一种脂肪酶基因、载体、工程菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种脂肪酶的基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的基因工程菌，本发明还涉及所述的脂肪酶在制备(35)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。(二)
背景技术：
：脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)，系统名称为三脂酰甘油酰基水解酶(triacylglycerolacylhydrolase)，是一类催化三酯酰甘油的酯键水解的酶。脂肪酶具有多种催化功能，除能催化酯水解，还具有催化酯合成、转酯化、氨解、醇解等反应，在食品、洗涤、饲料、制革、生物能源、油脂加工、有机合成和对映体拆分等领域应用广泛。脂肪酶催化的反应除具有选择性高、副反应少，产物光学纯度高等特点外，还具有催化反应条件温和、绿色环保等优越性，这使得脂肪酶在光学纯化合物特别是手性药物的制备中具有独特的优势。脂肪酶生物催化已成为重要的手性化学品合成、特别是手性药物制备的重要技术手段。脂肪酶广泛存在于自然界中的各种生物体内，其中来源于微生物的脂肪酶容易获得、种类最多，且与动植物来源的脂肪酶相比，具有更广的温度和pH值适应范围，并且底物谱广，催化选择性高，因而微生物成为工业脂肪酶的重要来源。不同微生物来源的脂肪酶，通常具有不同的分子结构和催化特性。如来源于嗜热菌的热稳定脂肪酶，一般具有较强的溶剂稳定性，具有很好的生物技术和工业应用潜力。从嗜热菌中获得热稳定酶已成为学术界和工业界的研究热点。部分嗜热菌的脂肪酶基因已被克隆表达，并获得产酶活力较高的基因工程菌，但是在对已有脂肪酶进行研究的同时，开发新的、具有应用价值的微生物来源的脂肪酶是研究的热点，具有重要意义。(三)技术实现要素：本发明目的是提供一种脂肪酶、编码该酶的基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，及其在立体选择性水解2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。本发明采用的技术方案是：本发明提供一种来源于嗜热真菌TalaromycesdupontiiATCC16461的脂肪酶，所述脂肪酶的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示，其中1-22aa(MRSSLVLFFISAWTALARPVRR)为信号肽序列，其成熟肽由269aa组成。所述SEQIDNO：2所示氨基酸序列为：任何对SEQIDNO：2所示氨基酸序列中氨基酸进行缺失、插入或替换的处理获得的多肽片段或其变体，只要其与SEQIDNO：2所示氨基酸序列具有95％以上同源性，均属于本发明的保护范围。本发明还提供一种编码所述脂肪酶的基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO：1所示。该脂肪酶基因由如下方法得到：采用RT-PCR从TalaromycesdupontiiATCC16461菌中分离脂肪酶基因。采用TRIzol法提取T.dupontiiATCC16461总RNA，使用RT-PCRKit进行cDNA第一链的合成，反应体系及条件均参照试剂盒的使用说明。然后利用根据Thermomyceslanuginosus脂肪酶Ln(EU004196.1)的信号肽编码序列设计的引物，利用脂肪酶TLL(EU022703.1)、Ln(EU004196.1)和TTL(JF414585.1)的中间高同源性序列设计引物，PCR获得约600bp的5′-端脂肪酶序列。在此基础上，利用3′-RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)，扩增约650bp的3′-端脂肪酶编码序列，并进行序列分析、拼接，获得了一个长为876bp的开放阅读框(SEQIDNO：1)。所述SEQIDNO：1所示的核苷酸序列为：任何对SEQIDNO：1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸具有95％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。本发明提供一种含有所述脂肪酶编码基因的重组载体，及含有所述脂肪酶编码基因的重组基因工程菌。根据脂肪酶成熟肽编码序列，设计并合成引物，以cDNA为模板PCR克隆脂肪酶成熟肽基因序列，然后用限制性酶NcoI/XhoI进行双酶切，切胶回收后与同样酶切处理回收的pET-28b连接，构建了含有脂肪酶基因的重组质粒pET28-TDL。将重组质粒pET28-TDL转化至E.coliBL21(DE3)菌株中，获得工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28-TDL。本发明提供一种所述脂肪酶编码基因在制备脂肪酶中的应用，所述方法为：构建含有所述脂肪酶编码基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的基因工程菌进行诱导培养，从培养液分离得到含有重组脂肪酶的菌体细胞。此外，本发明还涉及一种所述来源于TalaromycesdupontiiATCC16461的脂肪酶在制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中应用，具体所述的应用以含有该脂肪酶的工程菌菌体或者湿菌体分离提取的酶作为酶源，以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以Ca(OAc)2为产物螯合剂(用于解除产物抑制剂)，以水或缓冲液为反应介质构成pH值为6.5～8.5(优选7.0)的转化体系，20～60℃(优选30℃)、150r/min条件下进行转化反应，反应结束后，获得的转化液即为含有(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的混合液，参照Martinez的方法(Org.ProcessRes.Dev.2008，12：392-398)即可从混合液分离纯化获得(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。所述底物的初始浓度为0.1～1.0mol/L转化体系(优选1mol/L)，所述催化剂的用量以干菌体质量计，终浓度为2～15g/L转化体系(优选10g/L)，Ca(OAc)2终浓度为20～200mmol/L转化体系(优选150mol/L)。