专利名称：一种尿苷二磷酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种尿苷二磷酸的制备方法，具体地说，是以尿苷一磷酸(UMP)为原料，通过发酵和降解两步法生产尿苷二磷酸的方法。
背景技术：
上世纪六、七十年代，我国开始以核苷一磷酸为原料，利用酵母发酵生产核苷三磷酸(NTP)，主要生产腺苷三磷酸(ATP)和胞苷三磷酸(CTP)。利用酵母发酵生产ATP的研究较多，在七、八十年代已有较稳定的发酵生产工艺，并能进行小规模的生产。但这种发酵生产ATP、CTP等的工艺过程还存在很多的弊端，比如工艺复杂、操作繁琐、生产成本高，而且不适合大规模生产。主要原因如下1.发酵底物浓度低，一般低于2％或20mg/ml，所得产物量不高，因而导致发酵设备利用率低，劳动生产率低，使生产成本增加。
2.发酵液预处理工艺不合理，使用离心分离和酒精沉淀再回溶的方法，能耗大，时间长，回收率低。
3.分离纯化工艺不合理，分离纯化中采用的方法和使用的设备已落后，使周期长，回收率低，产品质量低，成本增加。
尿苷二磷酸(UDP)是合成阿普林津(Ampligen)的原料之一。阿普林津是一种错配双链RNA药物(PolyIC12U)，具有抗病毒和免疫调节的双重作用，高效低毒。目前，在国外该药正在进行一些疾病的临床实验，包括慢性疲劳综合症、艾滋病、乙肝等。
对于尿苷二磷酸(UDP)和尿苷三磷酸(UTP)的制备方法很少有人进行深入的研究，只是其衍生物，尤其是UDP-糖类由于药用广泛而引起国内外的重视。比如，专利文献98801453.X公开了一种尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的制备方法，该方法使用微生物菌体，由尿苷酸(UMP)和N-乙酰葡糖胺制备尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDPAG)，并使N-乙酰葡糖胺激酶共存。
但到目前为止，国内仍没有高效率、低成本、操作简便的UTP和UDP生产工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种尿苷二磷酸的制备方法，该方法生产周期短，产品得率高、成本低、操作简便。
本发明所述尿苷二磷酸的制备方法，包括如下步骤1)将尿苷一磷酸与啤酒酵母混合发酵，发酵终止后得尿苷三磷酸发酵液；2)将所述的尿苷三磷酸发酵液进行预处理，并分离纯化；3)将纯化后的尿苷三磷酸进行酸热降解；4)最后将酸热降解后的产物进行过滤、分离和精制处理。
其中，尿苷一磷酸(UMP)作为底物，以选用高纯度的为佳，如电泳纯度在75％以上，紫外纯度在80％以上。
本发明所用的啤酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)可采用新鲜啤酒酵母，也可采用啤酒生产过程中淘汰的啤酒酵母，从经济角度考虑，采用啤酒生产中淘汰的但仍具有较高酶活性的酵母，该酵母细胞存活率在90％以上即可。其经过离心或压榨后成干酵母，酵母的含量(重量百分比)在20～25％。
在混合发酵时，每升发酵物中含有尿苷一磷酸40～80克，啤酒酵母400～600克，葡萄糖0.2～0.5mol，磷酸二氢钠0.3～0.5mol和氯化镁0.01～0.1mol，剩余的体积由水补足。
本发明啤酒酵母在冷冻条件下保存为佳，比如冷冻温度在-15℃～-20℃之间，冷冻时间为5天～100天。
混合发酵的发酵温度为30～40℃，pH值为6～8，发酵时间为5～8小时。本发明采用一步法发酵，相对于核苷酸发酵来说，缩短发酵时间1/3～1/2，此发酵过程的转化率可达75％以上。
经快速纸电泳跟踪检测发现可以终止发酵，调pH值为2.0～3.0时可使发酵终止，所用的终止反应剂为三氯乙酸、盐酸或硫酸。优选为三氯乙酸，其作用是蛋白变性剂，使相关酶失活。
