2*-4可以另选地在步骤v)之后与所得化合物偶联。在该情况下，合成方法e-1包括下述步骤而不是步骤vi)：

vi′)在步骤v)之后将构造单元b2*-4与所得化合物偶联；

其中xj代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p⁵是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xj；

vii′)在步骤vi′)之后从所得化合物除去p¹和p⁵保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

当然，b2*-3或b2*-4能够用作初始构造单元。在该情况下，备择合成方法e-2包括下述步骤：

i)提供选自b2*-3或b2*-4的初始构造单元

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

其中xj代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p⁵是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xj；

ii)将构造单元b2*-1与选自b2*-3或b2*-4的初始构造单元偶联

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p²是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

iii)在步骤ii)之后从所得化合物除去p²保护基团；

iv)任选地将步骤i)-iii)重复t次：在步骤iii)之后使用所得化合物而不是步骤i)的初始构造单元，其中t是0至10的整数；

v)在步骤iv)之后将所得化合物与选自a2*-2、a2*-3或a2*-4的构造单元偶联

其中l是连接体和具有如前文所定义的相同含义；

xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹代表保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和/或xj；

vi)在步骤v)之后从所得化合物除去p¹、p³和p⁵保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在步骤vi)中，除去p¹、p³和p⁵保护基团和将叠氮基转化为胺基能够分步进行，但是优选在相同的反应条件下同时进行。

备择合成方法e-3不同于合成方法e-1之处是使用亚磷酰胺而不是膦酸化学部分。从而，合成方法e-3包括下述步骤：

i)提供选自a2*-2”、a2*-3”或a2*-4”的初始构造单元

其中l是连接体和具有如前文所定义的相同含义；

xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹代表保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；和

ii)将构造单元b2*-3”与选自a2*-2”、a2*-3”或a2*-4”的初始构造单元偶联

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

iii)在步骤ii)之后从所得化合物除去p³基团；

iv)在步骤iii)之后于所得化合物的核糖c-3位引入亚磷酰胺基团；

v)任选地将步骤i)-iv)重复t次：在步骤iv)之后使用所得化合物而不是步骤i)的初始构造单元，其中t是0至10的整数；

vi)在步骤v)之后从所得化合物除去p¹和p³保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在步骤vi)中，除去p¹和p³保护基团和将叠氮基转化为胺基能够分步进行，但是优选在相同的反应条件下同时进行。

在合成方法e-3步骤v)之后，另外的构造单元b2*-4”可以在步骤v)之后另选地与所得化合物偶联。在该情况下，合成方法e-3包括下述步骤而不是步骤vi)：

vi′)在步骤v)之后将构造单元b2*-4”与所得化合物偶联；

其中xj代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p⁵是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xj；

vii′)在步骤vi′)之后从所得化合物除去p¹和p⁵保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

合成方法f-1包括下述步骤(方案5)：

i)提供选自a2*-1或b2*-1的初始构造单元

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹，p²和p⁴代表保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

ii)将构造单元b2*-3与选自a2*-1或b2*-1的初始构造单元偶联

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

iii)在步骤ii)之后从所得化合物除去p³基团；

iv)在步骤iii)之后于所得化合物的核糖c-3位引入膦酸氢根；

v)任选地将步骤i)-iv)重复t次：在步骤iii)之后使用所得化合物而不是步骤i)的初始构造单元，其中t是0至10的整数；

vi)偶联选自c2*-1、c2*-2、c2*-3或c2*-4的构造单元

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

vii)在步骤vi)之后从所得化合物除去p¹、p²、p³和p⁴保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在步骤vii)中，除去p¹、p²、p³和p⁴保护基团和将叠氮基转化为胺基能够分步进行，但是优选在相同的反应条件下同时进行。

当然，c2*-1，c2*-2，c2*-3，或c2*-4能够用作初始构造单元。在该情况下，备择合成方法f-2包括下述步骤：

i)提供选自c2*-1，c2*-2，c2*-3或c2*-4的初始构造单元

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

ii)将构造单元b2*-1与选自c2*-1，c2*-2，c2*-3或c2*-4的初始构造单元偶联

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p²是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

iii)在步骤ii)之后从所得化合物除去p²保护基团；

iv)任选地将步骤i)-iii)重复t次：在步骤iii)之后使用所得化合物而不是步骤i)的初始构造单元，其中t是0至10的整数；

v)偶联选自a2*-1或b2*-1的初始构造单元

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹，p²和p⁴代表保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

vi)在步骤v)之后从所得化合物除去p¹、p²、p³和p⁴保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在步骤vi)中，除去p¹、p²、p³和p⁴保护基团和将叠氮基转化为胺基能够分步进行，但是优选在相同的反应条件下同时进行。

此外，由两个重复单元组成的下述构造单元用于通过[2+2]合成途径合成本发明糖：

合成方法g-1包括下述步骤：

i)提供选自a2*-2′、a2*-3′或a2*-4′的初始构造单元

其中l是连接体和具有如前文所定义的相同含义；

xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹代表保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

ii)将构造单元b2*-3′与选自a2*-2′，a2*-3′或a2*-4′的初始构造单元偶联

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

iii)在步骤ii)之后从所得化合物除去p³基团；

iv)任选地将步骤i)-iii)重复t次：在步骤iii)之后使用所得化合物而不是步骤i)的初始构造单元，其中t是0至10的整数；

v)在步骤iv)之后从所得化合物除去p¹和p³保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在步骤v)中，除去p¹和p³保护基团和将叠氮基转化为胺基能够分步进行，但是优选在相同的反应条件下同时进行。

在合成方法g-1步骤iv)之后，另外的构造单元b2*-4′可以另选地在步骤v)之后与所得化合物偶联。在该情况下，合成方法g-1包括下述步骤而不是步骤vi)：

v′)在步骤vi)之后将构造单元b2*-4′与所得化合物偶联；

其中xj代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p⁵是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xj；

vi′)在步骤v′)之后从所得化合物除去p¹和p⁵保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

当然，b2*-3′或b2*-4′能够用作初始构造单元。在该情况下，备择合成方法g-2包括下述步骤：

i)提供选自b2*-3′或b2*-4′的初始构造单元

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

其中xj代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p⁵是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xj；

ii)将构造单元b2*-1′与选自b2*-3或b2*-4的初始构造单元偶联

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p²是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

iii)在步骤ii)之后从所得化合物除去p²保护基团；

iv)在步骤iii)之后于所得化合物的核糖醇c-5位引入膦酸氢根；

v)任选地将步骤i)-iv)重复t次：在步骤iv)之后使用所得化合物而不是步骤i)的初始构造单元，其中t是0至10的整数；

vi)在步骤v)之后将所得化合物与选自a2*-2′，a2*-3′或a2*-4′的构造单元偶联

其中l是连接体和具有如前文所定义的相同含义；

xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹代表保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

vii)在步骤vi)之后从所得化合物除去p¹、p³和p⁵保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在步骤vii)中，除去p¹、p³和p⁵保护基团和将叠氮基转化为胺基能够分步进行，但是优选在相同的反应条件下同时进行。

合成方法h-1包括下述步骤：

i)提供选自a2*-1′或b2*-1′的初始构造单元

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹，p²和p⁴代表保护基团；

ii)将构造单元b2*-3′与选自a2*-1′或b2*-1′的初始构造单元偶联

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团；

iii)在步骤ii)之后从所得化合物除去p³基团；

iv)任选地将步骤i)-iii)重复t次：在步骤iii)之后使用所得化合物而不是步骤i)的初始构造单元，其中t是0至10的整数；

v)在步骤iv)之后将所得化合物与选自c2*-1′，c2*-2′，c2*-3′或c2*-4′的构造单元偶联

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团；

vi)在步骤v)之后从所得化合物除去p¹、p²、p³和p⁴保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在步骤vi)中，除去p¹、p²、p³和p⁴保护基团和将叠氮基转化为胺基能够分步进行，但是优选在相同的反应条件下同时进行。

当然，c2*-1′，c2*-2′，c2*-3′或c2*-4′能够用作初始构造单元。在该情况下，备择合成方法h-2包括下述步骤：

i)提供选自c2*-1′，c2*-2′，c2*-3′或c2*-4′的初始构造单元

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

ii)将构造单元b2*-1′与选自c2*-1′，c2*-2′，c2*-3′或c2*-4′的初始构造单元偶联

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p²是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

iii)在步骤ii)之后从所得化合物除去p²保护基团；

iv)在步骤iii)之后于所得化合物的核糖醇c-5位引入膦酸氢根；

v)任选地将步骤i)-iv)重复t次：在步骤iii)之后使用所得化合物而不是步骤i)的初始构造单元，其中t是0至10的整数；

vi)在步骤v)之后将所得化合物与选自a2*-1′或b2*-1′的构造单元偶联

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹，p²和p⁴代表保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

vii)在步骤vi)之后从所得化合物除去p¹、p²、p³和p⁴保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在步骤vii)中，除去p¹、p²、p³和p⁴保护基团和将叠氮基转化为胺基能够分步进行，但是优选在相同的反应条件下同时进行。

合成方法j-1包括下述步骤：

i)提供初始构造单元b2*-1″

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹，p²和p³代表保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

ii)在初始构造单元b2*-1″的核糖c-3位引入亚磷酰胺基团；

iii)在步骤ii)之后将构造单元b2*-3″与所得化合物偶联；

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

iv)在步骤iii)之后从所得化合物除去p³基团；

v)任选地将步骤i)-iv)重复t次：在步骤iv)之后使用所得化合物而不是步骤iii)的构造单元b2*-3″，其中t是0至10的整数；

vi)在步骤v)之后将化合物ho-l-n3与所得化合物偶联；

vii)除去p¹、p²和p³保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在步骤vii)中，除去p¹、p²和p³保护基团和将叠氮基转化为胺基能够分步进行，或在相同反应条件同时进行。

合成方法j-2包括下述步骤：

i)提供初始构造单元b2*-1″′

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹，p²和p³代表保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

ii)在初始构造单元b2*-1″′的核糖c-3位引入亚磷酰胺基团；

iii)在步骤ii)之后将构造单元b2*-3″′与所得化合物偶联；

其中xi和xj相互独立地代表x1，x2，x3，x4，x5或x6；p¹和p³是保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

iv)在步骤iii)之后从所得化合物除去p³基团；

v)任选地将步骤i)-iv)重复t次：在步骤iv)之后使用所得化合物而不是步骤iii)的构造单元b2*-3″′，其中t是0至10的整数；

vi)在步骤v)之后将化合物ho-l-n3与所得化合物偶联；

vii)除去p¹、p²和p³保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物。

在步骤vii)中，除去p¹、p²和p³保护基团和将叠氮基转化为胺基能够分步进行，或在相同反应条件下同时进行。

另外，本发明的hib荚膜低聚糖衍生物能够通过缩聚方法i合成。下述构造单元适用于缩聚方法i：

其中xi，xj，p¹，p²，p³和l具有如前文所定义的相同含义。

具有两个官能团也即膦酸氢根或亚磷酰胺和羟基的重复单元适用于缩聚反应。为了猝灭缩聚反应，可以使用具有羟基的猝灭构造单元。作为重复单元，二糖b1*-5、b1*-6和四糖b2*-2，b2*-3′适于缩聚。作为猝灭构造单元，可以使用t2*，a1*-6，a1*-7，a1*-8，b1*-1，b1*-4，c1*-1，c1*-2和c1*-3。

在b1*-5或b2*-2用作重复单元的情况下，t2*、c1*-1、c1*-2和c1*-3能够用作猝灭构造单元。在b1*-6或b2*-2′用作重复单元的情况下，t2*、a1*-6、a1*-7和a1*-8能够用作猝灭构造单元。

通过缩聚的合成方法i包括下述步骤：

i)提供适于缩聚反应的至少一个重复单元；

ii)进行所述至少一个重复单元的缩聚反应；

iii)通过猝灭构造单元猝灭所述至少一个重复单元的缩聚反应；

iv)除去p保护基团和将叠氮基转化为胺基，获得式(i)化合物或式(i)化合物的混合物；

其中在b1*-5或b2*-2用作重复单元的情况下，t2*、c1*-1、c1*-2或c1*-3用作猝灭构造单元；和

在b1*-6或b2*-2′用作重复单元的情况下，t2*、a1*-6、a1*-7或a1*-8用作猝灭构造单元。

另选地，可以同时提供至少一个重复单元和猝灭构造单元并且至少一个重复单元的缩聚反应和缩聚反应的猝灭在一锅系统中自动进行。

在至少一个重复单元的总和与猝灭构造单元之间的摩尔比对低聚糖的长度和多样性发挥关键作用。

提供至少一个重复单元和猝灭构造单元，其中在重复单元与猝灭构造单元之间的摩尔比范围是20:1至1:1，优选20:1至3:1，更优选15:1至4:1，最优选10:1至5:1。

从而，本发明的实施方式是合成式(i)糖的中间体化合物，其选自：

a1*-2，a1*-3，a1*-4，a1*-5，a1*-5'，a1*-5”，a1*-6，a1*-7，a1*-8，b1*-1，b1*-2，b1*-3，b1*-4，b1*-5，b1*-6，c1*-2，c1*-3，c1*-3'，c1*-3”a2*-1，a2*-2，a2*-3，a2*-4，b2*-1，b2*-2，b2*-3，b2*-4，c2*-1，c2*-2，c2*-3，c2*-4，a2*-1′，a2*-2′，a2*-3′，a2*-4′，a2*-2”，a2*-3”，a2*-4”，b2*-1′，b2*-1″，b2*-1″′，b2*-2′，b2*-3′，b2*-3″，b2*-3″′，b2*-4′，c2*-1′,c2*-2′，c2*-3′和c2*-4′：

其中p¹，p²，p³，p⁴和p⁵代表保护基团，其在结合至-o-的情况下不等于xi和xj；

xi和xj相互独立地代表―h，―oh，―f，―ch3，―c2h5，―cn，―och3，―oc2h5，―och(ch3)2，―och2f，―ocf3，-oco-n(ch3)2，-o-c2h4-o-ch3，-o-ch2-cf3，其中

如果基团xi或xj仅存在一个，则xi或xj不能是-oh；

如果基团xi和xj均存在，则xi和xj不能同时是-oh，

l具有前文定义的含义；和

m⁺代表na⁺，k⁺，nh4⁺或hnet3⁺：

另选地，本发明的实施方式是合成式(i)糖的中间体化合物，其选自：

a1*-4，a1*-5，a1*-6，a1*-7，a1*-8，b1*-1，b1*-2，b1*-3，b1*-4，b1*-5，b1*-6，c1*-2，c1*-3，a2*-1，a2*-2，a2*-3，a2*-4，b2*-1，b2*-2，b2*-3，b2*-4，c2*-1，c2*-2，c2*-3，c2*-4，a2*-1′，a2*-2′，a2*-3′，a2*-4′，b2*-1′，b2*-2′，b2*-3′，b2*-4′，b2*-1″′，b2*-3″′，c2*-1′,c2*-2′，c2*-3′和c2*-4′：

其中p¹，p²，p³，p⁴和p⁵代表保护基团；

xi和xj相互独立地代表―h，―oh，―f，―ch3，―c2h5，―cn，―och3，―oc2h5，―och(ch3)2，―och2f，―ocf3，-oco-n(ch3)2，-o-c2h4-o-ch3，-o-ch2-cf3，其中

如果基团xi或xj仅存在一个，则xi或xj不能是-oh；

如果基团xi和xj均存在，xi和xj不能同时是-oh，

l具有前文定义的含义；和

m⁺代表na⁺，k⁺，nh4⁺或hnet3⁺：

术语"保护基团"如本文所用是指有机合成中一般使用的保护基团，优选用于羟基。

更特别地，p¹、p²、p³、p⁴、p⁵和p⁶优选是适宜的羟基保护基团，更优选是不同的适宜的羟基保护基团，其能够通过适宜的脱保护反应程序接连除去。因此羟基的保护基团p¹、p²、p³、p⁴、p⁵和p⁶可以选自或包含：乙酰基，苄基，苯甲酰基，对-甲氧基苄基，对-甲氧基苯基，对-溴苄基，邻-硝基苯基，对-硝基苯基，烯丙基，甲基，异丙基，乙酰丙酰基，二甲氧基三苯甲基(dmtr)，三苯甲基，2-萘基甲基(nap)，新戊酰基，三异丙基甲硅烷基，叔丁基二甲基甲硅烷基，叔丁基二苯基甲硅烷基，叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基，三乙基甲硅烷基，三甲基甲硅烷基，2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基。

更特别地，在本发明的优选实施方式中p¹、p⁵和p⁶可以是苄基或对-甲氧基苄基，p²可以是烯丙基、二甲氧基三苯甲基(dmtr)、2-萘基甲基(nap)或三苯甲基，p³可以是乙酰丙酰基(lev)或2-萘基甲基(nap)，p⁴可以是甲基或乙酰基。

