用于DNA突变的多重检测的图像差异多重测定的制作方法
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本文提供了使用微载体多重检测样品中dna突变的方法，以及与其相关的试剂盒。微载体用标识符编码并包括用于检测目标dna突变的探针。
背景技术：
早期检测是减少可归因于癌症的死亡数量的一个至关重要的因素，因为更晚期肿瘤的生长和转移与死亡率增加相关。大多数结直肠癌病例是散发性的，而非遗传性的，但在这些散发病例中常见的是几种基因以及甚至类型的特定突变。例如，认为kras基因在30-50％的结肠直肠癌中发生突变(mundade,r.等(2014)oncoscience1:400-6)。虽然现有技术诸如结肠镜检查和乙状结肠镜检查在检测许多类型的早期结肠直肠癌方面是有效的，但是由于它们的侵袭性性质，它们遭受低的患者接受度。已经测试了诸如粪便dna测试的替代方案(carethers,j.m.(2014)clin.gastroenterol.hepatol.12:377-81)，但需要以高精确度水平同时检查多个基因的综合测试而不是单个基因测试。
免疫学和分子诊断测定在研究和临床领域中起着关键作用。通常有必要对一小组多个靶标进行检测，以获得有意义的或鸟瞰图的结果，以促进研究或临床决策。在基因组学和蛋白质组学的时代尤其如此，其中认为丰富的遗传标志物和/或生物标志物影响或预测特定的疾病状态。理论上，多个靶标的测定可以通过在不同的反应容器中分别并行或顺序测试每个靶标(即，多项单重法(multiplesingleplexing))来实现。然而，采用单重法策略的测定不仅通常很麻烦，而且通常还需要大的样品体积，尤其是当要分析的靶标数量很大时。
多重测定在单次测定中同时测量多种分析物(两种或更多种)。多重测定通常用于高通量筛选设置，其中可以一次分析许多样本。同时测定多种分析物以及并行测定许多样本的能力是多重检测的标志，也是此类测定已成为范围从药物发现到功能基因组学到临床诊断学的领域的有力工具的原因。与单重法相反，通过在同一反应容器中合并所有靶标，由于每个样品仅处理一个反应容器，因此测定远没有那么麻烦且更容易执行得多。因此，所需的测试样品的体积可以显著减小，这在样品(例如，肿瘤组织、脑脊髓液或骨髓)大量取出困难和/或具有侵害性时尤其重要。同样重要的是可以降低试剂成本并且大大提高测定通量。
复杂大分子样品的许多测定由两个步骤组成。在第一步中，将能够特异性捕获靶大分子的试剂附接在固相表面上。这些固定化分子可用于通过各种方法诸如杂交(例如，在基于dna、rna的测定中)从复杂样品中捕获靶大分子。在第二步中，将检测分子和捕获分子与靶标的复合物一起孵育，从而发射信号，诸如荧光或其它电磁信号。然后通过那些信号的强度定量靶标的量。
可通过利用多种捕获剂来进行多重测定，每种捕获剂对不同的靶大分子具有特异性。在基于芯片的阵列多重测定中，将每种类型的捕获剂(例如，单链寡核苷酸探针)附接在芯片上的预定位置。通过在对应于一种类型的捕获剂的每个位置处测量检测分子的信号来测定复合样品中的多重靶标的量。在悬浮阵列多重测定中，将微粒或微载体悬浮在测定溶液中。这些微粒或微载体含有识别元件，其可被包埋、打印，或以其它方式由微粒/微载体的一个或多个元件产生。将每种类型的捕获剂固定到具有相同id的颗粒上，并且从具有特定id的颗粒表面上的检测分子发射的信号反映相应靶标的量。
多重测定特别适合的一种应用是dna突变的检测。特别地，检测与癌症相关的突变可以有助于癌症的早期诊断以及小的和/或在不易通过常规诊断工具(例如结肠镜检查)发现的位置中的肿瘤的检测。参见，例如，美国专利第7,833,757号。然而，现有的诊断技术通常是昂贵的或耗时的。使用连续的、单独的测定法检测多个基因突变的方法是耗时的，并且如果使用不同的测定类型进行则缺乏一致性(参见schneider,m.等(2011)cancers3:91-105)。将多重测定技术诸如模拟编码微载体应用于该问题可以提供具有更准确的结果、同时使得能够在单个测定中对已知与肿瘤发生相关的许多突变进行多重筛选的更便宜、更快速的测定。
因此，存在对将稳健且灵敏的多重测定系统应用于筛选dna突变的问题的需要。这提供了在单次测定中多重检测许多dna突变的机制。
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技术实现要素：
为了满足这种需要，本文提供了使用利用独特的标识符编码微载体的方法和试剂盒，所述微载体包括用于检测dna突变(例如，与结直肠癌相关的突变)的探针。这些微载体可用于多重测定，其中所述微载体中的每一种包括用于检测特定dna突变(例如，kras、braf、ctnnb1或apc基因中的突变)的探针和用于使微载体与其相关探针相关联的标识符。本文公开的方法和试剂盒可用于例如监测结直肠癌，监测对结直肠癌的治疗的响应，和/或结直肠癌的早期筛选/检测。
因此，在一个方面，本文提供了用于检测kras、braf、ctnnb1和apc基因中dna突变的存在的方法，该方法包括：(a)从样品中分离dna；(b)使用对kras、braf、ctnnb1和apc基因中的每一种中的一个或多个dna突变的基因座具有特异性的引物对，通过聚合酶链反应(pcr)扩增分离的dna；(c)使扩增的dna与至少四种探针杂交，所述至少四种探针包括一种或多种对kras、braf、ctnnb1和apc基因中的每一种中的dna突变具有特异性的探针，其中所述至少四种探针中的每一种偶联至微载体，并且其中所述微载体中的每一种包含对应于与其偶联的探针的标识符；(d)检测扩增的dna与所述至少四种探针的杂交是否存在，其中扩增的dna与探针之一之间的杂交表明存在对应于探针的dna突变；(e)检测微载体的标识符；和(f)使检测到的微载体的标识符与检测到的扩增的dna与微载体的相应探针的杂交的存在或不存在相关联。本文还提供了用于检测kras、braf、ctnnb1和apc基因中的dna突变的存在的方法，该方法包括：(a)使用对kras、braf、ctnnb1和apc基因中的每一种中的一个或多个dna突变的基因座具有特异性的引物对，通过聚合酶链反应(pcr)扩增分离的dna；(b)使扩增的dna与至少四种探针杂交，所述至少四种探针包括一种或多种对kras、braf、ctnnb1和apc基因中的每一种中的dna突变具有特异性的探针，其中所述至少四种探针中的每一种偶联至微载体，并且其中所述微载体中的每一种包含对应于与其偶联的探针的标识符；(c)检测扩增的dna与所述至少四种探针的杂交是否存在，其中扩增的dna与探针之一之间的杂交表明存在对应于探针的dna突变；(d)检测微载体的标识符；(e)使检测到的微载体的标识符与检测到的扩增的dna与微载体的相应探针的杂交的存在或不存在相关联。在一些实施方案中，kras、braf、ctnnb1和apc基因为人基因。在一些实施方案中，步骤(b)包括在至少四种阻断核酸存在的情况下通过pcr扩增分离的dna，其中所述至少四种阻断核酸中的每一种与对应于kras、braf、ctnnb1或apc基因中的dna突变中的一种的野生型dna基因座杂交，并阻止野生型dna基因座的扩增。在一些实施方案中，所述至少四种阻断核酸中的每一种包含：与相应野生型dna基因座杂交的单链寡核苷酸；和阻断单链寡核苷酸延伸的3'末端部分。在一些实施方案中，3'末端部分包含一个或多个反向脱氧胸苷。在一些实施方案中，所述至少四种阻断核酸中的每一种包含一种或多种选自由以下组成的组的经修饰的核苷酸：锁核酸(lna)、肽核酸(pna)、己糖核酸(hna)、苏糖核酸(tna)、二醇核酸(gna)和环己烯基核酸(cena)。在一些实施方案中，kras基因中的一个或多个dna突变包括编码g12d、g12v、g12s或g13d突变的kras蛋白的一个或多个dna突变。在一些实施方案中，所述至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列tacgccaccagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:3)；ttggagctggtggcgta(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:142)；gctggtggcgtaggca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:143)；gctggtggcgtaggc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:144)或ttggagctggtggcgt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:145)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，braf基因中的一个或多个dna突变包括编码v600e突变的braf蛋白的一个或多个dna突变。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:10)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:146)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:147)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:148)或gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:149)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，ctnnb1基因中的一个或多个dna突变至少包括编码t41a或t41i突变的ctnnb1蛋白的第一ctnnb1突变。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:15)；tgccactaccacag(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:150)；cactaccacagctcc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:151)；gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:152)或gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:153)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，ctnnb1基因中的一个或多个dna突变至少包括编码s45f或s45p突变的ctnnb1蛋白的第一ctnnb1突变的基因。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:20)；tccttctctgagtgg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:174)；gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:175)；tccttctctgagtgg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:176)或gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:177)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，apc基因中的一个或多个dna突变至少包括编码q1367*突变的apc蛋白的第一apc突变。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含gtgctcagacacc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:33)；gtgctcagacacc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:158)；agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:159)；agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:160)或agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:161)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，apc基因中的一个或多个dna突变至少包括编码r1450*突变的apc蛋白的第一apc突变。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列cttctcgcttggtt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:37)；gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:162)；cttctcgcttggtt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:163)；gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:164)或gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:165)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，apc基因中的一个或多个dna突变至少包括编码e1309移码突变的apc蛋白的第一apc突变。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:29)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:154)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:155)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:156)或cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:157)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，apc基因中的一个或多个dna突变至少包括编码s1465移码突变的apc蛋白的第一apc突变。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列ccactctctctcttttcagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:25)；taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:166)；taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:167)；ccactctctctcttttcagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:168)或taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:169)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，apc基因中的一个或多个dna突变至少包括编码t1556移码突变的apc蛋白的第一apc突变。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列caatagttttttctgcc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:41)；gaatcaatagttttttctgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:170)；tcagaatcaatagttttttctg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:171)；gaatcaatagattttactgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:172)或aatcaatagttttttctgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:173)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，每一个引物对包含偶联至检测试剂的引物。在一些实施方案中，检测试剂包括荧光检测试剂，并且其中在步骤(d)中检测扩增的dna与所述至少四种探针的杂交的存在或不存在包括荧光检测试剂的荧光成像。在一些实施方案中，检测试剂包含生物素，并且其中在步骤(d)中检测扩增的dna与所述至少四种探针的杂交的存在或不存在包括：(1)在步骤(c)中杂交后，使微载体与缀合于信号发射实体的链霉亲和素接触；和(2)检测来自与微载体缔合的信号发射实体的信号。在一些实施方案中，信号发射实体包含藻红蛋白(pe)。在一些实施方案中，在步骤(e)中检测微载体的标识符包括对标识符的明视场成像。
在一些实施方案中，kras基因中的一个或多个dna突变包括编码g12d、g12v、g12s和g13d突变的kras蛋白的kras突变。在一些实施方案中，对kras基因中的一个或多个dna突变具有特异性的探针包括四种探针，其包含序列ggagctgatgg(seqidno:4)、ggagctgttgg(seqidno:5)、tggagctagtgg(seqidno:6)和tggagctggtgacgt(seqidno:7)，并且其中四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，四种探针中的每一种还在5'末端处包含8个核苷酸，其中5'末端处的8个核苷酸是腺嘌呤或胸腺嘧啶核苷酸，并且其中四种探针中的每一种包含至少24个总核苷酸。在一些实施方案中，四种探针包括：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：ggagctgatgg(seqidno:4)、agctgatggcgta(seqidno:178)、tggagctgatggcg(seqidno:179)、tggagctgatgg(seqidno:180)和gctgatggcgta(seqidno:181)；(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：ggagctgttgg(seqidno:5)，tggagctgttggtggc(seqidno:182)、ggagctgttggtg(seqidno:183)、tggagctgttggt(seqidno:184)和tggagctgtaggtgg(seqidno:185)；(3)包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：ttggagctagtggcgta(seqidno:186)、gctagtggcgtaggc(seqidno:187)、agctagtggcgt(seqidno:188)、gttggagctagtgg(seqidno:189)和ggagctagtgg(seqidno:190)；以及(4)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：ggtgacgtaggcaa(seqidno:191)、tgacgtaggcaagag(seqidno:192)、gctggtgacgtagg(seqidno:193)、agctggtgacgtag(seqidno:194)和ggagctggtgacgt(seqidno:195)；并且其中四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，四种探针包括：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：ttttttttttttaaggagctgatgg(seqidno:47)、ttttttttttttagctgatggcgta(seqidno:74)、ttttttttttatggagctgatggcg(seqidno:75)、ttttttttttttatggagctgatgg(seqidno:76)和tttttttttttttgctgatggcgta(seqidno:77)；(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：ttttttttttttaaggagctgttgg(seqidno:48)、ttttttttatggagctgttggtggc(seqidno:78)、ttttttttttaaggagctgttggtg(seqidno:79)、tttttttttttatggagctgttggt(seqidno:80)和tttttttttatggagctgtaggtgg(seqidno:81)；(3)包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：tttttttttttatggagctagtgg(seqidno:49)、ttttttttttggagctagtggcgta(seqidno:82)、tttttaatttgctagtggcgtaggc(seqidno:83)、tttttttttatttagctagtggcgt(seqidno:84)、tttttttttttgttggagctagtgg(seqidno:85)和ttttttttttttaaggagctagtgg(seqidno:86)；以及(4)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：tttttttttatggagctggtgacgt(seqidno:50)、ttttttttaaaggtgacgtaggcaa(seqidno:87)、tttttttttatgacgtaggcaagag(seqidno:88)、tttttttttttgctggtgacgtagg(seqidno:89)、ttttttttttaagctggtgacgtag(seqidno:90)和tttttttttaaggagctggtgacgt(seqidno:91)；并且其中四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，步骤(b)包括使用包含序列gtactggtggagtatttgatagtg(seqidno:1)和atcgtcaaggcactcttgcctac(seqidno:2)的引物对通过pcr扩增分离的dna。在一些实施方案中，步骤(b)包括在阻断核酸存在的情况下通过pcr扩增分离的dna，所述阻断核酸包含以下的序列：tacgccaccagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:3)；ttggagctggtggcgta(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:142)；gctggtggcgtaggca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:143)；gctggtggcgtaggc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:144)或ttggagctggtggcgt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:145)，其中斜体核酸表示锁核酸。
在一些实施方案中，braf基因中的一个或多个dna突变包括两个或更多个编码v600e突变的braf蛋白的braf突变。在一些实施方案中，对braf基因中的一个或多个dna突变具有特异性的探针包括含有以下序列的两种探针：tctagctacagagaaat(seqidno:11)和gtctagctacagaaaaat(seqidno:12)，并且其中所述两种探针中的每一种偶联至具有不同标签符的微载体。在一些实施方案中，所述两种探针中的每一种还在5'末端处包含8个核苷酸，其中5'末端处的8个核苷酸是腺嘌呤或胸腺嘧啶核苷酸，并且其中两种探针中的每一种包含至少24个总核苷酸。在一些实施方案中，探针包括：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：tacagagaaatctcgat(seqidno:196)、tacagagaaatctc(seqidno:197)、ctagctacagagaaat(seqidno:198)、ctagctacagagaaa(seqidno:199)和tctagctacagag(seqidno:200)；以及(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：gtctagctacagaaaaatc(seqidno:201)、gtctagctacagaaaaat(seqidno:12)、tagctacagaaaaa(seqidno:202)、tctagctacagaaaaat(seqidno:203)和tctagctacagaaaaatc(seqidno:204)；并且其中两种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，探针包括：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：ttttttaatttctagctacagagaaat(seqidno:51)、tttttttttatacagagaaatctcgat(seqidno:92)、tttttttttaatttacagagaaatctc(seqidno:93)、ttttttaattactagctacagagaaat(seqidno:94)、tttttttaattactagctacagagaaa(seqidno:95)和ttttttttttaatttctagctacagag(seqidno:96)；以及(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：tttttttatgtctagctacagaaaaat(seqidno:52)、ttttatgtctagctacagaaaaatc(seqidno:97)、ttttttttatttttagctacagaaaaa(seqidno:98)、tttttttatttctagctacagaaaaat(seqidno:99)和ttttttttattctagctacagaaaaatc(seqidno:100)；并且其中两种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，步骤(b)包括使用包含序列ggacccactccatcgagattt(seqidno:8)和cagatatatttcttcatgaagacctcacagtaa(seqidno:9)的引物对通过pcr扩增分离的dna。在一些实施方案中，步骤(b)包括在包含以下序列的阻断核酸存在的情况下通过pcr扩增分离的dna：gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:10)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:146)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:147)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:148)或gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:149)，其中斜体核酸表示锁核酸。
在一些实施方案中，ctnnb1基因中的一个或多个dna突变包括编码t41a、t41i、s45f和s45p突变的ctnnb1蛋白的ctnnb1突变。在一些实施方案中，对ctnnb1基因中的一个或多个dna突变具有特异性的探针包括含有以下序列的四种探针：aggagctgtggcag(seqidno:16)、ggagctgtgata(seqidno:17)、tttaccactcagaaaag(seqidno:21)和taccactcagaggag(seqidno:22)，并且其中四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，四种探针中的每一种还在5'末端处包含8个核苷酸，其中5'末端处的8个核苷酸是腺嘌呤或胸腺嘧啶核苷酸，并且其中四种探针中的每一种包含至少24个总核苷酸。在一些实施方案中，四种探针包括：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：aggagctgtggcagt(seqidno:205)、aggagctgtggcagtg(seqidno:206)、gctgtggcagtggc(seqidno:207)、gctgtggcagtggca(seqidno:208)和aaggagctgtggcag(seqidno:209)；(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：ggagctgtgatagtgg(seqidno:210)、gagctgtgatagtggc(seqidno:211)、agctgtgatagtggca(seqidno:212)、agaaggagctgtgata(seqidno:213)和ggagctgtgat(seqidno:214)；(3)包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：actcagaaaaggagct(seqidno:215)、taccactcagaaaagga(seqidno:216)、tttaccactcagaaaaggag(seqidno:217)、ttaccactcagaaaag(seqidno:218)和cagaaaaggagctgtg(seqidno:219)；以及(4)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：actcagaggaggagc(seqidno:220)、ttaccactcagagga(seqidno:221)、ttaccactcagaggagg(seqidno:222)、ttaacactcagaggag(seqidno:223)和ttaccaatcagaggagg(seqidno:224)；并且其中四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，探针包括：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：tttttttttttaggagctgtggcag(seqidno:53)、tttttttttttaggagctgtggcagtg(seqidno:101)、tttttttttttagctgtggcagtggc(seqidno:102)、tttttttttttgctgtggcagtggca(seqidno:103)和ttttttttttaaggagctgtggcag(seqidno:104)；(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：tttttttttttttggagctgtgata(seqidno:54)、tttttttttggagctgtgatagtgg(seqidno:105)、tttttttttgagctgtgatagtggc(seqidno:106)、tttttttttagctgtgatagtggca(seqidno:107)、tttttttttagaaggagctgtgata(seqidno:108)和ttttttttttttttggagctgtgat(seqidno:109)；(3)包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：tttttttttttaccactcagaaaag(seqidno:55)、tttaattttactcagaaaaggagct(seqidno:110)、ttttttaataccactcagaaaagga(seqidno:111)、ttttttttaccactcagaaaaggag(seqidno:112)、ttttttttattaccactcagaaaag(seqidno:113)和tttttttttcagaaaaggagctgtg(seqidno:114)；以及(4)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：tttttttttaataccactcagaggag(seqidno:56)、tttttttttaaaactcagaggaggagc(seqidno:115)、tttttttttttattaccactcagagga(seqidno:116)、tttttttttattaccactcagaggagg(seqidno:117)、ttttttttttattaacactcagaggag(seqidno:118)和tttttttttattaccaatcagaggagg(seqidno:119)，并且其中四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，步骤(b)包括使用包含序列ggaatccattctggtgccact(seqidno:13)和agaaaatccctgttcccactcata(seqidno:14)的第一引物对以及包含序列ggtgccactaccacagctcct(seqidno:18)和tctcaaaactgcattctgactttca(seqidno:19)的第二引物对通过pcr扩增分离的dna。在一些实施方案中，步骤(b)包括在以下阻断核酸存在的情况下通过pcr扩增所述分离的dna：第一阻断核酸，其包含序列：gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:15)；tgccactaccacag(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:150)；cactaccacagctcc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:151)；gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:152)或gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:153)；以及第二阻断核酸，其包含序列：gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:20)；tccttctctgagtgg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:174)；gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:175)；tccttctctgagtgg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:176)或gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:177)，其中斜体核酸表示锁核酸。
