包含工程化内皮细胞的血脑屏障的制作方法

本申请要求2016年9月13日提交的美国临时专利申请no.62/393,774的优先权，其内容在此以引用的方式整体并入本文。

通过引用的方式并入

本文提及的所有出版物，专利申请，专利和其他参考文献都通过引用的方式整体并入本文。

背景技术：

血脑屏障(bbb)将循环血液与细胞外液和中枢神经系统(cns)的细胞分离。在体内，bbb由彼此紧密连接的脑内皮细胞与基底膜和星形胶质细胞(一种神经胶质细胞)形成。bbb具有高电阻以及用于限制某些分子和微生物(例如细菌)进入cns的功能，但同时可以允许水，一些气体和一些必需分子(例如葡萄糖和氨基酸)通过被动扩散或选择性主动运输进入cns。

虽然bbb的屏障功能提供了体内必需的安全机制-保护脑和脊髓组织-同样的屏障功能可以对治疗中枢神经系统的治疗剂的开发构成挑战-其中穿过bbb的药物将是有益的。相反，当开发可能对cns组织具有不良影响的药物时，可能需要开发不能透过bbb的药剂。因此，本领域需要研究可用于研究治疗药剂透过bbb的能力的模型系统，并筛选具有所需bbb渗透性的药剂，以及研究bbb在正常和疾病情况下的其他生物学特性。

本领域还需要治疗、修复或替换体内发生的bbb损伤的方法，例如由于创伤性损伤，疾病或感染造成的bbb损伤。

本发明旨在解决所有这些需求。

技术实现要素：

本发明部分地是基于以下令人惊讶的发现：经过工程化改造以表达腺病毒e4orf1蛋白的内皮细胞可用于产生血脑屏障样组织(blood-brainbarrier-liketissue)，其不仅忠实地复制许多bbb在体内的重要特征，且重要的是，在几个重要方面优于利用天然(即，非e4orf1表达)内皮细胞的bbb系统。例如，如本发明申请的实施例部分中更详细描述的，现已证明，与包含天然ec的bbb系统相比，工程化e4orf1+内皮细胞可用于产生具有显着改善的屏障功能的bbb样组织(提高了的跨内皮电阻(trans-endothelialelectricalresistance,“teer”)和降低了的渗透系数)。虽然先前已知e4orf1表达改善了培养物中ec细胞的存活率(参见美国专利号8,465,732。另见seandel等人，(2008),pnas,105(49):19288-93)，e4orf1对内皮屏障功能的这种作用却是出乎意料的。

另外，如本发明申请的实施例部分中更详细描述的，现在还发现，与天然ec不同，工程化e4orf1+ec可长期保持与星形胶质细胞的直接接触(即，两种细胞类型之间没有物理屏障)，当细胞以这种方式与星形胶质细胞共培养时，工程化e4orf1+ec的屏障功能得到显着改善。同样，e4orf1对内皮-星形胶质细胞相互作用的这种影响也是出乎意料的。

使用工程化e4orf1+ec而不是天然ec来产生bbb样组织或系统的进一步好处是，与天然ec不同-其需要血清和/或生长因子(例如vegf)用于培养基中的长期存活，而工程化e4orf1+ec即使在不存在血清和生长因子的情况下也可以长期(例如超过1个月)在培养中维持。这在bbb组织/系统的情况下提供了特别重要的益处，因为血清和生长因子(例如vegf)是已知能够导致不希望发生的bbb渗漏(即，降低了的阻抗(resistance)/增加了的渗透性)，如本申请的图4所证实的。

基于这些发现以及本专利申请的实施例和附图部分中描述的其他发现，本发明提供了几种新的和改进的bbb系统，组合物和方法。

例如，在一些实施例中，本发明提供了体外血脑屏障(bbb)系统，其可用于例如药物测试/筛选，以及用于研究某些疾病状态(例如，癌症)或对伤害的响应中的bbb渗透性和bbb功能。因此，在一个实施例中，本发明提供了包含e4orf1+内皮细胞的体外血脑屏障(bbb)系统。在一些这样的实施例中，内皮细胞是小鼠内皮细胞。在其他实施例中，内皮细胞是人内皮细胞。在一些这样的实施例中，内皮细胞是脑内皮细胞。在一些这样的实施例中，体外bbb系统还包含可渗透的固体支持物，通常将内皮细胞置于其上。在一些这样的实施例中，体外bbb系统还包含星形胶质细胞，其可以与内皮细胞直接接触。

在其他实施例中，本发明提供了用于药物测试/筛选和/或用于研究在某些疾病状态(例如癌症)或对损伤的响应中的bbb渗透性和bbb功能的筛选方法。

在其他实施例中，本发明提供了包含e4orf1+内皮细胞(例如e4orf1+脑内皮细胞)和星形胶质细胞的组合物。在其他实施例中，此类组合物还可包含一种或多种另外的细胞类型，包括但不限于周细胞和/或神经干/祖细胞(nspc)。在一些实施例中，此类组合物包含基本上纯的所述细胞类型的群体，或所述的细胞类型的混合物。此类组合物可用于多种情况，包括研究应用和治疗应用。

