专利名称：一个调控植物脂肪酸代谢的转录因子及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及调控植物脂肪酸代谢的转录因子及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于拟南芥的调控植物脂肪酸代谢的转录因子及其编码基因与其在调控植物脂肪酸代谢中的应用。
背景技术：
植物中油脂或植物油的主要组分是脂肪酸及其脂肪酸衍生物，它广泛存在于植物的种子和果实中。植物油用途广泛，运用生物技术改良植物体内脂肪酸的组分和含量具有重要的经济价值。其中，基因工程技术所选用的操作基因必需是植物体内脂肪酸生物合成过程中的关键基因，但是目前人们对于植物脂肪酸生物合成的分子调控机制还不甚了解，因此，利用基因工程技术提高油料作物含油量的工作目前进展缓慢。
以双子叶模式植物拟南芥为例，植物的胚胎发生主要分为两个阶段早期形态发生过程和晚期成熟过程。整个胚胎发育过程中伴随着淀粉、蛋白质和脂肪酸等贮藏物质的积累。在胚胎发育早期，主要是淀粉的大量积累，在组织和器官形成以后，淀粉被转化为蛋白质和脂肪酸。在发育的种子中，碳水化合物通过糖酵解途径被分解成磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，PEP被运输到质体后再转化成丙酮酸和乙酰CoA，乙酰CoA作为底物参与脂肪酸的合成(Sari A.Ruuska等，2002，The PlantCell，Vol.14，1191-1206)。
在种子发育过程中，质体内的脂肪酸合成酶复合物中的酶类负责脂肪酸的合成，所合成的脂肪酸被导入胞质酰基CoA库中以维持三酯酰甘油(TAG)积累。植物种子中的TAG的生物合成是在内质网中进行的。TAG的前体是甘油-3-磷酸和脂酰CoA，合成TAG的过程共需要三种酰基转移酶和一种磷酸水解酶，分别是甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)，溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAT)，二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)和磷脂磷酸水解酶(PAPase)(Ohlrogge，J.B等，1979，Proc Natl Acad Sci USA 761194-1198.)。这三种酰基转移酶催化甘油骨架的逐步酰基化过程。
近几十年来，科学家们对利用基因工程技术提高植物体内，特别是种子中的脂肪酸含量进行了各种有益的探索。Shintani等在烟草中过量表达了ACCase的其中一个亚基-生物素羧化酶，结果在烟草叶片中BC的表达水平提高了3倍，其它三个亚基的表达水平没有发生明显变化，且脂肪酸的含量和组成也没有明显改变(见Shintani，D.K等，1997，Plant Physiol.114，881-886)。但是另一项研究表明，增加丙酰CoA的含量能够提高脂肪酸的含量。Roeseler等利用种子特异性表达启动子使拟南芥中的HO-ACCase基因在油菜中过量表达，结果使ACCase的活性明显提高，并且种子中的含油量也提高3-5％(Roesler，K.等，1997，Plant Physiol.113，75-81)。Roeseler等的研究结果表明，丙酰CoA水平能够提高脂肪酸的含量，但提高幅度较小。Dechesh等将菠菜的KASIII基因在烟草中过量表达，结果使KASIII的酶活性提高了100-300倍，但脂肪酸的含量却降低了5-10％(Dehesh，K等，2001，Plant Physiol.125，1103-1114)。上述研究结果表明，植物体内的脂肪酸代谢是一个复杂和高度协调的过程，通过对脂肪酸代谢途径中的个别或单个基因进行遗传操作并不能够有效地改变脂肪酸的含量。因此，Girke等人预言在脂肪酸的代谢过程中，很可能存在一种蛋白激酶或其它调控因子(如转录因子)在起调控作用(Girke，T.等，2000，Plant Physiol124，1570-1581)。
目前，已发现的参与植物脂肪酸代谢的转录因子只有WRI1。WRI1编码一个推测的AP2/EREB转录因子蛋白，它可能是植物体内由蔗糖向TAG转化的一个关键的调节因子(Cernac，A等，2004，Plant J 40，575-585)。
在植物的整个基因组中，编码转录因子的基因占了很大一部分，如拟南芥中编码转录因子的基因至少有1500个，占整个基因组的5％以上(Riechmann，J.L.等，2000，Science 290，2110)。这些转录因子大多属于大的基因家族，有的基因家族又包括许多亚族，而且有些转录因子家族是植物所特有的。大量对转录因子的研究结果表明，一个转录因子可能对一类相关性状的很多基因实施调节控制，从而有效改变植物的相关特性。
CCAAT盒是一个广泛存在于基因启动子上的顺式调控元件，与CCAAT序列结合的转录因子又称为nuclear factor Y(NF-Y)或CCAAT binding factor(CBF)。NF-Y是一个由三种不同亚基构成的异源三聚体复合物，它特异性地识别DNA上的CCAAT序列，并与之结合，从而调节基因的表达。NF-Y的三种不同亚基分别属于3个亚族NF-YA(又称为HAP2或CBF-B)，NF-YB(又称为HAP3或CBF-A)和NF-YC(又称为HAP5或CBF-C)。NF-YB和NF-YC的核心结构域在序列上与组蛋白H2A和H2B有很高的同源性，NF-YB/NF-YC形成一个紧密结合的异源二聚体复合物，NF-YA再结合在这个复合物的表面，形成异源三聚体复合物。该三聚体复合物对DNA有很高的亲和力(Mantovani R.1999.23915-27；Gusmaroli G等，2001，Gene 264173-185.Gene 28341-48；Romier C等，2003，Journal of Biological Chemistry 2781336-1345)。