在特别优选实施方式中，p¹可以是苄基，p²可以是2-萘基甲基和p³可以是乙酰丙酰基。

通过用三氯乙酸处理除去作为p²保护基团的dmtr基团导致核糖醇c-5位伯醇，其与伴侣构造单元的核糖c-3位的膦酸氢根或亚磷酰胺偶联。通过用乙酸肼处理裂解作为p³保护基团的乙酰丙酰基导致核糖c-3位仲醇，其也与伴侣构造单元的核糖醇c-5位的膦酸氢根或亚磷酰胺反应。

脱保护作为p¹保护基团的苄基优选通过pd-催化氢化反应进行。相同反应条件可以用来将叠氮基转化为胺基团。

为了在脱保护p³或p²保护基团之后在构造单元或所得化合物的核糖c-3位或核糖醇c-5位引入膦酸氢根基团，核糖c-3位或核糖醇c-5位的羟基优选在咪唑存在下与三氯膦和三乙胺反应。

为了在脱保护p³或p²保护基团之后在构造单元或所得化合物的核糖c-3位或核糖醇c-5位引入亚磷酰胺基团，核糖c-3位或核糖醇c-5位的羟基优选在四唑化二异丙基铵存在下与双(二异丙基氨基)-苄氧基膦反应。

新戊酰氯用作偶联或缩合试剂以偶联一对构造单元。如上文描述，为了偶联反应，一个偶联伴侣具有羟基而另一个偶联伴侣具有膦酸氢根基团。

为了缩聚反应，构造单元具有两个官能团，也即羟基和膦酸氢根基团。

连接体

因此本发明涉及通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)任一的糖，含有-o-l-nh2基团，其适于通过-o-l-nh2基团的氮原子与免疫原性载体缀合。本发明也涉及通式中任一的糖，含有-o-l-cooh基团，其适于通过-o-l-cooh基团的羧酸与免疫原性载体缀合。连接体l可以是任何非免疫原性部分，如前文所定义。从而，连接体l尽管是通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)任一的糖以及通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)任一的糖与免疫原性载体的任何缀合物的一部分，但是不影响通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)任一的糖以及通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)任一的糖与免疫原性载体的任何缀合物的免疫原性特性。

式ho-l-nh2或ho-l-cooh的任何双官能连接体能够用于本发明通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)和(iii-2)任一的糖以及它们与免疫原性载体的缀合物。在本发明通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)和(iii-2)任一的糖的一种实施方式中，连接体-l-选自：-l^a-，-l^a-l^e-，-l^a-l^b-l^e-，-l^a-l^d-l^e-；其中

-l^a-选自：-(ch2)o-，-(ch2-ch2-o)o-c2h4-，-(ch2-ch2-o)o-ch2-；

-l^b-代表-o-或-o-p(o)(oh)-o-；

-l^d-选自-(ch2)q-，-(cf2)q-，-(ch2-ch2-o)q-c2h4-和-(ch2-ch2-o)q-ch2-；

-l^e-选自：-(ch2)p1-，-(cf2)p1-，-c2h4-(o-ch2-ch2)p1-，-ch2-(o-ch2-ch2)p1-和-(ch2)p1-o-(ch2)p2-；

和o，q，p1和p2相互独立地是选自1，2，3，4，5和6的整数。

从而，本发明也涉及通式(i)的糖

其中

a是

b是c是

d是e是

f是----o----,

t¹和t²代表-h，-l-nh2；其中如果t¹是-l-nh2则t²是-h和如果t¹是-h则t²是-l-nh2或-l-cooh；

x1、x2、x3、x4、x5和x6相互独立地代表―h，―oh，―f，―ch3，―c2h5，―cn，―och3，―oc2h5，―och(ch3)2，―och2f，―ocf3，-oco-n(ch3)2，-o-c2h4-o-ch3，-o-ch2-cf3，和x1、x2、x3、x4、x5和x6中至少两个不是-oh；

n是选自1，2，3或4的整数；

n1，n2，n3和n4相互独立地选自0和1

和n1+n2+n3+n4≥1；

条件是如果n1+n2+n3+n4＝1和如果n＝1和如果

a是则

f是

和

条件是如果n1+n2+n3+n4＝1和如果n＝1和如果

f是----o----，或则

a是

l是连接体和l选自：-l^a-，-l^a-l^e-，-l^a-l^b-l^e-，-l^a-l^d-l^e-；其中-l^a-选自：-(ch2)o-，-(ch2-ch2-o)o-c2h4-，-(ch2-ch2-o)o-ch2-；

-l^b-代表-o-或-o-p(o)(oh)-o-；

-l^d-选自-(ch2)q-，-(cf2)q-，-(ch2-ch2-o)q-c2h4-和-(ch2-ch2-o)q-ch2-；

-l^e-选自：-(ch2)p1-，-(cf2)p1-，-c2h4-(o-ch2-ch2)p1-，-ch2-(o-ch2-ch2)p1-和-(ch2)p1-o-(ch2)p2-；

和o，q，p1和p2相互独立地是选自1，2，3，4，5和6的整数；

和上述化合物及其药学上可接受的盐的对映体，非对映体，对映体混合物，非对映体混合物，端基异构体，水合物，溶剂化物。

还优选的是，本发明通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)和(iii-2)任一的糖具有连接体-l-，其是-l^a-l^e-；和其中

-l^a-选自：-(ch2)o-，-(ch2-ch2-o)o-c2h4-，-(ch2-ch2-o)o-ch2-；

-l^e-选自：-c2h4-(o-ch2-ch2)p1-，-ch2-(o-ch2-ch2)p1-，-(ch2)p1-和-(ch2)p1-o-(ch2)p2-；和

o，p1，p2，相互独立地是选自1，2，3，4，5和6的整数。

在通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)和(iii-2)任一的糖的一种实施方式中，连接体-l-是-l^a-，其中

-l^a-代表：-(ch2)o1-，-(ch2-ch2-o)o2-c2h4-，-(ch2-ch2-o)o2-ch2-；

o1是选自2，3，4，5和6的整数；

o2是选自1，2，3，4，5和6的整数。

糖缀合物

本发明的又一方面涉及通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)任一的糖通过-o-l-nh2基团的氮原子与免疫原性载体缀合。所述糖也定义为糖缀合物，其是通过将通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)任一的糖与免疫原性载体反应获得的。从而所述通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)任一的糖通过-o-l-nh2基团的氮原子与免疫原性载体缀合和通过将通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)任一的糖与免疫原性载体反应获得的所述糖缀合物具有相同含义。

所述糖缀合物经证实是有效的疫苗，用于对与细菌有关的疾病免疫。

本领域技术人员已知糖是一般ti-2(t细胞独立-2型)抗原和劣免疫原。ti-2抗原是抗原，其仅被成熟b细胞通过表面暴露的免疫球蛋白受体的交联识别。在不存在t细胞的协助的情况下，免疫学记忆和igm与其它igg子类的同种型交换都无法产生，也不会发生b细胞亲和力成熟。此外已知糖是人中的劣免疫原，原因是其与人类糖脂和糖蛋白的结构同源性。由于它们的劣免疫原性特性，糖表现出引起b细胞抗体产生以及记忆细胞形成的低劣能力，而这些特征都是制备有效疫苗所必需的。

因此，为了产生有效的糖基疫苗，将通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)的糖缀合至免疫原性载体从而提供糖缀合物，其展示与糖比较增加的免疫原性。

糖-蛋白质缀合物由下述组成：至少一个通式(i)的合成糖和至少一种糖(i)与之共价结合的免疫原性载体。

在该上下文中术语"免疫原性载体"定义为这样的结构，其缀合至糖以形成展示与糖本身比较增加的免疫的糖缀合物。从而，通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)糖与免疫原性载体的缀合具有的效果是，刺激对通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)糖的免疫应答而不诱导对所述免疫原性载体的免疫应答。

优选的免疫原性载体是载体蛋白质。对于本领域技术人员来说，载体蛋白质是选自包含下述或由下述组成的组的蛋白质：白喉类毒素，突变的白喉类毒素，修饰的白喉类毒素，突变的和修饰的白喉类毒素，破伤风类毒素，修饰的破伤风类毒素，突变的破伤风类毒素，外膜蛋白质(omp)，牛血清白蛋白(bsa)，镇眼帽贝血蓝蛋白(klh)或霍乱类毒素(ct)。术语"类毒素"如本文所用是指细菌毒素(通常是外毒素)，其毒性已通过化学(福尔马林)或热处理灭活或抑制，而其它特性一般来说是免疫原性则得到保持。突变的类毒素如本文所用是重组细菌毒素，其已通过修改野生型氨基酸序列修改为具有更低的毒性或甚至无毒性。上述突变可以是取代一个或多个氨基酸。上述突变的类毒素在其表面展示官能性，其能够与转接分子的官能团y反应从而提供修饰的类毒素。

本发明的实施方式是通过-o-l-nh2-基团的氮原子共价连接至免疫原性载体的糖(i)。-o-l-nh2-基团的-l-是与免疫原性载体的连接，呈共价键形式(o-l-nh2-基团的氧原子直接或间接连接至免疫原性载体)或-l-nh-形式，其中氮原子直接或间接连接至载体蛋白质

直接连接意指连接至免疫原性载体的官能团或侧链而间接连接是指通过免疫原性载体的额外官能团和/或-o-l-nh2-基团的氮连接。

如果载体蛋白质用作免疫原性载体，为了将糖偶联至载体蛋白质必需的是化学活化糖且有时蛋白质。糖与蛋白质缀合方法的选择是受限的，原因是蛋白质的ph和温度敏感性以及它们在大多数有机溶剂中的有限溶解度。该程序必须在温和条件下进行以便预防蛋白质变性和糖降解。如此，缀合反应在中性或近中性ph缓冲液中进行。迄今已报告许多方案将碳水化合物共价附着至蛋白质。下述连接方法能够用于将合成糖(i)与载体蛋白质连接：

还原胺化是最普及的糖缀合方法之一，用于将游离低聚糖经由还原端与蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基结合。在本发明中，合成糖(i)的氨基能够用醛官能例如用戊二醛进一步官能化，而在醛官能化的合成糖与具有赖氨酸残基的载体蛋白质之间的糖缀合能够通过还原胺化形成。

马来酰亚胺-硫醇缀合是马来酰亚胺与硫醇的不可逆反应，其提供稳定连接，也频繁地用于制备糖缀合物。例如，马来酰亚胺能够制备自还原端携带胺连接体的合成糖(i)。糖-马来酰亚胺结构能够然后与载体蛋白质半胱氨酸中的硫醇侧链反应，引起稳定的糖缀合物。反过来说，载体蛋白质能够用马来酰亚胺活化和合成糖(i)能够用硫醇官能进一步官能化。

能够应用使用方形酸酯的糖缀合方法。首先，合成糖(i)的方形酸酰胺酯能够制备如下：将胺基团与方形酸酯偶联。合成糖(i)的方形酸酰胺酯能够进一步与载体蛋白质赖氨酸残基ε-氨基偶联从而形成方形酸二酰胺。

能够施用活化的酯包括二(n-琥珀酰亚胺基)己二酸酯，二(n-琥珀酰亚胺基)戊二酸酯(dsg)，n-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-gmbs)，琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-siab)，琥珀酰亚胺基-3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(sbap)，2-吡啶基二硫醇-四氧杂十四烷-n-羟基琥珀酰亚胺(peg-4-spdp)。(参见图1)。优选，二(n-琥珀酰亚胺基)己二酸酯能够用于制备糖缀合物。

能够使用零长度交联方法，其使用碳二亚胺、最常用edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)。n-取代的碳二亚胺能够与载体蛋白质羧酸反应以形成高度反应性的o-酰基异脲衍生物。该活性种类然后能够与合成糖(i)的伯胺反应以形成酰胺键。

作为其他缀合方法能够使用点击化学(clickchemistry)。点击化学是炔和叠氮化物的[3+2]环加成。优选，张力促进的叠氮化物-炔环加成(spaac)能够用于糖缀合。张力炔比如环辛炔由于非毒性反应条件对生物缀合是有利的。载体蛋白质能够用含叠氮化物的氨基酸简单标记并与用炔官能化的合成糖(i)缀合。反过来说，用叠氮化物官能化的合成糖(i)能够与用炔标记的载体蛋白质缀合。

天然化学连接(ncl)能够用于糖缀合。为了将该方法用于糖缀合，合成糖(i)应用硫代酯例如苄基硫代酯、乙硫基酯或苯硫基酯进一步官能化。在天然化学连接中，载体蛋白质n-末端半胱氨酸残基的烃硫基进攻官能化合成糖(i)的硫代酯。该可逆的转硫代酯化步骤是化学选择性和区域选择性并且使得形成硫代酯中间体并且该中间体通过分子内s,n-酰基位移重排引起在连接位置形成天然酰胺键。因而，合成糖(i)和载体蛋白质是用酰胺键缀合的。

无痕staudinger连接能够也用于糖缀合。在该反应中，膦携带硫代酯亲电试剂；在与叠氮化物反应之后，产品是酰胺和离去的氧化膦。staudinger连接已展示是在体外、在活细胞上和在活动物中标记携带叠氮化物的蛋白质的理想手段，原因是经展示的叠氮化物和膦在有关浓度无毒性。对于糖缀合应用，合成糖(i)用携带膦和叠氮化物基团的硫代酯官能化并以数种方式引入有关载体蛋白质，用于随后的膦探针引入。通常，能够掺入叠氮基高丙氨酸代替蛋白质的甲硫氨酸。用叠氮基高丙氨酸修饰的载体蛋白质能够有效地和特异性地通过staudinger连接与合成糖(i)缀合。

光交联是分子生物学领域的重要化学方法。最近，很多注意力已致力于将该方法用于鉴定配体-结合区域。光交联方法能够用于糖缀合。光亲和性标记需要官能团，其能够被光化学活化以产生高度反应性的中间体、通常是氮宾或卡宾。作为官能团，使用二苯甲酮，芳基叠氮化物，芳基或烷基二氮丙因。最近，烷基或芳基二氮丙因优选用于光亲和性标记(m.r.bondetal.natureprotocols2009,4(7),1044-1063；m.r.bondetal.bioconjugatechemistry2011,22(9),1811-1823)。为了将合成糖(i)与载体蛋白质缀合，合成糖(i)能够用烷基或芳基二氮丙因例如3-三氟甲基-3-苯基二氮丙因官能化。在uv-辐射之后，从用芳基二氮丙因官能化的合成糖(i)产生反应性卡宾而该卡宾通过c-c共价键与载体蛋白质偶联。

特别优选的是，通式(i)的糖和/或优选糖2a、2b、2c、4a、4b、4c、4d、4e、6a、6b、6c、8a、8b和8c缀合至非毒性突变的白喉毒素crm197，其官能是赖氨酸残基的伯胺官能。

crm197类野生型白喉毒素是535个氨基酸的单个多肽链(58kd)，其由二硫醚桥连接的两个亚单位组成，具有谷氨酸替换甘氨酸的单个氨基酸取代。其在许多经批准的缀合物疫苗(例如prevnar)中用作载体蛋白质，所述疫苗用于疾病比如肺炎球菌性细菌感染。

优选，二(n-琥珀酰亚胺基)己二酸酯首先连接至具有伯氨基的合成糖(i)。活化的糖(i)随后与载体蛋白质比如crm197缩合从而提供糖缀合物。另外，能够使用有关的二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(图2(a))。

与载体蛋白质缀合的所述糖优选具有≥95％，优选≥96％，更优选≥97％，还更优选≥98％，和最优选≥99％的纯度。

本发明的又一方面涉及本发明糖及其糖缀合物用作药物的用途，也即医药中可应用的药学活性剂。

发现的是，通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)的糖和通过将通式(i)，(ii-1)，(ii-2)，(iii-1)，(iii-2)，(iv-1)和(iv-2)的糖与免疫原性载体反应获得的所述糖缀合物适用于医药中的药学活性剂。所述糖和所述糖缀合物适宜引起动物中的免疫应答，和因此可用于提高在人类和/或动物宿主中的保护性免疫应答。

优选，所述糖和所述糖缀合物可用于预防和/或治疗与流感嗜血杆菌b型有关的疾病，优选选自脑膜炎、肺炎和会厌炎的疾病。

令人惊讶地发现，本发明的新缀合物也适于提高人类和/或动物宿主中的免疫应答和因此适于针对与流感嗜血杆菌b型有关的疾病。从而，本文公开的本发明缀合物可用于预防或治疗与流感嗜血杆菌b型有关的疾病。所述疾病包括但不限于脑膜炎，肺炎，会厌炎和呼吸道的其它疾病。此外还发现，用本发明新缀合物治疗动物导致免疫球蛋白igg-同种型的形成，其证明记忆b-细胞在活有机体中的发展。记忆b-细胞的存在展示免疫记忆。从而已显示的是，本发明的缀合物能够诱导在动物中针对流感嗜血杆菌b型的长期防护。