对尿苷三磷酸发酵液进行预处理时，采用微滤方法，所述的微滤也称微孔过滤，其滤膜的孔径为0.05～5.0μm，微滤的主要作用是固液分离和去除发酵液中的部分蛋白，减少分离纯化步骤中的负担。微滤膜的材质可采用有机和无机两大类，有机聚合物有醋酸纤维素、聚丙稀、聚碳酸酯、聚砜、聚酰胺等。无机膜材料有陶瓷和金属等，其中，优选的为孔径为0.1μm的无机陶瓷膜。
经微滤处理后的溶液澄清，无悬浮物。但经过预处理后还需进行分离纯化，分离纯化可采用本领域常用的方法，比如离子交换法。
离子交换法以选用强碱型阴离子交换树脂为佳，比如HZ201、HZ202、717、或711等。所用的条件可为上柱总量为阴离子交换树脂总交换量的1.18％～2.36％，即20～40mg UTP/ml树脂，上柱液浓度UTP含量10～25g/L，上柱pH2.0～3.0，上柱流速4倍～8倍树脂体积/小时，上柱的终点快速纸电泳检测有UTP斑点出现。
淋洗剂0.02N、pH2.0 NaCl溶液，洗涤流速4倍～8倍树脂体积/小时，洗涤终点快速纸电泳检测无斑点。
洗脱剂0.5N、pH2.0 NaCl溶液，洗脱流速0.5倍～1.0倍树脂体积/小时。
收集起点95％乙醇中产生白色沉淀或溶液OD260大于30 OD260/ml。
收集终点95％乙醇中无白色沉淀产生或溶液OD260小于30 OD260/ml。
在对尿苷三磷酸进行酸热降解时，pH值为0.8～1.2，降解温度为90～100℃，降解时间为30～40分钟。
对于降解获得的尿苷二磷酸需要经过过滤、分离和精制的一系列处理。
其中，过滤采用纳滤(Nanofilitration，NF)分离方法，其不仅可以截流分子量介于反渗透膜和超滤膜之间的物质，而且还对无机盐有一定的截流率，本发明采用的是卷式或管式的截留分子量为200～300道尔顿的纳滤设备。
分离时可采用前述的分离纯化方法，比如离子交换法。
离子交换法以选用强碱型阴离子交换树脂为佳，比如HZ201、HZ202、717或711等。所用的条件可为上柱总量为阴离子交换树脂总交换量的1.77％～2.83％，即25～40mg UDP/ml，树脂上柱液浓度UDP含量10～25g/L，上柱pH7.0～8.0，上柱流速4倍～8倍树脂体积/小时，上柱的终点快速纸电泳检测有UDP斑点出现。
淋洗剂0.012N、pH2.0 NaCl溶液，洗涤流速4倍～8倍树脂体积/小时，洗涤终点快速纸电泳检测无UMP斑点。
洗脱剂0.5N NaCl溶液，洗脱流速0.5倍～1.0倍树脂体积/小时。
收集起点95％乙醇中产生白色沉淀或溶液OD260大于30 OD260/ml。
收集终点95％乙醇中无白色沉淀产生或溶液OD260小于30 OD260/ml。
本发明的精制可采用乙醇沉淀法以去除杂质。
所述的乙醇沉淀法采用两次沉淀处理过程，具体为先用2～6倍量的95％～100％乙醇沉淀，然后将沉淀溶解为80～120g/l的溶液，调pH值2.0～4.0，再用15～20倍量的无水乙醇沉淀。
精制后的产品还可经过本领域常用的方法进行干燥处理，比如抽滤干燥、真空干燥等。
本发明的尿苷二磷酸的制备方法，具有以下优点(1)采用高底物浓度，UMP浓度在4％以上。
(2)采用一步法发酵，即底物与酵母混合后进行发酵，缩短发酵时间1/3～1/2。
(3)使用微滤设备对发酵液进行预处理。在发酵液的预处理中引入微滤设备，使用孔径为0.1μm无机陶瓷膜对发酵液进行微滤处理，微滤时间为1～4小时，微滤的主要作用是固液分离和去除发酵液中的部分蛋白，减少分离纯化步骤中的负担。经过微滤处理的发酵液可以直接上柱分离纯化，大大缩短了预处理的时间。同时也提高了产品回收率，达到95％～100％。
(4)分离纯化工艺过程中的提高上柱和洗涤的流速，缩短分离纯化周期。
(5)产品的紫外纯度在92％以上，含水量在7％以下，质量得率(产物纯量与原料纯量之间质量百分比)在30％以上。
经过一系列的改进，相对于核苷酸发酵来说，生产UDP的发酵时间缩短为1/2～2/3；预处理时间缩短为1/3；分离纯化的时间缩短为2/3，由此产生的经济效益显著。