在更进一步的实施例中，本发明提供了治疗影响血脑屏障的缺陷，疾病或紊乱的方法，这些方法包括给活体受试者例如人施用e4orf1+内皮细胞，例如e4orf1+脑内皮细胞。

在本专利公开的其他部分中进一步描述了本发明的这些和其他实施例。另外，对于本领域技术人员显而易见的是，对本发明描述的各种实施例的某些修改和组合落入本发明的范围内。

附图说明

图1显示单层e4orf1+小鼠脑内皮细胞(ec)(源自3周龄小鼠皮质)的免疫组织化学染色的荧光显微照片。使用对紧密连接标记物紧密连接蛋白5(claudin5)和cns特异性ec标记物mfsd2a特异的第一抗体和荧光标记的第二抗体标记细胞。在细胞边界检测到claudin5蛋白，而在细胞内检测到mfsd2a蛋白。内皮细胞来自3周龄小鼠的皮质。

图2a-b：(a)显示从以下各组的单层培养物记录的teer测量结果图(单位ω·cm²)：野生型(wt)小鼠脑ec，wt小鼠脑ec与小鼠星形胶质细胞共培养、e4orf1+小鼠脑ec、e4orf1+小鼠脑ec与小鼠星形胶质细胞共培养。在培养3天后测量teer值。本文所用的“wt”是指未经工程改造以表达e4orf1的ec。(b)图显示从以下各组的单层培养物记录的teer测量结果图：e4orf1+小鼠脑ec，以及e4orf1+小鼠脑ec与小鼠星形胶质细胞共培养。在培养3天后测量teer值。teer测量值表示为在没有星形胶质细胞共培养时获得的teer值的百分比。当e4orf1+ec以直接接触方式与星形胶质细胞共培养时，观察到teer值增加约20％。

图3显示从来源自人脑，人脐带静脉(“huvec”)，人肺，人肾或人心脏的e4orf1+ec的单层培养物记录的teer测量结果图(单位ω·cm²)。本图中使用的术语“veravec”是指e4orf1+ec。在培养3天后测量teer值。

图4显示在约24天的时间内，从e4orf1+人脑ec的单层培养物记录的teer测量结果图(单位ω·cm²)。箭头表示向培养物中加入vegf的时间点和含有vegf的培养基被不含vegf的新鲜培养基所更换的时间点。

图5a-b显示使用荧光黄(mw＝0.4kda)测量的以下各组的渗透性系数(pc)图：空的迁移小室(trans-well)(即没有细胞)、单层人293t细胞、源自人脑/gbm的天然ec、源自人肾的e4orf1+ec、以及源自人脑/gbm的e4orf1+ec。(a)pc数据以cm/s为单位表示。图(b)pc数据表示为在空的迁移小室(即没有细胞)中获得的pc值的百分比。本图中使用的术语“veravec”指的是e4orf1+ecs。

图6显示在约8天的时间内，从源自a级和b级gbm的e4orf1+人脑ec的单层培养物记录的teer测量结果图(单位ω·cm²)。

图7显示在约8天的时间内，从e4orf1+人脑ec的3种不同的单层培养物记录的teer测量结果图(单位ω·cm²)。如图所示，在第4天，将gbm肿瘤细胞加入3种培养物中的2种之中(“+gbm”)。在两种ec/gbm共培养物中，一种维持在无血清条件(“sf”)中，另一种在血清存在下进行培养，如图所示。本图中的术语“veravec”是指e4orf1+ec。

详细说明

本专利公开的“发明内容”，“附图”，“附图说明”，“实施例”和“权利要求书”部分描述了本发明的主要实施方式。该“详细描述”部分提供了与本发明的组合物和方法有关的某些附加描述，并且旨在与本专利公开的所有其它部分相结合地进行理解。此外，对于本领域技术人员来说显而易见的是，贯穿本专利公开所描述的不同实施例可以是，并且旨在以各种不同方式组合。本文描述的特定实施例的这种组合旨在落入本发明的范围内。

定义

下面提供了某些定义。在本专利公开其他部分定义的其它术语，具有从使用它们、或根据本领域通常含义使用它们的上下文得出的清楚的含义。

如本文中所使用的，术语“约”和“大约”当与数值一起使用时，是指在所述数值的+/-20％以内。

如本文所使用的术语“培养”是指在各种培养基上或培养基中进行的细胞繁殖。“共培养”是指两种或多种不同类型的细胞在各种培养基上或培养基中的繁殖，例如，在一些实施方式中，可以将内皮细胞和星形胶质细胞共培养。

如本文所使用的术语“有效量”是指特定药剂或细胞群(例如e4orf1多肽，编码e4orf1多肽的核酸分子，或e4orf1+工程化内皮细胞群)的量，如本文所述，其足以实现对本文所述的一种或多种结果的可检测作用。例如，在内皮细胞中表达e4orf1的情况下，引入/递送至内皮细胞的核酸分子(例如在载体中)的有效量可以导致与任何合适的对照(例如e4orf1^-内皮细胞)相比，在bbb模型中的内皮细胞屏障功能的可检测的增加。