因此，根据本发明的缀合物适于用作医药中可行的药学活性试剂，特别用于对流感嗜血杆菌b型导致的或与其有关的疾病的接种。

疫苗组合物

本发明的一个方面涉及药物组合物，特别是疫苗组合物，其含有通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)(iv-1)和(iv-2)中任一的至少一种糖、其药学上可接受的盐、其糖缀合物，以及至少一种药学上可接受的佐剂、载体、冷冻保护剂、冻干保护剂、赋形剂和/或稀释剂。

从而本发明用于通式(i)合成糖的合成还可以包括步骤b)

b)制备通式(i)糖的盐或制备通式(i)糖的冻干物或通式(i)合成糖的盐的冻干物。

在优选实施方式中，用于式(i)糖的本发明合成可以还包括步骤b)

b)制备通式(i)糖的盐或制备式(i)糖的冻干物或式(i)糖的盐的冻干物。

根据本发明的药物组合物包含通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)中任一的至少一种糖及其药学上可接受的盐。特别是根据本文公开的总化学合成获得的糖2a、2b、2c、4a、4b、4c、4d、4e、6a、6b、6c、8a、8b和8c用于这些疫苗当中。通过本文公开的总化学合成获得的通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)的糖以及糖2a、2b、2c、4a、4b、4c、4d、4e、6a、6b、6c、8a、8b和8c具有至少95％，更优选至少96％，还更优选至少97％，还更优选至少98％，和最优选至少99％的纯度。

本发明的糖以及含有通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)中任一的至少一种糖的药物组合物和特别是含有至少一种本发明的糖特别是糖2a、2b、2c、4a、4b、4c、4d、4e、6a、6b、6c、8a、8b和8c的疫苗是高度有用的，其用作疫苗免疫由流感嗜血杆菌b型引起的或与流感嗜血杆菌b型有关的疾病，优选脑膜炎、肺炎和会厌炎。

根据本发明糖2a、2b、2c、4a、4b、4c、4d、4e、6a、6b、6c、8a、8b和8c以及本文公开的任何其它本发明糖用于制备所述药物组合物，其用作疫苗免疫上述疾病。

疫苗可以以悬浮液形式制备或可以冻干。悬浮液形式可以冷冻储存。在冻干形式中，优选添加一种或多种稳定剂。接种能够在任何年龄进行。疫苗可以经皮下、喷雾、注射、经口、眼内、气管内或鼻部给予。待给予人类或动物的本发明疫苗的量和给药方案能够按照药物和兽医学领域技术人员熟知的标准技术确定，考虑的因素是比如特定抗原，佐剂(如果存在)，特定动物或患者的年龄、性别、体重、种类和条件，和给药途径。

在受试者中诱导对流感嗜血杆菌b型的免疫应答的方法包括给予本发明的糖、其混合物、其缀合物或其药物组合物。在受试者中治疗或预防由流感嗜血杆菌b型引起的或与流感嗜血杆菌b型有关的疾病优选脑膜炎、肺炎和会厌炎的方法包括给予至少一种本发明合成糖或其混合物、其缀合物或其组合物或疫苗。

在本发明中，为了接种对抗流感嗜血杆菌b型提供有效剂量的式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)中任一的糖的量能够是0.02μg至约10μg每kg体重。任选缀合至免疫原性载体、优选载体蛋白质比如crm197的式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)中任一的糖能够作为单次给药或相继给予(即使用一个"激发剂量"或多个"激发剂量")。例如，儿童能在生命早期接受单次给药然后在多至十年以后给予激发剂量，正如目前对预防儿童期疾病的其它疫苗所推荐。

静脉内和肠胃外给药是优选的。所述组合物可以与适宜的载体、稀释剂或赋形剂比如无菌水、生理学盐水、葡萄糖等混合。根据本发明的组合物或任选缀合至免疫原性载体的式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)中任一的糖还能够被冻干。

冻干的本发明糖将最终用液体组分重构以提供适于向患者给药的物质。重构将一般在使用时进行。从而，本发明糖和水包油乳液佐剂或佐剂的缓冲溶液可以在打包或分散的疫苗试剂盒中分开存放，在使用时即时配制最终配制剂。在含有两个容器的试剂盒中，一个包括重构液体而第二个容器包括冻干物质。为了稳定性原因，本发明的冻干组分可以包括稳定剂比如乳糖、蔗糖和/或甘露醇及其混合物。用蔗糖/甘露醇混合物能够加速干燥过程。冻干组分还可以包括氯化钠。冻干物质中的可溶组分将在重构之后保留在组合物中，因此最终的液体疫苗可以从而含有乳糖和/或蔗糖。

本发明疫苗的配制剂能够用本领域已知的方法实现。明显地，选择适宜载体和其它添加剂将取决于具体给药途径和特别剂型的性质。

本发明疫苗组合物可以含有一种或多种佐剂。如本文定义，"佐剂"是物质，其作用是增强根据本发明的任选缀合至免疫原性载体的式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)中任一的糖的免疫原性。免疫佐剂可以增强对抗原的免疫应答，所述抗原在单独给予的情况下是弱免疫原性的，例如不诱导或诱导弱抗体滴定度或细胞介导的免疫应答。进一步地，佐剂可以增加对抗原的抗体滴定度，和/或降低在个体中有效实现免疫应答的抗原剂量。从而，佐剂常常被提供来促进免疫应答并且是技术人员熟知的。增强有效性的适宜佐剂包括，仅为示例而非限制，铝佐剂(例如铝盐比如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝或其组合)，弗氏佐剂(完全或不完全)，bayr1005(n-(2-脱氧-2-l-亮氨酰基氨基-β-d-葡萄糖吡喃糖基)-n-十八烷基十二烷酰基酰胺乙酸氢盐)，dc-chol(二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基胆固醇，pcpp(聚[二(羧酸基苯氧基)磷腈])，一磷酰基脂质a，cpg寡核苷酸，qs-21(quillajasaponaria皂甙免疫学佐剂)，霍乱毒素和甲酰基甲硫氨酰基肽。

可以使用的备择佐剂包括水包油乳液配制剂例如描述于pctpubl.no.wo90/14837的mf59；saf-1(syntex佐剂配制剂苏氨酰-mdp(0.05-1％)，其在乳液媒介物[5％角鲨烷，2.5％l121，0.2％聚山梨酯80和磷酸缓冲盐水(ph7.4)]中；和一种或多种细菌细胞壁组分，其选自由一磷酰基脂质a(mpl)、海藻糖二霉菌酸酯(tdm)和细胞壁骨架(cws)组成的组；皂甙佐剂，比如stimulontm(cambridgebioscience，worcester，mass.)或其产生的颗粒。各种水包油乳液佐剂是已知的，并且它们一般包括至少一种油和至少一种表面活性剂，其中油和表面活性剂是生物可降解的(可代谢的)和生物可相容的。角鲨烷、角鲨烯的饱和类似物是优选的油。其它优选的油是生育酚类。能够使用油的混合物。表面活性剂能够通过其’hlb’(亲水/亲油平衡)分类。本发明的优选表面活性剂具有至少10、优选至少15和更优选至少16的hlb。本发明能够使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(一般称为吐温)；氧化乙烯(eo)、氧化丙烯(po)和/或氧化丁烯(bo)的共聚物；辛苯聚醇，其重复乙氧基(氧基-1,2-乙烷二基)数量能够变化，比如辛苯聚醇-9(tritonx-100，或辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；磷脂比如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自月桂基、鲸蜡基、硬脂基和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为brij表面活性剂)。乳液中包括的优选表面活性剂是tween80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)，span85(三油酸山梨坦)，卵磷脂和tritonx-100。

其它佐剂可以是细胞因子，比如白细胞介素(例如il-1，il-2，il-4，il-5，il-6，il-7，il-12等)，干扰素类(例如γ干扰素)，巨噬细胞群落刺激因子(m-csf)，肿瘤坏死因子(tnf)。

组合物能够含有辅剂物质比如润湿或乳化剂、ph缓冲剂、胶凝化或增粘添加剂、防腐剂、矫味剂、色素等，取决于给药途径和希望的制剂。本发明组合物可以包括抗微生物剂，特别是在包装为多剂量形式的情况下。抗微生物剂比如硫柳汞和2-苯氧乙醇一般存在于疫苗中，但优选的是使用不含汞的防腐剂或完全不使用防腐剂。

组合物可以包括温度保护性试剂。实例包括甘油，丙二醇和/或聚乙二醇(peg)。

本发明疫苗组合物可以还包含白喉抗原，破伤风抗原，百日咳抗原，乙肝抗原，灭活的脊髓灰质炎疫苗和灭活的轮状病毒属疫苗中的至少一种。

术语"白喉抗原"如本文所用优选是白喉类毒素。白喉类毒素是甲醛灭活的白喉棒杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)毒素,用作对白喉的活性免疫试剂。制备白喉类毒素有充分记载(例如plotkinetal,vaccines,6^thedition,2012,chapter12)。任何适宜的白喉类毒素可以使用。白喉类毒素的浓度一般是5至100lf(絮凝极限)/ml。优选浓度是10至50lf/ml。更优选的浓度是20至40lf/ml。最优选，浓度是约30lf/ml。

术语"破伤风抗原"如本文所用优选是破伤风类毒素。破伤风类毒素是本领域技术人员熟知的(例如plotkinetal,vaccines,6^thedition,2012,chapter33)。可以使用任何适宜的破伤风类毒素。破伤风类毒素的浓度一般是1至50lf/ml。优选的浓度是2至9lf/ml。更优选的浓度是5至8lf/ml。最优选，浓度是约6.5lf/ml。

术语"百日咳抗原"如本文所用可以是细胞(例如整个细胞)或非细胞类型。两种类型抗原的制备都有充分记载(例如plotkinetal,vaccines,6^thedition,2012,chapter23)。对于细胞型百日咳抗原，百日咳抗原的浓度一般是5至50ou/ml。优选的浓度是10至40ou/ml。更优选的浓度是25至35ou/ml。最优选，浓度是约30ou/ml。在使用非细胞型抗原的情况下，优选使用百日咳全毒素(pt)和丝状血细胞凝集素(fha)，更优选与百日咳杆菌粘附素(也称为prn或69kda抗原)和任选的凝集原(也称为伞毛)2和3相组合。pt是毒性蛋白质，和当其在百日咳抗原中存在时优选是解毒的。解毒可以通过化学和/或基因手段进行。优选的解毒突变型是9k/129gdoulb突变型。

术语"乙肝抗原"如本文所用可以是乙肝表面抗原。制备乙肝表面抗原有充分记载(例如plotkinetal,vaccines,6^thedition,2012,chapter15)。

术语"灭活的脊髓灰质炎疫苗(ipv)"如本文所用，优选由全部三种脊髓灰质炎病毒类型i-3的灭活(杀灭)脊髓灰质炎病毒菌株组成。在本发明中，病毒灭活是指消除病毒的传染能力。在灭活的两种方法(化学和物理)中，最一般使用的化学品是甲醛和β丙内酯。制备白喉类毒素有充分记载(例如plotkinetal,vaccines,6^thedition,2012,chapter27)。

术语"灭活的轮状病毒属疫苗"如本文所用，优选可以是牛(uk菌株)/人重配株疫苗、人新生rv3菌株或牛/人新生116e菌株。在本发明中，病毒灭活是指消除病毒的传染能力。在两种灭活方法(化学和物理)中，最一般使用的化学品是甲醛和β丙内酯。制备灭活的轮状病毒属疫苗有充分记载(例如plotkinetal,vaccines,6^thedition,2012,chapter30)。

本发明组合物方便地提供为液体制剂，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液或粘稠组合物，其可以缓冲为所选ph。用于液体配制剂的药学上可接受的载体可以是水溶液或非水溶液，悬浮液，乳液或油。非水溶剂的实例是丙二醇，聚乙二醇和可注射的有机酯比如油酸乙酯。含水载体包括水，含醇溶液，乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。

组合物ph在重构之后优选是6至8，和更优选6.5至7.5(例如约7)。本发明组合物可以通过使用缓冲剂例如tris缓冲剂，乙酸盐，谷氨酸盐，乳酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，磷酸盐，柠檬酸盐，碳酸盐，甘氨酸盐，组氨酸，甘氨酸，琥珀酸盐和三乙醇胺缓冲剂来保持。从而本发明组合物优选包括缓冲剂。等渗剂可以是离子型等渗剂比如盐或非离子的等渗剂比如碳水化合物。离子型等渗剂的实例包括但不限于nacl，cacl2，kcl和mgcl2。非离子型等渗剂的实例包括但不限于山梨醇和甘油。

在本发明的优选实施方式中，疫苗组合物配制为无菌液态的、无热原的、磷酸缓冲的生理学盐水，含或不含防腐剂。

药学上可接受的防腐剂能够用来增加组合物的存放期。苯甲醇可以是适宜的，尽管还可以使用各种防腐剂包括例如羟苯酯类，硫柳汞，三氯叔丁醇或苯扎氯铵。防腐剂的适宜浓度是0.02％至2％基于总重量，但是取决于所用试剂可以具备可观变化。

本发明组合物能够配制为单次给药小瓶，多剂量小瓶或预填充的注射器。

本发明的又一方面涉及药物配制剂和药物组合物，其含有任选与免疫原性载体或疫苗缀合的通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)中任一的至少一种糖作为活性成分，以及至少一种药学上可接受的佐剂、载体、赋形剂、溶剂和/或稀释剂。

还优选，药物组合物配制为冻干物或液体缓冲溶液形式。

疫苗或药物组合物还能够以其药学上活性盐形式给予，任选地使用实质上无毒的药学上可接受的载体，赋形剂，佐剂或稀释剂。本发明疫苗或药物组合物以已知方式在常规固体或液体载体或稀释剂和适宜剂量水平的常规药学用途的佐剂中制备。优选的制剂和配制剂呈适于口服施用的可给予形式。这些可给药形式例如包括丸剂，片剂，膜片剂，包衣片剂，胶囊，粉末剂和沉积剂。可口服给予形式以外的形式也是可能的。本发明疫苗或药物组合物可以通过任何适当手段给予，包括但不限于吸入，注射(静脉内、腹腔内、肌内、皮下)，通过上皮或粘膜皮肤层(口腔粘膜、直肠和阴道上皮层，鼻咽粘膜、肠粘膜)吸收；经口，直肠，经皮，局部，皮内，胃内，皮内，阴道内，脉管内，鼻内地，颊内，经皮，舌下，或药学领域可获得的任何其它手段。

本发明疫苗或药物组合物，含有至少一种通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)任一的糖，优选糖2a、2b、2c、4a、4b、4c、4d、4e、6a、6b、6c、8a、8b和8c或其药学上可接受的盐作为活性成分，将一般与根据期望的给药形式适宜选择的适宜载体物质混合给予，所述给药形式即口服片剂、胶囊(固体填充、半固体填充或液体填充)，构造粉末、口服凝胶、酏剂、可分散性粒剂、糖浆剂、悬浮液等，并且与常规药物实践相符。例如，为了以片剂或胶囊形式口服给药，活性成分可以与任何口服的无毒药学上可接受的惰性载体比如乳糖、淀粉、蔗糖、纤维素、硬脂酸镁、磷酸氢钙、硫酸钙、滑石、甘露醇、乙醇(液体形式)等相组合。此外在希望或需要时，适宜的粘合剂，润滑剂，崩解剂和着色剂还可以被加入混合物。粉末和片剂可以含约5至约95百分比的四糖。

适宜的粘合剂包括淀粉，明胶，天然糖类，玉米甜味剂，天然胶和合成胶比如阿拉伯胶，藻酸钠，羧甲纤维素，聚乙二醇和蜡。用于这些剂型可以提及的润滑剂尤其是硼酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠等。崩解剂包括淀粉，甲基纤维素，瓜耳胶等。甜味剂和矫味剂和防腐剂还可以酌情包括。上文的某些术语即崩解剂，稀释剂，润滑剂，粘合剂等在下文更加详细地讨论。

额外地，本发明疫苗或药物组合物可以配制为持续释放形式，提供组分或活性成分中任何一种或多种的速率受控释放以优化治疗效果。用于持续释放的适宜剂型包括含有不同崩解速率的层的分层片剂、或浸渍有活性组分且构造为片剂形式的受控释放聚合物基质、或含有所述浸渍或包衣的多孔聚合物基质的胶囊。

液体形式制剂包括溶液，悬浮液和乳液。例如可以提及的是水或水-丙二醇溶液，用于肠胃外注射剂；或加入甜味剂和遮光剂，用于口服溶液、悬浮液和乳液。液体形式制剂还可以包括用于鼻内给药的溶液。