在一些实施方案中，apc基因中的一个或多个dna突变包括编码q1367*、r1450*、e1309移码、s1465移码和t1556移码突变的apc蛋白的apc突变。在一些实施方案中，对apc基因中的一个或多个dna突变具有特异性的探针包括含有以下序列的5种探针：actgctgaaaagagagagt(seqidno:26)、gaaataaaagattgg(seqidno:30)、ttttgggtgtctaag(seqidno:34)、caaaccaagtgagaa(seqidno:38)和agaggcagaaaaaaact(seqidno:42)，并且其中所述五种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，五种探针中的每一种还在5'末端处包含8个核苷酸，其中5'末端处的8个核苷酸是腺嘌呤或胸腺嘧啶核苷酸，并且其中五种探针中的每一种包含至少24个总核苷酸。在一些实施方案中，探针包括：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：aaatagcagaaataaaag(seqidno:225)、gaaataaaagattggaa(seqidno:226)、agaaataaaagattg(seqidno:227)、gaaataaatgaatgg(seqidno:228)和cagaaataaaagatt(seqidno:229)；(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：tttgggtgtctaag(seqidno:230)、gggtgtctaagcaccact(seqidno:231)、ctaagcaccactttt(seqidno:232)、ttttgggtgtctaa(seqidno:233)和ggtgtctaagcacca(seqidno:234)；(3)包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：aagtgagaagtacctaa(seqidno:235)、caaaccaagtgagaa(seqidno:38)、tcaaaccaagtgag(seqidno:236)、accaagtgagaagta(seqidno:237)和agctcaaaccaagtgag(seqidno:238)；(4)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：gcacctactgctgaa(seqidno:239)、acctactgctgaaaag(seqidno:240)、tgctgaaaagagagagt(seqidno:241)、actgctgaaaagagagagt(seqidno:26)和cctactgctgaaaagaga(seqidno:242)；以及(5)包含选自由以下组成的组的序列的第五探针：gcagaaaaaaactattg(seqidno:243)、agaggcagaaaaaaact(seqidno:42)、cagaaaaaaactattgatt(seqidno:244)、agaaagaggcagaaaaaaact(seqidno:245)和gaggcagaaaaaaacta(seqidno:246)；并且其中五种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，探针包括：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：tttttttttttttgaaataaaagattgg(seqidno:58)、ttttttttttaaatagcagaaataaaag(seqidno:120)、tttttttttttgaaataaaagattggaa(seqidno:121)、tttttttttttttagaaataaaagattg(seqidno:122)、tttttttttttttgaaataaatgaatgg(seqidno:123)和tttttttttttttcagaaataaaagatt(seqidno:124)；(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：tttttttttttttgggtgtctaag(seqidno:59)、tttttttttatttgggtgtctaag(seqidno:125)、ttttttgggtgtctaagcaccact(seqidno:126)、tttttttttctaagcaccactttt(seqidno:127)、ttttttttttttttgggtgtctaa(seqidno:128)和tttttttttggtgtctaagcacca(seqidno:129)；(3)包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：tttttttttacaaaccaagtgagaa(seqidno:60)、ttttttttaagtgagaagtacctaa(seqidno:130)、ttttttttttttcaaaccaagtgag(seqidno:131)、ttttttttttaccaagtgagaagta(seqidno:132)和ttttttttagctcaaaccaagtgag(seqidno:133)；(4)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：ttttttttactgctgaaaagagagagt(seqidno:57)、tttttttttgcacctactgctgaa(seqidno:134)、tttttttttacctactgctgaaaag(seqidno:135)、tttttttttgctgaaaagagagagt(seqidno:136)和tttttttttcctactgctgaaaagaga(seqidno:137)；以及(5)包含选自由以下组成的组的序列的第五探针：ttttttttttagaggcagaaaaaaact(seqidno:61)、ttttttttttgcagaaaaaaactattg(seqidno:138)、tttttttttttcagaaaaaaactattgatt(seqidno:139)、tttttttagaaagaggcagaaaaaaact(seqidno:140)和tttttttttttgaggcagaaaaaaacta(seqidno:141)；并且其中所述五种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，步骤(b)包括使用以下引物对通过pcr扩增所述分离的dna：包含序列taaaaataaagcacctactgctgaaa(seqidno:23)和agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)的第一引物对；包含序列taggatgtaatcagacgacacagga(seqidno:27)和cagctgacctagttccaatctttta(seqidno:28)的第二引物对；包含序列tctccctccaaaagtggtgct(seqidno:31)和tggcaatcgaacgactctcaa(seqidno:32)的第三引物对；包含序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)的第四引物对，其中斜体核酸表示锁核酸；以及包含序列caggaaaatgacaatgggaatg(seqidno:39)和atctaataggtccttttcagaatcaatag(seqidno:40)的第五引物对。在一些实施方案中，步骤(b)包括在以下阻断核酸存在的情况下通过pcr扩增所述分离的dna：第一阻断核酸，其包含序列：ccactctctctcttttcagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:25)；taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:166)；taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:167)；ccactctctctcttttcagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:168)或taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:169)；第二阻断核酸，其包含序列：cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:29)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:154)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:155)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:156)或cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:157)；第三阻断核酸，其包含序列：gtgctcagacacc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:33)；gtgctcagacacc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:158)；agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:159)；agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:160)或agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:161)；第四阻断核酸，其包含序列：cttctcgcttggtt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:37)；gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:162)；cttctcgcttggtt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:163)；gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:164)或gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:165)；第五阻断核酸，其包含序列：caatagttttttctgcc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:41)；gaatcaatagttttttctgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:170)；tcagaatcaatagttttttctg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:171)；gaatcaatagattttactgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:172)或aatcaatagttttttctgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:173)，其中斜体核酸表示锁核酸。
在任何上述实施方案中的一些实施方案中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，所述方法还包括：使用对阳性对照dna序列具有特异性的引物对扩增阳性对照dna序列；使扩增的阳性对照基因序列与对阳性对照基因序列具有特异性的探针接触，其中对阳性对照基因序列具有特异性的探针偶联至具有对应于阳性对照的标识符的微载体；检测扩增的阳性对照dna序列与对阳性对照基因序列具有特异性的探针的杂交的存在或不存在；以及检测对应于阳性对照的标识符。在一些实施方案中，阳性对照dna序列包含人白细胞抗原基因的序列。在一些实施方案中，对阳性对照dna序列具有特异性的引物对包含序列tgagtgttacttcttcccacactc(seqidno:43)和attgcttttgcgcaatccct(seqidno:44)。在一些实施方案中，对阳性对照基因序列具有特异性的探针包含序列ttttttttttttggagacggtctg(seqidno:45)。在一些实施方案中，对阳性对照dna序列具有特异性的引物对包含序列aatcccatcaccatcttcca(seqidno:71)和tggactccacgacgtactca(seqidno:72)。在一些实施方案中，对阳性对照基因序列具有特异性的探针包含序列ctgtcttccactcactcc(seqidno:73)。
在一些实施方案中，所述方法还包括：检测扩增的dna与具有对应于阴性对照的标识符的微载体的杂交的不存在，其中具有对应于阴性对照的标识符的微载体包含不与扩增的dna杂交的探针；以及检测对应于阴性对照的标识符。在一些实施方案中，具有对应于阴性对照的标识符的微载体包含含有序列aatataatatattat(seqidno:46)的探针。在一些实施方案中，微载体的标识符包含数字条形码。在一些实施方案中，所述微载体中的每一种包含：(i)第一光聚合物层；(ii)第二光聚合物层；和(iii)第一层与第二层之间的中间层，所述中间层具有表示限定在其上的标识符的编码图案，其中所述中间层是部分地基本上透光的以及部分地基本上不透光的，表示对应于微载体的代码，其中微载体的最外表面包含光致抗蚀剂光聚合物，并且用对dna突变具有特异性的探针官能化所述光致抗蚀剂光聚合物，并且其中所述微载体具有与水大致相同的密度。在一些实施方案中，微载体的标识符包含模拟代码。在一些实施方案中，所述微载体中的每一种包含：(i)具有第一表面和第二表面的基本上透明的聚合物层，所述第一表面与所述第二表面彼此平行；(ii)基本上不透明的聚合物层，其中基本上不透明的聚合物层被固定至基本上透明的聚合物层的第一表面并包围基本上透明的聚合物层的中心部分，并且其中基本上不透明的聚合物层包含表示模拟代码标识符的二维形状，其中所述模拟代码代表标识符；以及(iii)对dna突变具有特异性的探针，其中所述探针耦合至基本上透明的聚合物层的至少中心部分中的基本上透明的聚合物层的第一表面和第二表面中的至少一个表面。在一些实施方案中，所述微载体中的每一种还包含：(iv)与第一基本上透明的聚合物层对齐的第二基本上透明的聚合物层，第二基本上透明的聚合物层具有与第一基本上透明的聚合物层的中心部分对齐的中心部分，其中第二基本上透明的聚合物层被固定至第一基本上透明的聚合物层的第二表面，并且不延伸超出第一基本上透明的聚合物层的二维形状；以及(v)基本上不透明的磁层，其包围基本上不透明的聚合物层与基本上透明的聚合物层的中心部分之间的第一基本上透明的聚合物层的中心部分，其中基本上不透明的磁层被固定在第一基本上透明的聚合物层与第二基本上透明的聚合物层之间。在一些实施方案中，所述微载体中的每一种还包含用于对基本上不透明的聚合物层的模拟代码进行定向的定向指示器。在一些实施方案中，基本上不透明的聚合物层的二维形状包括含有多个齿轮齿的齿轮形状，并且其中模拟代码由选自由以下组成的组的一个或多个方面表示：所述多个齿轮齿中的一个或多个齿轮齿的高度、所述多个齿轮齿中的一个或多个齿轮齿的宽度、所述多个齿轮齿中的齿轮齿的数量以及所述多个齿轮齿内一个或多个齿轮齿的排列。在一些实施方案中，所述微载体中的每一种还包含：(vi)从第一基本上透明的聚合物层的第一表面突出的一个或多个柱，其中所述一个或多个柱不在第一基本上透明的聚合物层的中心部分内；和/或(vii)从第一基本上透明的聚合物层的第二表面或未固定至第一基本上透明的聚合物层的第二基本上透明的聚合物层的表面突出的一个或多个柱，其中所述一个或多个柱不在第一基本上透明的聚合物层或第二基本上透明的聚合物层的中心部分内。在一些实施方案中，第一基本上透明的聚合物层或第二基本上透明的聚合物层的基本上透明的聚合物包括环氧基聚合物。在一些实施方案中，环氧基聚合物是su-8。在一些实施方案中，样品是粪便样品。在一些实施方案中，从患者获得多个粪便样品。在一些实施方案中，从单个粪便样本获得多个粪便样品。在一些实施方案中，本公开的方法包括检测扩增的dna与总共约1个至约1000个微载体/测定板的孔的杂交的存在或不存在。在一些实施方案中，本公开的方法用于检测例如从其收集样品的患者中的结肠癌、直肠癌、结直肠癌、结肠腺瘤、直肠腺瘤或结直肠腺瘤。
因此，在另一方面，本文提供了包含至少四个微载体的试剂盒，其中所述至少四种微载体中的每一种包含：(i)偶联至微载体的探针，其中所述探针对kras、braf、ctnnb1或apc基因中的dna突变具有特异性；和(ii)对应于与其偶联的探针的标识符；其中所述试剂盒包含至少一种包含对kras基因中的dna突变具有特异性的探针的微载体，至少一种包含对braf基因中的dna突变具有特异性的探针的微载体，至少一种包含对ctnnb1基因中的dna突变具有特异性的探针的微载体以及至少一种包含对apc基因中的dna突变具有特异性的探针的微载体。在一些实施方案中，kras、braf、ctnnb1和apc基因是人基因。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含：至少四种阻断核酸，其中所述至少四种阻断核酸中的每一种与对应于kras、braf、ctnnb1和apc基因中的dna突变之一的野生型dna基因座杂交。所述至少四种阻断核酸中的每一种包含：与相应野生型dna基因座杂交的单链寡核苷酸；和阻断单链寡核苷酸延伸的3'末端部分。在一些实施方案中，3'末端部分包含一个或多个反向脱氧胸苷。在一些实施方案中，所述至少四种阻断核酸中的每一种包含一种或多种选自由以下组成的组的经修饰的核苷酸：锁核酸(lna)、肽核酸(pna)、己糖核酸(hna)、苏糖核酸(tna)、二醇核酸(gna)和环己烯基核酸(cena)。在一些实施方案中，kras基因中的dna突变包括一个或多个编码g12d、g12v、g12s或g13d突变的kras蛋白的dna突变。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列tacgccaccagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:3)；ttggagctggtggcgta(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:142)；gctggtggcgtaggca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:143)；gctggtggcgtaggc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:144)或ttggagctggtggcgt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:145)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，braf基因中的dna突变包括一个或更多个编码v600e突变的braf蛋白的dna突变。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:10)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:146)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:147)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:148)或gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:149)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，ctnnb1基因中的dna突变至少包括编码t41a或t41i突变的ctnnb1蛋白的第一ctnnb1突变。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:15)；tgccactaccacag(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:150)；cactaccacagctcc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:151)；gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:152)或gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:153)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，ctnnb1基因中的dna突变至少包括编码s45f或s45p突变的ctnnb1蛋白的第一ctnnb1突变。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:20)；tccttctctgagtgg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:174)；gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:175)；tccttctctgagtgg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:176)或gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:177)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，apc基因中的dna突变至少包括编码q1367*突变的apc蛋白的第一apc突变。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列gtgctcagacacc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:33)；gtgctcagacacc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:158)；agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:159)；agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:160)或agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:161)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，apc基因中的dna突变至少包括编码r1450*突变的apc蛋白的第一apc突变。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列cttctcgcttggtt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:37)；gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:162)；cttctcgcttggtt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:163)；gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:164)或gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:165)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，apc基因中的dna突变至少包括编码e1309移码突变的apc蛋白的第一apc突变。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:29)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:154)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:155)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:156)或cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:157)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，apc基因中的dna突变至少包括编码s1465移码突变的apc蛋白的第一apc突变。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列ccactctctctcttttcagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:25)；taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:166)；taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:167)；ccactctctctcttttcagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:168)或taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:169)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，apc基因中的dna突变至少包括编码t1556移码突变的apc蛋白的第一apc突变。在一些实施方案中，至少四种阻断核酸中的至少一种包含序列caatagttttttctgcc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:41)；gaatcaatagttttttctgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:170)；tcagaatcaatagttttttctg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:171)；gaatcaatagattttactgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:172)或aatcaatagttttttctgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:173)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含至少四个引物对，其中所述试剂盒包含对kras、braf、ctnnb1和apc基因中的每一种中的一个或多个dna突变的基因座具有特异性的引物对。在一些实施方案中，所述至少四个引物对中的每一个包含偶联至检测试剂的引物。在一些实施方案中，检测试剂包括荧光检测试剂。在一些实施方案中，检测试剂包含生物素，并且其中所述试剂盒还包含与信号发射实体缀合的链霉亲和素。在一些实施方案中，信号发射实体包含藻红蛋白(pe)。
在一些实施方案中，kras基因中的dna突变包括编码g12d、g12v、g12s和g13d突变的kras蛋白的kras突变。在一些实施方案中，试剂盒包含4种探针，所述探针包含序列ggagctgatgg(seqidno:4)、ggagctgttgg(seqidno:5)、tggagctagtgg(seqidno:6)和tggagctggtgacgt(seqidno:7)，并且其中四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，试剂盒包含：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：ggagctgatgg(seqidno:4)、agctgatggcgta(seqidno:178)、tggagctgatggcg(seqidno:179)、tggagctgatgg(seqidno:180)和gctgatggcgta(seqidno:181)；(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：ggagctgttgg(seqidno:5)、tggagctgttggtggc(seqidno:182)、ggagctgttggtg(seqidno:183)、tggagctgttggt(seqidno:184)和tggagctgtaggtgg(seqidno:185)；(3)包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：ttggagctagtggcgta(seqidno:186)、gctagtggcgtaggc(seqidno:187)、agctagtggcgt(seqidno:188)、gttggagctagtgg(seqidno:189)和ggagctagtgg(seqidno:190)；以及(4)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：ggtgacgtaggcaa(seqidno:191)、tgacgtaggcaagag(seqidno:192)、gctggtgacgtagg(seqidno:193)、agctggtgacgtag(seqidno:194)和ggagctggtgacgt(seqidno:195)，并且其中四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，四种探针中的每一种还在5'末端处包含8个核苷酸，其中5'末端处的8个核苷酸是腺嘌呤或胸腺嘧啶核苷酸，并且其中四种探针中的每一种包含至少24个总核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒包含：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：ttttttttttttaaggagctgatgg(seqidno:47)、ttttttttttttagctgatggcgta(seqidno:74)、ttttttttttatggagctgatggcg(seqidno:75)、ttttttttttttatggagctgatgg(seqidno:76)和tttttttttttttgctgatggcgta(seqidno:77)；(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：ttttttttttttaaggagctgttgg(seqidno:48)、ttttttttatggagctgttggtggc(seqidno:78)、ttttttttttaaggagctgttggtg(seqidno:79)、tttttttttttatggagctgttggt(seqidno:80)和tttttttttatggagctgtaggtgg(seqidno:81)；(3)包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：tttttttttttatggagctagtgg(seqidno:49)、ttttttttttggagctagtggcgta(seqidno:82)、tttttaatttgctagtggcgtaggc(seqidno:83)、tttttttttatttagctagtggcgt(seqidno:84)、tttttttttttgttggagctagtgg(seqidno:85)和ttttttttttttaaggagctagtgg(seqidno:86)；以及(4)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：tttttttttatggagctggtgacgt(seqidno:50)、ttttttttaaaggtgacgtaggcaa(seqidno:87)、tttttttttatgacgtaggcaagag(seqidno:88)、tttttttttttgctggtgacgtagg(seqidno:89)、ttttttttttaagctggtgacgtag(seqidno:90)，和tttttttttaaggagctggtgacgt(seqidno:91)，并且其中四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，试剂盒还包含含有序列gtactggtggagtatttgatagtg(seqidno:1)和atcgtcaaggcactcttgcctac(seqidno:2)的引物对。在一些实施方案中，试剂盒还包含含有以下的序列的阻断核酸：tacgccaccagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:3)；ttggagctggtggcgta(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:142)；gctggtggcgtaggca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:143)；gctggtggcgtaggc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:144)或ttggagctggtggcgt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:145)，其中斜体核酸表示锁核酸。