在涉及向受试者施用e4orf1⁺内皮细胞的方法的情况下，有效量可以是，与任何合适的对照(例如e4orf1^-内皮细胞)相比，导致一种或多种所需生物学的或治疗的指标的可检测的提高(例如，改善的bbb功能)。任何个别情况下的合适的“有效量”可以凭经验确定，例如使用本领域已知的标准技术，例如剂量递增研究，以及可以通过考虑诸如计划用途，计划的递送/施用模式，期望的递送/施用频率等因素来确定。此外，可以使用如本专利公开的实施例部分中描述的本发明用来评估对bbb功能的影响的那些试验来确定“有效量”。

术语“工程化”当用于本文中的细胞时，是指已被人工改造以产生所述表型(如e4orf1⁺)，或表达所述核酸分子或多肽的细胞。术语“工程化细胞”不包括自然产生的细胞，而旨在包括，例如包含重组核酸分子的细胞，或被人为改变(例如，通过遗传修饰)的细胞，例如因此它们表达原本不表达的多肽，或因此它们表达比非工程化内皮细胞中所观察到的水平实质上更高水平的多肽。

本文所使用的术语“分离的”是指一种产物，化合物或组合物，其从与之自然发生状态(无论是天然的还是人工合成的)相关的至少一种其它产物，化合物或组合物中分离得到。

本文中所使用的术语“重组”是指由人工(包括通过机器)采用分子生物学和基因工程(如分子克隆)的方法产生的核酸分子，以及包括天然不存在的核苷酸序列的核酸分子。因此，重组核酸分子与天然存在的核酸分子不同(例如生物体的基因组)。包含mrna序列的互补dna或“cdna”的拷贝，而没有任何中间的内含子序列(如在相应的基因组dna序列中发现的)的核酸分子，因此被认为是重组核酸分子。举例来说，重组e4orf1核酸分子可以包括可操作地连接到启动子和/或其他基因组件的e4orf1编码序列，所述编码序列与其不同寻常地关联在天然存在的腺病毒基因组中。

术语“个体”和“患者”可在本文中互换使用，除非另有说明，其是指哺乳动物(诸如人)，非人灵长类动物，以及兔，大鼠，小鼠，山羊，猪和其它哺乳动物物种。

在本文中与细胞群相关使用的短语“大体上纯的”，是指实施方式中特定类型(例如，通过表达一种或多种特定的细胞标记物，形态特征或功能特征来确定的)的细胞群，或特定的多个类型(复数)的细胞群，其中两个或多个不同的细胞类型一起使用，即至少约50％，优选至少约75-80％，更优选至少约85-90％，最优选至少约95％的细胞组成总细胞群。因此，“大体上纯的细胞群”是指包含少于约50％，优选少于约20-25％，更优选少于约10-15％，最优选少于约5％的细胞不是特定类型或特定的多个类型。

核酸分子和多肽

本文所述的本发明的几个实施方式涉及e4orf1+工程化内皮细胞。e4orf1+细胞表达腺病毒e4orf1多肽，其由e4orf1核酸分子编码。在一些实施方式中，本发明涉及编码腺病毒e4orf1多肽的e4orf1多肽和/或核酸分子。

本发明的多肽和本发明的核酸分子可以具有本文所定义的或本领域已知的氨基酸序列或核苷酸序列，或可以具有这些氨基酸或核苷酸序列的变体，衍生物，突变体，或片段的氨基酸序列或核苷酸序列——假设这些变体，衍生物，突变体或片段具有或编码具有本文所述的一种或多种功能特性的多肽(包括但不限于与bbb功能相关的那些功能特性)。

在涉及腺病毒e4orf1多肽的那些实施方式中，所用的多肽序列可以来自任何合适的腺病毒类型或菌株，如人腺病毒2，3，5，7，9，11，12，14，34，35，46，50，或52型，在一些优选的实施方式中，所用的多肽序列来自人腺病毒5型。这些腺病毒多肽的氨基酸序列，以及编码这些多肽的核酸序列在本领域中是公知的，并且在众所周知的公开可用的数据库(例如genbank数据库)中是可获得的。例如，合适的序列包括如下：人腺病毒9(genbank登录号cai05991)，人腺病毒7(genbank登录号aar89977)，人腺病毒46(genbank登录号aax70946)，人腺病毒52(genbank登录号abk35065)，人腺病毒34(genbank登录号aaw33508)，人腺病毒14(genbank登录号aaw33146)，人腺病毒50(genbank登录号aaw33554)，人腺病毒2(genbank登录号ap.sub.--000196)，人腺病毒12(genbank登录号ap.sub.--000141)，人腺病毒35(genbank登录号ap.sub.--000607)，人腺病毒7(genbank登录号ap.sub.--000570)，人腺病毒1(genbank登录号ap.sub.--000533)，人腺病毒11(genbank登录号ap.sub.--000474号)，人腺病毒3(genbank登录号abb17792)和人腺病毒5型(genbank登录号d12587)。