适于吸入的气雾剂制剂可以包括溶液和粉末形式的固体，其可以与药学上可接受的载体比如惰性压缩气体例如氮组合。

为了制备栓剂，首先熔化低熔点蜡比如脂肪酸甘油酯的混合物比如可可油，和通过搅拌或相似混合将活性成分均匀分散于其中。然后，将熔化的均质混合物倾至方便控制大小的模具中，让其冷却，和由此固化。

还包括固体形式制剂，其期望在临使用前转化为用于口服或肠胃外给药的液体形式制剂。所述液体形式包括溶液，悬浮液和乳液。

含有至少一种通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)任一的糖，优选糖1f、2a、2b、2b'、2c、2f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、6a、6b、6c、6f、8a、8b、8c和8f的本发明疫苗或药物组合物还可以是可经皮递送的。透皮组合物可以呈霜剂、洗剂、气雾剂和/或乳液形式和能够包括在基质或储库类型的透皮贴剂中，对于该意图来说这是本领域常规的。

术语胶囊是指甲基纤维素、聚乙烯醇或变性明胶或淀粉制成的特殊容器或外壳，用于容纳或含有包含活性成分的组合物。硬壳胶囊一般由相对高凝胶强度的骨和猪皮明胶共混物制成。胶囊本身可以含有少量染料，遮光剂，增塑剂和防腐剂。

片剂意指压缩的或模塑的固体剂型，含有活性成分和适宜的稀释剂。片剂能够通过压缩通过湿法造粒、干法造粒获得的颗粒或混合物或通过本领域技术人员熟知的压实来制备。

口服凝胶是指在亲水半固体基质中分散的或溶剂化的活性成分。

构造粉末是指能够悬浮于水或浆液中的含有活性成分和适宜稀释剂的粉末共混物。

适宜稀释剂是通常构成组合物或剂型的主要部分的物质。适宜的稀释剂包括糖类比如乳糖，蔗糖，甘露醇和山梨醇，衍生自小麦、玉米稻和马铃薯的淀粉，和纤维素比如微晶纤维素。组合物中稀释剂的量能够是约5至约95％重量，优选约25至约75％，更优选约30至约60％重量，和最优选约40至50％重量的总组合物。

术语崩解剂是指加入组合物帮助其破开(崩解)和释放药物的物质。适宜的崩解剂包括淀粉，"冷水可溶的"改性淀粉比如羧甲基淀粉钠，天然和合成胶比如槐豆胶，刺梧桐树胶，瓜耳胶，黄蓍胶和琼脂，纤维素衍生物比如甲基纤维素和羧甲纤维素钠，微晶纤维素，和交联微晶纤维素比如交联羧甲基纤维素钠，藻酸盐比如藻酸和藻酸钠，粘土比如斑脱土，和泡腾剂混合物。组合物中崩解剂的量能够是约1至约40％重量的组合物，优选2至约30％重量的组合物，更优选约3至20％重量的组合物，和最优选约5至约10％重量。

粘合剂表征物质，其将粉末结合或"胶合"在一起并且通过形成颗粒使得它们内聚，由此充当配制剂中的"粘合剂"。粘合剂增加稀释剂或填充剂中已经存在的粘着强度。适宜的粘合剂包括糖比如蔗糖，衍生自小麦、玉米稻和马铃薯的淀粉；天然胶比如阿拉伯胶、明胶和黄蓍胶；海藻衍生物比如藻酸、藻酸钠和藻酸钙铵；纤维材料比如甲基纤维素和羧甲纤维素钠和羟丙基甲基纤维素；聚乙烯基吡咯烷酮；和无机物比如硅酸镁铝。组合物中粘合剂的量能够是约1至30％重量的组合物，优选约2至约20％重量的组合物，更优选约3至约10％重量，甚至更优选约3至约6％重量。

润滑剂是指加入剂型通过降低摩擦或磨损使得片剂、颗粒剂等在其压缩之后从模具或铸模释放成为可能的物质。适宜的润滑剂包括金属硬脂酸盐比如硬脂酸镁，硬脂酸钙或硬脂酸钾；硬脂酸；高熔点蜡；和水可溶的润滑剂比如氯化钠，苯甲酸钠，乙酸钠，油酸钠，聚乙二醇和d'l-亮氨酸。润滑剂通常在压缩之前的最末步骤加入，原因是它们必须出现在颗粒表面和在它们与压片机部件之间。组合物中润滑剂的量能够是约0.05至约15％重量的组合物，优选0.2至约5％重量的组合物，更优选约0.3至约3％，和最优选约0.3至约1.5％重量的组合物。

助流剂是预防结块和改善颗粒流动特征从而流动平滑和均匀的物质。适宜的助流剂包括二氧化硅和滑石。组合物中助流剂的量能够是约0.01至10％重量的组合物，优选0.1％至约7％重量的总组合物，更优选约0.2至5％重量，和最优选约0.5至约2％重量。

着色剂是向组合物或剂型提供着色的赋形剂。所述赋形剂能够包括食品级染料和吸附在适宜吸附剂比如粘土或氧化铝上的食品级染料。着色剂的量能够是约0.01至10％重量的组合物，优选约0.05至6％重量，更优选约0.1至约4％重量的组合物，和最优选约0.1至约1％。

配制和给药本发明疫苗的技术可以参考"remington'spharmaceuticalsciences"mackpublishingco.,eastonpa。包含至少一种通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)中任一的糖，优选糖1f、2a、2b、2b'、2c、2f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、6a、6b、6c、6f、8a、8b、8c和8f和/或其药学上可接受的盐的适宜的疫苗组合物可以是所述糖在适宜的液体药物载体中的溶液或任何其它配制剂比如片剂，丸剂，膜片剂，包覆片剂，锭剂，胶囊，粉末和贮库(deposits)，凝胶，糖浆剂，浆料，悬浮液，乳液等。

通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)中任一的糖，优选糖1f、2a、2b、2b'、2c、2f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、6a、6b、6c、6f、8a、8b、8c和8f的治疗有效剂量是指引起至少部分疾病免疫的化合物的量。所述化合物的毒性和疗效能够通过标准药学、药理学和毒理学程序在细胞培养物或实验动物中确定。在毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数。给予的组合物的真实量将取决于治疗的受试者，受试者体重，病患严重性，给药方式和出诊医师的判断。

由于本发明化合物的模块构造，所提及的疫苗配制剂显示在室温下异乎寻常的稳定性，其中所述疫苗配制剂可以于重构之前在至少25℃的温度保持至少3个月的时间段。本文所描述的疫苗配制剂的温度-稳定性构成本发明相对至今描述的针对流感嗜血杆菌b型的疫苗的特别优势。

在本发明的优选实施方式中，所述时间段包括6个月或至少12个月。

抗体

本发明也涉及对至少一种通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)合成糖的抗体。抗体通过单克隆杂交瘤产生。抗体用于诊断、预防和治疗肺炎，脑膜炎，中耳炎，菌血症和结膜炎，关节炎，鼻窦炎和慢性支气管炎的急性恶化。本发明的又一实施方式是抗体用于制备药物或装置的用途，所述药物或装置用于诊断、预防和治疗由流感嗜血杆菌b型引起的脑膜炎、肺炎和会厌炎。

术语"抗体"如本文所用涵盖多克隆和单克隆抗体制剂，以及包括杂交体抗体、f(ab’)2片段、f(ab)分子、单域抗体及其展示母体抗体分子的免疫学结合特性的功能片段的制剂。根据本发明的抗体可以是多克隆或单克隆的。

通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)中任一的糖，优选糖1f、2a、2b、2b'、2c、2f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、6a、6b、6c、6f、8a、8b、8c和8f或其抗体能够用于制备药物组合物特别是疫苗，其用于治疗或预防由流感嗜血杆菌b型引起的疾病。本发明的糖或其抗体能够用于治疗或预防由流感嗜血杆菌b型引起的疾病。

此外，本发明涉及至少一种根据本发明的通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)的糖，优选糖1f、2a、2b、2b'、2c、2f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、6a、6b、6c、6f、8a、8b、8c和8f或对至少一种本发明糖的至少一种抗体在免疫学测试中的用途，用于诊断由流感嗜血杆菌b型引起的脑膜炎、肺炎和会厌炎。

这种测试包括例如微阵列和elisa，用于诊断由流感嗜血杆菌b型引起的疾病。由此，本发明的又一方面涉及式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)中任一的糖，优选糖1f、2a、2b、2b'、2c、2f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、6a、6b、6c、6f、8a、8b、8c和8f用于诊断由流感嗜血杆菌b型引起的疾病的用途。

通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)中任一的糖，优选糖1f、2a、2b、2b'、2c、2f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、6a、6b、6c、6f、8a、8b、8c和8f或所述糖的混合物能在微阵列表面或任何其它表面上固定化并且用于检测流感嗜血杆菌b型的体外方法。鉴定流感嗜血杆菌b型的方法包括使用至少一种本发明糖。另外，通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)的合成糖，优选糖1f、2a、2b、2b'、2c、2f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、6a、6b、6c、6f、8a、8b、8c和8f或所述糖的混合物能够用作免疫测定的分析标准。

诊断装置

本发明的又一方面涉及固体载体，包含至少一种通式(i)的糖，优选式(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)的糖，更优选式(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)的糖，优选糖1f、2a、2b、2b'、2c、2f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、6a、6b、6c、6f、8a、8b、8c和8f。

该固体载体优选是诊断装置的一部分。固体载体和诊断装置用于诊断由流感嗜血杆菌b型引起的脑膜炎、肺炎和会厌炎，其中至少一种通式(i)的糖通过优选成共价键在所述固体载体上固定化。

本发明的其它实施方式是诊断装置，其中固体载体选自包含载玻片，玻璃板，微滴定板，微球或珠的组。

本发明的甚至其它实施方式是诊断装置，其中至少一种通式(i)的糖用连接分子共价结合。

此外本发明显示，根据式(i)的糖能够用于针对由流感嗜血杆菌b型引起的脑膜炎、肺炎和会厌炎的免疫学测试。

所述测试包含例如微阵列和elisa，其用于诊断由流感嗜血杆菌b型引起的脑膜炎、肺炎和会厌炎。

由此，本发明的又一方面涉及式(i)糖用于诊断由流感嗜血杆菌b型引起的脑膜炎、肺炎和会厌炎的用途。

根据本发明的糖(i)通过成共价键在固体载体上固定化。未结合的或在固体载体上固定化的至少一种合成糖(i)用于诊断由流感嗜血杆菌b型引起的脑膜炎、肺炎和会厌炎。

糖(i)用于诊断由流感嗜血杆菌b型引起的脑膜炎、肺炎和会厌炎的用途是基于检测对至少一种通式(i)的糖特异性的抗体的存在。从而，包含至少一种通式(i)的糖的诊断装置用于诊断由流感嗜血杆菌b型引起的脑膜炎、肺炎和会厌炎。

还优选的是，用于由流感嗜血杆菌b型引起的脑膜炎、肺炎和会厌炎的式(i)糖是实质上纯的，具有≥95％，优选≥96％，更优选≥97％，还更优选≥98％，和最优选≥99％的纯度。

对于选择测试系统存在不同的可能性，其中式(i)糖用于诊断由流感嗜血杆菌b型引起的脑膜炎、肺炎和会厌炎。根据本发明出于诊断意图进行的测试可以是免疫测试比如固相酶免疫测定(eia)，酶联免疫吸附测试(elisa)、特别是"间接"elisa或放射性免疫测试(ria)。为了将式(i)糖用于所述测试，可以必需的是将式(i)的糖固定化在固体载体上。

从而本发明的其它实施方式是固体载体，其上借助经连接体或间隔物的共价附着固定化至少一种糖(i)。本发明的甚至其它实施方式是通过经-o-l-nh2基团的氮原子成共价键在固体载体上直接或间接固定化的糖(图2(b))。

因此，式(i)糖可以在固体载体上固定化的，特别用于诊断应用。本发明的一个优选实施方式是通过成共价键在固体载体上固定化的通式(i)的糖。本发明的一个特别优选实施方式是通过直接或间接成共价键在固体载体上固定化的通式(i)的糖。由此直接成共价键是特别优选的。

还优选的固体载体选自包含下述或由下述组成的组：载玻片，微滴定板，试验管，微球，纳米粒子或珠。

特别优选的是，固体载体是载玻片或微滴定板。微滴定板或微量培养板或微孔板是具有多个用作小试管的"孔"的平板。一般来说，能够使用具有6、24、96、384或甚至1536个样品孔的微滴定板。微量培养板从许多不同的物质比如用于pcr的微滴定板的聚碳酸酯制备。最常见的是聚苯乙烯，其用于大多数光学检测微量培养板。其能够通过加入二氧化钛着白色用于光学吸光度或发光检测，或者通过加入碳着黑色用于荧光生物学测试。

"直接成共价键"如本文所用是指通式(i)化合物的固定化：将通式(i)糖的官能团与制备固体载体的物质的官能团反应。优选的是，通式(i)糖的官能团是如前文-o-l-nh2中所定义的胺。固体载体的可能反应性官能团可以是：苯基，氨基，羟基，硫醇，羰基，羧基，乙烯基，卤化物比如氟化物、氯化物、溴化物和碘化物，马来酰亚胺；琥珀酰亚胺酯。

"间接成共价键"如本文所用是指通式(i)糖在固体载体上固定化，其中通式(i)糖共价连接至介导与固体载体的固定化的第二化合物。优选的是该第二化合物是不导致免疫反应的蛋白质。重要的是，第二化合物本身最可能不被患者血液或血清中存在的任何抗体结合从而避免假阳性结果。进一步地，第二化合物应能够在固体载体上通过成共价键或成非共价键固定化。优选的是该第二化合物选自包含下述或由下述组成的组：牛血清白蛋白(bsa)，人血清白蛋白(has)，明胶或酪蛋白。因此，使用间接成共价键的固定化优选涉及通式(i)糖与作为第二化合物的蛋白质成共价键(例如用蛋白质的游离氨基)并且随后所述蛋白质通过在固体载体与蛋白质之间成共价键或非共价相互作用结合至固体载体。可能非共价相互作用是：氢键，离子键，范德华力和疏水相互作用。许多聚合物比如聚苯乙烯和聚丙烯具有疏水性。当然也有制造商供给固体载体，其具有为不同粘着条件优化的专门表面。

然而，固定化、特别是用间接成共价键固定化还可以通过强粘着发生。从而，根据本发明的有效固定化可以不仅通过成化学键实现而且还通过涉及物理吸附的固定化实现。作为物理吸附的关键特征起作用的现象是，粘着力是由范德华力引起的。术语"未键合的"是指除成共价键外的成键。

根据本发明的作为固定化形式的化学吸附使用在固体载体与式(i)糖之间的化学键。所述键可以是共价的，但还可以是离子的。

在本发明的优选实施方式中，式(i)糖在固体载体上的固定化通过直接成共价键实现，亦即在这两种反应物之间的化学反应，优选取代反应。在本发明的更优选实施方式中，固体载体用能够在与本发明化合物反应时离开固体载体的官能团修饰。所述官能团可以直接结合至固体载体的组成分子，或者可以结合至连接体，所述连接体直接结合至固体载体的组成分子。从而，在本发明的更优选实施方式中固体载体经修饰携带适宜的离去基团。适宜的离去基团可以是卤化物比如氯化物、溴化物和碘化物；氢氧化物，肟，马来酰亚胺，琥珀酰亚胺，醇和酯。所述离去基团可以是或可以掺入马来酰亚胺；α-碘乙酰基；α-溴乙酰基；n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)和2-吡啶二硫醇。在更优选实施方式中，固体载体上的离去基团能够与胺、醇和硫醇反应，优选在质子交换时反应。在本发明的最优选实施方式中，固体载体用琥珀酰亚胺基氢氧化物官能团、更优选n-琥珀酰亚胺基氢氧化物官能化，其在与本发明化合物作为n-羟基琥珀酰亚胺反应时将离开固体载体。

通过引入适宜离去基团修饰固体载体优选进行如下：将未修饰的载体与反应性双官能分子、优选两个官能团之间具有分子桥或间隔物臂的双官能分子反应。在本发明的优选实施方式中易与固体载体反应的官能团包含磺基琥珀酰亚胺酯和琥珀酰亚胺。

双官能连接分子的又一个优选方面是提供意在与式(i)糖结合的官能团的能力，其具有与固体载体的适当距离。所述适当距离通过适宜长度的分子桥或间隔物臂提供。上述分子桥或间隔物臂可以具有优选(10^-10m)至10nm，更优选至和最优选至的长度。