在一些实施方案中，braf基因中的dna突变包括两个或更多个编码v600e突变的braf蛋白的braf突变。在一些实施方案中，试剂盒包含含有以下序列的两种探针：tctagctacagagaaat(seqidno:11)和gtctagctacagaaaaat(seqidno:12)，并且其中两种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，试剂盒包含：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：tacagagaaatctcgat(seqidno:196)、tacagagaaatctc(seqidno:197)、ctagctacagagaaat(seqidno:198)、ctagctacagagaaa(seqidno:199)和tctagctacagag(seqidno:200)；以及(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：gtctagctacagaaaaatc(seqidno:201)、gtctagctacagaaaaat(seqidno:12)、tagctacagaaaaa(seqidno:202)、tctagctacagaaaaat(seqidno:203)和tctagctacagaaaaatc(seqidno:204)；并且其中四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，两种探针中的每一种还在5'末端处包含8个核苷酸，其中5'末端处的8个核苷酸是腺嘌呤或胸腺嘧啶核苷酸，并且其中两种探针中的每一种包含至少24个总核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒包含：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：ttttttaatttctagctacagagaaat(seqidno:51)、tttttttttatacagagaaatctcgat(seqidno:92)、tttttttttaatttacagagaaatctc(seqidno:93)、ttttttaattactagctacagagaaat(seqidno:94)、tttttttaattactagctacagagaaa(seqidno:95)和ttttttttttaatttctagctacagag(seqidno:96)；以及(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：tttttttatgtctagctacagaaaaat(seqidno:52)、ttttatgtctagctacagaaaaatc(seqidno:97)、ttttttttatttttagctacagaaaaa(seqidno:98)、tttttttatttctagctacagaaaaat(seqidno:99)和ttttttttattctagctacagaaaaatc(seqidno:100)；并且其中两种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，试剂盒还包含含有序列ggacccactccatcgagattt(seqidno:8)和cagatatatttcttcatgaagacctcacagtaa(seqidno:9)的引物对。在一些实施方案中，试剂盒还包含含有以下的序列的阻断核酸：gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:10)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:146)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:147)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:148)或gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:149)，其中斜体核酸表示锁核酸。
在一些实施方案中，ctnnb1基因中的dna突变包括编码t41a、t41i、s45f和s45p突变的ctnnb1蛋白的ctnnb1突变。在一些实施方案中，试剂盒包含含有以下序列的四种探针：aggagctgtggcag(seqidno:16)、ggagctgtgata(seqidno:17)、tttaccactcagaaaag(seqidno:21)和taccactcagaggag(seqidno:22)，并且其中所述四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，四种探针中的每一种还在5'末端处包含8个核苷酸，其中5'末端处的8个核苷酸是腺嘌呤或胸腺嘧啶核苷酸，并且其中四种探针中的每一种包含至少24个总核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒包含：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：aggagctgtggcagt(seqidno:205)、aggagctgtggcagtg(seqidno:206)、gctgtggcagtggc(seqidno:207)、gctgtggcagtggca(seqidno:208)和aaggagctgtggcag(seqidno:209)；(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：ggagctgtgatagtgg(seqidno:210)、gagctgtgatagtggc(seqidno:211)、agctgtgatagtggca(seqidno:212)、agaaggagctgtgata(seqidno:213)和ggagctgtgat(seqidno:214)；(3)包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：actcagaaaaggagct(seqidno:215)、taccactcagaaaagga(seqidno:216)、tttaccactcagaaaaggag(seqidno:217)、ttaccactcagaaaag(seqidno:218)和cagaaaaggagctgtg(seqidno:219)；以及(4)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：actcagaggaggagc(seqidno:220)、ttaccactcagagga(seqidno:221)、ttaccactcagaggagg(seqidno:222)、ttaacactcagaggag(seqidno:223)和ttaccaatcagaggagg(seqidno:224)；并且其中四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，四种探针中的每一种还在5'末端处包含8个核苷酸，其中5'末端处的8个核苷酸是腺嘌呤或胸腺嘧啶核苷酸，并且其中四种探针中的每一种包含至少24个总核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒包含：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：tttttttttttaggagctgtggcag(seqidno:53)、tttttttttttaggagctgtggcagtg(seqidno:101)、tttttttttttagctgtggcagtggc(seqidno:102)、tttttttttttgctgtggcagtggca(seqidno:103)和ttttttttttaaggagctgtggcag(seqidno:104)；(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：tttttttttttttggagctgtgata(seqidno:54)、tttttttttggagctgtgatagtgg(seqidno:105)、tttttttttgagctgtgatagtggc(seqidno:106)、tttttttttagctgtgatagtggca(seqidno:107)、tttttttttagaaggagctgtgata(seqidno:108)和ttttttttttttttggagctgtgat(seqidno:109)；(3)包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：tttttttttttaccactcagaaaag(seqidno:55)、tttaattttactcagaaaaggagct(seqidno:110)、ttttttaataccactcagaaaagga(seqidno:111)、ttttttttaccactcagaaaaggag(seqidno:112)、ttttttttattaccactcagaaaag(seqidno:113)和tttttttttcagaaaaggagctgtg(seqidno:114)；以及(4)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：tttttttttaataccactcagaggag(seqidno:56)、tttttttttaaaactcagaggaggagc(seqidno:115)、tttttttttttattaccactcagagga(seqidno:116)、tttttttttattaccactcagaggagg(seqidno:117)、ttttttttttattaacactcagaggag(seqidno:118)和tttttttttattaccaatcagaggagg(seqidno:119)，并且其中四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，试剂盒还包含含有序列ggaatccattctggtgccact(seqidno:13)和agaaaatccctgttcccactcata(seqidno:14)的第一引物对，以及含有序列ggtgccactaccacagctcct(seqidno:18)和tctcaaaactgcattctgactttca(seqidno:19)的第二引物对。在一些实施方案中，试剂盒还包含以下阻断核酸：包含以下序列的第一阻断核酸：gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:15)；tgccactaccacag(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:150)；cactaccacagctcc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:151)；gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:152)或gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:153)；包含以下序列的第二阻断核酸：gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:20)；tccttctctgagtgg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:174)；gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:175)；tccttctctgagtgg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:176)或gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:177)，其中斜体核酸表示锁核酸。
在一些实施方案中，apc基因中的dna突变包括编码q1367*、r1450*、e1309移码、s1465移码和t1556移码突变的apc蛋白的apc突变。在一些实施方案中，试剂盒包含五种探针，所述探针包含序列actgctgaaaagagagagt(seqidno:26)、gaaataaaagattgg(seqidno:30)、ttttgggtgtctaag(seqidno:34)、caaaccaagtgagaa(seqidno:38)和agaggcagaaaaaaact(seqidno:42)，并且其中五种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，试剂盒包含：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：aaatagcagaaataaaag(seqidno:225)、gaaataaaagattggaa(seqidno:226)、agaaataaaagattg(seqidno:227)、gaaataaatgaatgg(seqidno:228)和cagaaataaaagatt(seqidno:229)；(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：tttgggtgtctaag(seqidno:230)、gggtgtctaagcaccact(seqidno:231)、ctaagcaccactttt(seqidno:232)、ttttgggtgtctaa(seqidno:233)和ggtgtctaagcacca(seqidno:234)；(3)包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：aagtgagaagtacctaa(seqidno:235)、caaaccaagtgagaa(seqidno:38)、tcaaaccaagtgag(seqidno:236)、accaagtgagaagta(seqidno:237)和agctcaaaccaagtgag(seqidno:238)；(4)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：gcacctactgctgaa(seqidno:239)、acctactgctgaaaag(seqidno:240)、tgctgaaaagagagagt(seqidno:241)，actgctgaaaagagagagt(seqidno:26)和cctactgctgaaaagaga(seqidno:242)；以及(5)包含选自由以下组成的组的序列的第五探针：gcagaaaaaaactattg(seqidno:243)、agaggcagaaaaaaact(seqidno:42)、cagaaaaaaactattgatt(seqidno:244)、agaaagaggcagaaaaaaact(seqidno:245)和gaggcagaaaaaaacta(seqidno:246)；并且其中五种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，五种探针中的每一种还在5'末端处包含8个核苷酸，其中5'末端处的8个核苷酸是腺嘌呤或胸腺嘧啶核苷酸，并且其中五种探针中的每一种包含至少24个总核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒包含：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：tttttttttttttgaaataaaagattgg(seqidno:58)、ttttttttttaaatagcagaaataaaag(seqidno:120)、tttttttttttgaaataaaagattggaa(seqidno:121)、tttttttttttttagaaataaaagattg(seqidno:122)、tttttttttttttgaaataaatgaatgg(seqidno:123)和tttttttttttttcagaaataaaagatt(seqidno:124)；(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：tttttttttttttgggtgtctaag(seqidno:59)、tttttttttatttgggtgtctaag(seqidno:125)、ttttttgggtgtctaagcaccact(seqidno:126)、tttttttttctaagcaccactttt(seqidno:127)、ttttttttttttttgggtgtctaa(seqidno:128)和tttttttttggtgtctaagcacca(seqidno:129)；(3)包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：tttttttttacaaaccaagtgagaa(seqidno:60)、ttttttttaagtgagaagtacctaa(seqidno:130)、ttttttttttttcaaaccaagtgag(seqidno:131)、ttttttttttaccaagtgagaagta(seqidno:132)和ttttttttagctcaaaccaagtgag(seqidno:133)；(4)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：ttttttttactgctgaaaagagagagt(seqidno:57)、ttttttttttgcacctactgctgaa(seqidno:134)、tttttttttacctactgctgaaaag(seqidno:135)、tttttttttgctgaaaagagagagt(seqidno:136)和tttttttttcctactgctgaaaagaga(seqidno:137)；以及(5)包含选自由以下组成的组的序列的第五探针：ttttttttttagaggcagaaaaaaact(seqidno:61)、ttttttttttgcagaaaaaaactattg(seqidno:138)、tttttttttttcagaaaaaaactattgatt(seqidno:139)、tttttttagaaagaggcagaaaaaaact(seqidno:140)和tttttttttttgaggcagaaaaaaacta(seqidno:141)；并且其中五种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体。在一些实施方案中，试剂盒还包含以下引物对：包含序列taaaaataaagcacctactgctgaaa(seqidno:23)和agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)的第一引物对；包含序列taggatgtaatcagacgacacagga(seqidno:27)和cagctgacctagttccaatctttta(seqidno:28)的第二引物对；包含序列tctccctccaaaagtggtgct(seqidno:31)和tggcaatcgaacgactctcaa(seqidno:32)的第三引物对；包含序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)的第四引物对，其中斜体核酸表示锁核酸；以及包含序列caggaaaatgacaatgggaatg(seqidno:39)和atctaataggtccttttcagaatcaatag(seqidno:40)的第五引物对。在一些实施方案中，在一些实施方案中，试剂盒还包含以下阻断核酸：含有以下的序列的第一阻断核酸：ccactctctctcttttcagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:25)；taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:166)；taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:167)；ccactctctctcttttcagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:168)或taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:169)；含有以下的序列的第二阻断核酸：cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:29)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:154)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:155)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:156)或cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:157)；含有以下的序列的第三阻断核酸：gtgctcagacacc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:33)；gtgctcagacacc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:158)；agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:159)；agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:160)或agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:161)；含有以下的序列的第四阻断核酸：cttctcgcttggtt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:37)；gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:162)；cttctcgcttggtt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:163)；gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:164)或gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:165)；以及含有以下的序列的第五阻断核酸：caatagttttttctgcc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:41)；gaatcaatagttttttctgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:170)；tcagaatcaatagttttttctg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:171)；gaatcaatagattttactgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:172)或aatcaatagttttttctgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:173)，其中斜体核酸表示锁核酸。
在任何上述实施方案中的一些实施方案中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，试剂盒还包含具有对应于阳性对照的标识符并且与对阳性对照基因序列具有特异性的探针偶联的微载体；以及对阳性对照dna序列具有特异性的引物对。在一些实施方案中，阳性对照dna序列包含人白细胞抗原基因的序列。在一些实施方案中，对阳性对照dna序列具有特异性的引物对包含序列tgagtgttacttcttcccacactc(seqidno:43)和attgcttttgcgcaatccct(seqidno:44)。在一些实施方案中，对阳性对照基因序列具有特异性的探针包含序列ttttttttttttggagacggtctg(seqidno:45)。在一些实施方案中，对阳性对照dna序列具有特异性的引物对包含序列aatcccatcaccatcttcca(seqidno:71)和tggactccacgacgtactca(seqidno:72)。在一些实施方案中，对阳性对照基因序列具有特异性的探针包含序列ctgtcttccactcactcc(seqidno:73)。在一些实施方案中，试剂盒还包含具有对应于阴性对照的标识符并且与不与扩增的dna杂交的探针偶联的微载体。在一些实施方案中，具有对应于阴性对照的标识符的微载体包含含有序列aatataatatattat(seqidno:46)的探针。
在一些实施方案中，微载体的标识符包含数字条形码。在一些实施方案中，所述微载体中的每一种包含：(i)第一光聚合物层；(ii)第二光聚合物层；和(iii)第一层与第二层之间的中间层，所述中间层具有表示限定于其上的标识符的编码图案，其中所述中间层是部分地基本上透光的以及部分地基本上不透光的，表示对应于微载体的代码，其中微载体的最外表面包含光致抗蚀剂光聚合物，并且用对dna突变具有特异性的探针官能化所述光致抗蚀剂光聚合物，并且其中所述微载体具有与水大致相同的密度。在一些实施方案中，微载体的标识符包含模拟代码。在一些实施方案中，所述微载体中的每一种包含：(i)具有第一表面和第二表面的基本上透明的聚合物层，所述第一表面与所述第二表面彼此平行；(ii)基本上不透明的聚合物层，其中基本上不透明的聚合物层被固定至基本上透明的聚合物层的第一表面并包围基本上透明的聚合物层的中心部分，并且其中基本上不透明的聚合物层包含表示模拟代码的二维形状，其中所述模拟代码代表标识符；以及(iii)对dna突变具有特异性的探针，其中所述探针偶联至基本上透明的聚合物层的至少中心部分中的基本上透明的聚合物层的第一表面和第二表面中的至少一个表面。在一些实施方案中，所述微载体中的每一种还包含：(iv)与第一基本上透明的聚合物层对齐的第二基本上透明的聚合物层，第二基本上透明的聚合物层具有与第一基本上透明的聚合物层的中心部分对齐的中心部分，其中第二基本上透明的聚合物层被固定至第一基本上透明的聚合物层的第二表面，并且不延伸超出第一基本上透明的聚合物层的二维形状；以及(v)基本上不透明的磁层，其包围基本上不透明的聚合物层与基本上透明的聚合物层的中心部分之间的第一基本上透明的聚合物层的中心部分，其中基本上不透明的磁层被固定在第一基本上透明的聚合物层与第二基本上透明的聚合物层之间。在一些实施方案中，所述微载体中的每一种还包含用于对基本上不透明的聚合物层的模拟代码进行定向的定向指示器。在一些实施方案中，基本上不透明的聚合物层的二维形状包括含有多个齿轮齿的齿轮形状，并且其中模拟代码由选自由以下组成的组的一个或多个方面表示：所述多个齿轮齿中的一个或多个齿轮齿的高度、所述多个齿轮齿中的一个或多个齿轮齿的宽度、所述多个齿轮齿中的齿轮齿的数量以及所述多个齿轮齿内一个或多个齿轮齿的排列。在一些实施方案中，所述微载体中的每一种还包含：(vi)从第一基本上透明的聚合物层的第一表面突出的一个或多个柱，其中所述一个或多个柱不在第一基本上透明的聚合物层的中心部分内；和/或(vii)从第一基本上透明的聚合物层的第二表面或未固定至第一基本上透明的聚合物层的第二基本上透明的聚合物层的表面突出的一个或多个柱，其中所述一个或多个柱不在第一基本上透明的聚合物层或第二基本上透明的聚合物层的中心部分内。在一些实施方案中，第一基本上透明的聚合物层或第二基本上透明的聚合物层的基本上透明的聚合物包括环氧基聚合物。在一些实施方案中，环氧基聚合物是su-8。在一些实施方案中，试剂盒还包含使用试剂盒检测结肠癌、直肠癌、结直肠癌、结肠腺瘤、直肠腺瘤或结直肠腺瘤的说明书。
在另一方面，本文提供了试剂盒和制品，其包含(a)多种探针，所述多种探针包括含有序列ttttttttttatggagctgatggcg(seqidno:75)的第一探针、含有序列ttttttttttaaggagctgttggtg(seqidno:79)的第二探针、含有序列ttttttttttggagctagtggcgta(seqidno:82)的第三探针、含有序列ttttttttaaaggtgacgtaggcaa(seqidno:87)的第四探针、含有序列tttttttttatacagagaaatctcgat(seqidno:92)的第五探针、含有序列ttttttttattctagctacagaaaaatc(seqidno:100)的第六探针、含有序列tttttttttttaggagctgtggcag(seqidno:53)的第七探针、含有序列tttttttttgagctgtgatagtggc(seqidno:106)的第八探针、含有序列ttttttaataccactcagaaaagga(seqidno:111)的第九探针、含有序列tttttttttttattaccactcagagga(seqidno:116)的第十探针、含有序列tttttttttttttagaaataaaagattg(seqidno:122)的第十一探针、含有序列tttttttttatttgggtgtctaag(seqidno:125)的第十二探针、含有序列ttttttttttaccaagtgagaagta(seqidno:132)的第十三探针、含有序列ttttttttactgctgaaaagagagagt(seqidno:57)的第十四探针和含有序列tttttttttttgaggcagaaaaaaacta(seqidno:141)的第十五探针；(b)多个引物对，所述多个引物对分别包含含有序列gtactggtggagtatttgatagtg(seqidno:1)和atcgtcaaggcactcttgcctac(seqidno:2)的第一引物对、含有序列ggacccactccatcgagattt(seqidno:8)和cagatatatttcttcatgaagacctcacagtaa(seqidno:9)的第二引物对、含有序列ggaatccattctggtgccact(seqidno:13)和agaaaatccctgttcccactcata(seqidno:14)的第三引物对、含有序列ggtgccactaccacagctcct(seqidno:18)和tctcaaaactgcattctgactttca(seqidno:19)的第四引物对、含有序列taaaaataaagcacctactgctgaaa(seqidno:23)和agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)的第五引物对、含有序列taggatgtaatcagacgacacagga(seqidno:27)和cagctgacctagttccaatctttta(seqidno:28)的第六引物对、含有序列tctccctccaaaagtggtgct(seqidno:31)和tggcaatcgaacgactctcaa(seqidno:32)的第七引物对、含有序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)的第八引物对、含有序列caggaaaatgacaatgggaatg(seqidno:39)和atctaataggtccttttcagaatcaatag(seqidno:40)的第九引物对；和多种阻断核酸，所述多种阻断核酸包含以下阻断核酸：第一阻断核酸，其包含序列tacgccaccagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:3)；第二阻断核酸，其包含序列gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:10)；第三阻断核酸，其包含序列tgccactaccacag(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:150)；第四阻断核酸，其包含序列tccttctctgagtgg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:176)；第五阻断核酸，其包含序列agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:161)；第六阻断核酸，其包含序列cttctcgcttggtt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:163)；第七阻断核酸，其包含序列cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:157)；第八阻断核酸，其包含序列ccactctctctcttttcagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:25)以及第九阻断核酸，其包含序列tcagaatcaatagttttttctg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:171)，其中斜体核酸表示锁核酸。