图1为本发明尿苷二磷酸生产工艺流程；图2为本发明尿苷三磷酸的分离图谱；上柱pH2.5，上柱流速22L/hr；淋洗0.02N、pH2.0 NaCl溶液；洗脱流速22-23L/hr；；洗脱0.5N NaCl、pH2.0溶液；洗脱流速2.5L/hr；树脂HZ201，50-80目，上柱量为HZ201树脂总交换量的1.24％；图3为本发明尿苷二磷酸的分离图谱。
上柱pH8.0，上柱流速12L/hr；淋洗低盐洗脱0.012N、pH2.0 NaCl溶液；洗脱流速15L/hr；洗脱高盐洗脱0.5N NaCl溶液；洗脱流速1.2L/hr；树脂HZ201，80-120目，上柱量为HZ201树脂总交换量的1.92％。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1图1为本发明尿苷二磷酸生产工艺流程；本实施例采用一次发酵和降解的方法来生产尿苷二磷酸。
1.发酵首先采用一步法对尿苷一磷酸进行发酵(6升规模)，发酵条件UMP318.7g(按电泳纯度75.3％投料)；啤酒酵母3kg；Glu 432g；NaH2PO4280.8g；MgCl224.4g；pH6.7；H2O加至6升；37℃保温，静止发酵6小时。
啤酒酵母为啤酒生产中淘汰酵母，酵母细胞存活率为98％以上，其压榨后成干酵母中酵母的含量(重量百分比)为25％。
然后用快速纸电泳进行跟踪检测发酵产物。
用三氯乙酸调pH值到2.0，发酵终止，发酵转化率为79％。
2.微滤除蛋白使用孔径为0.1μm无机陶瓷膜处理发酵液，微滤前先过80目的筛子除去过大的固体颗粒，微滤中用35L的去离子水洗滤膜，分5～6次加入。
微滤后，溶液澄清，无悬浮物，产品回收率98±2％。
3.UTP分离，采用阴离子交换法(1)方法使用HZ201氯型强碱型阴离子交换树脂，上柱pH2.5，上柱流速22L/hr；淋洗低盐洗脱0.02N、pH2.0 NaCl溶液；洗脱流速22-23L/hr；洗脱高盐洗脱0.5N NaCl、pH2.0溶液；洗脱流速2.5L/hr。
(2)结果见图2。
上柱量为HZ201树脂总交换量的1.24％，即21mg UTP/ml树脂。
柱分离中产品损失率5％以内。
(3)鉴定方法开始收集取高盐洗脱液1～2滴，滴入95％乙醇中产生白色沉淀或溶液OD260大于30 OD260/ml。
停止收集取高盐洗脱液1～2滴，滴入95％乙醇中无白色沉淀产生或溶液OD260小于30 OD260/ml。
4.酸热降解先用6N盐酸调pH值到1.0，加热煮沸35min，采用高效液相和纸电泳检测，高效液相显示，降解得率45％。
5.纳滤除盐(1)方法使用截流分子量为200-300道尔顿的纳滤设备，10N氢氧化钠调pH值到8.0；纳滤中用60L的去离子水洗，分5～6次加入。
(2)结果纳滤后产品浓度为10g/L，除盐率99％，产品损失率低于3％。
6.UDP离子交换分离(1)方法使用HZ201氯型强碱型阴离子交换树脂，上柱pH8.0，上柱流速12L/hr；淋洗低盐洗脱0.012N、pH2.0 NaCl溶液；洗脱流速15L/hr；
洗脱高盐洗脱0.5N NaCl溶液；洗脱流速1.2L/hr。
(2)结果见图3。
上柱量为HZ201树脂总交换量的1.92％，即27.2mg/ml树脂。
柱分离中产品损失率1％以内。
(3)鉴定方法开始收集取高盐洗脱液1～2滴，滴入95％乙醇中产生白色沉淀或溶液OD260大于30 OD260/ml。
停止收集取高盐洗脱液1～2滴，滴入95％乙醇中无白色沉淀产生或溶液OD260小于30 OD260/ml。
7.精制(1)方法一次沉淀pH8.0，5倍体积的95％乙醇沉淀，4℃保存12小时；二次沉淀将沉淀溶解为浓度100mg/ml的溶液，6N盐酸调pH3.0，20倍体积无水乙醇沉淀，0℃保存3hr；抽滤干燥用G4砂芯漏斗抽滤，干粉用五氧化二磷真空干燥。真空度为-0.1Mpa，温度为40℃以下。
(2)结果一次沉淀产品损失率0.2％；二次沉淀产品状态松散，可以直接抽滤。
采用本实施例的方法获得的尿苷二磷酸产品参数紫外含量90％，HPLC97.5％，电泳纯度84.5％，水分含量6.7％，质量得率32％。