用于修饰固体载体的适宜的反应性双官能分子包含n-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-gmbo)，琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-sian)，琥珀酰亚胺基-3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(sbap)，二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(dsg)，2-吡啶基二硫醇-四氧杂十四烷-n-羟基琥珀酰亚胺(peg-4-spdp)。

还存在可商购的固体载体，其制备自具有为成共价键而引入的反应性官能的聚合物。一个实例是thermoscientific命名为covalink^tmnh的微量培养板，其允许通过仲胺基团共价结合。

本发明的又一方面是包含通过成共价键在固体载体上固定化的至少一种合成通式(i)的糖的诊断装置用于诊断由流感嗜血杆菌b型引起的脑膜炎、肺炎和会厌炎的用途。

试剂盒

本发明的一个实施方式涉及试剂盒，包含通过成共价键在固体载体上固定化的至少一种通式(i)的糖或者用于在固体载体上固定化的通式(i)的糖。所述至少一种通式(i)的糖可以用作所述测试中的标记物。本发明的又一实施方式涉及试剂盒，包含对通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)中任一的糖的至少一种抗体。

在分子生物学或在医学诊断学中的试剂盒是一种包装，其包括进行某些方法或单个步骤的全部必需成分。通常不包括在任何标准分子生物学或医学实验室存在的标准化学品。但是，可以需要这些标准化学品中的某些来适宜地进行诊断或固定化。应理解的是，全部成分所提供的数量允许所希望反应对多数科学、诊断和工业应用来说合适地执行。

常常但并不总是地，这些成分在已经制备的溶液中提供，即用或接近即用。可以还存在已经一起加入的不同成分的组合。又一优势是这种试剂盒是经证实的。因此操作员并不需要再次证实诊断方法的可行性和能够节省至少一些对照实验。因此在研究、诊断和工业中，试剂盒是在实验室中很普及的工具。

根据本发明的上述试剂盒将包括至少下述组分：

a)固体载体，其上固定化至少一种通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)糖

b)至少一种抗体，比如检测抗体

c)标准溶液

或根据本发明的试剂盒将包括至少下述组分：

a’)固体载体，其上固定化对通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)糖的至少一种抗体

b)至少一种其它抗体，比如检测抗体

c)标准溶液

下述组分还可以包括在所述试剂盒中：

d)阻断溶液

e)洗涤溶液

f)样品缓冲剂

试剂盒中的抗体可以是特异性抗体，其能够用作捕获抗体。但优选其至少是酶连接的二抗，用作特异性地结合抗体的fc区域的检测抗体。为了定量测定，将样品的光密度(od)或荧光与标准曲线比较，其一般是已知浓度的靶标分子的溶液(标准溶液)的系列稀释。阻断溶液可以是非反应蛋白质比如牛血清白蛋白或酪蛋白的溶液，将其添加以阻断孔中的仍未经抗原包覆的任何塑料表面。洗涤溶液用来除去未结合的组分。样品缓冲剂可以用来稀释患者样品(血液、血清、尿)，从而使靶标分子浓度位于所用试验系统能够通常检测的范围。

如果试剂盒将允许将通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)糖在固体载体上固定化，则该试剂盒应包括至少：

a)至少一种通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)中任一的糖，或对至少一种通式(i)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)、(iii-1)、(iii-2)、(iv-1)和(iv-2)合成糖的抗体

b)固体载体，比如微量滴定板或微阵列载玻片

由此固体载体可以被修饰，例如固体载体可以用如上文描述的连接体分子官能化。

下述组分还可以包括在所述试剂盒中：

c)阻断溶液

d)洗涤溶液

e)反应缓冲剂

附图描述

图1：根据本发明的可商购的转接分子。

图2：(a)与载体蛋白质缀合的糖；(b)固体载体上缀合的糖。

图3：2'-甲氧基核糖基核糖醇磷酸四聚体29缀合至crm197和半胱氨酸的合成方案。

图4：(a)在用0.1m氢氧化钠溶液处理20小时之后碎片化的hibcps和(b)作为参比的未处理hibcps的¹hnmr谱。比较显示hibcps在碱性条件下在20小时内完全水解。

图5：在用0.1m氢氧化钠溶液处理20小时之后碎片化的hibcps的(a)hplc色谱图和(b)esi质谱。

图6：用处理在37℃(a)7天之后和(b)2天之后以及在室温下(d)7天之后和(e)2天之后hibcps的hplc色谱图。未处理的hibcps的hplc色谱图示于(c)。

图7：(a)用(b)用磷酸铝、(c)用水在37℃处理7天之后化合物16的hplc色谱图。未处理的化合物16和8的hplc色谱图示于(d)和(e)。

图8：(a)用(b)用磷酸铝、(c)用水在2-8℃处理7天之后化合物16的hplc色谱图。未处理的化合物16和8的hplc色谱图示于(d)和(e)。

图9：(a)用(b)用磷酸铝、(c)用水在室温下处理7天之后化合物16的hplc色谱图。未处理的化合物16和8的hplc色谱图示于(d)和(e)。

图10：(a)用(b)用磷酸铝、(c)用水在70℃处理7天之后化合物16的hplc色谱图。未处理的化合物16和8的hplc色谱图示于(d)和(e)。

图11：(a)用(b)用磷酸缓冲剂、(c)用水在室温下处理14天之后化合物30的hplc色谱图。未处理的化合物30，16和8的hplc色谱图示于(d)，(e)和(f)。

图12：(a)用(b)用磷酸缓冲剂，(c)用水在2-8℃处理14天之后化合物30的hplc色谱图。未处理的化合物30，16和8的hplc色谱图示于(d)，(e)和(f)。

图13：(a)化合物30在用0.1m氢氧化钠溶液处理3天之后；(c)化合物16在用0.1m氢氧化钠溶液处理3天之后的hplc色谱图，未处理的化合物30，16和8的hplc色谱图示于(b)，(d)和(e)。

图14：(a)缀合至crm197的化合物30和(b)化合物94的maldi质谱图。

图15：在磷酸缓冲剂存在下的化合物94的hplc-sec色谱图。

图16：显示缀合物94的结构。

图17：聚糖阵列分析：(a)化合物19，24，29，53和62与抗体(hib人参比血清)的结合，在hibprp抑制剂存在下(灰色柱状图)或无抑制剂(黑色柱状图)，在21天之后；(b)化合物19，24，29，53和62与抗体(兔分型血清)的结合，在hibprp抑制剂存在下(灰色柱状图)或无抑制剂(黑色柱状图)，在21天之后；通过用化合物94(c)和具有alhydrogel的化合物94(d)免疫而提高的化合物19，24，29，53，62和作为参比的天然hibprp与抗体的结合，在35天之后。误差柱代表一式四份样品的标准偏差。

图18：elisa研究：用未辅佐的缀合物94免疫(■)，用alhydrogel辅佐的缀合物94免疫(▲)，用pbs/alhydrogel辅佐的缀合物94免疫(●)和用辅佐的缀合物94免疫的来自兔子的igg抗体(n＝4)与包覆天然hibprp抗原的板的结合，在0天之后(a-阴性对照)，14天之后(b)，21天之后(c)和35天之后(d)。血清用1％bsa-pbs稀释5倍。将稀释血清(100μl)加入用1μg的hib-prp多糖包覆的微量滴定板的每个孔中，用稀释至1:10000的hrp缀合的山羊抗-兔二抗检测，和用tmb显影。吸光度于450nm测量和数据用graphpadprism软件作图。

图19：elisa研究：用未辅佐的缀合物94免疫(■)，用alhydrogel辅佐的缀合物94免疫(▲)，用pbs/alhydrogel辅佐的缀合物94免疫(●)和用辅佐的缀合物94免疫的来自兔子的igg抗体(n＝4)与预涂层天然hibprp抗原的商业adi板的结合，在0天之后(a-阴性对照)，14天之后(b)，21天之后(c)和35天之后(d)。血清用1％bsa-pbs稀释5倍。将稀释血清(100μl)加入用1μghib-prp多糖包覆的微量滴定板的每个孔中，用稀释至1:10000的hrp缀合的山羊抗-兔二抗检测和用tmb显影。吸光度于450nm测量和数据用graphpadprism软件作图。

包括下述实施例以展示本发明的优选实施方式。本领域技术人员应认识到，下述实施例中公开的技术遵循发明人发现的技术良好地在本发明实践中起作用，并且从而能够视为构成其实施的优选模式。然而，鉴于本公开，本领域技术人员应理解在已公开的特定实施方式中能够进行许多变化，并且仍然获得相同或相似的结果而不背离本发明的主旨和范围。

鉴于本申请的描述，本发明的进一步变型和各方面的备择实施方式对本领域技术人员来说是明显的。相应地，本说明书仅解释为示例性的并且用于教导本领域技术人员进行本发明的一般方式的意图。应理解，本文显示和描述的本发明的形式是实施方式的实例。要素和物质可以取代本文说明和描述的那些，部分和过程可以颠倒，并且本发明的某些特征可以独立地使用，在获益于本发明的描述之后这全部对本领域技术人员来说是明显的。可以对本文描述的要素进行可以而不背离权利要求中描述的本发明主旨和范围。

实施例

化学合成

缩写：

tlc：薄层色谱，etoac：乙酸乙酯，dcm：二氯甲烷，rbf：圆底烧瓶，acn：乙腈，acoh：乙酸，tbaf：氟化四丁基铵，bnbr：苄基溴，dmap：二甲基氨基吡啶，ptfe：聚四氟乙烯，aibn：偶氮二异丁腈，thf：四氢呋喃，nap：2-萘基甲基，lev：乙酰丙酰基。

化学合成的一般信息

商业试剂不加进一步纯化使用，除了注明的以外。溶剂在使用前以通常方式干燥和再蒸馏。全部反应在炉干燥的玻璃仪器中于惰性气氛下进行，除非另有说明。分析薄层色谱法(tlc)在预涂层0.25mm厚硅胶的硅胶60f254铝板上进行。tlc板用紫外光并用hanessian溶液(含水硫酸中的硫酸铈和钼酸铵)或硫酸-乙醇溶液染色来可视化。柱色谱法在fluka硅胶60(230-400目)进行。旋光(or)用schmidt&haenschunipoll1000旋光仪于g/100ml表示的浓度(c)测量。¹h和¹³cnmr谱图用varian400-mr或varian600光谱仪测量，用me4si充当内标。nmr化学位移(δ)以ppm记录和偶联常数(j)以hz报告。高分辨率质谱图(hrms)用agilent6210esi-tof质谱记录。

一般程序a)二甲硅烷基氧基脱保护

在室温下在10mlrbf(炉干)中在氩气氛下，将tbaf(0.21ml，0.21mmol)和acoh(7μl，0.11mmol)加入搅拌的原料(0.073mmol)的thf(1.5ml)溶液。反应混合物在室温下搅拌4小时。反应通过tlc监测。在原料完全消耗之后，反应混合物用dcm(10ml)稀释和减压浓缩，获得粗制产品。粗制产品进行自动化快速色谱法，用etoac/正己烷(20-60％)作洗脱液。从含有产品的试管减压浓缩溶剂(基于tlc)，获得无色油状物。

一般程序b)用bu2sno苄基化

在室温下在10mlrbf(炉干)中在氩气氛下，将ag2o(0.116g，0.5mmol)和bnbr(8μl，0.07mmol)加入搅拌的原料(0.063mmol)的dcm(1ml)溶液。反应混合物保持在室温下搅拌6小时。反应通过tlc监测。在原料完全消耗之后反应混合物用dcm(30ml)稀释和过滤通过c盐垫和减压浓缩滤液，获得粗制产品。粗制产品通过自动化快速色谱法纯化，用etoac/正己烷(0-50％)作洗脱液。从含有产品的试管减压浓缩溶剂(基于tlc)，获得无色油状物。

在室温下在氩气氛下配有搅拌子和在1400rpm搅拌，将bu2sno(2.42g，9.73mmol)加入二醇原料(4.6g，6.48mmol)的甲苯(50ml)澄清溶液。然后将反应混合物在130℃保持回流6小时。在6小时之后，减压除去溶剂和反应与甲苯共沸干燥(5x10ml无水甲苯)。在完全除去溶剂之后，缩醛减压干燥20分钟。在氩存在下从真空除去缩醛和溶于dmf(50ml)。向该溶液加入bnbr(1.16ml，9.73mmol)和tbai(4.78g，12.96mmol)，反应混合物保持在100℃搅拌20小时。反应通过tlc监测(40％etoac/正己烷)。在20小时之后，反应混合物用etoac(50ml)和水(20ml)稀释。分开水层和用etoac(2x30ml)洗涤。经合并的有机层在na2so4(～2g)上干燥，过滤，和减压浓缩滤液，获得粗制产品。粗制产品通过柱色谱法在硅胶上纯化，用etoac/正己烷(梯度0至30％)作洗脱液。从试管浓缩溶剂引起无色油状物(3.8g，73％)。

一般程序c)用lev保护

在氩气氛下在25mlrbf中，向羟基化合物(0.195mmol)的dcm(3ml)溶液加入乙酰丙酸(0.3mmol，30μl)，n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.3mmol，58mg)和dmap(0.2mmol，24mg)。所得反应混合物在室温下搅拌2小时。反应通过tlc监测。在完全消耗原料之后，反应混合物用dcm(10ml)稀释和用盐水洗涤(5ml)。水层用dcm(2x5ml)萃取。有机层在na2so4(0.2g)上干燥，过滤，和减压浓缩滤液，获得粗制产品。粗制产品通过自动化快速色谱法纯化，用etoac/正己烷(0-50％)作洗脱液。从含有产品的试管减压浓缩溶剂(基于tlc)引起白色油状物。

一般程序d)nap脱保护

在0℃在10mlrbf(炉干)中在氩气氛下，向nap保护的化合物(0.048mmol)的二氯甲烷：h2o(1.8：0.2ml)溶液加入2.3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(14mg，0.058mmol)。在室温下搅拌反应混合物1.5小时。反应通过tlc监测。反应用dcm(10ml)稀释和用nahco3饱和水溶液(5ml)和盐水(5ml)萃取。有机层在na2so4(0.2g)上干燥，过滤，和减压浓缩滤液15分钟，获得粗制产品。粗制产品通过自动化快速色谱法纯化，用etoac/正己烷(0-80％)作洗脱液。从含有产品的试管减压浓缩溶剂(基于tlc)引起白色油状物。

一般程序e)磷酸盐/酯偶联：亚磷酰胺方法

在25mlrbf(炉干)中在氩气氛下，向3-oh化合物(0.054mmol)的dcm(1.2ml)溶液加入双(二异丙基氨基)-苄氧基膦(0.108mmol)和四唑化二异丙基铵(0.081mmol)，溶液在室温下搅拌1.5小时。反应通过tlc监测。反应混合物用dcm(10ml)稀释和用nahco3饱和水溶液(5ml)淬灭。水层用dcm(2x5ml)萃取。经合并的有机层用盐水洗涤(5ml)，在na2so4(0.5g)上干燥，过滤，和减压浓缩滤液，获得粗制产品。粗制产品在硅胶柱色谱上纯化(柱2x10cm)，用etoac/正己烷(0-30％)和2％三乙胺作洗脱液。从含有产品的试管减压浓度溶剂(基于tlc)引起黄色油状物。用甲苯(5ml)将产品转移至较小的rbf(10ml)和减压蒸发溶剂20分钟引起白色油状物。产品保留在高真空中10分钟，用氩冲洗和立即用于后续步骤。在10mlrbf(炉干)中在氩气氛下向亚磷酰胺(0.054mmol)的dcm(1.2ml)溶液加入5-oh化合物(0.036mmol)和0.45m的四唑acn溶液(0.24ml，0.108mmol)，溶液在室温下搅拌2小时。然后，在室温下加入5.0-6.0m的叔丁基过氧化物癸烷溶液(0.015ml，0.072mmol)，反应混合物搅拌1小时。反应混合物用dcm(10ml)稀释和用nahco3饱和水溶液(5ml)淬灭。水层用dcm(2x5ml)萃取。经合并的有机层用盐水洗涤(5ml)，在na2so4(0.3g)上干燥，过滤，和在35℃浴温的旋转式蒸发仪减压浓缩滤液15分钟，获得粗制产品。粗制产品通过自动化快速色谱法纯化，用etoac/正己烷(0-80％)。从含有产品的试管减压浓缩溶剂(基于tlc)引起无色油状物。

一般程序f)磷酸盐/酯与连接体偶联：亚磷酰胺方法(一锅程序)

