P1,P4-二(尿苷5’-)四磷酸的纯化方法与流程

本发明涉及从含有p¹,p⁴-二(尿苷5'-)四磷酸和铁离子的水溶液或亲水性溶剂溶液除去铁离子，从而降低该铁离子浓度的方法。

背景技术：

下式[i]所示的p¹,p⁴-二(尿苷5'-)四磷酸(以下表述为“up4u”)或其盐被用作与干眼症相伴的角结膜上皮损伤的治疗药。此外，具有排痰诱导作用，是期待开发作为祛痰剂或肺炎治疗药的化合物。

[化1]

作为以往的up4u的合成方法，已知下述的方法。

(1)使通过尿苷5'-三磷酸(utp)的脱水缩合反应而制备的尿苷5'-环状三磷酸与尿苷5'-单磷酸(ump)反应的方法(非专利文献1)、和其改良方法(专利文献1)。

(2)将焦磷酸通过咪唑活化而合成二咪唑基焦磷酸(ピロリン酸ジイミダゾリド)，使其在使用二甲基甲酰胺(dmf)等有机溶剂的无水环境下与ump缩合的方法(专利文献2、非专利文献2)。

(3)特征在于使下式[ii]或[iii]所示的磷酸活性化合物与选自ump、udp、utp和焦磷酸中的磷酸化合物或其盐(utp游离体除外)在铁(ii)离子或铁(iii)离子等金属离子的存在下、在水或亲水性溶剂中反应的方法(专利文献3)。

(式[ii]中，r¹表示在5'位键合的尿苷基，x表示杂环基，n表示1或2的整数)；

(式[iii]中，x表示选自咪唑基、苯并咪唑基和1,2,4-三唑基中的1个杂环基)

[化2]

[化3]

。

其中，如果使用(3)的方法，则能够避免不适合工业大量制造的utp游离体的利用和utp盐的脱水操作，而且同时以良好的收率合成up4u。此外，该方法几乎不生成副产物，通过在亲水性条件下进行反应而能够省略繁杂的脱水工序等，因此极适合于up4u的工业大量合成。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：wo2008/012949

专利文献2：wo2008/024169

专利文献3：wo2014/103704

专利文献4：wo2000/020430

非专利文献

非专利文献1：bioorg.&medicinalchemistryletters,vol.11,157-160(2001)

非专利文献2：org.biomol.chem.,2011,no.9,730-738(2011)。

技术实现要素：

发明要解决的课题

up4u是被用作医药品原料的化合物，要求极高的杂质管理。因此，针对金属离子浓度，也必须抑制为充分低的值。另一方面，例如在上述(3)的制造方法中，由于向反应溶液中作为催化剂添加铁(ii)离子或铁(iii)离子等金属离子，因此在反应结束后的up4u溶液中含有金属离子。这样的情况中，需要在纯化工序中除去金属离子。

作为up4u的纯化方法，以往已知up4u或其盐的晶体的制造方法，其特征在于，将粗up4u或其盐使用阴离子交换色谱和活性炭色谱纯化，将所纯化的up4u或其盐溶液根据期望调节为ph6~9后，在60℃以下的温度条件下添加亲水性有机溶剂而析出晶体(专利文献4)。但是，针对从包含铁离子的up4u溶液中除去金属的效率等，没有进行研究。

另一方面，作为除去溶液中的铁离子的方法，作为常规方法而使用的是使用磷酸、苛性钠而形成源自铁离子的沉淀并除去该沉淀的方法；使用螯合树脂、合成吸附树脂而吸附除去铁离子的方法等。然而，本发明人进行研究的结果发现，在想要降低含有铁离子的up4u反应液的铁离子浓度时，上述说明的常规方法有时无法充分降低铁离子的浓度。

因此，本发明的课题在于，提供作为up4u的纯化法的容易且可实践的铁离子除去方法。

用于解决课题的手段

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，在由包含up4u和铁离子的水溶液或亲水性溶剂溶液中除去铁离子时，通过将使用螯合树脂的柱纯化工序、和与以往已知的结晶条件不同的在ph5.5以下的结晶工序或使用氯化锌活化活性炭的处理工序组合，能够充分除去up4u反应液中的铁离子，使该铁离子的残存浓度降低至10ppm以下的非常低的浓度。