进一步，所述催化剂按如下方法制备：将脂肪酶的基因工程菌接种至终浓度为50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，150rpm培养10h，获得种子液，再以体积浓度1％接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，150rpm培养至菌体浓度OD600为0.4～0.8，加入终浓度为0.1～0.5mM的IPTG，于20～30℃诱导培养6～20h后，离心，弃上清，收集沉淀，即获得含有脂肪酶的重组细胞。所述的脂肪酶可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶或者完全纯化的酶的形式使用。如果需要，还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的脂肪酶制成固定化酶或者固定化细胞。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种来源于T.dupontiiATCC16461的脂肪酶及其编码基因；该脂肪酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌。该重组大肠杆菌含有脂肪酶，可以利用重组大肠杆菌细胞为催化剂进行生物催化生产普瑞巴林关键手性中间体制备(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。本发明获得的脂肪酶对2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯具有极高的对映选择性，具有很好的工业应用前景。(四)附图说明图1为脂肪酶基因的RT-PCR琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道M为DL5000DNAMarker，泳道1为利用引物P1和引物P2扩增得到的脂肪酶基因5′-端片段，泳道2为利用引物P3和引物P4进行3′-RACE扩增得到的脂肪酶基因片段；图2为脂肪酶成熟肽编码基因的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图，泳道M为DL2000DNAMarker，泳道1为引物P5和引物P6扩增得到的脂肪酶成熟肽编码基因片段，泳道2为未加模板的阴性对照；图3为pET28-TDL重组质粒物理图谱；图4为工程菌诱导表达SDS-PAGE图，泳道M为蛋白质分子量Marker，泳道1为未诱导的E.coliBL21(DE3)/pET28-TDL，泳道2为IPTG诱导的E.coliBL21(DE3)/pET28-TDL；图5为生物转化过程气相色谱检测图，其中R-CNDE、S-CNDE、S-产物的出峰时间分别为51.18、52.45、和42.82min。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1：TalaromycesdupontiiATCC16461脂肪酶基因的获得采用RT-PCR的方法从TalaromycesdupontiiATCC16461(购自美国典型微生物菌种保藏中心，AmericanTypeCultureCollection)中获得脂肪酶基因。收集45℃培养5d的T.dupontiiATCC16461菌丝，加入液氮充分研磨至粉末状，TRIzol法提取总RNA，使用Promega公司的GoScriptTM逆转录试剂盒进行cDNA第一条链的制备，反应体系及条件均参照试剂盒的使用说明。利用根据Thermomyceslanuginosus脂肪酶Ln(EU004196.1)的信号肽编码序列设计的引物P1(5′-ATGAGGAGCTCCCTTGTGCTGTTC-3′)，利用脂肪酶TLL(EU022703.1)、Ln(EU004196.1)和TTL(JF414585.1)的中间高同源性序列设计引物P2(5′-CCGACNCGGGGNGCGCCATATG-3′)，以cDNA第一链为模板，利用PCR方法扩增脂肪酶5′-端序列。PCR反应体系(总体积100μL)：10×PfuDNApolymerasebuffer10μL，10mMdNTPmixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)1μL，浓度为50μM的引物P1和P2各0.5μL，cDNA1μL，PfuDNA聚合酶2μL，无核酸水85μL。采用Biometra的TProfessionalPCR仪，PCR反应条件为：预变性94℃3min，然后进入温度循环94℃30s，45℃30s，72℃1min，共5个循环，再94℃30s，50℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR获得约600bp的5′-端脂肪酶序列(琼脂糖凝胶电泳结果见图1)，记为PCR产物1。对PCR产物1测序鉴定。根据PCR产物1测序结果设计用于3′-RACE的引物3(5′-CATAGTTTGGGTGGTGCACTG-3′)和引物4(5′-CATTGCTGGAGCCGCTCTGCG-3′)，以cDNA为模板，利用TaKaRa公司的3′-RACEKit(CodeNo.6106)完成3′-RACE操作，反应体系及条件均参照试剂盒的使用说明。3′-RACE获得大小约650bp的DNA片段(琼脂糖凝胶电泳结果见图1)，记为PCR产物2，对PCR产物2进行测序。然后利用DNAMAN软件对PCR产物1和PCR产物2测序结果进行分析、拼接，获得了一个长为876bp的开放阅读框(SEQIDNO：1)。利用DNAMAN软件和BLAST对该基因序列进行分析，所述基因编码的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示，其中1-22aa(MRSSLVLFFISAWTALARPVRR)为信号肽序列，其成熟肽由269aa组成。实施例2：重组表达载体pET28-TDL的构建根据实施例1的分析结果，设计脂肪酶成熟肽表达引物P5(5′-CATGCCATGGAAGTCTCGCAGGATCTGCTC-3′)和引物P6(5′-CCGCTCGAGTTAATCACACTCTGCAATGGC-3′)。以P5和P6为正反向引物，以实施例1中制备的cDNA为模板，利用高保真PfuDNA聚合酶(TaKaRa)进行PCR扩增，PCR反应体系各组分加入量(总体积100μL)：10×PfuDNAPolymeraseBuffer10μL，10mMdNTPmixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)0.5μL，浓度为50μM的引物P3、引物P4各0.5μL，cDNA1μL，PfuDNAPolymerase1μL，无核酸水86.5μL。