在10mlrbf(炉干)中在氩气氛下向羟基化合物(0.016mmol)的dcm(1.0ml)溶液加入双(二异丙基氨基)-苄氧基膦(0.032mmol)和四唑化二异丙基铵(0.024mmol)和溶液在室温下搅拌1.5小时。然后，加入连接体(0.097mmol)和0.45m的四唑acn溶液(0.11ml，0.049mmol)和溶液在室温下搅拌2小时。反应通过tlc监测。然后，在室温下加入5.0-6.0m叔丁基过氧化物癸烷溶液(0.006ml，0.032mmol)和反应混合物搅拌1小时。反应通过tlc监测。反应混合物用dcm(5ml)稀释和用nahco3饱和水溶液(3ml)淬灭。水层用dcm(2x3ml)萃取。经合并的有机层用盐水洗涤(3ml)，在na2so4(0.2g)上干燥，过滤，和减压浓缩滤液，获得粗制产品。粗制产品通过自动化快速色谱法纯化，用etoac/正己烷(0-80％)。从含有产品的试管减压浓缩溶剂(基于tlc)引起无色油状物。

合成中应用下述连接体：

一般程序g)lev脱保护

向lev保护的化合物(0.060mmol)的dcm(2ml)溶液加入溶于乙酸(0.08ml)和吡啶(0.12ml)溶液的水合肼(0.267mmol，13μl)。所得反应混合物在室温下搅拌2小时。反应通过加入丙酮猝灭(0.5ml)和减压除去溶剂，获得粗制产品。粗制产品通过自动化快速色谱法纯化，用etoac/正己烷(0-80％)作洗脱液。从含有产品的试管减压浓缩溶剂(基于tlc)引起白色油状物。

一般程序h)氢化

在配有搅拌子的10ml圆底烧瓶中向保护的化合物(20mg)的etoac：meoh：h2o：acoh(1.0:0.5:0.25:0.125，1.825ml)溶液加入钯/碳(20mg)。溶液借助气球用氢冲洗2分钟和在室温下在氢压力下搅拌40小时。反应过滤通过ptfe滤器(0.45μm)和烧瓶用h2o：meoh溶液(1:1，5ml)洗涤。减压浓缩滤液，获得粗制产品。粗制产品在seppakc18ec(小)上纯化，用100％h2o，h2o：meoh(1:1)和100％meoh作洗脱液。从含有主要产品的小瓶浓缩溶剂，在冻干器中过夜，引起白色固体。

实施例a.糖基化

实施例a-1.化合物4

2,3,4-三-o-苄基-5-o-(2-萘基甲基)-1-o-d-核糖醇2(40g，71.08mmol)与无水甲苯共蒸和减压干燥。在氩气氛下将搅拌的2的无水dcm(320ml)溶液冷却至0℃和滴加bf3·et2o(19.3ml，156.38mmol)。在5分钟之后，将1,2,3,5-四-o-乙酰基-β-d-核呋喃糖1(15.08g，47.38mmol)的甲苯(480ml)溶液在45分钟内加入。反应混合物温热至室温和搅拌2小时。反应通过tlc监测。反应混合物通过加入三乙胺猝灭(50ml)和用dcm(200ml)稀释。反应混合物用nahco3饱和水溶液(200ml)洗涤和水层用dcm(2x150ml)萃取。经合并的有机层用nacl饱和水溶液(100ml)洗涤和在na2so4(～20g)上干燥，过滤，和减压浓缩滤液，获得粗制产品。粗制产品4在硅胶柱色谱上纯化，用etoac/正己烷(20-30％)作洗脱液。从含有产品的试管减压浓缩溶剂引起黄色油状物。在250mlrbf(炉干)中在氩气氛下将产品(31.05g，37.82mmol)然后再溶于甲醇(70ml)和加入25％wt的甲醇钠甲醇溶液(4.09ml，18.91mmol)。溶液在室温下搅拌4小时。反应通过tlc监测。反应混合物通过加入amberliteir-120h(500mg)中和(ph7)，过滤和减压蒸发溶剂，获得粗制产品。粗制产品在硅胶柱色谱上纯化，用etoac/正己烷(50-100％)作洗脱液。从含有产品4的试管减压浓缩溶剂引起黄色油状物(11.46g，35％，2步)。hrms(esi⁺)计算值c42h46o9na⁺[m+na]⁺717.3040，实测值717.3057。

实施例a-2.化合物5

在100mlrbf(炉干)中在氩气氛下将1,3-二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷(8.2g，11.79mmol)滴加至三醇4(3.53g，11.2mmol)和咪唑(3.05mg，44.8mmol)的乙腈(70ml)溶液。反应通过tlc监测。在室温下搅拌10分钟之后，反应混合物通过加水猝灭(10ml)和用dcm(50ml)和水(20ml)稀释。分开水层和用dcm(2x30ml)洗涤。经合并的有机层在na2so4(～2g)上干燥，过滤，和减压浓缩滤液，获得粗制产品。粗制产品通过自动化快速色谱法纯化，用etoac/正己烷(0-30％)作洗脱液。从含有产品5的试管减压浓缩溶剂引起无色油状物(8.4g，76％)。hrms(esi⁺)计算值c54h72n2o10si2na⁺[m+na]⁺959.4562，实测值959.4590。

实施例b.2'-甲氧基聚核糖基核糖醇磷酸

实施例b-1.化合物6

在室温下在25mlrbf(炉干)中在氩气氛下将ag2o(6g，26.0mmol)加入搅拌的醇5(3.5g，3.73mmol)的mei(6ml)溶液。反应混合物搅拌2.5天。反应通过tlc监测。在原料完全消耗之后，反应混合物用dcm(50ml)稀释和过滤通过垫和减压浓缩滤液，获得粗制产品。粗制产品在硅胶柱色谱上纯化，用etoac/正己烷(0-20％)作洗脱液。从含有产品的试管减压浓缩溶剂引起无色油状物6(3.0g，85％)。hrms(esi⁺)计算值c55h74n2o10si2na⁺[m+na]⁺973.4718，实测值973.4738。

实施例b-2.化合物7

根据一般程序a)将硅烷化的化合物6转化为二醇产品7(4.6g，96％)。hrms(esi⁺)计算值c43h48o9na⁺[m+na]⁺731.3196，实测值731.3217。

实施例b-3。化合物8

根据一般程序h)，将单体7转化为脱保护的单体8(5mg，67％)。hrms(esi⁺)计算值c11h22o9na⁺[m+na]⁺321.1162，实测值321.1187。

实施例b-4.化合物9

在氩气氛下在0℃将苄基溴(77mg，0.45mmol)和氢化钠(16mg，0.672mmol)加入搅拌的二醇7(80mg，0.112mmol)的thf：dmf(1.5:0.2，1.7ml)溶液。反应温热至室温和搅拌过夜。反应混合物用冰冷水(1ml)淬灭和用etoac(3x10ml)萃取。经合并的有机层在na2so4(～0.5g)上干燥，过滤，和减压浓缩滤液，获得粗制产品。粗制产品通过快速色谱法纯化，用etoac/正己烷(0-50％)作洗脱液。从含有产品9的试管减压浓缩溶剂引起无色油状物(75mg，75％)。hrms(esi⁺)计算值c57h60o9na⁺[m+na]⁺911.4135，实测值911.4162。

实施例b-5.化合物10

根据一般程序d)，将nap保护的中间体9转化为5-羟基化合物10(189mg，89％)。hrms(esi⁺)计算值c46h52o9na⁺[m+na]⁺771.3509，实测值771.3521。

实施例b-6.化合物11

根据一般程序b)将二醇7转化为苄基化的产品11(3.8g，73％)。hrms(esi⁺)计算值c50h54o9na⁺[m+na]⁺821.3666，实测值821.3672。

实施例b-7.化合物12

根据一般程序c)，将3-羟基中间体11转化为lev保护的化合物12(1.75g，97％)。hrms(esi⁺)计算值c55h60o11na⁺[m+na]⁺919.4033，实测值919.4062。

实施例b-8.化合物13

根据一般程序d)，将nap保护的中间体12转化为5-羟基化合物13(1.23g，80％)。hrms(esi⁺)计算值c44h52o11na⁺[m+na]⁺779.3407，实测值779.3431。

实施例b-9.化合物15

根据一般程序e)，将3-羟基化合物11和5-羟基化合物10转化为二聚体15(60mg，95％)。hrms(esi⁺)计算值c103h111o20pna⁺[m+na]⁺1721.7304，实测值1721.7393。

实施例b-10.化合物16

根据一般程序h)，将二聚体15转化为脱保护的二聚体16(5.6mg，77％)。hrms(esi⁺)计算值c11h22o9na⁺[m+na]⁺681.1983，实测值681.2000。

实施例b-11.化合物17

根据一般程序d)，将nap保护的二聚体15转化为5-羟基化合物17(30mg，60％)。hrms(esi⁺)计算值c92h103o20na⁺[m+na]⁺1581.6678，实测值1581.6734。

实施例b-12.化合物18

根据一般程序e)，将二聚体17偶联至连接体5-叠氮基-戊醇，提供二聚体18(6mg，42％)。hrms(esi⁺)计算值c104h119n3o23p2na⁺[m+na]⁺1863.7641，实测值1863.7709。

实施例b-13.化合物19

根据一般程序h)，将二聚体18转化为脱保护的二聚体19(1.2mg，55％)。hrms(esi⁺)计算值c27h5o23p2na⁺[m+na]⁺846.2538，实测值846.2540。

实施例b-14.化合物20

根据一般程序e)，将3-羟基化合物11和5-羟基化合物13转化为二聚体20(1.5g，76％)。hrms(esi⁺)计算值c101h111o22pna⁺[m+na]⁺1729.7202，实测值1729.7240。

实施例b-15.化合物21

根据一般程序d)，将nap保护的中间体20转化为5-羟基化合物21(386mg，63％)。hrms(esi⁺)计算值c90h103o22pna⁺[m+na]⁺1589.6576，实测值1589.6613。

实施例b-16.化合物22

根据一般程序g)，将二聚体20转化为3-羟基二聚体22(473mg，74％)。hrms(esi⁺)计算值c96h105o20pna⁺[m+na]⁺1631.6835，实测值1631.6873。

实施例b-17.化合物23

根据一般程序e)，将3-羟基二聚体22偶联至连接体5-叠氮基-戊醇，提供二聚体23(3mg，30％)。hrms(esi⁺)计算值c108h121n3o23p2na⁺[m+na]⁺1912.7764，实测值1912.7781。

实施例b-18.化合物24

根据一般程序h)，将二聚体23转化为脱保护的二聚体24(1.1mg，76％)。hrms(esi⁺)计算值c27h5o23p2na⁺[m+na]⁺846.2538，实测值846.2540。

实施例b-19.化合物25

根据一般程序e)，将3-羟基二聚体22和5-羟基二聚体21转化为四聚体25(367mg，86％)。hrms(esi⁺)计算值c193h213o44p3na⁺[m+na]⁺3350.3540，实测值3350.3531。

实施例b-20.化合物26

根据一般程序d)，将nap保护的四聚体25转化为5-羟基四聚体26(125mg，75％)。hrms(esi⁺)计算值c182h205o44p3na⁺[m+na]⁺3210.2914，实测值3210.2911。

实施例b-21.化合物27

根据一般程序e)，将四聚体26偶联至连接体5-叠氮基-戊醇，提供四聚体27(35mg，77％)。hrms(esi⁺)计算值c194h221n3o47p4na⁺[m+na]⁺3491.3844，实测值3492.3787。

实施例b-22.化合物28

根据一般程序g)，将四聚体27转化为3-羟基四聚体28(30mg，90％)。hrms(esi⁺)计算值c189h215n3o45p4na⁺[m+na]⁺3393.3476，实测值3393.3543。

实施例b-23.化合物29

根据一般程序h)，将四聚体28转化为脱保护的四聚体29(10mg，73％)。hrms(esi⁺)计算值c49h97no45p4na⁺[m+na]⁺1566.4181，实测值1566.4174。

实施例b-24.化合物30

根据一般程序g)和一般程序h)，四聚体30以2步制备自四聚体26。

实施例b-25.化合物31

根据一般程序e)，将3-羟基二聚体22和5-羟基四聚体26转化为六聚体31(85mg，85％)。hrms(esi⁺)计算值c285h315o66p5na⁺[m/2+na]⁺2496.9888，实测值2496.0271。

实施例b-26.化合物32

根据一般程序d)，将nap保护的六聚体31转化为5-羟基六聚体32(50mg，65％)。hrms(esi⁺)计算值c274h307o66p5na⁺[m/2+na]⁺2426.9677，实测值2426.9977。

实施例b-27.化合物33

根据一般程序e)，将3-羟基二聚体22和5-羟基六聚体32转化为八聚体33(50mg，77％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ7.86-7.62(m，4h)，7.51-7.35(m，3h)，7.37-7.06(m，195h)，5.10(t，j＝5.5hz，1h)，5.03(dt，j＝7.6，4.2hz，7h)，4.97-4.77(m，22h)，4.69-4.37(m，60h)，4.36-4.14(m，23h)，3.98-3.55(m，47h)，3.53-3.36(m，13h)，3.34-3.21(m，24h)，2.72(t，j＝6.5hz，2h)，2.65-2.54(m，2h)，2.16(s，3h)。

实施例b-28.化合物34

根据一般程序d)，将nap保护的八聚体33转化为5-羟基八聚体34(35mg，73％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ7.43-7.07(m，195h)，5.10(t，j＝5.4hz，1h)，5.08-4.78(m，29h)，4.70-4.45(m，51h)，4.45-4.15(m，38h)，3.95-3.54(m，50h)，3.54-3.36(m，16h)，3.36-3.25(m，24h)，2.72(t，j＝6.5hz，2h)，2.65-2.56(m，2h)，2.16(s，3h)。

实施例b-29.化合物35-膦酸化学

在0℃在10mlrbf(炉干)中在氩气氛下向3-羟基化合物11(10mg)和咪唑(5.96mg，0.087mmol)的dcm(2ml)溶液加入pcl3(4.37μl，0.050mmol)和三乙胺(12.28μl，0.087mmol)。在5分钟之后，反应混合物温热至室温和搅拌1小时。反应通过tlc监测。反应用dcm(5ml)稀释，加入nahco3饱和水溶液(5ml)和三乙基铵缓冲溶液(5ml)猝灭。水层用dcm(2x10ml)萃取，经合并的有机层用盐水洗涤(5ml)。有机层在na2so4(0.25g)上干燥，过滤，和减压浓缩滤液，获得粗制产品。粗制产品在硅胶柱色谱上纯化，用10％meoh/dcm作洗脱液。从含有产品35的试管减压浓缩溶剂(基于tlc)引起黄色油状物(10mg，83％)。hrms(esi⁺)计算值c56h71no11sp⁺[m+h]⁺964.4765，实测值964.4759。

实施例b-30.化合物36

将h-膦酸盐35(10mg，0.010mmol)和化合物13(7.85mg，0.010mmol)溶于吡啶(1ml)。然后缓慢加入三甲基乙酰氯(3.83μl，0.031mmol)。在室温下搅拌反应混合物1小时。将碘(2.6mg，0.010mmol)的吡啶-水(96:4，v/v；67μl)溶液加入和反应在室温下再搅拌30分钟。反应混合物用ch2cl2(5ml)稀释，用饱和水溶液na2s2o3(5ml)洗涤，然后用1.0mteab溶液(5ml)洗涤。经合并的有机层在na2so4上干燥，过滤，和减压浓缩。残余物通过快速色谱法(dcm/meoh，10:1，v/v)纯化，产生36(5.5g，29％)，是无色油状物。hrms(esi⁺)计算值c94h104o22p⁺[m]^-1615.6762，实测值1615.7056。

实施例c.2'-脱氧聚核糖基核糖醇磷酸

实施例c-1.化合物37

在25mlrbf(炉干)中在氩气氛下向醇4(860mg，0.92mmol)的1,2-二氯乙烷(5ml)溶液加入硫羰基二咪唑(327mg，1.83mmol)。溶液在60℃搅拌64小时。反应通过tlc监测。减压蒸发溶剂，获得粗制产品。粗制产品通过快速柱色谱法纯化，用etoac/正己烷(0-30％)作洗脱液。从含有产品37的试管减压浓缩溶剂(基于tlc)引起白色油状物(950mg，98％)。hrms(esi⁺)计算值c58h74n2o10ssi2na⁺[m+na]⁺1069.4500，实测值1069.4525。

实施例c-2.化合物38

在100mlrbf(炉干)中在氩气氛下在60℃向bu3snh(0.49ml，1.814mmol)和aibn(0.2m的甲苯，0.46ml，0.091mmol)的甲苯(20ml)溶液滴加硫代氨基甲酸酯37(950mg，0.907mmol)的甲苯(20ml)溶液。搅拌反应混合物2小时。反应通过tlc监测。稀释反应混合物，用nahco3饱和水溶液(10ml)淬灭。水层用乙酸乙酯(2x20ml)萃取。经合并的有机层用盐水洗涤(10ml)，在na2so4(0.5g)上干燥，过滤，和减压浓缩滤液，获得粗制产品。粗制产品通过自动化快速色谱法纯化，用etoac/正己烷(0-50％)。从含有产品38的试管减压浓缩溶剂(基于tlc)引起无色油状物(510mg，61％)。hrms(esi⁺)计算值c58h72o9si2na⁺[m+na]⁺943.4613，实测值943.4640