实施例21.发酵首先采用一步法对尿苷一磷酸进行发酵(5升规模)，发酵条件UMP 240g(按电泳纯度75.3％投料)；啤酒酵母2.4kg；Glu 312g；NaH2PO4216g；MgCl257.1g；pH6.2；H2O加至5升；32℃保温，静止发酵8小时。
啤酒酵母为啤酒生产中淘汰酵母，酵母细胞存活率为90％以上，其压榨后成干酵母中酵母的含量(重量百分比)为20％。
然后用快速纸电泳进行跟踪检测发酵产物。
用三氯乙酸调pH值到3.0，终止反应，发酵转化率78.9％。
2.微滤除蛋白使用孔径为0.1μm无机陶瓷膜处理发酵液，微滤前先过80目的筛子除去过大的固体颗粒，微滤中用30L的去离子水洗滤膜，分5～6次加入。
微滤后，溶液澄清，无悬浮物，产品回收率98±2％。
3.UTP分离，采用阴离子交换法(1)方法使用HZ201氯型强碱型阴离子交换树脂，上柱pH2.0，上柱流速18L/hr；低盐洗脱0.02N、pH2.0 NaCl溶液；洗脱流速19L/hr；高盐洗脱0.5N NaCl、pH2.0溶液；洗脱流速2L/hr。
(2)结果上柱量为HZ201树脂总交换量的1.77％，即30mg UTP/ml树脂，柱分离中产品损失率5％以内。
(3)鉴定方法开始收集取高盐洗脱液1～2滴，滴入95％乙醇中产生白色沉淀或溶液OD260大于30 OD260/ml。
停止收集取高盐洗脱液1～2滴，滴入95％乙醇中无白色沉淀产生或溶液OD260小于30 OD260/ml。
4.酸热降解先用6N盐酸调pH值到0.8，加热90℃保持40min，采用高效液相和纸电泳检测，高效液相显示，降解得率40％。
5.纳滤除盐(1)方法使用截流分子量为200-300道尔顿的纳滤设备，10N氢氧化钠调pH值到8.0；纳滤中用50L的去离子水洗，分5～6次加入。
(2)结果纳滤后产品浓度为10g/L，除盐率99％，产品损失率低于3％。
6.UDP离子交换分离(1)方法使用HZ201氯型强碱型阴离子交换树脂，上柱pH7.0，上柱流速12L/hr；
低盐洗脱0.012N、pH2.0 NaCl溶液；洗脱流速12L/hr；高盐洗脱0.5N NaCl溶液；洗脱流速1.0L/hr。
(2)结果上柱量为HZ201树脂总交换量的1.77％，即25mgUDP/ml树脂。
柱分离中产品损失率1％以内。
(3)鉴定方法开始收集取高盐洗脱液1～2滴，滴入95％乙醇中产生白色沉淀或溶液OD260大于30 OD260/ml。
停止收集取高盐洗脱液1～2滴，滴入95％乙醇中无白色沉淀产生或溶液OD260小于30 OD260/ml。
7.精制(1)方法一次沉淀pH7.0，2倍体积95％乙醇沉淀，0℃保存10小时；二次沉淀将沉淀溶解为浓度80mg/ml的溶液，6N盐酸调pH2.0，15倍体积无水乙醇沉淀，4℃保存4hr；抽滤干燥用G4砂芯漏斗抽滤，干粉用五氧化二磷真空干燥。
(2)结果一次沉淀产品损失率0.2％；二次沉淀产品状态松散，可以直接抽滤。
实施例3基本步骤同实施例1，不同的是，一步法发酵时，发酵条件UMP 500g(按电泳纯度75.3％投料)；啤酒酵母(新鲜)3.5kg；Glu 493.8g；NaH2PO4360g；MgCl25.71g；pH7.0；H2O加至8升；39℃保温，静止发酵7小时。发酵转化率77.5％。
使用71 7氯型强碱型阴离子交换树脂进行UTP分离纯化时，上柱pH2.5，上柱流速26L/hr；低盐洗脱0.02N、pH2.0 NaCl溶液；洗脱流速26L/hr；高盐洗脱0.5N NaCl、pH2.0溶液；洗脱流速2.8L/hr。
上柱量为717树脂总交换量的2.36％，即40mg UTP/ml树脂，酸热降解时，先用6N盐酸调pH值到1.2，加热煮沸30min，采用高效液相和纸电泳检测，高效液相显示，降解得率42％。
使用截流分子量为200-300道尔顿的纳滤设备进行纳滤除盐，10N氢氧化钠调pH值到8.0；纳滤中用90L的去离子水洗，分5-6次加入。纳滤后产品浓度为10g/L，除盐率98％，产品损失率低于3％。