编码NF-Y亚基的基因普遍存在于各种生物体中，其中在酵母与动物体中，各种亚基都是由单基因编码的。而在植物的基因组中，NF-Y亚基是由多种不同基因编码的。在拟南芥中，Gusmaroli G等人先后于2001年和2002年报道了三个NF-Y亚族中的共29个ESTs的序列(Gusmaroli G，TonelliC，Mantovani R.2001.Regulation of theCCAAT binding NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana.Gene 264173-185.Gusmaroli G，Tonelli C，Mantovani R.2002.)，本发明的发明人于2004年完成了该家族32个基因cDNA的克隆，其中9个HAP2，11个HAP3，12个HAP5(GongW等，2004，Plant Physiol.135773-782)。
NF-YB亚族的转录因子在基因内部都含有一个保守的B结构域，依据B结构域序列的差异，该家族被分为两类LEAFY COTYLEDON1(LEC1)类型和非LEC1类型(KwongRW等，2003，Plant Cell 155-18)。LEC1类型包括两个基因LEC1和L1L。功能分析表明，这两个基因都是特异性地在种子发育过程中表达，是CCAAT转录因子家族中有特定生理功能的蛋白。LEC1类型的转录因子的B结构域含有16个保守的氨基酸残基，这16个氨基酸残基在非LEC1类型的转录因子中是不保守的。研究结果表明，B结构域是决定LEC1类转录因子在功能上区别于其它非LEC1类转录因子的关键因素(Hyeseung Lee等，2003，PNAS 1002152-2156.)。
LEC1是HAP3家族中功能研究的较为清楚的一个蛋白。LEC1是拟南芥胚胎发生过程中一个关键的调控因子。高等植物的胚胎发生主要分为两个阶段早期形态发生过程和晚期成熟过程。前者包括形成胚性细胞、组织和器官系统；后者包括使种子干燥及代谢静止。在胚胎发育的早期阶段，LEC1主要使胚性细胞形成胚柄，并决定子叶的特性(Lotan，T.等，1998，Cell 93，1195-1205；West，M.A.L.等，1994，PlantCell 61731-1745.)。在胚胎发育的晚期阶段，LEC1参与了种子成熟的多个过程，包括种子的干燥和养分的积累。目前，在玉米、向日葵和胡萝卜中，均发现了LEC1基因的同源基因(Zhang S等，2002，Planta 215(2)191-4；Yazawa K等，2004，Plant Physiol Biochem.42(3)215-23.)。
Microarray实验表明，在拟南芥的种子发育过程中，由糖类物质向脂类物质转化的过程是由多基因协同作用完成的，因此可能有不止一个基因参与了该过程的调节。其中，转录水平的调节是一个至关重要的环节，Cernac和Benning利用35S启动子使AP2类转录因子编码基因WRI1的cDNA在拟南芥中过量表达，实验结果表明该方法能够提高种子的含油量(Cernac，A.等，2004，Plant J 40，575-585.)。因此，通过对脂肪酸代谢途径中的关键因子进行遗传操作，用转基因方法提高作物的脂肪酸含量将是一条行之有效的途径。
PER8载体为化学诱导性表达载体，其插入的靶基因的表达受到化学诱导剂雌激素及其活性衍生物(estrogen or its biologically active derivatives)(例如17--estradiol)的严格调控(Zuo et al.，Plant Journal.24265-273，2000)。诱导性DNA剪切以及诱导性表达载体pX6是pER8系列载体的一个衍生表达载体，其特性已经被详尽描述报道(参见Zuo et al.，Nature Biotechnology 19157-161，2001)。
发明内容
本发明的目的是提供一个调控植物脂肪酸代谢的转录因子。
本发明所提供的调控植物脂肪酸代谢的转录因子，名称为Leafy Cotyledon 1(简称LEC1或AtLEC1)，来源于拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)将序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物脂肪酸代谢功能的蛋白质。
序列表中的SEQ ID NO1由238个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第57-147位氨基酸残基为保守序列。
所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。
编码本发明调控植物脂肪酸代谢转录因子的基因(Leafy Cotyledon 1，简称LEC1或AtLEC1)，其cDNA是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)与序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有调控植物脂肪酸代谢功能的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO2由717个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-717位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第169-441位碱基编码保守序列。