在另一方面，本文提供了试剂盒或制品，其包含(a)多种探针，所述多种探针包括含有序列ttttttttttatggagctgatggcg(seqidno:75)的第一探针、含有序列tttttttttatggagctgtaggtgg(seqidno:81)的第二探针、含有序列tttttttttttatggagctagtgg(seqidno:49)的第三探针、含有序列tttttttttatggagctggtgacgt(seqidno:50)的第四探针、含有序列tttttttttatacagagaaatctcgat(seqidno:92)的第五探针、含有序列tttttttatgtctagctacagaaaaat(seqidno:52)的第六探针、含有序列tttttttttttaggagctgtggcagtg(seqidno:101)的第七探针、含有序列tttttttttttttggagctgtgata(seqidno:54)的第八探针、含有序列ttttttaataccactcagaaaagga(seqidno:111)的第九探针、含有序列tttttttttattaccaatcagaggagg(seqidno:119)的第十探针、含有序列tttttttttttttagaaataaaagattg(seqidno:122)的第十一探针、含有序列tttttttttttttgggtgtctaag(seqidno:59)的第十二探针、含有序列ttttttttttaccaagtgagaagta(seqidno:132)的第十二探针、含有序列tttttttttacctactgctgaaaag(seqidno:135)的第十四探针、含有序列tttttttttttgaggcagaaaaaaacta(seqidno:141)的第十五探针；(b)多个引物对，所述多个引物对分别包含含有序列gtactggtggagtatttgatagtg(seqidno:1)和atcgtcaaggcactcttgcctac(seqidno:2)的第一引物对、含有序列ggacccactccatcgagattt(seqidno:8)和cagatatatttcttcatgaagacctcacagtaa(seqidno:9)的第二引物对、含有序列ggaatccattctggtgccact(seqidno:13)和agaaaatccctgttcccactcata(seqidno:14)的第三引物对、含有序列ggtgccactaccacagctcct(seqidno:18)和tctcaaaactgcattctgactttca(seqidno:19)的第四引物对、含有序列taaaaataaagcacctactgctgaaa(seqidno:23)和agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)的第五引物对、含有序列taggatgtaatcagacgacacagga(seqidno:27)和cagctgacctagttccaatctttta(seqidno:28)的第六引物对、分别含有序列tctccctccaaaagtggtgct(seqidno:31)和tggcaatcgaacgactctcaa(seqidno:32)的第七引物对、含有序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)的第八引物对、含有序列caggaaaatgacaatgggaatg(seqidno:39)和atctaataggtccttttcagaatcaatag(seqidno:40)的第九引物对；以及(c)多种阻断核酸，所述多种阻断核酸包含以下阻断核酸：第一阻断核酸，其包含序列ttggagctggtggcgta(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:142)；第二阻断核酸，其包含序列gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:148)；第三阻断核酸，其包含序列gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:15)；第四阻断核酸，其包含序列tccttctctgagtgg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:174)；第五阻断核酸，其包含序列agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:161)；第六阻断核酸，其包含序列cttctcgcttggtt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:163)；第七阻断核酸，其包含序列cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:29)；第八阻断核酸，其包含序列ccactctctctcttttcagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:168)以及第九阻断核酸，其包含序列caatagttttttctgcc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:41)，其中斜体核酸表示锁核酸。
在另一方面，本文提供了试剂盒或制品，其包含(a)多种探针，所述多种探针包括含有序列ttttttttttttaaggagctgatgg(seqidno:47)的第一探针、含有序列ttttttttttttaaggagctgttgg(seqidno:48)的第二探针、含有序列ttttttttttttaaggagctagtgg(seqidno:86)的第三探针、含有序列tttttttttaaggagctggtgacgt(seqidno:91)的第四探针、含有序列tttttttaattactagctacagagaaa(seqidno:95)的第五探针、含有序列tttttttatttctagctacagaaaaat(seqidno:99)的第六探针、含有序列ttttttttttaaggagctgtggcag(seqidno:104)的第七探针、含有序列ttttttttttttttggagctgtgat(seqidno:109)的第八探针、含有序列ttttttttattaccactcagaaaag(seqidno:113)的第九探针、含有序列tttttttttattaccaatcagaggagg(seqidno:119)的第十探针、含有序列tttttttttttttagaaataaaagattg(seqidno:122)的第十一探针、含有序列tttttttttatttgggtgtctaag(seqidno:125)的第十二探针、含有序列tttttttttacaaaccaagtgagaa(seqidno:60)的第十三探针、含有序列ttttttttactgctgaaaagagagagt(seqidno:57)的第十四探针、含有序列ttttttttttagaggcagaaaaaaact(seqidno:61)的第十五探针；(b)多个引物对，所述多个引物对分别包含含有序列gtactggtggagtatttgatagtg(seqidno:1)和atcgtcaaggcactcttgcctac(seqidno:2)的第一引物对、含有序列ggacccactccatcgagattt(seqidno:8)和cagatatatttcttcatgaagacctcacagtaa(seqidno:9)的第二引物对、含有序列ggaatccattctggtgccact(seqidno:13)和agaaaatccctgttcccactcata(seqidno:14)的第三引物对、含有序列ggtgccactaccacagctcct(seqidno:18)和tctcaaaactgcattctgactttca(seqidno:19)的第四引物对、含有序列taaaaataaagcacctactgctgaaa(seqidno:23)和agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)的第五引物对、含有序列taggatgtaatcagacgacacagga(seqidno:27)和cagctgacctagttccaatctttta(seqidno:28)的第六引物对、含有序列tctccctccaaaagtggtgct(seqidno:31)和tggcaatcgaacgactctcaa(seqidno:32)的第七引物对、含有序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)的第八引物对、含有序列caggaaaatgacaatgggaatg(seqidno:39)和atctaataggtccttttcagaatcaatag(seqidno:40)的第九引物对；以及(c)多种阻断核酸，所述多种阻断核酸包含以下阻断核酸：第一阻断核酸，其包含序列tacgccaccagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:3)；第二阻断核酸序列，其包含序列gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:10)；第三阻断核酸序列，其包含序列gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:15)；第四阻断核酸序列，其包含序列gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:20)；第五阻断核酸序列，其包含序列gtgctcagacacc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:33)；第六阻断核酸序列，其包含序列cttctcgcttggtt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:37)；第七阻断核酸序列，其包含序列cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:29)；第八阻断核酸序列，其包含序列ccactctctctcttttcagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:25)以及第九阻断核酸序列，其包含序列caatagttttttctgcc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:41)，其中斜体核酸表示锁核酸。在任何上述实施方案中的一些实施方案中，所述多种探针中的每一种探针与具有对应于与其偶联的探针的独特标识符的微载体偶联。
在另一方面，本文提供了试剂盒或制品，其包含(1)用于扩增kras突变(例如，编码或导致g12d、g12v、g12s或g13d突变的kras蛋白)的基因座的引物对；(2)阻断核酸，其包含序列tacgccaccagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:3)；ttggagctggtggcgta(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:142)；gctggtggcgtaggca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:143)；gctggtggcgtaggc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:144)或ttggagctggtggcgt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:145)，其中斜体核酸表示锁核酸；(3a)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：ggagctgatgg(seqidno:4)、agctgatggcgta(seqidno:178)、tggagctgatggcg(seqidno:179)、tggagctgatgg(seqidno:180)和gctgatggcgta(seqidno:181)；(3b)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：ggagctgttgg(seqidno:5)、tggagctgttggtggc(seqidno:182)、ggagctgttggtg(seqidno:183)、tggagctgttggt(seqidno:184)和tggagctgtaggtgg(seqidno:185)；(3c)包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：ttggagctagtggcgta(seqidno:186)、gctagtggcgtaggc(seqidno:187)、agctagtggcgt(seqidno:188)、gttggagctagtgg(seqidno:189)和ggagctagtgg(seqidno:190)；(3d)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：ggtgacgtaggcaa(seqidno:191)、tgacgtaggcaagag(seqidno:192)、gctggtgacgtagg(seqidno:193)，agctggtgacgtag(seqidno:194)和ggagctggtgacgt(seqidno:195)；并且其中四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体；(4)用于扩增braf突变(例如，编码或导致v600e突变的braf蛋白)的基因座的引物对；(5)包含以下序列的阻断核酸：gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:10)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:146)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:147)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:148)或gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:149)，其中斜体核酸表示锁核酸；(6a)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：tacagagaaatctcgat(seqidno:196)；tacagagaaatctc(seqidno:197)；ctagctacagagaaat(seqidno:198)；ctagctacagagaaa(seqidno:199)和tctagctacagag(seqidno:200)；(6b)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：gtctagctacagaaaaatc(seqidno:201)；gtctagctacagaaaaat(seqidno:12)；tagctacagaaaaa(seqidno:202)；tctagctacagaaaaat(seqidno:203)和tctagctacagaaaaatc(seqidno:204)；(7)用于扩增ctnnb1突变(例如，编码或导致t41a、t41i、s45f和s45p突变的ctnnb1蛋白)的基因座的引物对；(8a)包含以下序列的第一阻断核酸：gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:15)；tgccactaccacag(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:150)；cactaccacagctcc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:151)；gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:152)或gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:153)，其中斜体核酸表示锁核酸；(8b)包含以下序列的第二阻断核酸：gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:20)；tccttctctgagtgg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:174)；gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:175)；tccttctctgagtgg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:176)或gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:177)，其中斜体核酸表示锁核酸；(9a)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：aaatagcagaaataaaag(seqidno:225)；gaaataaaagattggaa(seqidno:226)；agaaataaaagattg(seqidno:227)；gaaataaatgaatgg(seqidno:228)和cagaaataaaagatt(seqidno:229)；(9b)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：tttgggtgtctaag(seqidno:230)；gggtgtctaagcaccact(seqidno:231)；ctaagcaccactttt(seqidno:232)；ttttgggtgtctaa(seqidno:233)和ggtgtctaagcacca(seqidno:234)；(9c)包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：aagtgagaagtacctaa(seqidno:235)；caaaccaagtgagaa(seqidno:38)；tcaaaccaagtgag(seqidno:236)；accaagtgagaagta(seqidno:237)和agctcaaaccaagtgag(seqidno:238)；(9d)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：gcacctactgctgaa(seqidno:239)；acctactgctgaaaag(seqidno:240)；tgctgaaaagagagagt(seqidno:241)；actgctgaaaagagagagt(seqidno:26)和cctactgctgaaaagaga(seqidno:242)；(9e)包含选自由以下组成的组的序列的第五探针：gcagaaaaaaactattg(seqidno:243)；agaggcagaaaaaaact(seqidno:42)；cagaaaaaaactattgatt(seqidno:244)；agaaagaggcagaaaaaaact(seqidno:245)和gaggcagaaaaaaacta(seqidno:246)；并且其中五种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体；(10)用于扩增apc突变(例如，编码或导致下文所述的突变的apc蛋白)的基因座的引物对；(11a)包含以下序列的第一阻断核酸：ccactctctctcttttcagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:25)；taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:166)；taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:167)；ccactctctctcttttcagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:168)或taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:169)，其中斜体核酸表示锁核酸；(11b)包含以下序列的第二阻断核酸：cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:29)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:154)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:155)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:156)或cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:157)，其中斜体核酸表示锁核酸；(11c)包含以下序列的第三阻断核酸：gtgctcagacacc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:33)；gtgctcagacacc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:158)；agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:159)；agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:160)或agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:161)，其中斜体核酸表示锁核酸；(11d)包含以下序列的第四阻断核酸：cttctcgcttggtt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:37)；gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:162)；cttctcgcttggtt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:163)；gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:164)或gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:165)，其中斜体核酸表示锁核酸；(11e)包含以下序列的第五阻断核酸：caatagttttttctgcc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:41)；gaatcaatagttttttctgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:170)；tcagaatcaatagttttttctg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:171)；gaatcaatagattttactgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:172)或aatcaatagttttttctgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:173)，其中斜体核酸表示锁核酸；(12a)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：aaatagcagaaataaaag(seqidno:225)、gaaataaaagattggaa(seqidno:226)、agaaataaaagattg(seqidno:227)、gaaataaatgaatgg(seqidno:228)和cagaaataaaagatt(seqidno:229)；(12b)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：tttgggtgtctaag(seqidno:230)、gggtgtctaagcaccact(seqidno:231)、ctaagcaccactttt(seqidno:232)、ttttgggtgtctaa(seqidno:233)和ggtgtctaagcacca(seqidno:234)；(12c)包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：aagtgagaagtacctaa(seqidno:235)、caaaccaagtgagaa(seqidno:38)、tcaaaccaagtgag(seqidno:236)、accaagtgagaagta(seqidno:237)和agctcaaaccaagtgag(seqidno:238)；(12d)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：gcacctactgctgaa(seqidno:239)、acctactgctgaaaag(seqidno:240)、tgctgaaaagagagagt(seqidno:241)、actgctgaaaagagagagt(seqidno:26)和cctactgctgaaaagaga(seqidno:242)；和(12e)包含选自由以下组成的组的序列的第五探针：gcagaaaaaaactattg(seqidno:243)、agaggcagaaaaaaact(seqidno:42)、cagaaaaaaactattgatt(seqidno:244)、agaaagaggcagaaaaaaact(seqidno:245)和gaggcagaaaaaaacta(seqidno:246)。在一些实施方案中，每一种探针与具有不同标识符的微载体偶联。在一些实施方案中，用于扩增kras突变的基因座的引物对包含序列gtactggtggagtatttgatagtg(seqidno:1)和atcgtcaaggcactcttgcctac(seqidno:2)。在一些实施方案中，用于扩增braf突变的基因座的引物对包含序列ggacccactccatcgagattt(seqidno:8)和cagatatatttcttcatgaagacctcacagtaa(seqidno:9)。在一些实施方案中，用于扩增ctnnb1突变的基因座的引物对包含：包含序列ggaatccattctggtgccact(seqidno:13)和agaaaatccctgttcccactcata(seqidno:14)的第一引物对以及包含序列ggtgccactaccacagctcct(seqidno:18)和tctcaaaactgcattctgactttca(seqidno:19)的第二引物对。在一些实施方案中，用于扩增apc突变的基因座的引物对包含：包含序列taaaaataaagcacctactgctgaaa(seqidno:23)和agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)的第一引物对；包含序列taggatgtaatcagacgacacagga(seqidno:27)和cagctgacctagttccaatctttta(seqidno:28)的第二引物对；包含序列tctccctccaaaagtggtgct(seqidno:31)和tggcaatcgaacgactctcaa(seqidno:32)的第三引物对；包含序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)的第四引物对，其中斜体核酸表示锁核酸；以及包含序列caggaaaatgacaatgggaatg(seqidno:39)和atctaataggtccttttcagaatcaatag(seqidno:40)的第五引物对。
应理解，可将本文中描述的各种实施方案的一个、一些或所有性质组合以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些和其它方面对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图简述
图1a和1b显示示例性微载体的两个视图。
图1c和1d显示使用示例性微载体进行dna检测的示例性测定。
图2a和2b显示示例性微载体的两个视图。
图3显示示例性模拟编码方案，其包括用于生成独特的模拟代码的多个形状变化点。
图4a显示微载体的三个实例，每个实例具有独特的模拟代码。
图4b显示根据一些实施方案的具有唯一模拟代码的微载体的实例。
图5a和5b显示示例性微载体的两个视图。
图6a和6b显示示例性微载体的两个视图。
图6c显示示例性模拟代码的尺寸。尺寸基于μm单位。
图7显示示例性微载体。
图8a显示示例性微载体，其包括不对称的起始位置作为定向指示器。
图8b显示示例性模拟编码方案，其包括用于生成独特的模拟代码的多个形状变化点。
图9a-9c显示示例性微载体的两个视图(图9a和图9b)，以及任选的特征的描绘(图9c)。
图10显示用于产生示例性微载体的方法。
图11a和11b显示用于产生示例性微载体的方法。
图12a-12e显示用于产生示例性微载体的方法。
图13a-13c显示用于产生示例性微载体的方法。
图14显示说明用于根据一些实施方案检测一个或多个dna突变的存在的示例性方法的流程图。
图15和图16举例说明了根据一些实施方案的用于相对于对应于目标dna突变的野生型(图15)基因座优先扩增和检测突变型(图16)基因座的示例性方案。水平实线表示扩增的dna序列，水平虚线表示引物/探针/阻断核酸(na)序列，垂直线表示watson-crick碱基配对。
图17显示了举例说明根据一些实施方案的示例性方案的流程图，所述方案用于使扩增的dna杂交，检测扩增的dna与偶联至微载体的一种或多种探针的杂交的存在或不存在，以及检测微载体的模拟标识符。
图18a和图18b显示了根据一些实施方案检测kras、braf、ctnnb1和apc基因中dna突变的存在的结果。数字报告了用分离的dna(具有突变或野生型序列，如列中所示的)和探针(如行中所示的)的每个成对组合观察到的荧光信号(以任意单位(au)表示)。
具体实施方式
在一个方面，本文提供了用于检测kras、braf、ctnnb1和apc基因中的dna突变的存在的方法。在一些实施方案中，所述方法包括从样品分离dna；使用对kras、braf、ctnnb1和apc基因中的每一个中的一个或多个dna突变的基因座具有特异性的引物对通过聚合酶链式反应(pcr)扩增分离的dna；使扩增的dna与至少四种探针杂交，所述至少四种探针包括一种或多种对kras、braf、ctnnb1和apc基因中的每一个中的dna突变具有特异性的探针，其中所述至少四种探针中的每一种偶联至微载体，并且其中每一个微载体包含对应于与其偶联的探针的标识符；检测扩增的dna与所述至少四种探针的杂交的存在或不存在，其中扩增的dna与探针之一之间的杂交表明对应于所述探针的dna突变存在；以及检测微载体的标识符，例如以使每一个检测到的标识符与其相应的探针相关联(以及探针与扩增的dna之间的杂交或其不存在)。
在另一方面，本文提供了包含至少四种微载体的试剂盒或制品，其中所述至少四种微载体中的每一种包含：偶联至微载体的探针，其中所述探针对kras、braf、ctnnb1和apc基因中的dna突变具有特异性；和对应于与其偶联的探针的标识符；其中所述试剂盒包含至少一种包含对kras基因中的dna突变具有特异性的探针的微载体，至少一种包含对braf基因中的dna突变具有特异的探针的微载体，至少一种包含对ctnnb1基因中的dna突变具有特异的探针的微载体和至少一种包含对apc基因中的dna突变具有特异的探针的微载体。