在一些实施例中，本发明的多肽和核酸分子具有与本文特别描述的或本领域已知的(例如公共序列数据库，如genbank数据库)相同的氨基酸或核苷酸序列。在一些实施方式中，本发明的多肽和核酸分子可以具有这些序列的变体，衍生物，突变体，或片段的氨基酸或核苷酸序列，例如与这些序列具有大于85％序列同一性的变体，衍生物，突变体，或片段。在一些实施方式中，变体，衍生物，突变体或片段具有已知序列约85％的序列同一性，或具有已知序列约88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一些实施方式中，已知核苷酸序列的变体，衍生物，突变体，或片段，在长度上约50个核苷酸，或约45个核苷酸，或约40个核苷酸，或约35个核苷酸，或约30个核苷酸，或约28个核苷酸，26个核苷酸，24个核苷酸，22个核苷酸，20个核苷酸，18个核苷酸，16个核苷酸，14个核苷酸，12个核苷酸，10个核苷酸，9个核苷酸，8个核苷酸，7个核苷酸，6个核苷酸，5个核苷酸，4个核苷酸，3个核苷酸，2个核苷酸，或1个核苷酸不同于所述已知核苷酸序列。在一些实施方式中，使用的已知氨基酸序列的变体，衍生物，突变体，或片段，在长度上约50个氨基酸，或约45个氨基酸，或约40个氨基酸，或约35个氨基酸，或约30个氨基酸，或约28个氨基酸，26个氨基酸，24个氨基酸，22个氨基酸，20个氨基酸，18个氨基酸，16个氨基酸，14个氨基酸，12个氨基酸，10个氨基酸，9个氨基酸，8个氨基酸，7个氨基酸，6个氨基酸，5个氨基酸，4个氨基酸，3个氨基酸，2个氨基酸，或1个氨基酸不同于所述已知氨基酸序列。

在一些实施方式中使用e4orf1核酸或氨基酸序列，在一些实施方式中，使用这样的序列而没有来自腺病毒e4区的其他序列——例如，不在整个e4区的核苷酸序列的环境中或不与e4区编码的其他多肽一起。然而，在一些其他实施方式中，此类序列可以与来自e4区的一种或多种其他核酸或氨基酸序列结合使用，例如e4orf2，e4orf3，e4orf4，e4orf5或e4orf6序列，或其变体，突变体或片段。例如，尽管e4orf1序列可用于含有其他序列，基因或编码区(如启动子，标记基因，抗生素抗性基因等)的构建体(如病毒载体)，在某些实施方式中，e4orf1序列用于不含整个e4区的构建体，或者不含有来自整个e4区的其它开放阅读框(orf)的构建体，例如e4orf2，e4orf3，e4orf4，e4orf5和/或e4orf6。

取决于所需的用途，本发明的核酸分子可用于含有各种其他核酸序列，基因或编码区(例如抗生素抗性基因，报告基因或表达标签(如编码gfp的核苷酸序列)，或可能需要的任何其他核苷酸序列或基因)的构建体中。本发明的多肽可以单独表达或作为融合蛋白的一部分表达。

在一些实施方式中，本发明的核酸分子可以在一种或多种启动子的控制下进行表达。可以使用能够驱动所需细胞类型的核酸序列表达的任何启动子。合适的启动子的实例包括但不限于cmv，sv40，rsv，hiv-ltr和mml启动子。启动子也可以是来自腺病毒基因组的启动子或其变体。例如，在使用e4orf1的情况下，启动子可以是用于驱动腺病毒中相应基因表达的启动子。

在一些实施方式中，可以将本发明的核酸分子置于诱导型启动子的控制下，从而可以根据需要开启或关闭核酸序列的表达。可以使用任何合适的诱导型表达系统，例如四环素诱导型表达系统或激素诱导型表达系统。例如，本发明的核酸分子可以在需要时表达，然后在达到所需结果时关闭，例如当内皮细胞已经充分生长或增殖时。开启或关闭表达的能力对于体内应用是特别有用的。

本发明的核酸分子可包含天然存在的核苷酸，合成核苷酸或其组合。例如，在一些实施方式中，本发明的核酸分子可以包含rna，例如在细胞内稳定存在的，且可以用于直接在细胞内指导蛋白质的表达/产生的合成的修饰rna。在其他实施方式中，本发明的核酸分子可包含dna。在使用dna的实施方式中，dna序列可以与一种或多种合适的启动子和/或调节元件可操作地连接，以允许(和/或促进，增强或调节)细胞内的表达，并且可以存在于一种或多种合适的载体或构建体中。本发明的核酸分子可以在相同的核酸构建体中，或者在分别的核酸构建体中被引入内皮细胞。