其基因组基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO3的DNA序列；
2)与序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有调控植物脂肪酸代谢功能的核苷酸序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO3由2038个碱基组成，自5′端第47-98位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第99-1203位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端第1204-1868位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第1-46位碱基为该基因组基因的5’非编码区(UTR)，自5′端第1869-2038位碱基为该基因组基因的3’非编码区。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增AtLEC1中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种调控植物脂肪酸组分和含量的方法。
本发明所提供的调控植物脂肪酸组分和含量的方法，是将所述编码调控植物脂肪酸代谢转录因子的基因AtLEC1或与AtLEC1具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列导入植物组织、细胞或器官，植物脂肪酸组分和含量获得调控。
在上述调控植物脂肪酸组分和含量的方法中，所述编码调控植物脂肪酸代谢转录因子的基因既可为AtLEC1的cDNA序列，也可为AtLEC1的基因组基因序列；与AtLEC1具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列，是将AtLEC1的cDNA或基因组基因序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。
所述编码调控植物脂肪酸代谢转录因子的基因AtLEC1或其同源序列可以正义方向或反义方向导入植物组织、细胞或器官。
所述编码调控植物脂肪酸代谢转录因子的基因AtLEC1或其同源序列可通过含有AtLEC1或其同源序列的植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如PER8、PX6、pBI系列载体、pBin系列载体、pCAMBIA系列载体或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可为可在原核生物中复制的载体，如pUC系列载体或pBluescript系列载体等。
使用AtLEC1或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子；所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，玉米Ubiquitin启动子或水稻actin1启动子等；所述组织特异性表达启动子可为种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子，如2S1启动子(GenBank号NM_118848.2，GI30687489)和NapinA(GenBank号M64633.1，GI349405)启动子；所述诱导型启动子可为受ABA、乙烯或化学等诱导的启动子；上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。
其中，以PER8为出发载体，构建的含有AtLEC1的植物表达载体为PER8-AtLEC1；以pX6为出发载体，构建的含有AtLEC1的植物表达载体为pX6-AtLEC1。
携带有本发明编码调控植物脂肪酸代谢转录因子的基因AtLEC1或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca2+、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。
此外，通过将转化有本发明编码调控植物脂肪酸代谢转录因子的基因AtLEC1或与AtLEC1具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。转基因植株脂肪酸含量和组分的改变包括植物体内各组织和器官内各种脂肪酸含量包括饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的改善和提高，及各种脂肪酸组分的提高或降低。
本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、组织或器官既可来源于拟南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕榈树、橄榄树、蓖麻、马铃薯或烟草等双子叶植物，也可来源于水稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。