采用Biometra的TProfessionalPCR仪，PCR反应条件为：预变性94℃3min，然后进入温度循环94℃30s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR反应液经1.0％琼脂糖凝胶电泳，可见0.8kb大小条带(见图2)。切胶回收该片段，利用限制性内切酶NcoI和XhoI(Fermentas)对PCR产物进行酶切处理，回收酶切后的片段，并利用T4DNA连接酶(Promega)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pET-28b(Novagen)进行连接，构建重组表达载体pET28-TDL，其物理图谱如图3所示。实施例3：工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28-TDL的构建将实施例2中构建的重组表达载体pET28-TDL转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含50μg/mlKan的LB平板37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定，阳性克隆测序验证，结果表明重组表达载体pET28-TDL成功转化进表达宿主E.coliBL21(DE3)中，且脂肪酶成熟肽编码基因已成功克隆至pET-28b的NcoI和XhoI位点，构建脂肪酶工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28-TDL。实施例4：脂肪酶的诱导表达实施例3构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28-TDL接种至终浓度为50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，150rpm培养10h，再以1％接种量(v/v)接种到新鲜的含有50μg/ml卡那霉素LB培养基中，37℃，150rpm培养至菌体浓度OD600约0.5左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，于28℃诱导培养10h后，4℃、5000rpm离心10min，收集含有重组脂肪酶的菌体细胞，可直接用于生物催化制备普瑞巴林中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，也可-20℃冷冻保存备用。以未诱导的E.coliBL21(DE3)/pET28-TDL作为对照，分别取20μl培养液与2×SDS-PAGELoadingBuffer混合后煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图4所示，可以看出经IPTG诱导后在30kDa附近出现明显表达条带，与目的蛋白大小吻合，进一步证明工程菌构建成功。实施例5：脂肪酶在(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用以实施例4中获得的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28-TDL湿菌体作为生物催化剂(同时以实施例4中未诱导的E.coliBL21(DE3)/pET28-TDL和宿主菌E.coliBL21(DE3)作为对照)，以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，进行转化反应制备普瑞巴林中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。转化体系组成及转化操作如下：在50mL转化瓶中加入0.2g的湿菌体和10mLTris-HCl(100mM，pH7.5)，100mM底物，30℃、150r/min反应1h，定时取样200μl，并加50μl1M的HCl终止反应，乙酸乙酯萃取、离心取上层(有机相)经无水硫酸钠干燥处理后，取600μl萃取液，加入400μl的甲醇和40μl的衍生化试剂Trimethylsilyldiazomethane。气相色谱岛津GC-14A测定气相色谱测定转化率和产物的对映体过量值(e.e.)，色谱柱类型：G-TA毛细管柱；色谱条件：柱温130℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦流量为1mL/min；分流比为30：1。酶活单位(U)定义为：在30℃、pH7.5条件下，在1min内催化2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成1μmol(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸所需要的酶量定义为1U。根据体系中(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的生成量计算重组菌酶活(结果见表1)，手性气相色谱检测产物e.e.＞99％(图5)。表1脂肪酶活力测定结果菌株/质粒酶活(U/g(wetcells))E.coliBL21(DE3)0未诱导E.coliBL21(DE3)/pET28-TDL0IPTG诱导E.coliBL21(DE3)/pET28-TDL13.2实施例6：表达脂肪酶的大肠杆菌全细胞在(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用以实施例4中获得的表达脂肪酶的大肠杆菌全细胞为催化剂进行生物转化，选择性水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。转化体系组成及转化操作如下：200ml反应体系中，加入表达脂肪酶的湿细胞10g，Ca(OAc)25.2g，底物2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯51g(底物浓度1.0M，即255g/l)，反应温度30℃，反应过程中通过滴加NaOH的方式控制反应液的pH值7.0，反应24h，取样进行气相色谱检测，气相检测条件同实施例5，转化率达到45.3％，产物e.e.＞99％。离心或者过滤除去大肠杆菌细胞，减压蒸馏至1/3体积，通过两次甲苯萃取除去剩余底物，再减压蒸馏去除残留甲苯，得到目标产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸(e.e.＞99％)。本发明不受上述具体文字描述的限制，应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页1 2 3