可以使用本领域已知的任何合适的系统将本发明的核酸分子引入内皮细胞，这些系统包括但不限于转染技术和病毒介导的转导技术。本发明使用的转染方法包括但不限于脂质体介导的转染，聚凝胺介导的转染，deae葡聚糖介导的转染，电穿孔，磷酸钙沉淀，显微注射和微粒子轰击。本发明使用的病毒介导的转导方法包括但不限于慢病毒介导的转导，腺病毒介导的转导，逆转录病毒介导的转导，腺相关病毒介导的转导和疱疹病毒介导的转导。

本发明还提供载体，包括含有本发明核酸分子的表达载体。例如，在一个实施方式中，本发明提供了包含编码e4orf1多肽的核苷酸序列的表达载体。在一些这样的实施方式中，表达载体是慢病毒载体。

在一些实施方式中可以使用模拟肽(peptidomimetic)。模拟肽是一种小蛋白质样链，旨在模拟多肽。可以设计这种分子结构以模拟任何本发明的多肽(例如e4orf1多肽)。各种不同的修饰肽以产生模拟肽或以其他方式设计模拟肽的方法是本领域已知的，并且这些方法可用于产生本发明多肽之一的模拟肽。

本发明多肽和核酸分子的处理，操纵和表达可利用分子生物学和细胞生物学的常规技术进行。这些技术在本领域中是公知的。例如，人们可以参考由sambrook,fritsch和maniatis编辑，“molecularcloningalaboratorymanual,2nded.,coldspringsharborlaboratorypress,1989；以及methodsofenzymology(academicpress,inc.)系列丛书或任何其它标准文章的教导，用于指导使用合适的技术来处理，操纵和表达核苷酸和/或氨基酸序列。在美国专利no.8,465,732中描述了与e4orf1序列的处理或表达相关的其它方面，其内容在此以参考的方式引入。

内皮细胞

在一些实施方式中，本发明提供工程化内皮细胞，例如e4orf1+工程化内皮细胞。工程化内皮细胞可以衍生自本领域已知的任何合适的内皮细胞来源。例如，在一些实施方式中，内皮细胞是血管内皮细胞。在一些实施方式中，内皮细胞是原代内皮细胞。在一些实施方式中，工程化内皮细胞是哺乳动物细胞，例如人或非人灵长类动物细胞，或兔，大鼠，小鼠，山羊，猪或其他哺乳动物细胞。在一些实施方式中，内皮细胞是原代人内皮细胞。在一些实施方式中，内皮细胞是脐静脉内皮细胞(uvec)，例如人脐静脉内皮细胞(huvec)。其它合适的可以使用的内皮细胞包括之前在美国专利no.8,465,732中所描述的那些适于表达e4orf1的内皮细胞，其内容在此以参考的方式引入。在优选的实施方式中，内皮细胞是脑内皮细胞，例如脑微血管内皮细胞。

在一些实施方式中，工程化内皮细胞是经遗传修饰的，因此除特定的所述分子(例如e4orf1)的表达外，它们还包含一种或多种遗传修饰。例如，此类细胞可包含已知参与或被怀疑参与影响内皮细胞或影响bbb功能的疾病或病症的基因的校正形式，或任何其他基因，例如治疗上有用的基因，其可能需要提供在内皮细胞中或使用工程化内皮细胞进行施用或递送。

本发明的工程化内皮细胞可以以各种形式存在或提供。例如，在一些实施方式中，工程化内皮细胞可以包括细胞群，例如分离的细胞群。在一些实施方式中，工程化内皮细胞可以包括离体的细胞群。在一些实施方式中，工程化内皮细胞可以包括大体上纯的细胞群。例如，在一些实施方式中，本发明构成总细胞群的至少约50％，优选至少约75-80％，更优选至少约85-90％，最优选至少约95％的细胞是工程化内皮细胞。在一些实施方式中，工程化内皮细胞可以以包含工程化细胞以及一种或多种附加成分的组合物的形式提供。例如，在一些实施方式中，本发明可以提供一种组合物，其包括本文所述的工程化内皮细胞群以及载体溶液，如生理盐水，细胞悬浮介质，细胞培养介质等等。在一些实施方式中，所述组合物可以是治疗性组合物——包含工程化内皮细胞群和适于施用于个体(如人体)中的载体溶液。如果需要，可以包括其它治疗可接受的药剂。本领域技术人员可以根据预期用途容易地选择包含在治疗性组合物中的合适药剂。

在一些实施方式中，本发明的工程化内皮细胞可以以组合物(例如治疗组合物)的形式提供，所述组合物含有本发明的工程化内皮细胞以及一种或多种其他的细胞类型。这些其他的细胞类型可以是，例如，可以在工程化内皮细胞(例如，使用本发明的工程化内皮细胞作为“饲养细胞”)存在下维持、培养或扩增的细胞类型，或任何其他能被希望与本发明的工程化内皮细胞一起使用的细胞类型——例如用于体外模型系统或用于共同施用于受试者。在一些优选的实施方式中，本发明的工程化内皮细胞可以在含有本发明的工程化内皮细胞和星形胶质细胞的组合物(例如治疗组合物)中提供。