本发明提供了一个调控植物脂肪酸代谢的转录因子AtLEC1及其编码基因。编码该转录因子的基因是以拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚生态型为材料，用RT-PCR的方法分离得到的。该转录因子可用于调控植物体内脂肪酸代谢，实验证明，AtLEC1转基因拟南芥体内，不仅脂肪酸含量得到显著提高，而且参与脂肪酸合成的酶FAE1和参与脂肪酸修饰的酶FAB2，FAD2以及FAD3也都获得表达。本发明的转录因子及其编码基因对于植物脂肪酸代谢分子机制的研究，以及提高植物(特别是油料作物)的脂肪酸含量及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，在农业领域具有广阔的应用和市场前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为AtLEC1基因组基因的框架结构图2为AtLEC1与已知其它物种间的同源基因的进化关系树图3为AtLEC1转基因拟南芥在诱导培养基上萌发后10天的表型图4为苏丹红染色指示的AtLEC1转基因拟南芥体内脂肪酸含量的变化图5为GC-MS方法检测AtLEC1转基因植株在诱导培养基上萌发20天后体内脂肪酸含量变化情况的结果图6为Northern Blotting检测AtLEC1转基因植株体内脂肪酸合成途径的部分修饰酶和合成酶表达水平变化情况的结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物及探针均由上海生工合成。
实施例1、调控植物脂肪酸代谢的转录因子基因AtLEC1的克隆用TRIZAL试剂(购自Invitrogen公司)并参照试剂盒说明书提取拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚生态型(Col-0)新鲜果荚的总RNA，然后用Invitrogen公司的SuperScriptTMII Reverse Transcriptase试剂盒并参照试剂盒说明书反转录合成其第一链cDNA，再以所合成的cDNA为模板，在引物P1(上游引物)5’-CCCTCGAGAAATGACCAGCTCAGTCGTAGT-3’和P2(下游引物)5’-AAACTAGTTCACTTATACTGACCAT-3’的引导下PCR扩增拟南芥中的调控植物脂肪酸代谢的转录因子基因，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用购自鼎国公司的DNA回收试剂盒回收长度约717bp的目的片段并对其进行纯化，将回收片段连接入到载体pGEM-Teasy(Promega公司)中，再将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含50mg/L氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提质粒，得到含有回收片段的重组质粒，命名为pGEM-T Vector-AtLEC1，对其进行测序，测序结果表明扩增片段具有序列表中的SEQ ID NO2的核苷酸序列，由717个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-717位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第169-441位碱基编码保守序列。其基因组基因具有序列表中SEQ ID NO3的核苷酸序列，由2038个碱基组成，自5′端第47-98位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第99-1203位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端第1204-1868位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第1-46位碱基为该基因组基因的5’非编码区(UTR)，自5′端第1869-2038位碱基为该基因组基因的3’非编码区。该基因的框架结构见图1。将克隆的来自拟南芥的调控植物脂肪酸代谢的转录因子基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与GenBank中的序列进行同源性比对，该基因与来自胡萝卜(D.carota)、水稻(O.sativa)和玉米(Z.mays)的调控植物脂肪酸代谢的转录因子基因的系统进化树如图2所示，由图2可以看出，该基因与来自胡萝卜的调控植物营养物质储存的转录因子基因C-LEC1的亲缘关系最近，编码蛋白的氨基酸序列相似性达71％。
实施例2、AtLEC1转基因拟南芥的获得一、含AtLEC1的植物表达载体的构建用限制性内切酶Xho I和Spe I对实施例1构建的含有AtLEC1的质粒pGEM-TVector-AtLEC1进行双酶切，对双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收长度约717bp的AtLEC1基因片段并对其进行纯化，将回收片段用T4DNA连接酶(Roche公司)与经相同酶双酶切的载体PER8(Zuo et al.，Plant Journal.24265-273，2000)或pX6(Zuo et al.，Nature Biotechnology 19157-161，2001)连接，再将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含50mg/L潮霉素的5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提质粒，对重组质粒用限制性内切酶Xho I和Spe I进行双酶切鉴定，结果经酶切获得了11479bp和717bp的DNA片段，与预期结果相符，再用引物P1和P2做进一步的PCR鉴定，结果经PCR扩增得到了717bp的DNA片段，也与预期结果一致，表明得到了插入序列及位置正确的含有AtLEC1的植物表达载体，命名为PER8-AtLEC1(将以pX6为出发载体构建的含有AtLEC1的植物表达载体命名为pX6-AtLEC1)。