在另一方面，本文中提供了试剂盒或制品，其包含(a)多种探针，所述多种探针包括含有序列ttttttttttatggagctgatggcg(seqidno:75)的第一探针、含有序列ttttttttttaaggagctgttggtg(seqidno:79)的第二探针、含有序列ttttttttttggagctagtggcgta(seqidno:82)的第三探针、含有序列ttttttttaaaggtgacgtaggcaa(seqidno:87)的第四探针、含有序列tttttttttatacagagaaatctcgat(seqidno:92)的第五探针、含有序列ttttttttattctagctacagaaaaatc(seqidno:100)的第六探针、含有序列tttttttttttaggagctgtggcag(seqidno:53)的第七探针、含有序列tttttttttgagctgtgatagtggc(seqidno:106)的第八探针、含有序列ttttttaataccactcagaaaagga(seqidno:111)的第九探针、含有序列tttttttttttattaccactcagagga(seqidno:116)的第十探针、含有序列tttttttttttttagaaataaaagattg(seqidno:122)的第十一探针、含有序列tttttttttatttgggtgtctaag(seqidno:125)的第十二探针、含有序列ttttttttttaccaagtgagaagta(seqidno:132)的第十三探针、含有序列ttttttttactgctgaaaagagagagt(seqidno:57)的第十四探针、含有序列tttttttttttgaggcagaaaaaaacta(seqidno:141)的第十五探针；(b)多个引物对，所述多个引物对分别包含含有序列gtactggtggagtatttgatagtg(seqidno:1)和atcgtcaaggcactcttgcctac(seqidno:2)的第一引物对、含有序列ggacccactccatcgagattt(seqidno:8)和cagatatatttcttcatgaagacctcacagtaa(seqidno:9)的第二引物对、含有序列ggaatccattctggtgccact(seqidno:13)和agaaaatccctgttcccactcata(seqidno:14)的第三引物对、含有序列ggtgccactaccacagctcct(seqidno:18)和tctcaaaactgcattctgactttca(seqidno:19)的第四引物对、含有序列taaaaataaagcacctactgctgaaa(seqidno:23)和agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)的第五引物对、含有序列taggatgtaatcagacgacacagga(seqidno:27)和cagctgacctagttccaatctttta(seqidno:28)的第六引物对、含有序列tctccctccaaaagtggtgct(seqidno:31)和tggcaatcgaacgactctcaa(seqidno:32)的第七引物对、含有序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)的第八引物对、含有序列caggaaaatgacaatgggaatg(seqidno:39)和atctaataggtccttttcagaatcaatag(seqidno:40)的第九引物对；以及多种阻断核酸，所述多种阻断核酸包含以下阻断核酸：第一阻断核酸，其包含序列tacgccaccagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:3)；第二阻断核酸，其包含序列gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:10)；第三阻断核酸，其包含序列tgccactaccacaginvdtinvdtinvdt(seqidno:150)；第四阻断核酸，其包含序列tccttctctgagtgginvdtinvdtinvdt(seqidno:176)；第五阻断核酸，其包含序列agtggtgctcagacacccainvdtinvdtinvdt(seqidno:161)；第六阻断核酸，其包含序列cttctcgcttggttinvdtinvdtinvdt(seqidno:163)；第七阻断核酸，其包含序列cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:157)；第八阻断核酸，其包含序列ccactctctctcttttcagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:25)以及第九阻断核酸，其包含序列tcagaatcaatagttttttctginvdtinvdtinvdt(seqidno:171)，其中斜体核酸表示锁核酸。在另一方面，本文提供了试剂盒或制品，其包含(a)多种探针，所述多种探针包括含有序列ttttttttttatggagctgatggcg(seqidno:75)的第一探针、含有序列tttttttttatggagctgtaggtgg(seqidno:81)的第二探针、含有序列tttttttttttatggagctagtgg(seqidno:49)的第三探针、含有序列tttttttttatggagctggtgacgt(seqidno:50)的第四探针、含有序列tttttttttatacagagaaatctcgat(seqidno:92)的第五探针、含有序列tttttttatgtctagctacagaaaaat(seqidno:52)的第六探针、含有序列tttttttttttaggagctgtggcagtg(seqidno:101)的第七探针、含有序列tttttttttttttggagctgtgata(seqidno:54)的第八探针、含有序列ttttttaataccactcagaaaagga(seqidno:111)的第九探针、含有序列tttttttttattaccaatcagaggagg(seqidno:119)的第十探针、含有序列tttttttttttttagaaataaaagattg(seqidno:122)的第十一探针、含有序列tttttttttttttgggtgtctaag(seqidno:59)的第十二探针、含有序列ttttttttttaccaagtgagaagta(seqidno:132)的第十三探针、含有序列tttttttttacctactgctgaaaag(seqidno:135)的第十四探针、含有序列tttttttttttgaggcagaaaaaaacta(seqidno:141)的第十五探针；(b)多个引物对，所述多个引物对分别包含含有序列gtactggtggagtatttgatagtg(seqidno:1)和atcgtcaaggcactcttgcctac(seqidno:2)的第一引物对、含有序列ggacccactccatcgagattt(seqidno:8)和cagatatatttcttcatgaagacctcacagtaa(seqidno:9)的第二引物对、含有序列ggaatccattctggtgccact(seqidno:13)和agaaaatccctgttcccactcata(seqidno:14)的第三引物对、含有序列ggtgccactaccacagctcct(seqidno:18)和tctcaaaactgcattctgactttca(seqidno:19)的第四引物对、含有序列taaaaataaagcacctactgctgaaa(seqidno:23)和agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)的第五引物对、含有序列taggatgtaatcagacgacacagga(seqidno:27)和cagctgacctagttccaatctttta(seqidno:28)的第六引物对、含有序列tctccctccaaaagtggtgct(seqidno:31)和tggcaatcgaacgactctcaa(seqidno:32)的第七引物对、含有序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)的第八引物对、含有序列caggaaaatgacaatgggaatg(seqidno:39)和atctaataggtccttttcagaatcaatag(seqidno:40)的第九引物对；以及(c)以及多种阻断核酸，所述多种阻断核酸包含以下阻断核酸：第一阻断核酸，其包含序列ttggagctggtggcgtainvdtinvdtinvdt(seqidno:142)；第二阻断核酸，其包含序列gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:148)；第三阻断核酸，其包含序列gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:15)；第四阻断核酸，其包含序列tccttctctgagtgginvdtinvdtinvdt(seqidno:174)；第五阻断核酸，其包含序列agtggtgctcagacacccainvdtinvdtinvdt(seqidno:161)；第六阻断核酸，其包含序列cttctcgcttggttinvdtinvdtinvdt(seqidno:163)；第七阻断核酸，其包含序列cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:29)；第八阻断核酸，其包含序列ccactctctctcttttcagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:168)以及第九阻断核酸，其包含序列caatagttttttctgccinvdtinvdtinvdt(seqidno:41)，其中斜体核酸表示锁核酸。在另一方面，本文提供了试剂盒或制品，其包含(a)多种探针，所述多种探针包括含有序列ttttttttttttaaggagctgatgg(seqidno:47)的第一探针、含有序列ttttttttttttaaggagctgttgg(seqidno:48)的第二探针、含有序列ttttttttttttaaggagctagtgg(seqidno:86)的第三探针、含有序列tttttttttaaggagctggtgacgt(seqidno:91)的第四探针、含有序列tttttttaattactagctacagagaaa(seqidno:95)的第五探针、含有序列tttttttatttctagctacagaaaaat(seqidno:99)的第六探针、含有序列ttttttttttaaggagctgtggcag(seqidno:104)的第七探针、含有序列ttttttttttttttggagctgtgat(seqidno:109)的第八探针、含有序列ttttttttattaccactcagaaaag(seqidno:113)的第九探针、含有序列tttttttttattaccaatcagaggagg(seqidno:119)的第十探针、含有序列tttttttttttttagaaataaaagattg(seqidno:122)的第十一探针、含有序列tttttttttatttgggtgtctaag(seqidno:125)的第十二探针、含有序列tttttttttacaaaccaagtgagaa(seqidno:60)的第十三探针、含有序列ttttttttactgctgaaaagagagagt(seqidno:57)的第十四探针、含有序列ttttttttttagaggcagaaaaaaact(seqidno:61)的第十五探针；(b)多个引物对，所述多个引物对分别包含含有序列gtactggtggagtatttgatagtg(seqidno:1)和atcgtcaaggcactcttgcctac(seqidno:2)的第一引物对、含有序列ggacccactccatcgagattt(seqidno:8)和cagatatatttcttcatgaagacctcacagtaa(seqidno:9)的第二引物对、含有序列ggaatccattctggtgccact(seqidno:13)和agaaaatccctgttcccactcata(seqidno:14)的第三引物对、含有序列ggtgccactaccacagctcct(seqidno:18)和tctcaaaactgcattctgactttca(seqidno:19)的第四引物对、含有序列taaaaataaagcacctactgctgaaa(seqidno:23)和agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)的第五引物对、含有序列taggatgtaatcagacgacacagga(seqidno:27)和cagctgacctagttccaatctttta(seqidno:28)的第六引物对、含有序列tctccctccaaaagtggtgct(seqidno:31)和tggcaatcgaacgactctcaa(seqidno:32)的第七引物对、含有序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)的第八引物对以及含有序列caggaaaatgacaatgggaatg(seqidno:39)和atctaataggtccttttcagaatcaatag(seqidno:40)的第九引物对；以及(c)多种阻断核酸，所述多种阻断核酸包含以下阻断核酸：第一阻断核酸，其包含序列tacgccaccagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:3)；第二阻断核酸，其包含序列gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:10)；第三阻断核酸，其包含序列gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:15)；第四阻断核酸，其包含序列gctccttctctgagtinvdtinvdtinvdt(seqidno:20)；第五阻断核酸，其包含序列gtgctcagacaccinvdtinvdtinvdt(seqidno:33)；第六阻断核酸，其包含序列cttctcgcttggttinvdtinvdtinvdt(seqidno:37)；第七阻断核酸，其包含序列cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:29)；第八阻断核酸，其包含序列ccactctctctcttttcagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:25)以及第九阻断核酸，其包含序列caatagttttttctgccinvdtinvdtinvdt(seqidno:41)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，所述多种探针中的每一种探针偶联至与具有对应于与其偶联的探针的独特标识符的微载体。
i.一般技术
除非另有说明，否则本文所述技术的实践将采用如在本领域技术人员的能力内的聚合物技术、微细加工、微机电系统(mems)制造、光刻、微流体、有机化学、生物化学、寡核苷酸合成和修饰、生物共轭化学、核酸杂交、分子生物学、微生物学、遗传学、重组dna以及相关领域中的常规技术。所述技术描述于本文引用的参考文献中，并在文献中进行了充分解释。
关于分子生物学和重组dna技术，参见，例如，(maniatis,t.等(1982),molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharbor；ausubel,f.m.(1987),currentprotocolsinmolecularbiology,greenepub.associatesandwiley-interscience；ausubel,f.m.(1989),shortprotocolsinmolecularbiology:acompendiumofmethodsfromcurrentprotocolsinmolecularbiology,greenepub.associatesandwiley-interscience；sambrook,j.等(1989),molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharbor；innis,m.a.(1990),pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications,academicpress；ausubel,f.m.(1992),shortprotocolsinmolecularbiology:acompendiumofmethodsfromcurrentprotocolsinmolecularbiology,greenepub.associates；ausubel,f.m.(1995),shortprotocolsinmolecularbiology:acompendiumofmethodsfromcurrentprotocolsinmolecularbiology,greenepub.associates；innis,m.a.等(1995),pcrstrategies,academicpress；ausubel,f.m.(1999),shortprotocolsinmolecularbiology:acompendiumofmethodsfromcurrentprotocolsinmolecularbiology,wiley以及年度更新(annualupdates)。
关于dna合成技术和核酸化学，参见例如，gait,m.j.(1990),oligonucleotidesynthesis:apracticalapproach,irlpress；eckstein,f.(1991),oligonucleotidesandanalogues:apracticalapproach,irlpress；adams,r.l.等(1992),thebiochemistryofthenucleicacids,chapman&hall；shabarova,z.等(1994),advancedorganicchemistryofnucleicacids,weinheim；blackburn,g.m.等(1996),nucleicacidsinchemistryandbiology,oxforduniversitypress；hermanson,g.t.(1996),bioconjugatetechniques,academicpress)。
关于微细加工，参见例如(campbell,s.a.(1996),thescienceandengineeringofmicroelectronicfabrication,oxforduniversitypress；zaut,p.v.(1996),microarrayfabrication:apracticalguidetosemiconductorprocessing,semiconductorservices；madou,m.j.(1997),fundamentalsofmicrofabrication,crcpress；rai-choudhury,p.(1997).handbookofmicrolithography,micromachining,µfabrication:microlithography)。
ii.定义
在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于特定的组合物或生物系统，它们当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是限制性的。
如本文中所用，术语“微载体”可以指其上可以偶联捕获剂或探针的物理基质。本公开的微载体可采用任何合适的几何形式或形状。在一些实施方案中，微载体可以是盘形的。通常，微载体的形式或形状将包括至少一个约10-4至10-7m级的维度(因此前缀为“微”)。
如本文中所用，术语“聚合物”可以指包含重复单体的任何大分子结构。聚合物可以是天然的(例如，天然存在的)或合成的(例如，人造的，诸如由一个或多个非天然单体组成的聚合物和/或以不存在于自然界中的构型或组合聚合的聚合物)。
如本文中所使用，术语“基本上透明的”和“基本上不透明的”可以指光(例如，具有特定波长的，诸如红外光、可见光、uv等)通过物质诸如聚合物层的能力。基本上透明的聚合物可以指对于光是透明的、半透明的和/或能透过的聚合物，而基本上不透明的聚合物可以指反射和/或吸收光的聚合物。应当理解，材料是基本上透明的还是基本上不透明可取决于照射材料的光的波长和/或强度，以及检测穿过材料的光(或其减少或不存在)的装置。在一些实施方案中，与周围材料或影像野(imagefield)相比，基本上不透明的材料导致透射光的可感知的减少，例如，如通过光学显微镜(例如，明视野显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、微分干涉差(dic)显微镜、nomarski干涉差(nic)显微镜、nomarski，霍夫曼调制对比(hmc)显微镜或荧光显微镜)成像的。在一些实施方案中，基本上透明的材料允许可感知量的透射光穿过材料，例如，通过光学显微镜(例如，明视野显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、微分干涉差(dic)显微镜、nomarski干涉差(nic)显微镜、nomarski，霍夫曼调制对比(hmc)显微镜或荧光显微镜)成像的。
如本文中所用，术语“模拟代码”可以指其中编码的信息以非量化和/或非离散方式表示的任何代码，例如，与数字代码相反。例如，对于有限的一组值(例如，0/1类型值)，在离散位置处对数字代码进行采样，然而可以在更大的位置范围(或作为连续的整体)对模拟代码进行采样和/或模拟代码可以包含更宽的一组值(例如，形状)。在一些实施方案中，可以使用一种或多种模拟形状识别技术来读取或解码模拟代码。
如本文中所用，“样品”是指含有待检测的材料(诸如分子)的组合物。在一个实施方案中，样品是“生物样品”(即，从活的来源(例如人、动物、植物、细菌、真菌、原生生物、病毒)获得的任何材料)。生物样品可呈任何形式，包括固体材料(例如粪便、组织、细胞沉淀和活组织检查)和生物液体(例如尿液、血液、粪便、唾液、淋巴液、泪液、汗液、前列腺液、精液(seminalfluid)、精液(semen)、胆汁、粘液、羊水和漱口液(含口腔细胞))。固体材料通常与流体混合。样品也可以指环境样品诸如水、空气、土壤或任何其它环境来源。
如本说明书和所附权利要求中所用，除非另有说明，否则单数形式“一个/种(a)”，“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数所指物。因此，例如，对“一个/种(a)分子”的引用任选地包括两个或更多个此类分子的组合等。
如本文中所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文中对“约”值或参数的引用包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。
应理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含”方面和实施方案、“由方面和实施方案组成”和“基本上由方面和实施方案组成”。
iii.检测dna突变的方法
本公开的某些方面涉及通过使用微载体(例如，本文所述的编码微载体，或国际公开第wo2016/198954号中描述的任何微载体)检测dna突变(例如，kras、braf、ctnnb1和/或apc基因中的一个或多个突变)的存在的方法。本公开的方法采用一种或多种编码微载体，其具有本文中(例如，在第iv部分、第v部分和第vi部分中)所述的一些或所有微载体特征和方面。有利地，与常规多重测定相比，这些编码微载体允许在具有大量潜在的独特微载体和减少的识别错误的改进的多重测定中检测dna突变。图14-16中提供描述用于检测dna突变的示例性方法的流程图。可在本领域已知的任何合适的测定容器(例如微孔板、培养皿或许多其它公知的测定容器)中进行本文中使用的检测方法。
在一些实施方案中，本公开的方法包括从样品中分离dna。本领域已知的标准分子技术允许从各种不同类型的样品中分离dna。适用于各种样品的dna分离试剂盒是商购可得的。例如，
在一些实施方案中，本公开的方法使用浓度为约0.5ng/μl至2.5ng/μl的来自样品的dna。在一些实施方案中，本公开的方法使用浓度为至少约0.5ng/μl的来自样品的dna。例如，可使用20μl的0.5ng/μldna原液(总共10ngdna)或2.5ng/μldna原液(总共50ngdna)(例如，用于pcr扩增)。
在一些实施方案中，本公开的方法用于检测、监测、筛选或监测例如从其收集样品的患者的结肠癌、直肠癌、结直肠癌、结肠腺瘤、直肠腺瘤或结直肠腺瘤的治疗响应。如本文中所用，结肠癌、直肠癌和结直肠癌可以指各种类型的癌症，包括但不限于腺癌、淋巴瘤、间质瘤、平滑肌肉瘤、类癌瘤和黑色素瘤。随着dna突变积累，结直肠癌被认为从良性肿瘤如腺瘤(例如，息肉)发展到恶性肿瘤诸如癌症和转移性疾病，但即使是一些早期腺瘤也具有dna突变，诸如本文所述的kras激活突变。参见fearon,e.f.和vogelstein,b.(1990)cell61:759-67。检测来自粪便样品的dna突变对结直肠癌的早期检测特别有意义。参见，例如，美国专利第7,833,757号；imperiale,t.f.等(2014)n.engl.j.med.370:1287-97；以及
本公开的方法可用于检测任何合适的溶液中的分析物(例如，dna突变)。在一些实施方案中，所述溶液包含生物样品。在一些实施方案中，所述溶液包含从生物样品分离的dna和任选的缓冲剂。用于dna分离的合适缓冲剂是本领域公知的。生物样品的实例包括但不限于粪便、血液、尿液、痰、胆汁、脑脊髓液、皮肤或脂肪组织的间质液、唾液、泪液、支气管-肺泡灌洗液、口咽分泌物、肠液、子宫颈阴道或子宫分泌物以及精液。在一些实施方案中，样品是粪便样品。在一个实施方案中，从单个样本获得多个样品(例如，代表样本的不同区域，诸如实施例2中所述的)并单独分析。在其它实施方案中，分析单个大的粪便样本(例如，分析整个粪便或粪便样品而不是对离散的较小样品进行取样)。在一些实施方案中，生物样品可来自人。在其它实施方案中，所述溶液包含不是生物样品的样品，诸如环境样品、在实验室中制备的样品(例如，含有已经制备、分离、纯化和/或合成的一种或多种分析物的样品)、固定的样品(例如，福尔马林固定的、石蜡包埋的或ffpe样品)，等等。
在一些实施方案中，本公开的方法包括通过聚合酶链式反应(pcr)扩增dna(例如，如上所述从样品中分离的dna)。pcr技术是本领域公知的。简言之，使用模板dna链(例如，从样品中分离并变性的)和一对分别与dna模板的有义链和反义链的3'末端互补的寡核苷酸引物，使用热稳定dna聚合酶来扩增目标dna序列的拷贝。将dna聚合酶与两种引物、所有四种脱氧核苷酸(dntp)、缓冲液、镁离子(例如，mgcl2)和钾离子(例如，kcl)以及任选的其它成分在反应中混合。然后使反应混合物经历多个温度变化的循环(例如，20-40个)，所述循环允许dna模板变性，引物对变性的单链模板的退火，以及通过dna聚合酶进行的引物延伸。已经表征了用于pcr的具有不同目标特性的各种dna聚合酶(例如，扩增长模板或重复性模板的能力、高保真度、热启动等)并且所述dna聚合酶可商购获得。
在一些实施方案中，本公开的方法包括从分离的dna中扩增(例如，通过pcr)一个或多个特定目标基因中的一个或多个dna突变的基因座。如本文中所述，dna突变的“基因座”包含突变本身和突变的一侧或两侧上的足够的邻近序列，用于突变的dna序列的pcr扩增和/或探针与突变的dna序列的杂交。如本领域已知的，足以用于pcr扩增的最小序列长度可受若干因素影响，包括但不限于聚合酶、引物的解链温度、引物形成引物二聚体的倾向、模板与引物的比率等。在一些实施方案中，dna突变的基因座包含至少约100个碱基对的相邻序列(即，包括dna突变的5'和3'的相邻序列)。在一些实施方案中，dna突变的基因座包含少于或等于约200个碱基对的相邻序列(即，包括dna突变的5'和3'的相邻序列)。如上所述，dna突变的基因座可以使用基因座作为dna模板，使用一对对基因座具有特异性的引物进行扩增。尽管本文将突变描述为dna突变，但应理解，类似的技术可用于检测rna突变，例如使用来自样品的mrna或cdna。
在一些实施方案中，可使用多个pcr反应，例如，以检测各种dna突变。在一些实施方案中，每个pcr反应可包括多个引物对，每个引物对目标dna突变具有特异性。例如，在一些实施方案中，如下文实施例1和2中所示，本公开的方法可包括两个pcr反应：具有用于检测以下突变的试剂的第一pcr反应：krasg12d、krasg12v、krasg12s、krasg13d、brafv600e1、brafv600e2、ctnnb1t41a、ctnnb1t41i、apce1309、apcq1367、apcr1450和apct1556；以及利用用于检测以下突变的试剂的第二次pcr反应：ctnnb1s45f、ctnnb1s45p和apcs1465。在一些实施方案中，每个pcr反应包括：10μlpcr反应混合物、10μl引物混合物和20μldna(例如，20μl0.5ng/μl的dna原液，总共10ngdna)。在一些实施方案中，使用相同的温度循环条件进行多重pcr反应。
突变
在一些实施方案中，本公开的方法包括扩增kras基因中一个或多个突变的基因座。如本文中关于kras、braf、ctnnb1和apc基因所使用的，扩增dna突变的基因座包括扩增突变基因座或相应的野生型基因座。应当理解，在大多数情况下，虽然在多重测定中筛选了四个或更多个突变，但任何单个样品通常将包括至多一个被筛选的突变。kras编码kras原癌基因(一种经常在人癌症中发生突变的小gtp酶，也称为kirstenrag肉瘤病毒致癌基因同源物)、pr310c-k-ras癌基因、c-ki-ras、c-kirsten-ras、k-ras2、k-rasp21、gtp酶kras、细胞c-ki-ras2原癌基因、细胞转化原癌基因、癌基因kras2、转化蛋白p21和v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤2病毒致癌基因同源物。在一些实施方案中，kras基因是人kras基因。在一些实施方案中，人kras基因是指ncbientrezgeneid号3845描述的基因，包括其突变体和变体。在其它实施方案中，kras基因来自以下动物之一：小鼠(参见，例如，ncbientrezgeneid号16653)、大鼠(参见，例如，ncbientrezgeneid号24525)、食蟹猴(参见，例如，ncbientrezgeneid号102131483)、鱼(参见，例如，ncbientrezgeneid号445289)、狗(参见，例如，ncbientrezgeneid号403871)、牛(参见，例如，ncbientrezgeneid号541140)、马(参见，例如，ncbientrezgeneid号100064473)、鸡(参见，例如，ncbientrezgeneid号418207)、黑猩猩(参见，例如，ncbientrezgeneid号473387)、恒河猴(参见，例如，ncbientrezgeneid号707977)或猫(参见，例如，ncbientrezgeneid号751104)。
与癌症相关的多种kras突变是已知的，并且可通过本文所述的方法适当地检测；参见，例如prior,i.a.等(2012)cancerres.72:2457-67。例如，一项研究发现其队列中30％的结直肠肿瘤具有kras突变，主要在氨基酸12处(smith,g.等(2002)proc.natl.acad.sci.99:9433-8)。在本文所述的一些实施方案中，基于根据例如以下序列中所示的人kras蛋白的所得氨基酸取代/缺失/移码命名kras突变：mteyklvvvgaggvgksaltiqliqnhfvdeydptiedsyrkqvvidgetclldildtagqeeysamrdqymrtgegflcvfainntksfedihhyreqikrvkdsedvpmvlvgnkcdlpsrtvdtkqaqdlarsygipfietsaktrqgvddafytlvreirkhkekmskdgkkkkkksktkcvim(seqidno:62)。示例性人krascdna序列示于以下序列中：tgtgctcggagctcgattttcctaggcggcggccgcggcggcggaggcagcagcggcggcggcagtggcggcggcgaaggtggcggcggctcggccagtactcccggcccccgccatttcggactgggagcgagcgcggcgcaggcactgaaggcggcggcggggccagaggctcagcggctcccaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagaggagtacagtgcaatgagggaccagtacatgaggactggggagggctttctttgtgtatttgccataaataatactaaatcatttgaagatattcaccattatagagaacaaattaaaagagttaaggactctgaagatgtacctatggtcctagtaggaaataaatgtgatttgccttctagaacagtagacacaaaacaggctcaggacttagcaagaagttatggaattccttttattgaaacatcagcaaagacaagacagagagtggaggatgctttttatacattggtgagagagatccgacaatacagattgaaaaaaatcagcaaagaagaaaagactcctggctgtgtgaaaattaaaaaatgcattataatgtaatctgggtgttgatgatgccttctatacattagttcgagaaattcgaaaacataaagaaaagatgagcaaagatggtaaaaagaagaaaaag(seqidno:66)。在一些实施方案中，dna突变导致根据seqidno:62或seqidno:66的g12或g13的突变。例如，在一些实施方案中，kras基因中的dna突变编码或导致g12d、g12v、g12s或g13d突变的kras蛋白(根据seqidno:62编码)。这些dna突变还可通过下文表a中的其核苷酸位置(而非突变的多肽密码子)来描述。在一些实施方案中，kras基因中的dna突变导致seqidno:66的相应的cdna序列中的c.35g>a、c.35g>t、c.34g>a或c.38g>a突变。
因此，如上文中所述，由于已知多种kras基因和相应突变的序列，本领域普通技术人员可适当地选择引物对以扩增这些dna突变中的一种或多种的基因座。影响引物设计的各种因素是已知的，并且用于鉴定适合于扩增给定dna模板序列的引物对的工具是可获得的(参见，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)。在一些实施方案中，用于扩增kras突变(例如，编码或导致g12d、g12v、g12s或g13d突变的kras蛋白)的基因座的引物对分别包含序列gtactggtggagtatttgatagtg(seqidno:1)和atcgtcaaggcactcttgcctac(seqidno:2)。
在一些实施方案中，本公开的方法包括扩增braf基因中一个或多个突变的基因座。braf编码braf原癌基因(一种在人癌症中频繁突变的丝氨酸/苏氨酸激酶，也称为b-raf、braf1、b-raf1、rafb1、ns7、94kdab-raf蛋白、p94、鼠肉瘤病毒(v-raf)癌基因同源物b1、v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物b和v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物b1)。在一些实施方案中，braf基因是人braf基因。在一些实施方案中，人braf基因是指ncbientrezgeneid号673描述的基因，包括其突变体和变体。在其它实施方案中，braf基因来自以下生物体之一：小鼠(参见，例如，ncbientrezgeneid号109880)、大鼠(参见，例如，ncbientrezgeneid号114486)、食蟹猴(参见，例如，ncbientrezgeneid号101866436)、鱼(参见，例如，ncbientrezgeneid号403065)、狗(参见，例如，ncbientrezgeneid号475526)、牛(参见，例如，ncbientrezgeneid号536051)、马(参见，例如，ncbientrezgeneid号100065760)、鸡(参见，例如，ncbientrezgeneid号396239)、黑猩猩(参见，例如，ncbientrezgeneid号463781)、恒河猴(参见，例如，ncbientrezgeneid号693554)或猫(参见，例如，ncbientrezgeneid号101092346)。