星形胶质细胞

本发明的几个实施方式中均涉及星形胶质细胞。任何合适的星形胶质细胞均可以被使用。在一些实施方式中，星形胶质细胞是小鼠星形胶质细胞。在一些实施方式中，它们是人星形胶质细胞。这些星形胶质细胞可以是原代星形胶质细胞(例如从cns组织分离的)或者是培养的星形胶质细胞系。获得和培养星形胶质细胞的方法是本领域已知的，任何所述方法都可以与本发明结合使用。

模型系统，方法和应用

在一些实施方式中，本发明提供了在此系统中有用的bbb模型系统，组合物和试剂盒，以及利用此bbb模型系统的筛选方法。在本领域中在药物筛选和/或生物研究中应用bbb模型系统是已知的，并且本发明新的bbb模型系统的使用方式可以与本领域已知的那些系统相同或相似。例如，可以使用e4orf1+内皮细胞代替通常用于其他bbb模型系统的天然(非e4orf1+)内皮细胞。典型地，此类系统将包含在固体可渗透支持物上生长的汇合的内皮细胞单层，使得内皮细胞形成物理性隔离在内皮细胞层任一侧上的两个室的屏障。通过这种方式，人们可以研究药剂通过内皮细胞屏障从一个物理隔室穿过至另一个物理隔室的能力。

如上所述，所述bbb模型系统可用于药物筛选。例如，在一些实施方式中，本发明提供了用于评估候选药剂的血脑屏障渗透性的方法，其中所述方法包括使bbb模型系统中的e4orf1+内皮细胞与一种或多种候选药剂接触。类似地，在一些实施方式中，本发明提供了用于评估一种或多种候选药剂对血脑屏障渗透性的影响的方法，其中此类方法包括在bbb模型系统中使e4orf1+内皮细胞与一种或多种候选药剂接触。类似地，在一些实施方式中，本发明提供评估一种或多种测试细胞类型对血脑屏障渗透性的影响的方法，其中此类方法包括在如本文所述的含e4orf1+内皮细胞的bbb模型中包括一种或多种测试细胞类型，并测定该测试细胞类型对bbb屏障功能和渗透性的影响。每种这样的筛选/测定方法(包括用于评估bbb屏障功能和渗透性的合适分析方法)的其他细节在本专利申请的其他地方描述——包括在实施例和权利要求中。

在一些实施方式中，本发明提供各种治疗方法，例如，通过向有需要的受试者给予有效量的本发明的工程化内皮细胞(或包含此类工程化内皮细胞的组合物)对所述受试者进行治疗的方法。在这样的治疗方法中，可以使用本领域已知的任何合适的方法将细胞施用于受试者。例如，细胞可以通过注射或输注到期望位置的血流或组织中来施用。例如，在cns的疾病治疗、紊乱或病症的情况下，根据本发明的工程化细胞可以是直接施用于脑或脊髓的受影响区域或其附近区域。在一些实施方式中，工程化内皮细胞可以与一种或多种其他的细胞类型一起施用。这些其他的细胞类型可以是，例如，星形胶质细胞。工程化内皮细胞可以单剂量或多剂量给药。本领域技术人员能够根据所需用途选择合适的给药方法和合适的给药方案。

在一些实施方式中，本发明的工程化内皮细胞可以在体内产生，例如用于研究目的或用于治疗应用。例如，在一些方面，本发明提供各种治疗方法，例如对有需要的受试者进行治疗的方法，其包括向这些受试者施用有效量的编码e4orf1多肽的核酸分子(例如，在合适的载体中，和/或在合适的启动子控制下)，使得受试者中的内皮细胞用这种核酸分子转染或转导，并在体内生成工程化内皮细胞。在这些方法中，可以使用本领域已知的任何合适的方法将核苷酸分子给予受试者。例如，核苷酸分子(例如在合适的载体中)可以通过注射或输注至在所需位置的血流或组织进行给药。核酸分子可以以单剂量或多剂量施用。本领域技术人员将能够根据所需用途选择合适的给药方法和合适的给药方案。

在一些实施方式中，本发明的工程化内皮细胞在使用前(例如治疗应用)是有丝分裂失活的，使得它们不能复制。这可以通过例如使用化学药剂如mitomyconc或通过照射工程化内皮细胞来实现。

细胞培养方法

培养细胞的方法是本领域公知的，并且可以使用任何合适的细胞培养方法。例如，可以使用已知用于培养其它内皮细胞的方法，或已知用于培养表达e4orf1的内皮细胞的方法来培养本发明的工程化内皮细胞，例如，如美国专利no.8,465,732中所描述的，其内容在此以引用的方式并入。在一些实施方式中，本发明的工程化内皮细胞可以在没有血清的情况下，或在没有外源生长因子的情况下，或在没有血清和外源生长因子的情况下进行培养。本发明工程化内皮细胞也可以冷冻保存(cryopreserved)。用于细胞培养和细胞冷冻保存的各种方法是本领域技术人员公知的，如cultureofanimalcells：amanualofbasictechnique,4thedition(2000)(作者r.ianfreshney("freshney"))中所描述的方法，其内容在此以参考的方式并入。