二、AtLEC1转基因拟南芥的获得将步骤一构建的植物表达载体PER8-AtLEC1(或pX6-AtLEC1)用电激法转化农杆菌GV3101感受态细胞，将其涂布于含50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平的LB抗性平板上在28℃、150rpm下培养12-16小时，挑取长出的农杆菌单菌落再接种于含50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平的20mL LB液体培养基中在28℃、150rpm下振荡培养2天，然后，再按2％的接种量菌将菌液接种于含50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平的300mL LB液体培养基中在28℃、150rpm下振荡培养16-18小时。培养结束后，5000rpm离心20分钟收集菌体，再将菌体悬浮于250mL含有5％蔗糖，0.1％Silwetl-77的溶液中。最后，将菌液转于250mL烧杯中，将已去掉果荚的哥伦比亚生态型拟南芥植株倒置于烧杯中，使其花序完全浸入菌液中，真空抽10分钟为宜，为提高转化效率，一周后再重复一次。将转化植株进行常规培养，收获种子，所得种子经20mg/L潮霉素筛选后得到AtLEC1转基因植株。
三、AtLEC1转基因植株在诱导培养基上的萌发将步骤二获得的过表达AtLEC1的阳性转基因植株的种子播在含10μM雌激素17--estradiol(购自Sigma公司)的MS培养基上，置于温室中在22℃、光照强度80-120μE-2S-1，光照周期为16小时光照/8小时黑暗的条件下培养，以哥伦比亚野生型拟南芥作为对照。观察AtLEC1过表达植株和野生型植株的生长情况，AtLEC1过表达植株在诱导培养基上萌发后生长10天时的表型如图3所示，AtLEC1过表达植株矮小、黄化，顶端分生组织的发育完全受阻，根的生长发育异常。
实施例3、AtLEC1过表达植株的脂肪酸代谢检测一、苏丹红染色指示AtLEC1过表达植株体内脂肪酸含量的变化将实施例2中在诱导培养基中萌发后生长20天的AtLEC1转基因植株与哥伦比亚野生型对照植株浸泡于1％苏丹红(Fat Red 7B)(Sigma公司)，室温过夜(12-24小时)，用去离子水清洗3次，每次60秒，染色结果如图4所示，在AtLEC1转基因植株的根部和子叶处，脂肪酸的积累量明显高于野生型。
二、GC-MS方法检测AtLEC1转基因植株经诱导后体内各种脂肪酸组分的含量变化情况分别取实施例2获得的在诱导培养基中萌发后生长20天的AtLEC1转基因植株与对照植株的整株植物各0.1克，在液氮中研磨成干粉，然后转移到带密封盖的试管中，加入3mL甲醇(含2.5％(V/V)浓硫酸)，在80℃水浴加热90分钟.再加入4.5mL0.9％NaCl溶液和1mL正己烷，混匀，4000rpm离心10分钟，收集正己烷相。真空抽干，用100ul乙酸乙酯溶解，取1ul上样，用PerkinElmer公司的TurboMass GC/MS仪分析各种脂肪酸组分的含量变化情况，所用GC柱为30m×0.25mmBPX-70柱，GC升温程序为初始温度120℃，保持1分钟，再以每分钟10℃的速率升至150℃，然后以每分钟4℃的速率升温至230℃，保持10分钟，以C170的三酯酰甘油作内标。结果如图5所示，与野生型对照相比，AtLEC1转基因植株经诱导后脂肪酸的各个组分含量都明显上升，其中，二十碳一稀酸提高了约50倍。
三、Northern Blotting检测AtLEC1转基因植株经诱导后脂肪酸合成途径的部分修饰酶和合成酶的表达水平变化用Northern Blotting法检测AtLEC1转基因植株经诱导后脂肪酸合成途径的部分修饰酶和合成酶(FAE1、FAB2、FAD2和FAD3)的表达水平变化，具体方法为将实施例2获得的AtLEC1转基因植株的种子播在分别含有20μM DMSO(对照)和20μM雌激素17--estradiol的MS培养基中，在种子萌发3天后取样(在不同培养基中生长的AtLEC1转基因植株的叶片)，用TRIZAL法提取总RNA，-70℃保存。然后，每种样品的RNA各取10-15μg，加入10×MOPS(购自Sigma公司)2μL，制样缓冲液2μL，甲醛4μL，去离子甲酰胺10μl，混匀后，沸水煮1-2分钟，再冰水浴10分钟，然后进行1.2％琼脂糖凝胶电泳分离RNA，将拍照后的凝胶在超纯水中漂洗后，加入10×SSC(NaCl 175.3g，柠檬酸钠88.2g，pH 7.0，用蒸馏水定容至1L)，轻摇约1小时，期间换一次10×SSC缓冲液；然后准备好转膜装置，将尼龙膜(Duralon-UV TM Membrane；Stratagene，LaJolla，CA，USA)用超纯水漂洗，并用10×SSC浸泡15分钟，覆于正面朝下的上述凝胶上面，尼龙膜四周与液体绝缘，将3张滤纸覆盖尼龙膜上，除净气泡后再覆盖吸水纸，以适当的重物压平，适时换纸，转移过夜(12-24小时)，触胶面朝上，将膜在紫外干燥仪中固定3分钟，用超纯水漂洗，将膜封好后-20℃保存。