与癌症相关的多种braf突变是已知的，并且可通过本文所述的方法适当地检测；参见，例如davies,h.等(2002)nature417:949-54；和garnett,m.j.和marais,r.(2004)cancercell6:313-9。例如，一篇综述描述了在9-14％的结肠癌和直肠癌患者中发现braf突变，所述突变与总体生存率差有关，并且在超过50％的微卫星不稳定性(msi)高的肿瘤中发现所述突变(clarke,c.n.和kopetz,e.s.(2015)j.gastrointest.oncol.6:660-7)。在本文所述的一些实施方案中，基于根据如下序列中所示的人braf蛋白的所得氨基酸取代/缺失/移码命名braf突变：maalsggggggaepgqalfngdmepeagagagaaassaadpaipeevwnikqmikltqehiealldkfggehnppsiyleayeeytskldalqqreqqlleslgngtdfsvsssasmdtvtsssssslsvlpsslsvfqnptdvarsnpkspqkpivrvflpnkqrtvvparcgvtvrdslkkalmmrglipeccavyriqdgekkpigwdtdiswltgeelhvevlenvpltthnfvrktfftlafcdfcrkllfqgfrcqtcgykfhqrcstevplmcvnydqldllfvskffehhpipqeeaslaetaltsgsspsapasdsigpqiltspspsksipipqpfrpadedhrnqfgqrdrsssapnvhintiepvniddlirdqgfrgdggsttglsatppaslpgsltnvkalqkspgpqrerksssssedrnrmktlgrrdssddweipdgqitvgqrigsgsfgtvykgkwhgdvavkmlnvtaptpqqlqafknevgvlrktrhvnillfmgystkpqlaivtqwcegsslyhhlhiietkfemiklidiarqtaqgmdylhaksiihrdlksnniflhedltvkigdfglatvksrwsgshqfeqlsgsilwmapevirmqdknpysfqsdvyafgivlyelmtgqlpysninnrdqiifmvgrgylspdlskvrsncpkamkrlmaeclkkkrderplfpqilasiellarslpkihrsasepslnragfqtedfslyacaspktpiqaggygafpvh(seqidno:63)。示例性人brafcdna序列示于以下序列中：gttataagatggcggcgctgagcggtggcggtggtggcggcgcggagccgggccaggctctgttcaacggggacatggagcccgaggccggcgccggcgccggcgccgcggcctcttcggctgcggaccctgccattccggaggaggtgtggaatatcaaacaaatgattaagttgacacaggaacatatagaggccctattggacaaatttggtggggagcataatccaccatcaatatatctggaggcctatgaagaatacaccagcaagctagatgcactccaacaaagagaacaacagttattggaatctctggggaacggaactgatttttctgtttctagctctgcatcaatggataccgttacatcttcttcctcttctagcctttcagtgctaccttcatctctttcagtttttcaaaatcccacagatgtggcacggagcaaccccaagtcaccacaaaaacctatcgttagagtcttcctgcccaacaaacagaggacagtggtacctgcaaggtgtggagttacagtccgagacagtctaaagaaagcactgatgatgagaggtctaatcccagagtgctgtgctgtttacagaattcaggatggagagaagaaaccaattggttgggacactgatatttcctggcttactggagaagaattgcatgtggaagtgttggagaatgttccacttacaacacacaactttgtacgaaaaacgtttttcaccttagcattttgtgacttttgtcgaaagctgcttttccagggtttccgctgtcaaacatgtggttataaatttcaccagcgttgtagtacagaagttccactgatgtgtgttaattatgaccaacttgatttgctgtttgtctccaagttctttgaacaccacccaataccacaggaagaggcgtccttagcagagactgccctaacatctggatcatccccttccgcacccgcctcggactctattgggccccaaattctcaccagtccgtctccttcaaaatccattccaattccacagcccttccgaccagcagatgaagatcatcgaaatcaatttgggcaacgagaccgatcctcatcagctcccaatgtgcatataaacacaatagaacctgtcaatattgatgacttgattagagaccaaggatttcgtggtgatggagcccctttgaaccagctgatgcgctgtcttcggaaataccaatcccggactcccagtcccctcctacattctgtccccagtgaaatagtgtttgattttgagcctggcccagtgttcagaggatcaaccacaggtttgtctgctaccccccctgcctcattacctggctcactaactaacgtgaaagccttacagaaatctccaggacctcagcgagaaaggaagtcatcttcatcctcagaagacaggaatcgaatgaaaacacttggtagacgggactcgagtgatgattgggagattcctgatgggcagattacagtgggacaaagaattggatctggatcatttggaacagtctacaagggaaagtggcatggtgatgtggcagtgaaaatgttgaatgtgacagcacctacacctcagcagttacaagccttcaaaaatgaagtaggagtactcaggaaaacacgacatgtgaatatcctactcttcatgggctattccacaaagccacaactggctattgttacccagtggtgtgagggctccagcttgtatcaccatctccatatcattgagaccaaatttgagatgatcaaacttatagatattgcacgacagactgcacagggcatggattacttacacgccaagtcaatcatccacagagacctcaagagtaataatatatttcttcatgaagacctcacagtaaaaataggtgattttggtctagctacagtgaaatctcgatggagtgggtcccatcagtttgaacagttgtctggatccattttgtggatggcaccagaagtcatcagaatgcaagataaaaatccatacagctttcagtcagatgtatatgcatttggaattgttctgtatgaattgatgactggacagttaccttattcaaacatcaacaacagggaccagataatttttatggtgggacgaggatacctgtctccagatctcagtaaggtacggagtaactgtccaaaagccatgaagagattaatggcagagtgcctcaaaaagaaaagagatgagagaccactctttccccaaattctcgcctctattgagctgctggcccgctcattgccaaaaattcaccgcagtgcatcagaaccctccttgaatcgggctggtttccaaacagaggattttagtctatatgcttgtgcttctccaaaaacacccatccaggcagggggatatggagaatttgcagccttcaagtagccaccatcatggcagcatctgctcttatttcttaagtcttgtgttcgtacaatttgttaacatcaaaacacagttctgttcctcaaatctttttttaaagatacaaaatttccaatgcataagctgatgtggaacagaatggaatttcccatccaacaaaagaggaaagaatgttttaggaaccagaattctctgctgccagtgtttcttcaacaaaaataccacgagcatacaagtctgcccagtcccaggaagaaagaggagagaccctgaattctgaccttttgatggtcaggcatgatggaaagaaactgctgctacagcttgggagatttgctatggaaagtctgccagtcaactttgcccttctaaccaccagatcaatttgtggctgatcatctgatggggcagtttcaatcaccaagcatcgttctctttcctgttctggaattttgttttggagctctttcccctagtgaccaccagttagtttctgagggatggaacaaaaatgcagcttgccctttctatgtggtgcgtgttcaggccttgacagattttatcaaaaggaaactattttatttaaatggaggctgagtggtgagtagatgtgtcttggtatggaggaaaagggcatgctgcatcttcttcctgacctccggggtctctggccttttgtttccttgctcactgaggggtctgtctaaccaagcaggctagatagtgctggcacacattgccttctttctcattgggtccagcaatgaagataagtgtttgggttttttttttttcctccacaatgtagcaaattctcaggaaatacagtttatatcttcctcctatgctcttccagtcaccaactacttatgcggctactttgtccagggcacaaaatgccgtggcagtatctaactaaacccccacaaaactgcttaataacagttttgaatgtgagaaatttagataatttaaatataaggtacaggttttaatttctgagtttcttcttttctatttttattaaaaagaaaataattttcagatttaattgaattggaaaaaaacaatacttcccaccagaattatatatcctgaaaattgtatttttgttatataaacaacttttaagaaagatcattatccttttctctacctaaatatgaggagtcttagcataatgacaaatatttataatttttcaattaatggtacttgctggatccacactaacatctttgctaataatctcattgtttcttccaactgattcctaacactatatcccacatcttctttctagtcttttatctagaatatgcaacctaaaataaaaatggtggcgtctccattcattctccttcttccttttttcccaagcctggtcttcaaaaggttgggcaatttggcagctgaattcccagacagagaatagagcaattttagggatattaggactgagggagggtgtgggaaagctgtcatcagttgtttttatagaaagaactggcattcattaagaacctaaatcttatctttgcacaaatggaaaatataacctagttatagcttcctttggcctttattaaagggtaatatcaatcacagtcatagcaaagaaagcggatgtattaatggcaaattaatggaaaacctcccttatcaggaatctagactcagaatttaggaacacaaatcaaatcagaccaaccaagctatagccaaggacttgaaagaaattaaacaagacccagaataaatcaaggaattagaaattgttatttaaaaatttcagattgtaactccaggccctgctgtctatattgcagccactaaaagctcactaccattagatttttgctaacatacatgtattcagaagaaagcctattgaaattttcattgtcttgtaaaaggttgtcctagtaaaatggaaaagatccttaagttattaatcagtttgaaaagcaaatttgtttttaagttttacatcagcagggcagtgtcttacaaaattcagaaattgcaaaggtggaaataattcacgctgatttgaagaacatcttctgtgcaataatactgcctctcttgaaaagcattggctgttttttctttttaaatatatctctagatgcttttaaatgtggctgtgttccctttaccaagattggcttcaagtttccgcaggtagagagacctgggcttgaacaagaggatgtgtttcatgtcctgctgaggaggtagaacatgtgcagcctgggtccgggactgcctccgtggggcaggggcaggggcggtaccattagggaggaagcttagcatttcagtttcttaaacaatattcagggtgatacactttttcttcccttgcattttagaataggctggtatctcatttgaacgggggagcagacttgatctcaaatgaagctgtgcccaggagccaggcttagcatattgagatttttatagataccttaaaaaataaaatatttaaacctctcttttcttcctttttctatgaaataggttttttctctagtttacaaatgacatgaaaataggttttatttgtgttttatctgctttattttttgatgcttagacaacagttagacttactgagctcctaaaaaaacgaggaagaagtccttatttgtgaaaagcactttatgagtaattgtatagacagtatgtggctgcgtcactgatcatcttgtaagggtgtaacagtcttgtctgtaaagtggctgcagtgccttctgtagtgtgttttatttttggtagggagaggtgaagccttctgaaaaatttgagagcaactacagaggattgtttgtaactgtgtagtattcctgatggacttttttcatcgttagagtcaaggacctagacttttgccactgaaataatattgaccaaaaaaatagtttataaaagggatttgtgaatagaaaattcagtgtgatcatttgttgttaatgtgcaccttaaaagaagattctgtctagctgtcaaattctggttcccgaatatctcacccctgattgtatttgagatctagtagggcatactggggcattttagaagataaaatcccatacaaatgatatatgctatatttatgttggtgttggagaagaaagagcagtatataaagaaataattcaagactgcagcactgtcaacctgaaactttgtaaatatttcctagcttctggtttggtgcggtgacagcactttcatcacaggatgttaccttgtattcaccaggcggagtgcgagctgctgcacatcctcctcagatctcacctgtccccactgtacatccacccgccagctgcttgcaaacctcatctctagctttagttcgaaaccacattgcagggttcaggtgacctctacaaaaaactacctcttcagaatgaggtaatgaatagttatttattttaaaatatgaaaagtcaggagctctagaacatgacgatgatttaagattttaacttttttgtgtacttgtatttgagcactctcattttgtcctaaagggcattatacatttaagcagtaatactgtaaaaaaatgtgttgctcggaatatctgaatgttgttgaaagtggtgccagaaccggtttaggggtacgtttcagaatcttaaccttgagtcaattgcatgaaattaaatagctgtggtatcacttcactaacagtgatgtaattttaattttcagtaggcttggcatgacagtacatcctcataatgagtttgctgcagctttgtcacatgcacaggcattcatagaaagaccacccagctaagagggtagaatgattactctttttgcaagattctcttctttgtccaagttggcattgttagtgctaggaataccagcaccttgagacgagcagattccaaccattaggctataaacaccatagccagagatggaaggtttactgtgagtatgaacagcaaatagcttacaggtcatgagttgaaatggtgtaggtgaggctctagaaaaataccttgacaatttgccaaatgatcttactgtgccttcatgatgcaataaaaaagctaacattttagcagaaatcagtgatttgtgaagagagcagccactctggtttaactcagctgtgttaataatttttagagtgcaatttagactgcataggtaaatgcactaaagagtttatagccaaaatcacatttaacaatgagaaaacacacaggtaaattttcagtgaacaaaattatttttttaaagcacataatccctagtatagtcagatatatttatcacatagagcaactaggttgcaaatatagttcagtgacatttctagagaaactttttctactcccataggctcttcaaagcatggaacttttatacaacagaaatgttgacagaaattgctgtagtttagggttgaagtactgtatgatgggcagcaatcatgtattaacttagaaggggaaattgaaatataggaccgaatttggttttatcagtttccagagtactgctgccaacctagacactgatttttcagagtttgaaatgtaaatttcttcccgggacttgattgcacatgaagctggactgcgttagtcatcctgtcccaaagcgctgtgggggccagggtggaggtctcaaggcatcctttatgacctggccattggatgtaaaagaaaacatattccatgctgtggttcttgtatcttgtttcattcctcaccattgaaagagaaagtccatgtattgtctccagcacatccttgaaatgttatactgggatggattactgatgcccatcggtagttgagccccagaagagggtagtagcatctctgcctcaggtgatgatttgtagcttggccagaggagagcggagtcaccagtatatctgtggtccatgttgctagctctggtaaaattaaaaatactggtaagatgtttgttttattagtacactagacagtaagctctgttttgttgttttcaaataacctattttcacttttgtttgggcaaagacatttaaattgaaattcaattctaatttttgttaattgtggaaagggtaattaacagttcctatcaggtatttttaatgtggaaaaggacagaaacccaactcctaaaatcttaaattaaggtaacagtgctttaaaaaaaaaaaatgcatggggcaattagtcggcaactcaatgagtgactaaagtacttttatttaacatccacaacttcaactgttaagttttattaattactaaatcagctttattaaaatgttgacatttatttagctattttgaataattatagtgacttgacgagtgtgtatgaggacacagccaatgtaagccagtgtatccattttttagaggtgcatttttttttaaagaattctgtagatagaagtgctctgaaaacaactaaaatatgtttattcatggtagtatcaaaaaatgtttgtacaaaccatctgcttctcccggccagccgagttcattctccagcaccgtgaccgctggttctcatgtacagcacatatgcgggagagttggcagaaaatttgtgaagagatgccgcaaaggaagggtctgttgacgggtgggattgggggttttgatgaagttgcttagtcctggttttgttttgaaaattactgcgttgcatttttgtgttaagtttttgaacccacgtgtgttttggtggagtatgagttggaagtcactgcaaactagcataaacaacaaagctcacagagtaggcacagatgtagagaacagagaccaaaatggggtgaggtggcagtaaatctaggatagggaaaaattaatgtgagggtgggaaataaactgtaattacctgaaatcaaatgtaagagtgcaataagtatgctttttattctaagctgtgaacggtttttttaagaatcattccttcctaatacatttgtgtatgttccatagctgattaaaaccagctatatcaacatataatgcctttttattcatgttaatgaccaacgtaagtggctagcctttatgtcttatttatcttcatgttatgttagtttacatacaggggtgtatgtctctgtgctgtccccttctcctgccttcattttaaaatgcatccatgggtcctccgtgtttcctttggccatgccacatatatagactcagtttggccttcatgatatcgcctgatttttgaggactgtatcacagtgatatgtatttgtggtaatctcatttgttggttgtacatctgatcctttcctcaacatggcaattgctgcctttcctaagataggatcatacaactgatcaggggattgaatttgatcattcatcaacatgtgtctctgaattttattcagtagttgtcattgctctttggtttagaccaagaaaaaggaaatccccccttttcatgtattccttggtttgaggacatgactcctgtaagggagaggaaagggagatgcttcctgtttgaactgcagtgaattcacggttcctgtttcaccactccaaaccttatggcgactcacacacacattcctcttttctgttactgccaaaggttcgggtttagtacacttcagttccactcaagcattgaaaaggttctcgtggagtctggggcgtgcccagtgaaaagatggggactttttaattgtccacagacctctctatacctgctttgcaaaaattacaatggagtaactatttttaaagcttatttttcaattcataaaaaagacatttattttcagtcaaatggatgatgtctccctcttttcccctattctcaatgtttgcttgaatcttttattattttttttaattctcccccatacccacttcctgatactttggttctctttcctgctcaggtcccttcatttgtactttggagtttttctcatgtaaatttgtataacagaaaatattgttcagtttggatagaaagcatggagaataaaaaaagatagctgaaattcagattgaagaaatttatttctgtgtaaagttatttaaaaactgtattatataaaaggcaaaaaaagttctatgtacttgatgtgaatatgcgaatactgctataataaagattgactgcatggagaagtc(seqidno:67)。在一些实施方案中，dna突变导致根据seqidno:63或seqidno:67的v600的突变。例如，在一些实施方案中，braf基因中的dna突变编码或导致v600e突变的braf蛋白(根据seqidno:63编码)。这些dna突变还可通过下文表a中的其核苷酸位置(而非突变的多肽密码子)来描述。应理解，关于v600ebraf突变的一些参考文献将其称为v599e是由早期错误的braf蛋白质序列造成的，所述蛋白质序列缺失了大致氨基酸31处的密码子(关于描述，参见garnett,m.j.和marais,r.(2004)cancercell6:313-9)。例如，在一些实施方案中，braf基因中的dna突变导致seqidno:67的相应cdna序列中的c.1799t>a或c.1799_1800tg>aa突变。
因此，如上所述，由于已知多种braf基因和相应突变的序列，本领域普通技术人员可适当地选择引物对以扩增这些dna突变中的一种或多种的基因座。影响引物设计的各种因素是已知的，并且用于鉴定适合于扩增给定dna模板序列的引物对的工具是可获得的(参见，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)。在一些实施方案中，用于扩增braf突变(例如，编码或导致v600e突变的braf蛋白)的基因座的引物对分别包含序列ggacccactccatcgagattt(seqidno:8)和cagatatatttcttcatgaagacctcacagtaa(seqidno:9)。
在一些实施方案中，本公开的方法包括扩增ctnnb1基因中的一个或多个突变的基因座。ctnnb1编码ctnnb1β连环蛋白1蛋白，其为钙粘蛋白蛋白复合物的一个亚基，可转导wnt信号，经常在人癌症中发生突变，也称为ctnnb、mrd19、犰狳连环蛋白(钙粘蛋白相关蛋白)β1和连环蛋白(钙粘蛋白相关蛋白)β188kda。在一些实施方案中，ctnnb1基因为人ctnnb1基因。在一些实施方案中，人ctnnb1基因是指由ncbientrezgeneid号1499描述的基因，包括其突变体和变体。在其它实施方案中，ctnnb1基因来自以下生物体之一：小鼠(参见，例如，ncbientrezgeneid号12387)、大鼠(参见，例如，ncbientrezgeneid号84353)、食蟹猴(参见，例如，ncbientrezgeneid号102146984)、鱼(参见，例如，ncbientrezgeneid号30265)、狗(参见，例如，ncbientrezgeneid号477032)、牛(参见，例如，ncbientrezgeneid号539003)、马(参见，例如，ncbientrezgeneid号100055241)、鸡(参见，例如，ncbientrezgeneid号395964)、黑猩猩(参见，例如，ncbientrezgeneid号450183)、恒河猴(参见，例如，ncbientrezgeneid号574265)或猫(参见，例如，ncbientrezgeneid号101097342)。
与癌症相关的多种ctnnb1突变是已知的，并且可通过本文所述的方法适当地检测；参见，例如morin,p.j.等(1997)science275:1787-90和polakis,p.(2000)genesdev.14:1837-51。例如，已经在结直肠腺瘤和癌中，特别是在缺乏apc突变的肿瘤中发现导致人ctnnb1蛋白的位置t41和s45处的氨基酸变化的ctnnb1突变(sparks,a.b.等(1998)cancerres.58:1130-4)。在本文所述的一些实施方案中，基于根据例如以下序列中所示的人ctnnb1蛋白的所得氨基酸取代/缺失/移码命名ctnnb1突变：matqadlmeldmamepdrkaavshwqqqsyldsgihsgatttapslsgkgnpeeedvdtsqvlyeweqgfsqsftqeqvadidgqyamtraqrvraamfpetldegmqipstqfdaahptnvqrlaepsqmlkhavvnlinyqddaelatraipeltkllndedqvvvnkaavmvhqlskkeasrhaimrspqmvsaivrtmqntndvetarctagtlhnlshhregllaifksggipalvkmlgspvdsvlfyaittlhnlllhqegakmavrlagglqkmvallnktnvkflaittdclqilaygnqeskliilasggpqalvnimrtytyekllwttsrvlkvlsvcssnkpaiveaggmqalglhltdpsqrlvqnclwtlrnlsdaatkqegmegllgtlvqllgsddinvvtcaagilsnltcnnyknkmmvcqvggiealvrtvlragdreditepaicalrhltsrhqeaemaqnavrlhyglpvvvkllhppshwplikatvglirnlalcpanhaplreqgaiprlvqllvrahqdtqrrtsmggtqqqfvegvrmeeivegctgalhilardvhnrivirglntiplfvqllyspieniqrvaagvlcelaqdkeaaeaieaegatapltellhsrnegvatyaaavlfrmsedkpqdykkrlsveltsslfrtepmawnetadlgldigaqgeplgyrqddpsyrsfhsggygqdalgmdpmmehemgghhpgadypvdglpdlghaqdlmdglppgdsnqlawfdtdl(seqidno:64)。示列性人ctnnb1cdna序列示于以下序列中：aagtcccatcagtcctggggatcggaccagtggactttctcttaagatttcctctttcattcttaagaatagaagtgttattattttttttaatgccctggctatgtgagtttgaatcgaagcaactttaaaccttagagcaactaaactctaagtgcagcgggtgcgatgcgtcagtagggtgagcacataaaaaatccatgtcttgcacctgtattttagcgtactatgcagggtatttgaagtataccatacaactgttttgaaaatccagcgtggacaatggctactcaagctgatttgatggagttggacatggccatggaaccagacagaaaagcggctgttagtcactggcagcaacagtcttacctggactctggaatccattctggtgccactaccacagctccttctctgagtggtaaaggcaatcctgaggaagaggatgtggatacctcccaagtcctgtatgagtgggaacagggattttctcagtccttcactcaagaacaagtagctgatattgatggacagtatgcaatgactcgagctcagagggtacgagctgctatgttccctgagacattagatgagggcatgcagatcccatctacacagtttgatgctgctcatcccactaatgtccagcgtttggctgaaccatcacagatgctgaaacatgcagttgtaaacttgattaactatcaagatgatgcagaacttgccacacgtgcaatccctgaactgacaaaactgctaaatgacgaggaccaggtggtggttaataaggctgcagttatggtccatcagctttctaaaaaggaagcttccagacacgctatcatgcgttctcctcagatggtgtctgctattgtacgtaccatgcagaatacaaatgatgtagaaacagctcgttgtaccgctgggaccttgcataacctttcccatcatcgtgagggcttactggccatctttaagtctggaggcattcctgccctggtgaaaatgcttggttcaccagtggattctgtgttgttttatgccattacaactctccacaaccttttattacatcaagaaggagctaaaatggcagtgcgtttagctggtgggctgcagaaaatggttgccttgctcaacaaaacaaatgttaaattcttggctattacgacagactgccttcaaattttagcttatggcaaccaagaaagcaagctcatcatactggctagtggtggaccccaagctttagtaaatataatgaggacctatacttacgaaaaactactgtggaccacaagcagagtgctgaaggtgctatctgtctgctctagtaataagccggctattgtagaagctggtggaatgcaagctttaggacttcacctgacagatccaagtcaacgtcttgttcagaactgtctttggactctcaggaatctttcagatgctgcaactaaacaggaagggatggaaggtctccttgggactcttgttcagcttctgggttcagatgatataaatgtggtcacctgtgcagctggaattctttctaacctcacttgcaataattataagaacaagatgatggtctgccaagtgggtggtatagaggctcttgtgcgtactgtccttcgggctggtgacagggaagacatcactgagcctgccatctgtgctcttcgtcatctgaccagccgacaccaagaagcagagatggcccagaatgcagttcgccttcactatggactaccagttgtggttaagctcttacacccaccatcccactggcctctgataaaggctactgttggattgattcgaaatcttgccctttgtcccgcaaatcatgcacctttgcgtgagcagggtgccattccacgactagttcagttgcttgttcgtgcacatcaggatacccagcgccgtacgtccatgggtgggacacagcagcaatttgtggagggggtccgcatggaagaaatagttgaaggttgtaccggagcccttcacatcctagctcgggatgttcacaaccgaattgttatcagaggactaaataccattccattgtttgtgcagctgctttattctcccattgaaaacatccaaagagtagctgcaggggtcctctgtgaacttgctcaggacaaggaagctgcagaagctattgaagctgagggagccacagctcctctgacagagttacttcactctaggaatgaaggtgtggcgacatatgcagctgctgttttgttccgaatgtctgaggacaagccacaagattacaagaaacggctttcagttgagctgaccagctctctcttcagaacagagccaatggcttggaatgagactgctgatcttggacttgatattggtgcccagggagaaccccttggatatcgccaggatgatcctagctatcgttcttttcactctggtggatatggccaggatgccttgggtatggaccccatgatggaacatgagatgggtggccaccaccctggtgctgactatccagttgatgggctgccagatctggggcatgcccaggacctcatggatgggctgcctccaggtgacagcaatcagctggcctggtttgatactgacctgtaaatcatcctttaggagtaacaatacaaatggattttgggagtgactcaagaagtgaagaatgcacaagaatggatcacaagatggaatttatcaaaccctagccttgcttgttaaatttttttttttttttttttaagaatatctgtaatggtactgactttgcttgctttgaagtagctctttttttttttttttttttttttttgcagtaactgttttttaagtctctcgtagtgttaagttatagtgaatactgctacagcaatttctaatttttaagaattgagtaatggtgtagaacactaattcataatcactctaattaattgtaatctgaataaagtgtaacaattgtgtagcctttttgtataaaatagacaaatagaaaatggtccaattagtttcctttttaatatgcttaaaataagcaggtggatctatttcatgtttttgatcaaaaactatttgggatatgtatgggtagggtaaatcagtaagaggtgttatttggaaccttgttttggacagtttaccagttgccttttatcccaaagttgttgtaacctgctgtgatacgatgcttcaagagaaaatgcggttataaaaaatggttcagaattaaacttttaattcattcga(seqidno:68)。在一些实施方案中，dna突变导致根据seqidno:64或seqidno:68的突变t41或s45。例如，在一些实施方案中，ctnnb1基因中的dna突变编码或导致t41a、t41i、s45f或s45p突变的ctnnb1蛋白(根据seqidno:64编号)。这些dna突变还可通过下文表a中的其核苷酸位置(而非突变的多肽密码子)来描述。例如，在一些实施方案中，ctnnb1基因中的dna突变导致seqidno:68的相应的的cdna序列中的121a>g、122c>t、133t>c或134c>t突变。