实施例c-2.化合物39

根据一般程序a)将硅烷化的化合物38转化为二醇产品39(330mg，90％)。hrms(esi⁺)计算值c42h46o8na⁺[m+na]⁺701.3090，实测值701.3117。

实施例c-3.化合物40

根据一般程序b)将二醇39转化为苄基化的产品40(260mg，69％)。hrms(esi⁺)计算值c49h52o8na⁺[m+na]⁺791.3560，实测值791.3565。

实施例c-4.化合物41

根据一般程序c)，将3-羟基中间体40转化为lev保护的化合物41(135mg，82％)。hrms(esi⁺)计算值c54h58o10na⁺[m+na]⁺889.3928，实测值889.3928。

实施例c-5.化合物42

根据一般程序d)，将nap保护的中间体41转化为5-羟基化合物42(95mg，85％)。hrms(esi⁺)计算值c43h50o10na⁺[m+na]⁺749.3302，实测值749.3325。

实施例c-6.化合物44

根据一般程序e)，将3-羟基化合物40和5-羟基化合物42转化为二聚体44(160mg，78％)。hrms(esi⁺)计算值c99h107o20pna⁺[m+na]⁺1669.6991，实测值1669.6981。

实施例c-7.化合物45

根据一般程序d)，将二聚体44转化为5-羟基二聚体45(53mg，73％)。hrms(esi⁺)计算值c99h107o20pna⁺[m+na]⁺1529.6365，实测值1529.6397。

实施例c-8.化合物46

根据一般程序g)，将二聚体44转化为3-羟基二聚体46(85mg，91％)。hrms(esi⁺)计算值c94h101o18pna⁺[m+na]⁺1571.6623，实测值1571.6656。

实施例c-9.化合物49

根据一般程序e)，将3-羟基二聚体46和5-羟基二聚体45转化为四聚体49(96mg，83％)。hrms(esi⁺)计算值c189h205o40p3na⁺[m+na]⁺3230.3118，实测值3230.3111。

实施例c-10.化合物50

根据一般程序d)，将nap保护的四聚体49转化为5-羟基四聚体50(50mg，56％)。hrms(esi⁺)计算值c178h197o40p3na⁺[m+na]⁺3090.2492，实测值3090.2405。

实施例c-11.化合物51

根据一般程序e)，将四聚体50偶联至连接体5-叠氮基-戊醇，提供四聚体51(41mg，76％)。hrms(esi⁺)计算值c190h213n3o43p4na⁺[m+na]⁺3371.3421，实测值3371.3321。

实施例c-12.化合物52

根据一般程序g)，将四聚体51转化为3-羟基四聚体52(36mg，92％)。hrms(esi⁺)计算值c185h207n3o41p4na⁺[m+na]⁺3273.3053，实测值3273.3079。

实施例c-13.化合物53

根据一般程序h)，将四聚体52转化为脱保护的四聚体53(6mg，70％)。hrms(esi⁺)计算值c45h89no41p4na⁺[m+na/2]⁺723.1879，实测值723.1996。

实施例d.2'-n,n,-二甲基氨基羰基聚核糖基核糖醇磷酸

实施例d-1.化合物54

在室温下在氩气氛下向醇4(2.153g，2.299mmol)的dcm(10ml)溶液加入1,1'-碳酰二咪唑(145mg，4.598mmol)。搅拌反应混合物20分钟(cdi完全溶解)和通过tlc监测直至原料完全消耗。减压蒸发溶剂，提供粗制产品。粗制产品通过自动化快速色谱法纯化，用etoac/正己烷(0-100％)作洗脱液。从含有产品54的试管减压浓缩溶剂(基于tlc)引起无色油状物(2.35g，99％)。hrms(esi⁺)计算值c58h75n2o11si2⁺[m+h]⁺1031.4909，实测值1031.4936。

实施例d-2.化合物55

在室温下在氩气氛下将单体54(2.396g，2.32mmol)溶于acn(20ml)和加入me2nh(1.89g，23.2mmol)。反应混合物在室温下搅拌65小时和通过tlc监测。溶液通过c盐垫滤出和用dcm(50ml)洗涤。减压蒸发溶剂。所得固体在dcm(100ml)中溶剂化，有机溶液用盐水(100ml)洗涤和用na2so4(～2g)干燥。减压蒸发有机溶剂，提供粗制产品。粗制产品通过自动化快速色谱法纯化，用etoac/正己烷(0-100％)作洗脱液。从含有产品55的试管减压浓缩溶剂(基于tlc)引起无色油状物(2g，85％)。hrms(esi⁺)计算值c57h77no11si2na⁺[m+na]⁺1030.4933，实测值1030.4958。

实施例d-3.化合物56

根据一般程序a)将硅烷化的化合物55转化为二醇产品56(1.1g，73％)。hrms(esi⁺)计算值c45h51no10na⁺[m+na]⁺788.3411，实测值788.3431。

实施例d-4.化合物57

根据一般程序b)将二醇56转化为苄基化的产品57(91mg，16％)。hrms(esi⁺)计算值c52h57no10na⁺[m+na]⁺878.3880，实测值878.3930。

实施例d-5.化合物58

根据一般程序c)，将3-羟基中间体57转化为lev保护的化合物58(46mg，92％)。hrms(esi⁺)计算值c57h63no12na⁺[m+na]⁺976.4248，实测值976.4318。

实施例d-6.化合物59

根据一般程序d)，将单体58转化为5-羟基单体59(23mg，60％)。hrms(esi⁺)计算值c46h55no12na⁺[m+na]⁺836.3622，实测值836.3682。

实施例d-7.化合物60

根据一般程序e)，将单体59偶联至连接体5-叠氮基-戊醇，提供单体60(19mg，70％)。hrms(esi⁺)计算值c58h71n4o15pna⁺[m+na]⁺1117.4551，实测值1117.4628。

实施例d-8.化合物61

根据一般程序g)，将单体60转化为3-羟基单体61(12mg，71％)。hrms(esi⁺)计算值c53h65n4o13pna⁺[m+na]⁺1019.4183，实测值1019.4246。

实施例d-9.化合物62

根据一般程序h)，将单体61转化为脱保护的单体62(3mg，60％)。hrms(esi⁺)计算值c18h38n2o13pna⁺[m+h]⁺521.2112，实测值521.2125。

实施例e.2'-氟聚核糖基核糖醇磷酸

实施例e-1.化合物63

向丙酮中的化合物4加入2,2-二甲氧基丙烷(1.2当量)、随后樟脑磺酸(0.5当量)。在搅拌6小时之后，减压浓缩反应混合物，在柱色谱上纯化，提供纯化合物63。

实施例e-2.化合物64

化合物63在0℃用三氟甲磺酸酐和吡啶/dcm处理。在2小时之后，加入亚硝酸四丁基铵和亚硝酸钠和在室温搅拌混合物额外的5小时。将产品萃取入己烷(200ml)。萃取物用含水氢氧化钠(2n)、盐水洗涤，干燥(na2so4)和减压浓缩，提供褐色油状物。通过快速色谱法纯化(用己烷:乙醚洗脱)，提供64。

实施例e-3.化合物65

在-78℃将dast(二乙基氨基硫三氟化物)(1.2当量)滴加至搅拌的64的二氯甲烷溶液。用冷却浴原位让混合物温热至室温过夜。在20小时之后，将溶液缓慢倾倒入激烈搅拌的冰和过量碳酸氢钠饱和水溶液的混合物。在起泡停止的情况下，将产品萃取入己烷(200ml)。萃取物用含水氢氧化钠(2n)、盐水洗涤，干燥(na2so4)和减压浓缩，提供褐色油状物。通过快速色谱法纯化(用己烷:乙醚)洗脱，提供65。

实施例e-4.化合物66

将化合物65混入80％乙酸和在80℃搅拌2小时。在反应完成之后(tlc)，减压浓缩酸性溶液，提供粗制产品，将其通过柱色谱法纯化，产生化合物66。

实施例e-5.化合物67

根据一般程序b)将二醇66转化为苄基化的产品67。

实施例e-6.化合物68

根据一般程序c)，将3-羟基中间体67转化为lev保护的化合物68。

实施例e-7.化合物69

根据一般程序d)，将nap保护的中间体68转化为5-羟基化合物69。

实施例e-8.化合物71

根据一般程序e)，将3-羟基化合物67和5-羟基化合物69转化为二聚体71。

实施例e-9.化合物72

根据一般程序h)，将二聚体71转化为脱保护的二聚体72。

实施例e-10.化合物73

根据一般程序d)，将nap保护的二聚体71转化为5-羟基化合物73。

实施例e-11.化合物74

根据一般程序e)，将二聚体73偶联至连接体5-叠氮基-戊醇，提供二聚体74。

实施例e-12.化合物75

根据一般程序h)，将二聚体74转化为脱保护的二聚体75。

实施例f.2'-取代的聚核糖基核糖醇磷酸

实施例f-1.化合物76

根据一般程序e)，将3-羟基化合物67和5-羟基化合物69转化为二聚体76。

实施例f-2.化合物77

根据一般程序d)，将nap保护的中间体76转化为5-羟基化合物77。

实施例f-3.化合物79

根据一般程序e)，将3-羟基二聚体22和5-羟基二聚体77转化为四聚体79。

实施例f-4.化合物80

根据一般程序d)，将nap保护的四聚体79转化为5-羟基四聚体80。

实施例f-5.化合物81

根据一般程序e)，将四聚体80偶联至连接体5-叠氮基-戊醇，提供四聚体81。

实施例f-6.化合物82

根据一般程序g)，将四聚体81转化为3-羟基四聚体82。

实施例f-7.化合物83

根据一般程序h)，将四聚体82转化为脱保护的四聚体83。

实施例f-8.化合物85

根据一般程序e)，将3-羟基二聚体22和5-羟基二聚体45转化为四聚体85。

实施例f-9.化合物86

根据一般程序d)，将nap保护的四聚体85转化为5-羟基四聚体86。

实施例f-10.化合物87

根据一般程序e)，将四聚体86偶联至连接体5-叠氮基-戊醇，提供四聚体87。

实施例f-11.化合物88

根据一般程序g)，将四聚体87转化为3-羟基四聚体88。

实施例f-12.化合物89

根据一般程序h)，将四聚体88转化为脱保护的四聚体89。

实施例g.合成稳定化的糖-crm197-半胱氨酸缀合物

实施例g-1.化合物90

准备crm197用于缀合：将来自储备溶液的crm197(3.0mg，0.0517μmol)转移至amicon滤器(0.5ml，mwco30kda)和于10000rpm离心3分钟。将300μl1xpbs加至amicon滤器中剩余的蛋白质和于10000rpm再次离心3分钟。然后将400μl1xpbs缓冲液(ph7.4)加至amicon滤器和于10000rpm离心3分钟。然后将含有蛋白质的滤器在新amicon微离心管(1.5ml)内颠倒和于1000rpm离心1分钟从而在微离心管中收集蛋白质(体积～＝100-120μl)。

缀合程序：在配有搅拌子的反应小瓶中在室温将1xpbs缓冲液中的crm197(～100μl)用1.3ml1xpbs缓冲液稀释。将3-(马来酰亚胺基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(0.688mg，2.58μmol)转移至i型玻璃-2ml反应小瓶，用20μldmso溶解，将其加入含有1xpbs缓冲液中的crm197的反应小瓶。在rt搅拌反应4小时。rm是透明无色溶液。

洗涤步骤：将反应混合物转移至amicon滤器(0.5ml，mwco30kda)和于10000rpm离心3分钟和重复该过程直至全部反应混合物都被转移和离心。然后将400μl1xpbs缓冲液加入反应小瓶，冲洗和将其转移至amicon滤器。该洗涤用400μlpbs缓冲溶液再重复四次。最终，含有crm197-马来酰亚胺的amicon滤器在新amicon微离心管(1.5ml)内颠倒和于1000rpm离心1分钟从而在微离心管中收集～130μlcrm197-马来酰亚胺。向其加入950μlpbs溶液(ph7.4)，将小瓶储存在2-8℃(总体积＝～1.08ml)。crm197-马来酰亚胺缀合物通过maldi、sds-page、westernblot、sec-hplc分析且蛋白质通过bca估计。crm197-马来酰亚胺缀合物通过maldi分析并且发现在21-24之间。bca估计也显示良好的蛋白质回收。sdspage显示crm-马来酰亚胺缀合物90比crm197分子量更高且稳定。westernblot显示crm抗-山羊抗体识别crm-缀合物90，而hib抗-兔抗体并未识别不含糖的crm-马来酰亚胺缀合物90。样品储存在2-8℃直至后续使用。

实施例g-2.化合物94糖-crm197-半胱氨酸缀合物

化合物94的合成路线描述于图3。

dtt方法：在室温下将化合物29(5mg，0.003mmol)溶于ph7.4pbs缓冲液(5ml)和加入dmso(2.5ml)中的dsp(二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯))(20mg，0.049mmol)过夜。此后，加入二硫苏糖醇(dtt)(4mg，0.025mmol)并将溶液在40℃再搅拌2小时。化合物91通过sephadexg-25柱色谱纯化(4.5mg，88％)。hrms(esi⁺)计算值c51h99no46p4s[m+2na+2k-4h]^-1736.2793，实测值1736.279。

准备糖-硫醇用于缀合：tcep方法：将100μltcep悬浮液移入1.5ml小瓶并加入300μl1xpbs溶液(ph7.4)。离心，除去上清溶液。并再用pbs洗涤1次。最终将残余物移入100μlpbs溶液并加至在2mli型玻璃小瓶中的pbs缓冲液(0.15ml)中的糖-二硫化物91(1.38mg，0.292μmol)。在室温用轨道摇动器轻柔振摇1小时。将rm转移至小瓶，将玻璃反应小瓶用200μlpbs溶液冲洗并转移至小瓶。离心，在2mli型玻璃小瓶中收集pbs溶液的上清液(～325μl)。将200μlpbs溶液加入残余物并充分混合，离心，收集上清液和再次转移至2mli型玻璃小瓶。因此，还原的硫醇78溶液的总体积是～525μl。保留～25μl用于分析。

缀合程序：在室温将1xpbs缓冲液(～850μl)中的crm197-马来酰亚胺90移入配有搅拌子的反应小瓶。将1xpbs缓冲液中的糖-硫醇92的pbs溶液(～500μl)滴加至crm197-马来酰亚胺90溶液。小瓶用50μlpbs溶液冲洗，在室温将溶液转移至反应混合物。rm是透明溶液和在室温搅拌20小时。[反应混合物的～40μl等分试样取出用于分析]。然后将磷酸缓冲剂(ph7.4，30μl)中的半胱氨酸(0.14mg)加至含有93的rm和在室温搅拌1小时。

洗涤步骤：将含有94的反应混合物转移至amicon滤器(0.5ml，mwco30kda)和于10000rpm离心3分钟，重复该过程直至全部反应混合物都被转移和离心。然后将400μl1xpbs缓冲液加入反应小瓶并冲洗，将溶液转移至amicon滤器。该洗涤用400μlpbs缓冲溶液再重复4次。最终，将含有crm197-马来酰亚胺-糖-半胱氨酸94的滤器在新amicon微离心管(1.5ml)内颠倒和于1000rpm离心1分钟从而在微离心管中收集～150μlcrm197-马来酰亚胺-糖-半胱氨酸。将200μlpbs溶液(ph7.4)加入amicon滤器并充分冲洗，将溶液转移至微离心管和用750μlpbs溶液(ph7.4)稀释溶液并将小瓶储存在2-8℃(总体积＝～1100μl)。将缀合物94的40μl等分试样用milliq水洗涤，使用amicon滤器并用maldi(芥子酸基质)分析并获得3.4-4.2的载量。缀合物94用sds-page、westernblot和sec-hplc进一步成功地分析。用bca方法蛋白质估计显示的是，缀合物中的良好蛋白质回收。

实施例h.稳定性测试

实施例h-1.hib荚膜多糖在碱性介质中的稳定性

本发明糖的稳定性研究对于开发稳定的液体hib糖缀合物疫苗来说是关键因素。作为对照，我们首先检查hib聚核糖基核糖醇磷酸荚膜多糖(cps)的稳定性和裂解。相应地，hibcps用标准程序碎片化，其描述于vaccine，2000，18，1982-1993：1mghibcps，在0.43ml的0.1mnaoh中，20小时。在纯化(过滤通过30kdaamicon过滤器随后脱盐)之后获得的片段通过¹hnmr、hplc和hrms分析。