接着，将膜放入杂交管中，用预杂交液(含10％SDS，6×SSC，20mg/mL dextran sulfate，10mg/mL鲑鱼精子DNA)润湿，65℃预杂交10小时，加入以等体积的0.4N NaOH变性10分钟，再用1MTris·HCl(pH7.5)中和的放射性标记的探针，探针的制备利用Amersham Biosciences公司的Megaprime DNA Labelling System(货号RPN1605)，即将15μL超纯水，5μLPrimer solution，5μL总量50ng以上的DNA模板(FAE1基因(GeneID829603)、FAB2基因(GeneID818973)、FAD2基因(GeneID820387)或FAD3基因(GeneID817548)，模板制备方法从野生型Col-0拟南芥的cDNA中通过RT-PCR扩增得到，反应体系及条件为取1-2μg RNA，1μL oligo(dT)15和1μL 10mM dNTP，混合后(总体积12μL)在冰上混匀，65℃反应5分钟，然后依次加入5×buffer(购自Invitrogen)4μL，0.1MDTT 2μL和M-MLV RT(购自Invitrogen)0.5μL，42℃50分钟，45℃10分钟，70℃加热20分钟，RNAase消化30min。产物经稀释后可做为模板用于PCR反应)混匀，沸水浴2分钟。室温冷却后，加入dATP、dTTP和dGTP各4μL，反应缓冲液(购自AmershamBiosciences)5μL，Klenow(购自Amersham Biosciences)2μl，放射性32P标记的dCTP2.5μL，37℃保温30分钟以上，然后在68℃下杂交过夜。倒掉杂交液，加入洗液(2×SSC，0.1％SDS)，室温下洗10-15分钟，再用含0.1×SSC和0.1％SDS的溶液在55℃下洗2次，每次10-15分钟，待放射性读数为5-10时，取出杂交完的膜固定在磷屏仪中，曝光(根据放射性强度调节曝光时间的长短)。Northern Blotting检测结果如图6所示(ESTR为经诱导的AtLEC1转基因植株，DMSO为对照)，与对照相比，AtLEC1转基因植株经诱导剂诱导后，在萌发3天的苗中，参与脂肪酸合成的酶FAE1和参与脂肪酸修饰的酶FAB2，FAD2以及FAD3都受到明显诱导，表明本发明的AtLEC1可用于调控植物的脂肪酸代谢。
序列表<160>3<210>1<211>238<212>PRT<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1Met Glu Arg Gly Ala Pro Phe Ser His Tyr Gln Leu Pro Lys Ser Ile1 5 10 15Ser Glu Leu Asn Leu Asp Gln His Ser Asn Asn Pro Thr Pro Met Thr20 25 30Ser Ser Val Val Val Ala Gly Ala Gly Asp Lys Asn Asn Gly Ile Val35 40 45Val Gln Gln Gln Pro Pro Cys Val Ala Arg Glu Gln Asp Gln Tyr Met50 55 60Pro Ile Ala Asn Val Ile Arg Ile Met Arg Lys Thr Leu Pro Ser His65 70 75 80Ala Lys Ile Ser Asp Asp Ala Lys Glu Thr Ile Gln Glu Cys Val Ser85 90 95Glu Tyr Ile Ser Phe Val Thr Gly Glu Ala Asn Glu Arg Cys Gln Arg100 105 110Glu Gln Arg Lys Thr Ile Thr Ala Glu Asp Ile Leu Trp Ala Met Ser115 120 125Lys Leu Gly Phe Asp Asn Tyr Val Asp Pro Leu Thr Val Phe Ile Asn130 135 140Arg Tyr Arg Glu Ile Glu Thr Asp Arg Gly Ser Ala Leu Arg Gly Glu145 150 155 160Pro Pro Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Gly Gly Asn Gly Ile Gly Phe His165 170 175
Gly Pro Ser His Gly Leu Pro Pro Pro Gly Pro Tyr Gly Tyr Gly Met180 185 190Leu Asp Gln Ser Met Val Met Gly Gly Gly Arg Tyr Tyr Gln Asn Gly195 200 205Ser Ser Gly Gln Asp Glu Ser Ser Val Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser210 215 220Ile Asn Gly Met Pro Ala Phe Asp His Tyr Gly Gln Tyr Lys225 230 235<210>2<211>717<212>cDNA<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2atggaacgtg gagctccctt ctctcactat cagctaccaa aatccatctc tgaattgaac 60ttggaccagc acagcaacaa cccaacccca atgaccagct cagtcgtagt agccggcgcc120ggtgacaaga acaatggtat cgtggtccag cagcaaccac catgtgtggc tcgtgagcaa180gaccaataca tgccaatcgc aaacgtcata agaatcatgc