使用717氯型强碱型阴离子交换树脂进行UDP离子交换分离，上柱pH8.0，上柱流速18L/hr；低盐洗脱0.012N、pH2.0 NaCl溶液；洗脱流速18L/hr；高盐洗脱0.5N NaCl溶液；洗脱流速1.5L/hr。上柱量为717树脂总交换量的2.05％，即29mg/ml树脂。
精制时，一次沉淀pH7.5，6倍体积95％乙醇沉淀，0℃保存16小时；二次沉淀将沉淀溶解为浓度120mg/ml的溶液，6N盐酸调pH4.0，18倍体积无水乙醇沉淀，0℃保存5hr。
将实施例1-3的生产方法进行对比，结果见表1。
表1实施例1-3检测结果
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)将尿苷一磷酸与啤酒酵母混合发酵，发酵终止后得尿苷三磷酸发酵液；2)将所述的尿苷三磷酸发酵液进行预处理，并分离纯化；3)将纯化后的尿苷三磷酸进行酸热降解；4)最后将酸热降解后的产物进行过滤、分离和精制处理。
2.根据权利要求1所述尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于在混合发酵时，每升发酵物含有尿苷一磷酸40～80克，啤酒酵母400～600克，葡萄糖0.2～0.5mol，磷酸二氢钠0.3～0.5mol和氯化镁0.01～0.1mol。
3.根据权利要求1或2所述的尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于所述啤酒酵母为酵母细胞存活率在90％以上的淘汰啤酒酵母。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于混合发酵的发酵温度为30～40℃，pH值为6～8，发酵时间为5～8小时。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于调pH值至2.0～3.0使发酵终止，所用终止反应剂为三氯乙酸、盐酸或硫酸。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于所述的预处理采用微滤处理，所用微滤膜的孔径为0.05～5.0μm。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于所述的分离纯化采用离子交换法，以选用强碱型阴离子交换树脂为佳。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于所述酸热降解时，pH值为0.8～1.2，温度为90～100℃，降解时间为30～40分钟。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于所述的过滤采用截留分子量为200～300道尔顿的纳滤设备。
10.根据权利要求1～8中任一项所述的尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于所述的精制采用乙醇沉淀法，为先用2～6倍量的95％～100％乙醇沉淀，然后将沉淀溶解为80～120g/l的溶液，调pH值2.0～4.0，再用15～20倍量的无水乙醇沉淀。
全文摘要
本发明提供了一种尿苷二磷酸的制备方法，其包括如下步骤将尿苷一磷酸与啤酒酵母混合发酵，发酵终止后得尿苷三磷酸发酵液；然后将所述的尿苷三磷酸发酵液进行预处理，并分离纯化；再将纯化后的尿苷三磷酸进行酸热降解；最后将酸热降解后的产物进行过滤、分离和精制处理。本方法获得的尿苷二磷酸产品的紫外纯度在92％以上，含水量在7％以下，质量得率在30％以上，相对于核苷酸发酵来说，本方法使生产UDP的发酵时间缩短为1/2～2/3；预处理时间缩短为1/3；分离纯化的时间缩短为2/3。
文档编号C12R1/85GK1962875SQ20061011473
公开日2007年5月16日 申请日期2006年11月22日 优先权日2006年11月22日
发明者曾滨, 饶林凡, 黎高沃 申请人:北京燕京中科生物技术有限公司