图4a显示碎片化的hibcps的¹hnmr谱和图4b显示未处理的hibcps的¹hnmr谱。图5a显示碎片化的hibcps的hplc色谱图和图5b显示经处理的hibcps的esi质谱。该组初始实验展示的是，hibcps在碱性介质中被裂解为其最小的2和3-o磷酸片段。

实施例h-2.hib荚膜多糖在氢氧化铝悬浮液中的稳定性

建立对照hibcps的稳定性数据之后，研究hibcps在氢氧化铝中的稳定性，其已知在疫苗配制剂{0.5mghibcps，3ml(brentag)和22mlmilli-q水}于各种温度{37℃(a1)和rt(a3)}不稳定。在37℃在2天之后观察到裂解为最小片段而在室温在第7天之后观察到该图谱(图6)。由该实验确认的是，hibcps在商业疫苗所用的最常见佐剂氢氧化铝中取决于温度在2至7天内分解至2和3-o磷酸片段。

实施例h-3.化合物16的稳定性

在各种佐剂存在下进行合成的2'-甲氧基核糖基核糖醇磷酸二聚体16的稳定性研究。作为第一步，16的稳定性用al(oh)3、alpo4和水在各温度{37℃(a1)，2-8℃(a2)，rt(a3)和70℃(a4)}研究。

用于该研究的al(oh)3和alpo4的量类似商业hib疫苗中存在的量。在1周之后用hplc分析在不同温度的样品，示于图7-10。化合物16和8用作参比，原因是二聚体16的分解应导致单体8。每24小时从各小瓶取40μl溶液等分试样并于5000rpm离心4分钟。取上清液(25μl)上清液(25μl)用于hplc分析。即使在7天之后也并未观察到分解。由该研究清楚的是，2'-甲氧基核糖基核糖醇二聚体16在37℃(a1)、2-8℃(a2)、室温(a3)和在70℃稳定。

二聚体16的稳定性在含水碱性条件下进一步研究，如实施例h-1的应用。从图13d的hplc色谱图得出的结论是，二聚体16在4天之后完全裂解，而天然hibcps在20小时内就已经完全裂解。这展示的是，与天然hibcps相比，2'-甲氧基核糖基核糖醇磷酸低聚物甚至在极端碱性条件下都很稳定。

实施例h-4.化合物29的稳定性

合成的携带连接体29的2'-甲氧基核糖基核糖醇磷酸四聚体的稳定性研究在各种佐剂存在下进行。作为第一步，29的稳定性用al(oh)3、磷酸缓冲剂(pbs)和水在各种温度{2-8℃(a2)和室温(a3)}研究。

用于该研究的al(oh)3的量类似商业hib疫苗中存在的量。在1周之后用hplc分析在不同温度的样品，示于图11和12。化合物29、16和8用作参比，原因是四聚体29的分解应导致二聚体16和单体8。每24小时从各小瓶取40μl溶液等分试样并于5000rpm离心4分钟。取上清液(25μl)用于hplc分析。即使在7天之后也未观察到分解。由该研究清楚的是，2'-甲氧基核糖基核糖醇磷酸四聚体29在al(oh)3存在下、在磷酸缓冲剂(pbs)中和在水中在2-8℃(a2)和室温(a3)稳定。

四聚体29的稳定性在含水碱性条件下进一步研究，如实施例h-1的应用。从图13a的hplc色谱图得出的结论是，四聚体29在4天之后完全裂解，而天然hibcps在20小时内就已经完全裂解。这展示的是，与天然hibcps相比，2'-甲氧基核糖基核糖醇磷酸低聚物即使在极端碱性条件下也很稳定。

实施例h-5.缀合物94在磷酸缓冲剂存在下的稳定性

将2个小瓶中的～5μg化合物94各自稀释至500μlpbsph7.4；将1个小瓶储存在25℃而另1个储存在2-8℃。在1天之后和在15天之后，通过二辛可宁酸测试(bca)和hplc-sec(柱：tskgelg2000swxl，缓冲剂：50mm三，20mmnacl，ph7.2)分析样品。数据显示的是，在15天之后缀合物94仍然存在且在温度条件25℃和2-8℃均稳定。

实施例h-6.在氢氧化铝存在下化合物94的稳定性

含有～5μg化合物94和(0.125mg/dose)的两个小瓶各填充至500μlpbsph7.4；1个小瓶储存在25℃而另1个储存在2-8℃。在1天之后和在1周之后，通过二辛可宁酸测试(bca)、hplc-sec柱：tskgelg2000swxl，缓冲剂：50mm三，20mmnacl，ph7.2)、sds-page和westernblot分析样品。数据显示的是，～75％的缀合物94吸附在上并且所吸附的缀合物在两个温度条件均稳定。在该时间过程期间未观察到降解产品。

表1：在磷酸缓冲剂和氢氧化铝存在下缀合物94的bca测试。

实施例i.聚糖阵列分析

实施例i-1.兔子中的免疫

对兔子进行免疫实验(chongetal.infect.immun.,1997,p.4918-4925；fernández-santanaetal.science,2004,305(5683),p.522-525.)。兔子根据国际动物规章(eudirective2010/63/eu)培养和交易并且由政府部门(landesamtfürlandwirtschaft,lebensmittelsicherheitundfischereimecklenburg-vorpommern)核准。

每组4只兔子的四个组以初免-加强方案进行免疫，使用含有5μg糖29的未辅佐的缀合物94或用alhydrogel辅佐的缀合物94(含有5μghib糖29)。阴性对照组仅接受pbs/alhydrogel。阳性对照组接受批准的疫苗(5μgprp，相应于人类剂量的一半)，即天然prp与破伤风类毒素(tt)的缀合物。取得出血第21日的免疫前血清和抗血清(在两次免疫之后)并在聚糖阵列上分析。在三次给予之后获得acthib-特异性血清，与本发明hib类似物两次免疫比较。

实施例i-2.聚糖阵列分析

用s3微阵列点样器(scienion)将pbs中的糖印迹在n-羟基琥珀酰亚胺活化的载玻片(codelinkslides，surmodics)上。在湿度饱和室中温育载玻片过夜，用100mm乙醇胺、50mm磷酸钠(ph7.5)猝灭2小时，用水洗涤和干燥。

为了温育，用3％(w/v)bsa-pbs阻断载玻片1小时，用pbs和水洗涤，离心干燥。附上64孔温育网格。血清稀释于3％bsa-pbs、0.1％(v/v)吐温-20，在37℃温育15分钟，于3220rpm离心2分钟。将血清稀释液施用至载玻片和在室温下温育1小时。各孔用pbs+0.1％吐温-20(pbs-t)洗涤三次。将二抗(抗-兔iggfitc，抗-兔igmalexafluor647，抗-人igg-fcalexafluor488和igmalexafluor594)在室温在载玻片上温育30分钟，各孔用pbs-t洗涤两次，除去温育网格，载玻片用pbs和水洗涤。在离心干燥之后，载玻片用genepix4300a(moleculardevices)微阵列读数器扫描。

初次免疫应答通过聚糖阵列评价，筛选在第0天、第21天和第35天取回的血清样品。将2'-甲氧基核糖基核糖醇磷酸二聚体19，2'-甲氧基核糖基核糖醇磷酸二聚体24，2'-甲氧基核糖基核糖醇磷酸四聚体29，2'-脱氧核糖基核糖醇磷酸四聚体53和2'-二甲基氨基羰基核糖基核糖醇磷酸62以及天然hibprp印迹于nhs酯-活化的微阵列载玻片上。在用alhydrogel辅佐的和无佐剂的缀合物94免疫之后，在全部免疫兔子中检测到针对hibprp衍生物19、24、29、53和62的以及针对天然hibprp多糖的igg和igm亚型抗体。

聚糖阵列筛选也显示，人类参比血清(图17a)和兔分型血清(图17b)中存在的抗-hib抗体结合至hibprp衍生物19、24、29、53和62。天然hibprp的存在抑制hibprp衍生物19、24、29和62的结合，但并不抑制2'-脱氧核糖基核糖醇磷酸53的结合。

用alhydrogel辅佐的缀合物94首次免疫的21天之后以及用未辅佐的缀合物94首次免疫的35天之后可检测到血清igg抗体。抗体与天然hibprp多糖交叉反应指出这些抗体能够结合至流感嗜血杆菌细菌并赋予针对流感嗜血杆菌感染防护。

实施例j.elisa研究

●elisa板(高结合型，eia/ria板，96孔，平底配低蒸发盖，公司：3361)

●商业兔抗-hib-prpiggelisa组装物试剂盒(αlphadiagnosticintl.inc，#980-130-prg；lot：170531k5，过期：06/2018)

●抗原：来自流感嗜血杆菌b型的磷酸核糖基磷酸(prp)荚膜多糖(nibsc，code：12/306)

●试验血清：biogenesgmbh供给。

●检测抗体：山羊抗兔igg过氧化物酶缀合物(sigma，#a4914)。

●磷酸缓冲盐水(pbs)：室内制备自储备液(biochromgmbh，cat：l182-10)

●阻断溶液：1％fcs(v/v)，在pbs中。

●抗体稀释剂：pbs+1％bsa(w/v)。

●洗涤缓冲剂：pbs+0.1％吐温20(pbs-t)

●显影溶液：1step^tmultratmb-elisa显影剂。(thermoscientific，cat#：34028)

●停止溶液-2m硫酸(h2so4)(室内制备)

●读板器：anthosht2。

软件：winread2.36用于吸光度测量和graphpadprism7用于数据作图和分析。

实施例j-1.免疫计划和血清收集

全部免疫实验在biogenesgmbhberlin进行。实验组包括i)含alhydrogel的pbs(阴性对照)，ii)不含alhydrogel的化合物94，iii)含alhydrogel的化合物94，和iv)商业疫苗(阳性对照)。简言之，兔子(n＝4)以初免-加强方案免疫，其中各实验组的安排如表1中所述。在初免-加强方案之后免疫小鼠并在第0天(免疫前)、第14天、第21天和第35天收集血清。

表2.兔子的免疫计划和抗原剂量信息(n＝4)。

血清收集和处理：

来自不同实验组和各时间点的血清储存在-20℃。将来自特定实验组单个兔子的血清(20μl)汇集和储存在-20℃。作为分开的储备制备单个兔血清(20μl)的等分试样，储存在-20℃直至进一步使用。

实施例j-2.血清的酶联免疫吸附测试(elisa)，使用室内抗原包衣板

将板用抗原包衣：

将抗原hibprp荚膜多糖(储备浓度1mg/ml)稀释至在pbsph7.4中10μg/ml的工作抗原浓度。将100μl加入各孔(1μg抗原/孔)和在4℃温育过夜。

洗涤：

在吸附抗原过夜之后，各板用pbs-t(200μl/孔)洗涤3x和通过将板翻转除去每个孔的过量流体，在清洁的干燥纸巾上触拭。

阻断：

各板用300μl阻断溶液(pbs+1％fcs)在rt阻断2小时。

洗涤：

在阻断之后，各板用pbs-t(200μl/孔)洗涤3x和通过将板翻转除去每个孔的过量流体，在清洁的干燥纸巾上触拭。

稀释血清和温育：

将不同实验组的汇集的(n＝4兔子/组)免疫前和试验血清和单独的兔试验血清(n＝4)在抗体稀释剂(pbs+1％bsa)中稀释为其各自的稀释液。将不同实验组的100μl稀释血清样品(100一式两份地加入相应孔中和在rt在设为250rpm的摇动器上温育1小时。100μl/孔的抗体稀释剂(pbs+1％bsa)形成实验空白。在与血清温育之后，各板用pbs-t(200μl/孔)洗涤5x和通过将板翻转除去每个孔的过量流体，在清洁的干燥纸巾上触拭。

温育(检测抗体)：

将检测抗体即山羊抗-兔igg过氧化物酶在抗体稀释剂(pbs+1％bsa)中稀释1:10000并将100μl加至孔中和在rt在摇动器上于250rpm温育1小时。在与检测抗体温育之后，各板用pbs-t(200μl/孔)洗涤5x和通过将板翻转除去每个孔的过量流体，在清洁的干燥纸巾上触拭。

显影：

向各孔加入100μl即用tmb底物(从4℃标准化为rt)和避光温育15分钟。酶反应的蓝色通过加入100μl/孔的2mh2so4溶液停止，引起黄色溶液。用读板器于450nm测量黄色溶液的吸收，使用630nm的校正波长。吸收值通过用graphpadprism软件作图分析。

结果：

如图18a可见，全部实验组的免疫前血清的全部稀释不显示任何显著应答且读数等于0。在免疫后/试验血清中，第14天hiberix组(倒三角)显示免疫应答显著高于pbs对照组(实心圈)，其在第21天和第35天组中增加多至1:2500的滴定度(图18b-d)。在用辅佐的化合物94免疫的实验组(三角)中，抗体滴定度在第14天低于pbs组，其实质上增加至hiberix组的滴定度1:25000但是低1倍。尽管用未辅佐的化合物94免疫的实验组(方形)显示在第14天可与hiberix组比拟的免疫滴定度，在第21天时间点并未观察到加强应答，而辅佐的组显示加强应答。然而，在第二次加强之后，未辅佐的化合物94显示可与辅佐的组比拟的免疫滴定度，但是低于hiberix组。

实施例j-3.血清的酶联免疫吸附测试(elisa)，使用商业adi板

兔抗-hib-prpiggelisa试剂盒(adi)检测接种动物血清中的hib-prp特异性igg抗体。试剂盒包括用抗原hib-prp多糖预包覆的96孔微量滴定板，还提供洗涤缓冲液和过氧化物缀合的检测抗体。试剂盒也包括一组校准剂(0.5、1.0、2.5和5.0u/ml)和阳性对照/参比血清。校准剂提供对内部测试参数的控制并且区分1:50及以上的血清稀释中的假阳性。0.5u/ml值成为最低的可检测滴定度，而在该值以下的测试会是假阳性。测试以普通elisa形式按照生产商指导进行。简言之，在试剂盒提供的稀释剂中将待测试的血清稀释为1:100及以上的适当稀释范围。将100μl稀释血清以及校准剂、阳性对照和阴性对照加至预定的孔中和在室温下温育1小时。各孔然后用试剂盒洗涤缓冲剂洗涤4次，加入100μl检测抗体，再温育30分钟，随后洗涤5次。使各孔显影：加入100μltmb底物和温育15分钟随后用100μl停止溶液停止反应，引起黄色溶液。用微读板器于450nm测量黄色溶液的吸收，校正波长为630nm。吸收值用graphpadprism软件作图分析。

结果：

由于ph差异和其它生理化学因素hib-prp多糖(抗原)对水解很敏感，其可能导致elisa中抗原的较低检测。为了证实图18b-d观察到的免疫滴定度和排除由于抗原室内包衣而出现的异常，在预包覆hib-prp多糖的商业诊断板(advanceddiagnostics-adi)上筛选兔血清。如实施例j-2的描述，将来自不同实验组和时间点的兔免疫的血清稀释5-倍(1:100、500、2500和12500)并且分析多糖特异性igg抗体。如图19a所示，全部实验组的免疫前血清的全部稀释不显示任何显著应答和读数低于阈值。阈值是指0.5u/ml校准剂在相同板上操作所获得的吸收值，在该值之下能够视为阴性或假阳性。

在免疫后/试验血清中，第14天hiberix组(倒三角)，含(三角)和不含(方形)alhydrogel的化合物94显示低于阈值的免疫滴定度，即使是在最高稀释1:100亦如此(图19b)。然而，pbs对照组(实心圈)在1:100的最高稀释仅在第14天时间点就显示比阈值更高的信号，但是在第21天和第35天的全部其它时间点低于阈值。在室内包衣的抗原板中观察到相似趋势(图18b-d)。辅佐的化合物94(三角)和hiberix组(倒三角)在第21天和第35天时间点在分别多至1:500和1:2500的稀释显示饱和。佐剂效果和加强应答在含alhydrogel的化合物94组中清晰可见，原因是滴定度从第21天时间点1:2500显著增加至第35天时间点1:12500。在第35天可见，用辅佐的化合物94免疫的组显示与hiberix可比拟但低1倍的应答。然而，用未辅佐的化合物94免疫的组直到第21天都未检测到igg滴定度，但在第二加强之后显著增加多至1:2500。该趋势与在用室内抗原包衣的板中进行的elisa的观察类似(图18c，d)。

这些数据展示缀合物94的免疫原性。同种型交换指出t细胞依赖性的抗体应答。用alhydrogel辅佐的缀合物94首次免疫之后21天和用未辅佐的缀合物94首次免疫之后35天可检测到血清igg抗体。抗体与天然hibprp多糖交叉反应指出这些抗体结合至流感嗜血杆菌细菌并且赋予针对流感嗜血杆菌感染的防护的能力。