gtaaaacctt accgtctcac240gccaaaatct ctgacgacgc caaagaaacg attcaagaat gtgtctccga gtacatcagc300ttcgtgaccg gtgaagccaa cgagcgttgc caacgtgagc aacgtaagac cataactgct360gaagatatcc tttgggctat gagcaagctt gggttcgata actacgtgga ccccctcacc420gtgttcatta accggtaccg tgagatagag accgatcgtg gttctgcact tagaggtgag480ccaccgtcgt tgagacaaac ctatggagga aatggtattg ggtttcacgg cccatctcat540ggcctacctc ctccgggtcc ttatggttat ggtatgttgg accaatccat ggttatggga600ggtggtcggt actaccaaaa cgggtcgtcg ggtcaagatg aatccagtgt tggtggtggc660tcttcgtctt ccattaacgg aatgccggct tttgaccatt atggtcagta taagtga 717<210>3<211>2038<212>DNA<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>3aattatttta taaagaacaa aaaaaaaaaa agacggcaga gaaacaatgg aacgtggagc 60tcccttctct cactatcagc taccaaaatc catctctggt aatctaagtg gctattttta120tacagtatat acttgcctcc atgtatattt atatgctcat gaaaaattgg agacatgctt180tatgaatttt atgagacttt gcaacaacga actaaatgct ttctttctag aaatttttaa240tttagatttg tgaaggtttt gggaatggcc cggagaagac gattttatat acatacatgc300aagagtttga tatgtattgt ttcatcatgg ctgagtcaaa gttttatcca aatatttcca360tggtgtggta ttagttaaac aaatctctcg tatgtgttca ttgaatatac ccgtgcatgt420accaggaatg tttttgagta tcgttttctt tcttttatca aaaaaaattt cgattctaaa480aacgtttttt tctttgttgt aacggttgag tttttttctt cgtttcaaaa cgagattctc540gtttgtctct tcccttgtct aaaaacatct acggttcatg tgattcaaaa acactaaaaa600aatagaaact caaatttttt tagtacttaa catttaaact atatatatat atatatatat660cttatactag tcccaagttt tagtgtgagg tttttttatt caaaatctat cagtaatttt720tttggaaaaa aactaagtga aattttctcc aaattttcct tttactattg attttttaat780tactggatgt cattaactcc aatcttttga ttctttcaac atttaccatt gggaaccttc840acatgaaata aatgtctact ttattgagtc ataccttcgt ctacataaat taattgatgt900tcttctccaa attttgagtt tttggttttt ctaattaata atctaagcga aagctttttg960gtatacatgt aaaacgtaac ggcaagaatc tgaacagtct actcaacggg gtccataagt 1020ctagaatgta gaccccacaa acttactctt atcttattgg tccgtaacta agaacgtgtc 1080ccttgattct cttgttttct tctaatccat tcgtatccta caaatttaat catcatttct 1140acttcaacta atctttttta tttcctaaag atttcaattt ctctctgtat tttctatgaa 1200cagaattgaa cttggaccag cacagcaaca acccaacccc aatgaccagc tcagtcgtag 1260tagccggcgc cggtgacaag aacaatggta tcgtggtcca gcagcaacca ccatgtgtgg 1320ctcgtgagca agaccaatac atgccaatcg caaacgtcat aagaatcatg cgtaaaacct 1380taccgtctca cgccaaaatc tctgacgacg ccaaagaaac gattcaagaa tgtgtctccg 1440agtacatcag cttcgtgacc ggtgaagcca acgagcgttg ccaacgtgag caacgtaaga 1500ccataactgc tgaagatatc ctttgggcta tgagcaagct tgggttcgat aactacgtgg 1560accccctcac cgtgttcatt aaccggtacc gtgagataga gaccgatcgt ggttctgcac 1620ttagaggtga gccaccgtcg ttgagacaaa cctatggagg aaatggtatt gggtttcacg 1680gcccatctca tggcctacct cctccgggtc cttatggtta tggtatgttg gaccaatcca 1740tggttatggg aggtggtcgg tactaccaaa acgggtcgtc gggtcaagat gaatccagtg 1800