在一些实施方式中，本发明提供共培养方法，例如涉及e4orf1+内皮细胞和星形胶质细胞的共培养。这种共培养方法可包括在同一培养容器中一起培养e4orf1+内皮细胞和星形胶质细胞。在一些实施方式中，e4orf1+内皮细胞和星形胶质细胞可以直接地细胞－细胞接触(没有任何屏障例如将e4orf1+内皮细胞与星形胶质细胞分开的膜)。在一些这样的实施方式中，工程化内皮细胞可以在培养容器的表面或一些其他固体的但可渗透的底物上形成汇合的单层，并且星形胶质细胞可以置于内皮细胞单层上。

试剂盒

本发明还提供了用于制备本发明所述bbb模型系统和/或用于制备、使用或实施本文所述的任何组合物或方法的试剂盒。此类试剂盒可含有本文所述的任何组分，包括但不限于核苷酸序列(例如在载体中)、工程化内皮细胞、星形胶质细胞，用于维持或扩增工程化内皮细胞或星形胶质细胞的培养基或组合物，用于培养内皮细胞单层的固体可渗透支持物，或其任何组合。所有这些试剂盒可任选地包括使用说明书，容器，培养瓶等。试剂盒可包括标签，其可以包括任何书写的或记录的材料，可以是电子的或计算机可读形式(例如，磁盘、光盘、存储芯片或磁带)，以提供用于使用所述试剂盒的说明或其它信息。

在以下非限制性具体实施方式中进一步描述了本发明的某些方面。

具体实施方式

小鼠脑微血管内皮细胞的分离和培养

处死五至八只三周大的小鼠，并将脑分离到解剖介质中。用镊子将两个大脑半球分开，并小心地去除脑膜和嗅球。使用精细手术剪将组织切成小块(直径约0.5mm)。收集小的组织碎片并用解剖介质转移到15ml锥形管中。使组织块沉降约1-2分钟，然后小心地从解剖介质中去除。向锥形管中加入6-8mltryple并盖紧盖子。将锥形管快速上下翻转3次，然后将锥形管置于37℃的水浴中15分钟，同时间或对试管进行涡旋振荡。然后除去tryple且不扰动切成小块的组织，并添加1-2ml小鼠内皮细胞培养基

(http://angiocrinebioscience.com/wp-content/uploads/veravec-mouse-brain-instruction-sheet.pdf)。加入dna酶，1分钟，同时通过频繁轻打锥形管进行混合。然后用小鼠内皮细胞培养基冲洗组织碎块3次。然后将组织碎块在约1ml小鼠内皮细胞培养基中研磨，通过将组织碎块和培养基上下颠倒10次，接着使用火焰抛光玻璃移液管研磨组织和培养基来进行。然后将研磨的细胞悬浮液400g离心5分钟，除去上清液。用完全小鼠内皮培养基重悬细胞沉淀，并铺板到涂有纤连蛋白的t75培养瓶中。每隔一天用新鲜的小鼠内皮细胞培养基替换培养基直至培养物达到汇合。使用cd31抗体来通过荧光激活细胞分选(facs)纯化脑微血管内皮细胞。将分选后获得的细胞重新涂布在纤连蛋白包被的孔(6孔板)上，每孔约400,000个细胞。第二天，使用聚凝胺(8μg/ml，不含抗生素的培养基)采用e4orf1慢病毒(40-50μl浓缩的病毒)转导细胞。24小时后，用常规小鼠内皮细胞培养基替换感染培养基。对细胞在达到汇合时进行传代。

人脑微血管内皮细胞的分离和培养

从患有癫痫的患者或患有胶质母细胞瘤(glioblastoma,gbm)的患者通过手术切除获得人脑组织。然后按照上述对小鼠组织的描述对人组织进行处理和培养。

跨内皮电阻(teer)和荧光黄渗透性分析(luciferyellowpermeabilityassays)

在第0天，将内皮细胞接种到适合12孔板的迁移小室(transwellinserts)(corninginc.，353180)中。第二天细胞达到汇合(约200,000-400,000个细胞/小室)。自第1天开始每日测量跨内皮电阻(“teer”)。培养基用含有皮质醇，camp，pka，磷酸二酯酶抑制剂，视黄酸，胰岛素，转铁蛋白和亚硒酸钠的“teer加强剂(booster)”培养基代替。对于星形胶质细胞共培养实验，在第2天(在迁移小室中形成单层ec之后)将星形胶质细胞以每个小室50,000个细胞的密度加入到迁移小室中，使得星形胶质细胞与内皮细胞直接接触。对于gbm细胞共培养实验，在第4天将gbm细胞添加到支持迁移小室(具有ec单层)的孔的底部。