由于，如上文中所述，已知多种ctnnb1基因和相应突变的序列，本领域普通技术人员可适当地选择引物对以扩增这些dna突变中的一种或多种的基因座。影响引物设计的各种因素是已知的，并且用于鉴定适合于扩增给定dna模板序列的引物对的工具是可获得的(参见，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)。在一些实施方案中，用于扩增ctnnb1突变(例如，编码或导致t41a、t41i、s45f和s45p突变的ctnnb1蛋白)的基因座的引物对分别包含序列ggaatccattctggtgccact(seqidno:13)和agaaaatccctgttcccactcata(seqidno:14)(对于t41基因座)；或ggtgccactaccacagctcct(seqidno:18)和tctcaaaactgcattctgactttca(seqidno:19)(对于s45基因座)。在一些实施方案中，两个引物对用于pcr：第一引物对包含序列ggaatccattctggtgccact(seqidno:13)和agaaaatccctgttcccactcata(seqidno:14)，并且第二引物对包含序列ggtgccactaccacagctcct(seqidno:18)和tctcaaaactgcattctgactttca(seqidno:19)。
在一些实施方案中，本公开的方法包括扩增apc基因中的一个或多个突变的基因座。apc编码apc肿瘤抑制剂，其为β连环蛋白和wnt信号传导的负调节剂，经常在人癌症中发生突变，也称为gs、dp2、dp3、btps2、dp2.5、ppp1r46、腺瘤性结肠息肉蛋白(adenomatouspolyposiscoliprotein)、wnt信号传导途径负调节剂、腺瘤性结肠息肉肿瘤抑制剂(在息肉病2.5中删除的)、蛋白质磷酸酶1调节亚基46和截短的腺瘤性结肠息肉。在一些实施方案中，apc基因是人apc基因。在一些实施方案中，人apc基因是指由ncbientrezgeneid号324描述的基因，包括其突变体和变体。在其它实施方案中，apc基因来自以下生物体中的一种：小鼠(参见，例如，ncbientrezgeneid号11789)、大鼠(参见，例如，ncbientrezgeneid号24205)、食蟹猴(参见，例如，ncbientrezgeneid号102126553)、鱼(参见，例如，ncbientrezgeneid号386762)、狗(参见，例如，ncbientrezgeneid号479139)、牛(参见，例如，ncbientrezgeneid号533233)、马(参见，例如，ncbientrezgeneid号100064431)、鸡(参见，例如，ncbientrezgeneid号415607)、黑猩猩(参见，例如，ncbientrezgeneid号461999)、恒河猴(参见，例如，ncbientrezgeneid号693443)或猫(参见，例如，ncbientrezgeneid号101096138)。
与癌症相关的多种apc突变是已知的，并且可通过本文所述的方法适当地检测；参见，例如morin,p.j.等(1997)science275:1787-90和polakis,p.(2000)genesdev.14:1837-51。apc突变通常导致移码或截短的apc突变蛋白，并且在称为突变密集区(mcr)的区域中特别常见。参见miyoshi，y.等(1992)hum.mol.genet.1:229-33；以及segditsas,s.和tomlinson,i.(2006)oncogene25:7531-7。一项研究在72％的结直肠癌患者发现apc基因的mcr中的突变，并且经常观察到编码人apc残基q1367、r1450、e1309和s1465的密码子处的移码或无义突变(luchtenborg,m.等(2004)carcinogenesis25:1219-26)。在本文所述的一些实施方案中，基于根据例如以下序列中所示的人apc蛋白的所得氨基酸取代/缺失/移码命名apc突变：maaasydqllkqvealkmensnlrqelednsnhltkleteasnmkevlkqlqgsiedeamassgqidllerlkelnldssnfpgvklrskmslrsygsregsvssrsgecspvpmgsfprrgfvngsrestgyleelekersllladldkeekekdwyyaqlqnltkridslpltenfslqtdmtrrqleyearqirvameeqlgtcqdmekraqrriariqqiekdilrirqllqsqateaerssqnkhetgshdaerqnegqgvgeinmatsgngqgsttrmdhetasvlssssthsaprrltshlgtkvemvysllsmlgthdkddmsrtllamsssqdscismrqsgclplliqllhgndkdsvllgnsrgskeararasaalhniihsqpddkrgrreirvlhlleqiraycetcwewqeahepgmdqdknpmpapvehqicpavcvlmklsfdeehrhamnelgglqaiaellqvdcemygltndhysitlrryagmaltnltfgdvankatlcsmkgcmralvaqlksesedlqqviasvlrnlswradvnskktlrevgsvkalmecalevkkestlksvlsalwnlsahctenkadicavdgalaflvgtltyrsqtntlaiiesgggilrnvssliatnedhrqilrennclqtllqhlkshsltivsnacgtlwnlsarnpkdqealwdmgavsmlknlihskhkmiamgsaaalrnlmanrpakykdanimspgsslpslhvrkqkaleaeldaqhlsetfdnidnlspkashrskqrhkqslygdyvfdtnrhddnrsdnfntgnmtvlspylnttvlpsssssrgsldssrsekdrslerergiglgnyhpatenpgtsskrglqisttaaqiakvmeevsaihtsqedrssgsttelhcvtdernalrrssaahthsntynftksensnrtcsmpyakleykrssndslnsvsssdgygkrgqmkpsiesyseddeskfcsygqypadlahkihsanhmddndgeldtpinyslkysdeqlnsgrqspsqnerwarpkhiiedeikqseqrqsrnqsttypvytestddkhlkfqphfgqqecvspyrsrgangsetnrvgsnhginqnvsqslcqeddyeddkptnyseryseeeqheeeerptnysikyneekrhvdqpidyslkyatdipssqkqsfsfsksssgqssktehmssssentstpssnakrqnqlhpssaqsrsgqpqkaatckvssinqetiqtycvedtpicfsrcsslsslssaedeigcnqttqeadsantlqiaeikekigtrsaedpvsevpavsqhprtkssrlqgsslssesarhkavefssgakspsksgaqtpksppehyvqetplmfsrctsvssldsfesrsiassvqsepcsgmvsgiispsdlpdspgqtmppsrsktpppppqtaqtkrevpknkaptaekresgpkqaavnaavqrvqvlpdadtllhfatestpdgfscssslsalsldepfiqkdvelrimppvqendngneteseqpkesnenqekeaektidsekdllddsddddieileeciisamptkssrkakkpaqtasklpppvarkpsqlpvykllpsqnrlqpqkhvsftpgddmprvycvegtpinfstatslsdltiesppnelaagegvrggaqsgefekrdtiptegrstdeaqggktssvtipelddnkaeegdilaecinsampkgkshkpfrvkkimdqvqqasasssapnknqldgkkkkptspvkpipqnteyrtrvrknadsknnlnaervfsdnkdskkqnlknnskvfndklpnnedrvrgsfafdsphhytpiegtpycfsrndslssldfddddvdlsrekaelrkakenkeseakvtshteltsnqqsanktqaiakqpinrgqpkpilqkqstfpqsskdipdrgaatdeklqnfaientpvcfshnsslsslsdidqennnkenepiketeppdsqgepskpqasgyapksfhvedtpvcfsrnsslsslsidseddllqecissampkkkkpsrlkgdnekhsprnmggilgedltldlkdiqrpdsehglspdsenfdwkaiqegansivsslhqaaaaaclsrqassdsdsilslksgislgspfhltpdqeekpftsnkgprilkpgekstletkkieseskgikggkkvykslitgkvrsnseisgqmkqplqanmpsisrgrtmihipgvrnsssstspvskkgpplktpaskspsegqtattsprgakpsvkselspvarqtsqiggsskapsrsgsrdstpsrpaqqplsrpiqspgrnsispgrngisppnklsqlprtsspstastkssgsgkmsytspgrqmsqqnltkqtglsknassiprsesaskglnqmnngngankkvelsrmsstkssgsesdrserpvlvrqstfikeapsptlrrkleesasfeslspssrpasptrsqaqtpvlspslpdmslsthssvqaggwrklppnlsptieyndgrpakrhdiarshsespsrlpinrsgtwkrehskhssslprvstwrrtgssssilsassessekaksedekhvnsisgtkqskenqvsakgtwrkikenefsptnstsqtvssgatngaesktliyqmapavsktedvwvriedcpinnprsgrsptgntppvidsvsekanpnikdskdnqakqnvgngsvpmrtvglenrlnsfiqvdapdqkgteikpgqnnpvpvsetnessivertpfsssssskhsspsgtvaarvtpfnynpsprkssadstsarpsqiptpvnnntkkrdsktdstessgtqspkrhsgsylvtsv(seqidno:65)。示例性人apccdna序列示于以下序列中：gtattggtgcagcccgccagggtgtcactggagacagaatggaggtgctgccggactcggaaatggggtccaagggtagccaaggatggctgcagcttcatatgatcagttgttaaagcaagttgaggcactgaagatggagaactcaaatcttcgacaagagctagaagataattccaatcatcttacaaaactggaaactgaggcatctaatatgaaggaagtacttaaacaactacaaggaagtattgaagatgaagctatggcttcttctggacagattgatttattagagcgtcttaaagagcttaacttagatagcagtaatttccctggagtaaaactgcggtcaaaaatgtccctccgttcttatggaagccgggaaggatctgtatcaagccgttctggagagtgcagtcctgttcctatgggttcatttccaagaagagggtttgtaaatggaagcagagaaagtactggatatttagaagaacttgagaaagagaggtcattgcttcttgctgatcttgacaaagaagaaaaggaaaaagactggtattacgctcaacttcagaatctcactaaaagaatagatagtcttcctttaactgaaaatttttccttacaaacagatatgaccagaaggcaattggaatatgaagcaaggcaaatcagagttgcgatggaagaacaactaggtacctgccaggatatggaaaaacgagcacagcgaagaatagccagaattcagcaaatcgaaaaggacatacttcgtatacgacagcttttacagtcccaagcaacagaagcagagaggtcatctcagaacaagcatgaaaccggctcacatgatgctgagcggcagaatgaaggtcaaggagtgggagaaatcaacatggcaacttctggtaatggtcagggttcaactacacgaatggaccatgaaacagccagtgttttgagttctagtagcacacactctgcacctcgaaggctgacaagtcatctgggaaccaaggtggaaatggtgtattcattgttgtcaatgcttggtactcatgataaggatgatatgtcgcgaactttgctagctatgtctagctcccaagacagctgtatatccatgcgacagtctggatgtcttcctctcctcatccagcttttacatggcaatgacaaagactctgtattgttgggaaattcccggggcagtaaagaggctcgggccagggccagtgcagcactccacaacatcattcactcacagcctgatgacaagagaggcaggcgtgaaatccgagtccttcatcttttggaacagatacgcgcttactgtgaaacctgttgggagtggcaggaagctcatgaaccaggcatggaccaggacaaaaatccaatgccagctcctgttgaacatcagatctgtcctgctgtgtgtgttctaatgaaactttcatttgatgaagagcatagacatgcaatgaatgaactagggggactacaggccattgcagaattattgcaagtggactgtgaaatgtatgggcttactaatgaccactacagtattacactaagacgatatgctggaatggctttgacaaacttgacttttggagatgtagccaacaaggctacgctatgctctatgaaaggctgcatgagagcacttgtggcccaactaaaatctgaaagtgaagacttacagcaggttattgcgagtgttttgaggaatttgtcttggcgagcagatgtaaatagtaaaaagacgttgcgagaagttggaagtgtgaaagcattgatggaatgtgctttagaagttaaaaaggaatcaaccctcaaaagcgtattgagtgccttatggaatttgtcagcacattgcactgagaataaagctgatatatgtgctgtagatggtgcacttgcatttttggttggcactcttacttaccggagccagacaaacactttagccattattgaaagtggaggtgggatattacggaatgtgtccagcttgatagctacaaatgaggaccacaggcaaatcctaagagagaacaactgtctacaaactttattacaacacttaaaatctcatagtttgacaatagtcagtaatgcatgtggaactttgtggaatctctcagcaagaaatcctaaagaccaggaagcattatgggacatgggggcagttagcatgctcaagaacctcattcattcaaagcacaaaatgattgctatgggaagtgctgcagctttaaggaatctcatggcaaataggcctgcgaagtacaaggatgccaatattatgtctcctggctcaagcttgccatctcttcatgttaggaaacaaaaagccctagaagcagaattagatgctcagcacttatcagaaacttttgacaatatagacaatttaagtcccaaggcatctcatcgtagtaagcagagacacaagcaaagtctctatggtgattatgtttttgacaccaatcgacatgatgataataggtcagacaattttaatactggcaacatgactgtcctttcaccatatttgaatactacagtgttacccagctcctcttcatcaagaggaagcttagatagttctcgttctgaaaaagatagaagtttggagagagaacgcggaattggtctaggcaactaccatccagcaacagaaaatccaggaacttcttcaaagcgaggtttgcagatctccaccactgcagcccagattgccaaagtcatggaagaagtgtcagccattcatacctctcaggaagacagaagttctgggtctaccactgaattacattgtgtgacagatgagagaaatgcacttagaagaagctctgctgcccatacacattcaaacacttacaatttcactaagtcggaaaattcaaataggacatgttctatgccttatgccaaattagaatacaagagatcttcaaatgatagtttaaatagtgtcagtagtagtgatggttatggtaaaagaggtcaaatgaaaccctcgattgaatcctattctgaagatgatgaaagtaagttttgcagttatggtcaatacccagccgacctagcccataaaatacatagtgcaaatcatatggatgataatgatggagaactagatacaccaataaattatagtcttaaatattcagatgagcagttgaactctggaaggcaaagtccttcacagaatgaaagatgggcaagacccaaacacataatagaagatgaaataaaacaaagtgagcaaagacaatcaaggaatcaaagtacaacttatcctgtttatactgagagcactgatgataaacacctcaagttccaaccacattttggacagcaggaatgtgtttctccatacaggtcacggggagccaatggttcagaaacaaatcgagtgggttctaatcatggaattaatcaaaatgtaagccagtctttgtgtcaagaagatgactatgaagatgataagcctaccaattatagtgaacgttactctgaagaagaacagcatgaagaagaagagagaccaacaaattatagcataaaatataatgaagagaaacgtcatgtggatcagcctattgattatagtttaaaatatgccacagatattccttcatcacagaaacagtcattttcattctcaaagagttcatctggacaaagcagtaaaaccgaacatatgtcttcaagcagtgagaatacgtccacaccttcatctaatgccaagaggcagaatcagctccatccaagttctgcacagagtagaagtggtcagcctcaaaaggctgccacttgcaaagtttcttctattaaccaagaaacaatacagacttattgtgtagaagatactccaatatgtttttcaagatgtagttcattatcatctttgtcatcagctgaagatgaaataggatgtaatcagacgacacaggaagcagattctgctaataccctgcaaatagcagaaataaaagaaaagattggaactaggtcagctgaagatcctgtgagcgaagttccagcagtgtcacagcaccctagaaccaaatccagcagactgcagggttctagtttatcttcagaatcagccaggcacaaagctgttgaattttcttcaggagcgaaatctccctccaaaagtggtgctcagacacccaaaagtccacctgaacactatgttcaggagaccccactcatgtttagcagatgtacttctgtcagttcacttgatagttttgagagtcgttcgattgccagctccgttcagagtgaaccatgcagtggaatggtaagtggcattataagccccagtgatcttccagatagccctggacaaaccatgccaccaagcagaagtaaaacacctccaccacctcctcaaacagctcaaaccaagcgagaagtacctaaaaataaagcacctactgctgaaaagagagagagtggacctaagcaagctgcagtaaatgctgcagttcagagggtccaggttcttccagatgctgatactttattacattttgccacggaaagtactccagatggattttcttgttcatccagcctgagtgctctgagcctcgatgagccatttatacagaaagatgtggaattaagaataatgcctccagttcaggaaaatgacaatgggaatgaaacagaatcagagcagcctaaagaatcaaatgaaaaccaagagaaagaggcagaaaaaactattgattctgaaaaggacctattagatgattcagatgatgatgatattgaaatactagaagaatgtattatttctgccatgccaacaaagtcatcacgtaaagcaaaaaagccagcccagactgcttcaaaattacctccacctgtggcaaggaaaccaagtcagctgcctgtgtacaaacttctaccatcacaaaacaggttgcaaccccaaaagcatgttagttttacaccgggggatgatatgccacgggtgtattgtgttgaagggacacctataaacttttccacagctacatctctaagtgatctaacaatcgaatcccctccaaatgagttagctgctggagaaggagttagaggaggggcacagtcaggtgaatttgaaaaacgagataccattcctacagaaggcagaagtacagatgaggctcaaggaggaaaaacctcatctgtaaccatacctgaattggatgacaataaagcagaggaaggtgatattcttgcagaatgcattaattctgctatgcccaaagggaaaagtcacaagcctttccgtgtgaaaaagataatggaccaggtccagcaagcatctgcgtcttcttctgcacccaacaaaaatcagttagatggtaagaaaaagaaaccaacttcaccagtaaaacctataccacaaaatactgaatataggacacgtgtaagaaaaaatgcagactcaaaaaataatttaaatgctgagagagttttctcagacaacaaagattcaaagaaacagaatttgaaaaataattccaaggtcttcaatgataagctcccaaataatgaagatagagtcagaggaagttttgcttttgattcacctcatcattacacgcctattgaaggaactccttactgtttttcacgaaatgattctttgagttctctagattttgatgatgatgatgttgacctttccagggaaaaggctgaattaagaaaggcaaaagaaaataaggaatcagaggctaaagttaccagccacacagaactaacctccaaccaacaatcagctaataagacacaagctattgcaaagcagccaataaatcgaggtcagcctaaacccatacttcagaaacaatccacttttccccagtcatccaaagacataccagacagaggggcagcaactgatgaaaagttacagaattttgctattgaaaatactccggtttgcttttctcataattcctctctgagttctctcagtgacattgaccaagaaaacaacaataaagaaaatgaacctatcaaagagactgagccccctgactcacagggagaaccaagtaaacctcaagcatcaggctatgctcctaaatcatttcatgttgaagataccccagtttgtttctcaagaaacagttctctcagttctcttagtattgactctgaagatgacctgttgcaggaatgtataagctccgcaatgccaaaaaagaaaaagccttcaagactcaagggtgataatgaaaaacatagtcccagaaatatgggtggcatattaggtgaagatctgacacttgatttgaaagatatacagagaccagattcagaacatggtctatcccctgattcagaaaattttgattggaaagctattcaggaaggtgcaaattccatagtaagtagtttacatcaagctgctgctgctgcatgtttatctagacaagcttcgtctgattcagattccatcctttccctgaaatcaggaatctctctgggatcaccatttcatcttacacctgatcaagaagaaaaaccctttacaagtaataaaggcccacgaattctaaaaccaggggagaaaagtacattggaaactaaaaagatagaatctgaaagtaaaggaatcaaaggaggaaaaaaagtttataaaagtttgattac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由于，如上所述，已知多种apc基因和相应突变的序列，本领域普通技术人员可适当地选择引物对以扩增这些dna突变中的一种或多种的基因座。影响引物设计的各种因素是已知的，并且用于鉴定适合于扩增给定dna模板序列的引物对的工具是可获得的(参见，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)。在一些实施方案中，用于扩增apc突变(例如，编码或导致上文所述的突变的apc蛋白)的基因座的引物对分别包含序列taaaaataaagcacctactgctgaaa(seqidno:23)和agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)(对于s1465基因座)；分别包含taggatgtaatcagacgacacagga(seqidno:27)和cagctgacctagttccaatctttta(seqidno:28)(对于e1309基因座)；分别包含tctccctccaaaagtggtgct(seqidno:31)和tggcaatcgaacgactctcaa(seqidno:32)(对于q1367基因座)；分别包含gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)(对于r1450基因座)；或分别包含caggaaaatgacaatgggaatg(seqidno:39)和atctaataggtccttttcagaatcaatag(seqidno:40)(对于t1556基因座)。在一些实施方案中，5个引物对用于pcr：包含序列taaaaataaagcacctactgctgaaa(seqidno:23)和agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)的第一引物对；包含序列taggatgtaatcagacgacacagga(seqidno:27)和cagctgacctagttccaatctttta(seqidno:28)的第二引物对；包含序列tctccctccaaaagtggtgct(seqidno:31)和tggcaatcgaacgactctcaa(seqidno:32)的第三引物对；包含序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)的第四引物对；以及包含序列caggaaaatgacaatgggaatg(seqidno:39)和atctaataggtccttttcagaatcaatag(seqidno:40)的第五引物对。在一些实施方案中，用于扩增一种或多种apc突变(例如，编码或导致上文所述的一个或多个突变的apc蛋白)的基因座的引物对包含序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)。
在一些实施方案中，本公开的引物对包含一个或多个经修饰的核苷酸，例如锁核酸(如下文中更详细描述的)。例如，在一些实施方案中，用于扩增apc突变(例如，编码或导致上文所述的突变的apc蛋白)的基因座的引物对包含序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，用于扩增apc突变(例如，编码或导致上文所述的突变的apc蛋白)的基因座的引物对包含序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)，其中加以下划线的核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，5个引物对用于pcr以扩增apc基因的基因座：包含序列taaaaataaagcacctactgctgaaa(seqidno:23)和agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)的第一引物对；包含序列taggatgtaatcagacgacacagga(seqidno:27)和cagctgacctagttccaatctttta(seqidno:28)的第二引物对；包含序列tctccctccaaaagtggtgct(seqidno:31)和tggcaatcgaacgactctcaa(seqidno:32)的第三引物对；包含序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)的第四引物对，其中斜体核酸表示锁核酸；以及包含序列caggaaaatgacaatgggaatg(seqidno:39)和atctaataggtccttttcagaatcaatag(seqidno:40)的第五引物对。在一些实施方案中，5个引物对用于pcr以扩增apc基因的基因座：包含序列taaaaataaagcacctactgctgaaa(seqidno:23)和agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)的第一引物对；包含序列taggatgtaatcagacgacacagga(seqidno:27)和cagctgacctagttccaatctttta(seqidno:28)的第二引物对；包含序列tctccctccaaaagtggtgct(seqidno:31)和tggcaatcgaacgactctcaa(seqidno:32)的第三引物对；包含序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)的第四引物对，其中加以下划线的核酸表示锁核酸；以及包含序列caggaaaatgacaatgggaatg(seqidno:39)和atctaataggtccttttcagaatcaatag(seqidno:40)的第五引物对。
本公开的多重测定包括检测上述突变中的两种或更多种的组合。例如，在一些实施方案中，本公开的方法包括扩增kras基因中一个或多个突变的基因座、braf中一个或多个突变的基因座、ctnnb1基因中一个或多个突变的基因座以及apc基因中一个或多个突变的基因座。在某些实施方案中，本公开的方法包括扩增编码g12d、g12v、g12s或g13d突变的kras蛋白的突变的基因座；编码v600e突变的braf蛋白的突变的基因座；编码t41a或t41i突变的ctnnb1蛋白的突变的基因座和/或编码s45f或s45p突变的ctnnb1蛋白的突变的基因座；以及以下基因座中的一个或多个基因座：编码q1367*突变的apc蛋白的突变的基因座、编码r1450*突变的apc蛋白的突变的基因座、编码e1309遗码突变的apc蛋白的突变的基因座、编码s1465遗码突变的apc蛋白的突变的基因座以及编码t1556遗码突变的apc蛋白的突变的基因座。在某些实施方案中，本公开的方法包括扩增编码g12d、g12v、g12s和g13d突变的kras蛋白的突变的基因座；编码v600e突变的braf蛋白的突变的基因座；编码t41a或t41i突变的ctnnb1蛋白的突变的基因座和/或编码s45f或s45p突变的ctnnb1蛋白的突变的基因座；以及编码q1367*突变的apc蛋白的突变的基因座、编码r1450*突变的apc蛋白的突变的基因座、编码e1309遗码突变的apc蛋白的突变的基因座、编码s1465遗码突变的apc蛋白的突变的基因座和编码t1556遗码突变的apc蛋白的突变的基因座。
阻断核酸
在一些实施方案中，本公开的方法包括在一种或多种阻断核酸(例如，对应于每种目标dna突变的阻断核酸)存在的情况下通过pcr扩增分离的dna。有利地，阻断核酸阻止野生型dna基因座的扩增，从而增加检测dna突变的灵敏度(参见图15和图16)。在一些实施方案中，该方法包括在至少四种阻断核酸(其每一种与对应于kras、braf、ctnnb1或apc基因中的dna突变的野生型dna基因座杂交)存在的情况下通过pcr扩增分离的dna。
在一些实施方案中，本公开的阻断核酸包含：与相应的野生型dna基因座杂交的单链寡核苷酸，和阻断单链寡核苷酸延伸从而防止野生型dna基因座扩增的3'末端部分。在一些实施方案中，3'末端部分包含一个或多个反向脱氧胸苷(invdt)。在一些实施方案中，3'末端部分包含三个连续的反向脱氧胸苷。