ttggtggtgg ctcttcgtct tccattaacg gaatgccggc ttttgaccat tatggtcagt1860ataagtgaag atggaattat tcttcatttt tatatctgtt caaaacatgt gtttggatag1920atattttatt tttatgtctt atcaataaca tttctatata atgttgcttc tttaaggaaa1980agtgttgtat ttcaatactt tatgagaaac tgatttatat atgcaaatga tttaaccc 2038
权利要求
1.一个调控植物脂肪酸代谢的转录因子，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)将序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物脂肪酸代谢功能的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的转录因子，其特征在于所述转录因子的氨基酸残基序列为序列表中的SEQ ID NO1。
3.编码权利要求1或2所述转录因子基因的cDNA序列，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)与序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有调控植物脂肪酸代谢功能的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQID NO2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因的cDNA序列为序列表中的SEQ ID NO2。
5.编码权利要求1或2所述转录因子基因的基因组序列，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO3的DNA序列；2)与序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有调控植物脂肪酸代谢功能的核苷酸序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
6.含有权利要求3或4或5所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
7.一种调控植物脂肪酸组分和含量的方法，是将权利要求3或4或5所述编码调控植物脂肪酸代谢转录因子的基因或与该基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列导入植物组织、细胞或器官，植物脂肪酸组分和含量获得调控。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述编码调控植物脂肪酸代谢转录因子的基因或与该基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列通过含有该基因或与该基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列的植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体为PER8、PX6、pBI系列载体、pBin系列载体、pCAMBIA系列载体、pUC系列载体或pBluescript系列载体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述植物表达载体为PER8-AtLEC1或pX6-AtLEC1。
10.根据权利要求7-9任一项所述方法，其特征在于所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
全文摘要
本发明公开了一个调控植物脂肪酸代谢的转录因子及其编码基因与应用。其目的是提供一个调控植物脂肪酸代谢的转录因子及其编码基因与其在调控植物脂肪酸代谢中的应用。该转录因子是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)将序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物脂肪酸代谢功能的蛋白质。本发明的转录因子及其编码基因对于植物脂肪酸代谢分子机制的研究，以及提高植物(特别是油料作物)的脂肪酸含量及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，在农业领域具有广阔的应用和市场前景。
文档编号C12N15/82GK1948338SQ20061011448
公开日2007年4月18日 申请日期2006年11月10日 优先权日2006年11月10日
发明者左建儒, 牟金叶 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所