即，本发明提供下述[1]和[2]。

[1]p¹,p⁴-二(尿苷5'-)四磷酸的纯化方法，其是由含有p¹,p⁴-二(尿苷5'-)四磷酸和铁离子的水溶液或亲水性溶剂溶液除去铁离子以纯化p¹,p⁴-二(尿苷5'-)四磷酸的方法，该方法包括下述工序：

(1)使用螯合树脂的柱纯化工序；和

(2)将螯合树脂柱纯化后的溶液ph调节为5.5以下后，使p¹,p⁴-二(尿苷5'-)四磷酸结晶的工序；或者将螯合树脂柱纯化后的溶液通过氯化锌活化活性炭进行处理的工序。

[2]根据[1]所述的纯化方法，其中，铁离子为3价的铁离子。

发明的效果

通过使用本发明的纯化方法，即使在使用铁离子作为催化剂的方法中，也能够制造与通过不使用催化剂的方法制造的up4u同等品质的up4u。

附图说明

图1示出螯合树脂柱处理后，使用各种树脂再次进行螯合树脂柱处理时，处理结束后溶液中相对于up4u的铁离子浓度。

图2示出螯合树脂柱处理后进行活性炭处理时，处理结束后溶液中相对于up4u的铁离子浓度。

具体实施方式

本发明的方法涉及由含有up4u和铁离子的水溶液或亲水性溶剂溶液除去铁离子从而使该铁离子浓度降低的方法。

含有up4u和铁离子的水溶液或亲水性溶剂溶液只要含有up4u和铁离子则没有限制。例如，可以举出通过下述制造方法而得到的合成反应液等，所述制造方法是特征在于使(1)下式[ii]或[iii]所示的磷酸活性化合物与(2)选自ump、udp、utp和焦磷酸中的磷酸化合物或其盐(utp游离体除外)在(3)选自铁(ii)离子和铁(iii)离子中的金属离子的存在下、在水或亲水性有机溶剂中反应的制造方法(专利文献3)。

(式[ii]中，r¹表示在5'位键合的尿苷基，x表示杂环基，n表示1或2的整数)；

(式[iii]中，x表示选自咪唑基、苯并咪唑基和1,2,4-三唑基中的1个杂环基)

[化4]

[化5]

。

本发明的“铁离子”是指通过将铁以盐的形态添加到溶液中而在水或亲水性有机溶剂中形成金属离子。作为盐的种类，可以提出卤化物、无机酸盐、有机酸盐等。作为进一步的具体例，作为(i)卤化物的例子可以举出氯化亚铁、氯化铁、溴化铁等，作为(ii)无机酸盐的例子，可以举出硫酸、硝酸、高氯酸等无机酸盐，作为(iii)有机酸盐的例子，可以举出三氟甲磺酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、柠檬酸盐等有机酸盐。盐可以是亚铁盐，也可以是铁盐，优选铁盐，其中，特别优选氯化铁。应予说明，所使用的盐可以是无水物，也可以是水合物。

本发明的up4u溶液中，溶剂是水或亲水性有机溶剂。作为亲水性有机溶剂，可以使用甲醇、乙醇等碳原子数为6以下的醇类、丙酮等酮类、二氧杂环己烷等醚类、乙腈等腈类、二甲基甲酰胺等酰胺类等。

up4u溶液中的铁离子浓度相对于up4u优选为10ppm以上、更优选为60ppm以上、进一步优选为60ppm以上且10%以下。此外，up4u溶液中的up4u浓度优选为0.01~10%、更优选为0.1~5%、进一步优选为1~3%。

本发明的方法涉及up4u的纯化方法，在由up4u溶液除去铁离子的方法中，包括：(1)使用螯合树脂的柱纯化工序、和(2)在ph5.5以下进行结晶的工序、或进行氯化锌活化的活性炭处理的工序。

(1)的使用螯合树脂的柱纯化工序中，按照常规方法进行柱纯化即可。作为所使用的螯合树脂的种类，使用氨基磷酸型、亚氨基二乙酸型、多胺型、双甲基吡啶基胺型、异硫脲鎓（イソチオウロニウム）型等中的任意螯合树脂即可。其中，优选氨基磷酸型、亚氨基二乙酸型的螯合树脂。