对于基于荧光黄(ly)的渗透性试验，进行以下方案。在第1天，将细胞接种到适合12孔板的小室(inserts)中，使得它们在第二天达到汇合。(～200,000-400,000个细胞/小室)。在第2天，用含有皮质醇，camp，pka，磷酸二酯酶抑制剂，视黄酸，胰岛素，转铁蛋白和亚硒酸钠的“teer加强剂”培养基替换培养基。在第3天，替换培养基，换用无血清“teer加强剂”培养基(具有n2和b27的神经祖细胞培养基)。在第4天，在进行基于ly的渗透性分析之前进行teer测定。ly分析是使用市售的分析方法，基本上按照制造商的说明书进行的

(http://ebiotrade.com/buyf/productsf/bd％20falcon/insert_protocol_lucifer_yellow_permeability_assay.pdf)。基于制造商的说明，使用ly分析方法来确定渗透性系数或“pc”(cm/秒)。pc＝(v/(axci))x(cf/t)，其中v是基底腔的体积(ml)，a是膜小室(membranceinsert)的面积(cm²)，ci是ly的初始浓度，cf是ly的最终浓度，t是以秒计的测定时间(t为1小时(3600秒)和/或4小时)。使用该系统计算得到的pc值提供了屏障完整性和功能的定量测定。通常，在基于荧光黄的分析中，pc<2.5×10^-6cm/s表示bbb特性屏障功能。

免疫细胞化学

在使用对紧密连接蛋白5(claudin5)和mfsd2a特异的抗体进行免疫组织化学之前，用4％多聚甲醛固定单层e4orf1+小鼠脑内皮细胞(ec)。

结果

发现e4orf1+小鼠脑内皮细胞单层表达紧密连接标记物紧密连接蛋白5和cns特异性ecmfsd2a(参见图1)。

发现，与在天然(非e4orf1+)小鼠脑ec中观察到的情形相比，e4orf1在小鼠脑内皮细胞中的表达提高了teer值，并且e4orf1+小鼠脑内皮细胞与星形胶质细胞的共培养进一步提高了teer值/屏障功能(参见图2a和2b——在培养的第3天的teer测量)。星形胶质细胞能够形成与e4orf1+ec直接接触的单层，而当使用天然(非e4orf1+)ec时，星形胶质细胞在ec的“海洋”中形成星形胶质细胞的“岛”(与使用e4orf1+ec时所观察到的形成多层星形胶质细胞/ec结构的情形相反)，且，星形胶质细胞与天然(非e4orf1+)ec细胞培养时的teer值(指示屏障功能)也很低，与e4orf1+ec相反(参见图2a)。

如图3所示，与来自人脐带，肺，肾或心脏的e4orf1+ec的teer值(～25ω·cm2)相比，人脑e4orf1+内皮细胞表现出独特的高teer值(第2天为～200ω·cm2)。(注意——在图3中，术语“veravec”指的是e4orf1+ec。)此外，人脑e4orf1+脑内皮细胞单层的teer值持续6周保持高水平(约200ω·cm2)。此外，人脑e4orf1+脑内皮细胞单层的渗透性显示对已知影响bbb渗透性的细胞外刺激-例如vegf有响应(见图4)。

图5显示了将人e4orf1+脑内皮细胞与天然(非e4orf1表达)人脑内皮细胞、人e4orf1+肾内皮细胞、人293t细胞、和空转移孔(即没有细胞)进行对比试验，测量的teer值和测定的渗透性系数(pc)的实验结果。(注意-在图5中，术语“veravec”是指e4orf1+细胞。)获得的pc和teer值如下：(a)不含细胞的小室(insert)-pc＝7.11±1.07×10^-6cm/s；teer＝0；(b)293t细胞-pc＝4.86±0.44×10^-6cm/s，teer＝～5ω·cm²，(c)天然人gbmec-pc＝4.26±0.40×10^-6cm/s，teer＝～50ω·cm²，(d)e4orf1+人肾ec-pc＝3.57±0.13×10^-6cm/s，teer＝～35ω·cm²，和(e)e4orf1+人gbmec-pc＝1.69±0.12×10^-6cm/s，teer＝～120ω·cm²。人e4orf1+脑内皮细胞表现出最低的pc值——即最佳的屏障功能。

在另一个实验中，从两个不同的gbm样品——一个从肿瘤的中心/核心获得(称为b级)，另一个从与正常组织相邻的区域的肿瘤的外周获得(称为a级)产生人e4orf1+脑内皮细胞。如图6所示，观察到a级和b级e4orf1+脑内皮细胞之间teer值的显着差异。

图7显示了源自患有癫痫的患者的人e4orf1+脑内皮细胞与人gbm肿瘤细胞共培养的实验结果。tem值在gbm肿瘤细胞共培养时下降。当在不存在血清的情况下进行共培养时，teer值下降至单独培养e4orf1+脑内皮细胞(无gbm肿瘤细胞)时的值的约50％。当在胎牛血清(fbs)存在下进行共培养时，teer值下降两天，但在共培养的第三天恢复。本发明猜测这种恢复可能是由于fbs处理诱导的gbm细胞分化所致。

这些结果表明，本发明的模型系统展示了bbb的许多关键功能特性——包括但不限于提供高阻抗屏障，其渗透性对各种环境因子能够响应。

通过所述权利要求进一步描述本发明。