作为螯合树脂的市售品，可以举出irc747(氨基磷酸基na型，オルガノ株式会社制)、irc748(亚氨基二乙酸基na型，オルガノ株式会社制)、cr-11(亚氨基二乙酸基na型，三菱化学株式会社制)、cr-20(多胺基游离型、三菱化学株式会社制)、ot-71(亚氨基二乙酸基na型，室町ケミカル公司制)、xms-5612(氨基磷酸基na型，室町ケミカル公司制)、xms-5418(双甲基吡啶基胺基so4型，室町ケミカル公司制)、xms-5413(异硫脲鎓基cl型，室町ケミカル公司制)。

工序(1)具体而言，使包含铁离子的up4u水溶液或亲水性有机溶剂溶液通过填充有螯合树脂的柱，采集通过的溶液即可。

通过使用螯合树脂的柱纯化工序，up4u溶液中的相对于up4u的铁离子浓度达到60ppm以下。

(2)的结晶工序(2-1)中，首先向(1)处理后的溶液中添加盐酸、磷酸、硫酸、硝酸、乙酸等酸，由此将结晶母液调节为ph5.5以下，进行结晶。在此，ph只要为5.5以下即可，更优选为2.5以上且5.5以下。结晶时，例如向该up4u溶液中添加亲水性有机溶剂并搅拌直至白浊后静置，通过将所析出的晶体过滤等取出即可。作为亲水性有机溶剂，可以例示出甲醇、乙醇等碳原子数为6以下的醇类、丙酮等酮类、二氧杂环己烷等醚类、乙腈等腈类、二甲基甲酰胺等酰胺类等，特别地可以举出醇类、优选乙醇。此时，为了提高结晶效率，可以在添加亲水性有机溶剂的同时添加晶种。

(2)的使用氯化锌活化的活性炭的处理工序(2-2)中，按照常规方法进行活性炭处理即可。即，进行向(1)处理后的溶液添加氯化锌活化的活性炭并搅拌30分钟~20小时左右后，通过过滤等而除去该活性炭等的处理方法即可。

作为本发明的方法中使用的活性炭的种类，在经水蒸气活化的活性炭、经化学试剂活化的活性炭等之中，特征在于使用氯化锌活化的活性炭。活性炭的原料可以选自木材、椰子壳、煤等。形状从粉末、破碎状、颗粒状、圆柱状、纤维状、片状等中选择任意形状即可。作为氯化锌活化的活性炭的市售品，可以举出特制白鹭m600(大阪ガスケミカル公司制)等。

本发明的方法中，上述(1)使用螯合树脂的柱纯化工序和(2)在ph5.5以下的条件下的结晶工序或氯化锌活化的活性炭处理工序按照(1)、(2)的顺序至少各进行1次。此外，本发明的方法除了上述工序(1)、(2)之外，还可以包括进行利用离子交换柱等的柱纯化的工序、进行其他活性炭处理的工序、进行再次结晶的工序等。这些工序可以在工序(1)和(2)的前后和中间进行。

通过进行利用本发明的方法的纯化，能够使含有up4u的溶液中的铁浓度降低至极低的浓度，例如能够将处理后的相对于up4u的铁含量调节至10ppm以下的极低值。

本发明的方法中，作为工序(2)的利用氯化锌活化的活性炭的处理工序的纯化结束后，根据需要进行结晶处理等，由此能够以高纯度获得up4u。作为结晶的方法，例如可以使用公知的知识(专利文献4)等。

实施例

(参考例)

按照公知的方法(专利文献3)合成up4u。作为磷酸活性化合物，使用二咪唑基焦磷酸，作为磷酸化合物，使用ump，溶剂使用水，催化剂使用氯化铁，进行缩合反应。(式[iii]，x为咪唑基)

[化6]

将缩合反应后的溶液供于螯合树脂(irc748、オルガノ株式会社制)柱处理。螯合树脂处理后的铁离子浓度为40ppm。其后，即使按照已知方法进行结晶，铁离子浓度也不会达到40ppm以下。

应予说明，铁离子浓度的定量参考jisk0400-57-10的1,10-菲咯啉吸光光度法进行。具体的定量方法如下所述。

(1)将样品和标准曲线制作用的铁标准液(fe100)投入10ml容量瓶中。还准备空白用的未投入任何物质的10ml容量瓶。

(2)向所有的容量瓶中投入6.0mhcl溶液400μl、10%盐酸羟胺溶液200μl，充分混合。其后，静置30分钟以上。

(3)添加0.5%邻菲咯啉溶液200μl、50%乙酸铵溶液1ml，定容至10ml。

(4)充分搅拌，在室温下静置10分钟以上。其后，测定各自的od510。

(5)根据所得od510的值，制作标准曲线，求出样品中的铁离子浓度。

(实施例1)螯合树脂柱处理和结晶工序的组合的研究

作为螯合树脂柱处理后追加再次脱铁处理的方法，研究对螯合处理液进行结晶，通过仅分离晶体，降低铁的浓度。

研究中，制作相对于up4u包含铁38ppm的模拟处理液而进行。具体而言，首先将up4u480g溶解于去离子水中，调节至2l。并且，向该溶液中添加氯化铁(iii)溶液，相对于up4u的铁含量设为38ppm。向该溶液中添加盐酸，调节ph以达到4.5、5.0、5,5、6.0、6.5、7.0，将其作为模拟处理液。

将各模拟处理液200ml在25℃水浴中搅拌后，添加95%乙醇直至白浊(约120ml)，添加up4u的晶种(25mg)，搅拌过夜。确认晶体充分析出，进一步添加95%乙醇约40ml，进行搅拌。通过过滤，分离晶体和上清液。将所得晶体溶解于100ml的去离子水，测定铁含量。

结果示于表1。

[表1]

如上表所示，接着螯合树脂之后进行结晶处理时，结晶前液在ph7.0结晶后的铁浓度为38ppm，铁未被除去。另一方面，在ph5.5以下结晶时的结晶后的铁浓度为10ppm以下，通过在ph5.5以下的低ph条件下进行结晶，能够使铁浓度降低至非常低的浓度。

(实施例2)螯合树脂柱处理和其他处理的组合的研究

作为螯合树脂柱处理后追加再次脱铁处理的方法，研究对首次螯合处理液再次投入铁吸附剂(各种螯合柱树脂或各种活性炭)，降低铁的浓度。

研究中，制作包含铁离子的模拟处理液而进行。具体而言，首先将up4u480g溶解于去离子水中，调节至2l。并且，向该溶液中添加氯化铁(iii)溶液，将相对于up4u的铁含量设为60ppm，作为模拟处理液。

将调节为ph2.0的模拟处理液量取到14根试管中，各4.0ml。向该试管中的模拟处理液中，分别量取各60mg的螯合树脂、或者粉末活性炭，添加至装有模拟处理液的试管中，进行搅拌。搅拌开始起20小时后，采集1ml以上的该处理液，通过0.2μm的膜过滤器过滤，除去树脂、活性炭。使用滤液1ml，测定铁含量。

应予说明，试验中使用的螯合柱树脂的种类如下述举出所示：irc747(氨基磷酸基na型，オルガノ株式会社制)、irc748(亚氨基二乙酸基na型，オルガノ株式会社制)、cr-11(亚氨基二乙酸基na型，三菱化学株式会社制)、cr-20(多胺基游离型、三菱化学株式会社制)、ot-71(亚氨基二乙酸基na型，室町ケミカル公司制)、xms-5612(氨基磷酸基na型，室町ケミカル公司制)、xms-5418(双甲基吡啶基胺基so4型，室町ケミカル公司制)、xms-5413(异硫脲鎓基cl型，室町ケミカル公司制)。

此外，活性炭的种类如下所述：白鹭p(椰子壳/水蒸气活化、大阪ガスケミカル株式会社)、特制白鹭(木质/氯化锌活化、大阪ガスケミカル株式会社)、白鹭a(木质/水蒸气活化、大阪ガスケミカル株式会社)、fp-3(原料不明/水蒸气活化、大阪ガスケミカル株式会社制)、太阁kタイプa(木质/活化法不明、フタムラ化学株式会社制)。

结果示于表2、3和图1、2。

[表2]

[表3]

如上述图1所示，向螯合树脂柱处理液中投入螯合树脂时，除了使用作为氨基磷酸基na型的xms-5612(室町ケミカル公司制)或irc747(オルガノ株式会社制)的情况之外，铁未被除去。此外，用氨基磷酸基na型树脂处理的情况中，处理后的铁浓度也为10ppm以上。

接着，如图2所示，如果对螯合树脂柱处理液进行活性炭处理，则使用任意活性炭的情况中，铁浓度均降低。特别地，使用氯化锌活化活性炭的情况中，处理后的铁浓度低于10ppm，能够使铁浓度降低至非常低的浓度。