在一些实施方案中，本公开的阻断核酸包含一种或多种经修饰的核苷酸。设想了在一些或所有序列位置包含经修饰的核苷酸的寡核苷酸，并且所述寡核苷酸可具有改进的杂交特性，特别有利于在pcr期间用作阻断核酸。例如，已知使用锁核酸(lna)部分或完全合成的寡核苷酸比仅用常规核苷酸合成的相应寡核苷酸具有更高的热稳定性，从而提高寡核苷酸:lna双链体的解链温度并允许更短的序列在热循环过程中保持稳定的杂交。见koshkin,a.a.等(1998)tetrahedron54:3607-30。已知多种经修饰的核苷酸，其包括但不限于锁核酸(lna)、肽核酸(pna)、己糖核酸(hna)、苏糖核酸(tna)、二醇核酸(gna)和环己烯基核酸(cena)。关于示例性经修饰的核苷酸的更详细描述，参见，例如，schmidt,m.(2010)bioessays32:322-31。
在一些实施方案中，本公开的阻断核酸与对应于编码g12d、g12v、g12s或g13d突变的kras蛋白的一个或多个dna突变的基因座的野生型kras基因座杂交。在一些实施方案中，阻断核酸包含序列tacgccaccagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:3)；ttggagctggtggcgta(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:142)，gctggtggcgtaggca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:143)，gctggtggcgtaggc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:144)或ttggagctggtggcgt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:145)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，在某些实施方案中，阻断核酸包含序列tacgccaccagctinvdtinvdtinvdt(seqidno:3)、ttggagctggtggcgtainvdtinvdtinvdt(seqidno:142)、gctggtggcgtaggcainvdtinvdtinvdt(seqidno:143)、gctggtggcgtaggcinvdtinvdtinvdt(seqidno:144)或ttggagctggtggcgtinvdtinvdtinvdt(seqidno:145)，其中斜体核酸表示锁核酸。在某些实施方案中，阻断核酸包含序列tacgccaccagctinvdtinvdtinvdt(seqidno:3)、ttggagctggtggcgtainvdtinvdtinvdt(seqidno:142)、gctggtggcgtaggcainvdtinvdtinvdt(seqidno:143)、gctggtggcgtaggcinvdtinvdtinvdt(seqidno:144)或ttggagctggtggcgtinvdtinvdtinvdt(seqidno:145)，其中加以下划线的核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:3或142-145的序列，但任选地包括不同模式或类型的一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:3或142-145的序列但包括不同的3’末端部分。
在一些实施方案中，本公开的阻断核酸与对应于编码v600e突变的braf蛋白的一个或多个dna突变的基因座的野生型braf基因座杂交。在一些实施方案中，阻断核酸包含序列gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:10)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:146)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:147)；gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:148)或gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:149)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，在某些实施方案中，阻断核酸包含序列gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:10)、gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:146)、gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:147)、gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:148)或gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:149)，其中斜体核酸表示锁核酸。在某些实施方案中，阻断核酸包含序列gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:10)、gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:146)、gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:147)、gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:148)或gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:149)，其中加以下划线的核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:10或146-149的序列但任选地包括不同模式或类型的一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:10或146-149的序列但包括不同的3'末端部分。
在一些实施方案中，本公开的阻断核酸与对应于t41a或t41i突变的ctnnb1蛋白的一个或多个突变的基因座的野生型ctnnb1基因座杂交。在一些实施方案中，阻断核酸包含序列gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:15)；tgccactaccacag(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:150)；cactaccacagctcc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:151)；gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:152)或gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:153)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，在某些实施方案中，阻断核酸包含序列gccactaccacagctinvdtinvdtinvdt(seqidno:15)、tgccactaccacaginvdtinvdtinvdt(seqidno:150)、cactaccacagctccinvdtinvdtinvdt(seqidno:151)、gccactaccacagctinvdtinvdtinvdt(seqidno:152)或gccactaccacagctinvdtinvdtinvdt(seqidno:153)，其中斜体核酸表示锁核酸。在某些实施方案中，阻断核酸包含序列gccactaccacagctinvdtinvdtinvdt(seqidno:15)、tgccactaccacaginvdtinvdtinvdt(seqidno:150)、cactaccacagctccinvdtinvdtinvdt(seqidno:151)、gccactaccacagctinvdtinvdtinvdt(seqidno:152)或gccactaccacagctinvdtinvdtinvdt(seqidno:153)，其中加以下划线的核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:15或150-153的序列，但任选地包括不同模式或类型的一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:15或150-153的序列，但包括不同的3'末端部分。
在一些实施方案中，本公开的阻断核酸与对应于编码s45f或s45p突变的ctnnb1蛋白的一个或多个突变的基因座的野生型ctnnb1基因座杂交。在一些实施方案中，阻断核酸包含序列gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:20)；tccttctctgagtgg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:174)；gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:175)；tccttctctgagtgg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:176)或gctccttctctgagt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:177)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，在某些实施方案中，阻断核酸包含序列gctccttctctgagtinvdtinvdtinvdt(seqidno:20)、tccttctctgagtgginvdtinvdtinvdt(seqidno:174)、gctccttctctgagtinvdtinvdtinvdt(seqidno:175)、tccttctctgagtgginvdtinvdtinvdt(seqidno:176)或gctccttctctgagtinvdtinvdtinvdt(seqidno:177)，其中斜体核酸表示锁核酸。在某些实施方案中，阻断核酸包含序列gctccttctctgagtinvdtinvdtinvdt(seqidno:20)、tccttctctgagtgginvdtinvdtinvdt(seqidno:174)、gctccttctctgagtinvdtinvdtinvdt(seqidno:175)、tccttctctgagtgginvdtinvdtinvdt(seqidno:176)或gctccttctctgagtinvdtinvdtinvdt(seqidno:177)，其中加以下划线的核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:20或174-177的序列，但任选地包括不同模式或类型的一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:20或174-177的序列，但包括不同的3'末端部分。
在一些实施方案中，本公开的阻断核酸与对应于编码q1367*突变的apc蛋白的一个或多个突变的基因座的野生型apc基因座杂交。在一些实施方案中，阻断核酸包含序列gtgctcagacacc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:33)；gtgctcagacacc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:158)；agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:159)；agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:160)或agtggtgctcagacaccca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:161)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，在某些实施方案中，阻断核酸包含序列gtgctcagacaccinvdtinvdtinvdt(seqidno:33)、gtgctcagacaccinvdtinvdtinvdt(seqidno:158)、agtggtgctcagacacccainvdtinvdtinvdt(seqidno:159)、agtggtgctcagacacccainvdtinvdtinvdt(seqidno:160)或agtggtgctcagacacccainvdtinvdtinvdt(seqidno:161)，其中斜体核酸表示锁核酸。在某些实施方案中，阻断核酸包含序列gtgctcagacaccinvdtinvdtinvdt(seqidno:33)、gtgctcagacaccinvdtinvdtinvdt(seqidno:158)、agtggtgctcagacacccainvdtinvdtinvdt(seqidno:159)、agtggtgctcagacacccainvdtinvdtinvdt(seqidno:160)或agtggtgctcagacacccainvdtinvdtinvdt(seqidno:161)，其中加以下划线的核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:33或158-161的序列，但任选地包括不同模式或类型的一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:33或158-161的序列，但包括不同的3’末端部分。
在一些实施方案中，本公开的阻断核酸与对应于编码r1450*突变的apc蛋白的一个或多个突变的基因座的野生型apc基因座杂交。在一些实施方案中，阻断核酸包含序列cttctcgcttggtt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:37)；gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:162)；cttctcgcttggtt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:163)；gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:164)或gtacttctcgcttggt(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:165)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，在某些实施方案中，阻断核酸包含序列cttctcgcttggttinvdtinvdtinvdt(seqidno:37)、gtacttctcgcttggtinvdtinvdtinvdt(seqidno:162)、cttctcgcttggttinvdtinvdtinvdt(seqidno:163)、gtacttctcgcttggtinvdtinvdtinvdt(seqidno:164)或gtacttctcgcttggtinvdtinvdtinvdt(seqidno:165)，其中斜体核酸表示锁核酸。在某些实施方案中，阻断核酸包含序列cttctcgcttggttinvdtinvdtinvdt(seqidno:37)、gtacttctcgcttggtinvdtinvdtinvdt(seqidno:162)、cttctcgcttggttinvdtinvdtinvdt(seqidno:163)、gtacttctcgcttggtinvdtinvdtinvdt(seqidno:164)或gtacttctcgcttggtinvdtinvdtinvdt(seqidno:165)，其中加以下划线的核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:37或162-165的序列，但任选地包括不同模式或类型的一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:37或162-165的序列，但包括不同的3’末端部分。
在一些实施方案中，本公开的阻断核酸与对应于编码e1309遗码突变的apc蛋白的一个或多个突变的基因座的野生型apc基因座杂交。在一些实施方案中，阻断核酸包含序列cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:29)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:154)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:155)；cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:156)或cttttcttttatttctgc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:157)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，在某些实施方案中，阻断核酸包含序列cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:29)、cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:154)、cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:155)、cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:156)或cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:157)，其中斜体核酸表示锁核酸。在某些实施方案中，阻断核酸包含序列cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:29)、cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:154)、cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:155)、cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:156)或cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:157)，其中加以下划线的核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:29或154-157的序列，但任选地包括不同模式或类型的一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:29或154-157的序列，但包括不同的3'末端部分。
在一些实施方案中，本公开的阻断核酸与对应于编码s1465遗码突变的apc蛋白的一个或多个突变的基因座的野生型apc基因座杂交。在一些实施方案中，阻断核酸包含序列ccactctctctcttttcagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:25)；taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:166)；taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:167)；ccactctctctcttttcagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:168)或taggtccactctctctcttttcagca(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:169)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，在某些实施方案中，阻断核酸包含序列ccactctctctcttttcagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:25)、taggtccactctctctcttttcagcainvdtinvdtinvdt(seqidno:166)、taggtccactctctctcttttcagcainvdtinvdtinvdt(seqidno:167)、ccactctctctcttttcagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:168)或taggtccactctctctcttttcagcainvdtinvdtinvdt(seqidno:169)，其中斜体核酸表示锁核酸。在某些实施方案中，阻断核酸包含序列ccactctctctcttttcagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:25)、taggtccactctctctcttttcagcainvdtinvdtinvdt(seqidno:166)、taggtccactctctctcttttcagcainvdtinvdtinvdt(seqidno:167)、ccactctctctcttttcagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:168)或taggtccactctctctcttttcagcainvdtinvdtinvdt(seqidno:169)，其中加以下划线的核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:25或166-169的序列，但任选地包括不同模式或类型的一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:25或166-169的序列，但包括不同的3'末端部分。
在一些实施方案中，本公开的阻断核酸与对应于编码t1556遗码突变的apc蛋白的一个或多个突变的基因座的野生型apc基因座杂交。在一些实施方案中，阻断核酸包含序列caatagttttttctgcc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:41)；gaatcaatagttttttctgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:170)；tcagaatcaatagttttttctg(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:171)；gaatcaatagattttactgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:172)或aatcaatagttttttctgcctc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:173)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，在某些实施方案中，阻断核酸包含序列caatagttttttctgccinvdtinvdtinvdt(seqidno:41)、gaatcaatagttttttctgcctcinvdtinvdtinvdt(seqidno:170)、tcagaatcaatagttttttctginvdtinvdtinvdt(seqidno:171)、gaatcaatagattttactgcctcinvdtinvdtinvdt(seqidno:172)或aatcaatagttttttctgcctcinvdtinvdtinvdt(seqidno:173)，其中斜体核酸表示锁核酸。在某些实施方案中，阻断核酸包含序列caatagttttttctgccinvdtinvdtinvdt(seqidno:41)、gaatcaatagttttttctgcctcinvdtinvdtinvdt(seqidno:170)、tcagaatcaatagttttttctginvdtinvdtinvdt(seqidno:171)、gaatcaatagattttactgcctcinvdtinvdtinvdt(seqidno:172)或aatcaatagttttttctgcctcinvdtinvdtinvdt(seqidno:173)，其中加以下划线的核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:41或170-173的序列，但任选地包括不同模式或类型的一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，阻断核酸包含seqidno:41或170-173的序列，但包括不同的3’末端部分。
杂交
在一些实施方案中，本公开的方法包括将扩增的dna与一种或多种对本公开的dna突变(例如，如上上所述的kras、braf、ctnnb1或apc基因中的dna突变)具有特异性的探针杂交。在一些实施方案中，所述方法包括使扩增的dna与至少四种探针杂交，所述探针包括对kras、braf、ctnnb1和apc基因中的每一种基因中的dna突变具有特异性的一种或多种探针(例如，代表每种基因中的突变的一种或多种探针)。如本文中所用，探针可以指能够与目标dna突变的基因座的至少一部分杂交的寡核苷酸。例如，探针可包括能够与包含目标dna突变的单链dna模板的大多数或所有碱基对碱基配对的单链寡核苷酸。对于dna突变的特异性检测，探针能够与携带dna突变的基因座杂交，但不能与相应野生型基因座杂交(参见图15和16)。适合探针与扩增的dna杂交的条件是本领域已知的(例如，如本文引用的材料中所引用的)并且在下文中举例说明。
在一些实施方案中，本公开的探针偶联至本公开的编码微载体，例如，如部分iv中所述的。用于将多核苷酸探针偶联至微载体表面的示例性方法是本领域已知的并且提供于部分iv中。对于多重测定，每种类型的探针可以偶联至具有对应于探针类型的特定标识符的微载体。有利地，这允许用户将从探针检测到的信号与探针的身份相关联，从而使得能够实现其中使用多种探针的多重测定。在一些实施方案中，本公开的探针包含5'修饰，例如5'氨基修饰物c6。
在一些实施方案中，本公开的探针包含(1)与目标dna突变的基因座的至少一部分杂交的序列；和(2)一种或多种另外的核苷酸。可使用所述一种或多种另外的核苷酸，例如，将探针偶联至微载体表面和/或提供间隔以减少杂交过程中微载体表面与扩增的dna之间的空间位阻。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的核苷酸位于探针序列的5'末端处。在其它实施方案中，所述一个或多个另外的核苷酸位于探针序列的3'末端。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的核苷酸是腺嘌呤或胸腺嘧啶核苷酸。有利地，这降低了非特异性结合的亲和力。在一些实施方案中，本公开的探针在5'末端处包含1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或8个或更多个腺嘌呤或胸腺嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，本公开的探针包含至少20个、至少24个、至少25个或至少30个总核苷酸。
以下提供示例性探针序列。本领域普通技术人员可使用公知的技术容易地选择适合与扩增的目标dna序列(例如，包含目标dna突变的基因座)杂交的多种探针序列。
在一些实施方案中，对kras基因中的dna突变具有特异性的探针包含序列ggagctgatgg(seqidno:4)、agctgatggcgta(seqidno:178)、tggagctgatggcg(seqidno:179)、tggagctgatgg(seqidno:180)、gctgatggcgta(seqidno:181)、ggagctgttgg(seqidno:5)、tggagctgttggtggc(seqidno:182)、ggagctgttggtg(seqidno:183)、tggagctgttggt(seqidno:184)、tggagctgtaggtgg(seqidno:185)、tggagctagtgg(seqidno:6)、ttggagctagtggcgta(seqidno:186)、gctagtggcgtaggc(seqidno:187)、agctagtggcgt(seqidno:188)、gttggagctagtgg(seqidno:189)、ggagctagtgg(seqidno:190)或tggagctggtgacgt(seqidno:7)。例如，包含以下序列的探针可用于检测编码g12d突变的kras蛋白的突变：ggagctgatgg(seqidno:4)、agctgatggcgta(seqidno:178)、tggagctgatggcg(seqidno:179)、tggagctgatgg(seqidno:180)或gctgatggcgta(seqidno:181)；包含以下序列的探针可用于检测编码g12v突变的kras蛋白的突变：ggagctgttgg(seqidno:5)、tggagctgttggtggc(seqidno:182)、ggagctgttggtg(seqidno:183)、tggagctgttggt(seqidno:184)或tggagctgtaggtgg(seqidno:185)；包含以下序列的探针可用于检测编码g12s突变的kras蛋白的突变：tggagctagtgg(seqidno:6)、ttggagctagtggcgta(seqidno:186)、gctagtggcgtaggc(seqidno:187)、agctagtggcgt(seqidno:188)、gttggagctagtgg(seqidno:189)或ggagctagtgg(seqidno:190)；和/或包含以下序列的探针可用于检测编码g13d突变的kras蛋白的突变：tggagctggtgacgt(seqidno:7)、ggtgacgtaggcaa(seqidno:191)、tgacgtaggcaagag(seqidno:192)、gctggtgacgtagg(seqidno:193)、agctggtgacgtag(seqidno:194)或ggagctggtgacgt(seqidno:195)。如上文中所述，在一些实施方案中，一种或多种本公开的探针可在其5'末端处包含8个或更多个核苷酸(例如，腺嘌呤或胸腺嘧啶)。在某些实施方案中，包含以下序列的探针可用于检测编码g12d突变的kras蛋白的突变：ttttttttttttaaggagctgatgg(seqidno:47)、ttttttttttttagctgatggcgta(seqidno:74)、ttttttttttatggagctgatggcg(seqidno:75)、ttttttttttttatggagctgatgg(seqidno:76)或tttttttttttttgctgatggcgta(seqidno:77)。在某些实施方案中，包含以下序列的探针可用于检测编码g12v突变的kras蛋白的突变：ttttttttttttaaggagctgttgg(seqidno:48)、ttttttttatggagctgttggtggc(seqidno:78)、ttttttttttaaggagctgttggtg(seqidno:79)、tttttttttttatggagctgttggt(seqidno:80)或tttttttttatggagctgtaggtgg(seqidno:81)。在某些实施方案中，包含以下序列的探针可用于检测编码g12s突变的kras蛋白的突变：tttttttttttatggagctagtgg(seqidno:49)、ttttttttttggagctagtggcgta(seqidno:82)、tttttaatttgctagtggcgtaggc(seqidno:83)、tttttttttatttagctagtggcgt(seqidno:84)、tttttttttttgttggagctagtgg(seqidno:85)或ttttttttttttaaggagctagtgg(seqidno:86)。在某些实施方案中，包含以下序列的探针可用于检测编码g13d突变的kras蛋白的突变：tttttttttatggagctggtgacgt(seqidno:50)、ttttttttaaaggtgacgtaggcaa(seqidno:87)、tttttttttatgacgtaggcaagag(seqidno:88)、tttttttttttgctggtgacgtagg(seqidno:89)、ttttttttttaagctggtgacgtag(seqidno:90)或tttttttttaaggagctggtgacgt(seqidno:91)(还设想了包含这些不包含5'腺嘌呤和/或胸腺嘧啶的序列的探针)。
在一些实施方案中，对braf基因中的dna突变具有特异性的探针包含序列tctagctacagagaaat(seqidno:11)或gtctagctacagaaaaat(seqidno:12)。例如包含以下序列的探针可用于检测v600e突变的braf蛋白中的突变(例如，c.1799t>adna突变)：tctagctacagagaaat(seqidno:11)、tacagagaaatctcgat(seqidno:196)、tacagagaaatctc(seqidno:197)、ctagctacagagaaat(seqidno:198)、ctagctacagagaaa(seqidno:199)或tctagctacagag(seqidno:200)，和/或包含序列gtctagctacagaaaaat(seqidno:12)的探针可用于检测编码v600e突变的braf蛋白的突变(例如，c.1799_1800tg>aadna突变)。如上所述，在一些实施方案中，本公开的一种或多种探针可在其5'末端处包含8个或更多个核苷酸(例如，腺嘌呤或胸腺嘧啶)和/或包含至少24个总核苷酸。在某些实施方案中，包含以下序列的探针可用于检测编码v600e突变的braf蛋白的突变(例如，c.1799t>adna突变)：ttttttaatttctagctacagagaaat(seqidno:51)、tttttttttatacagagaaatctcgat(seqidno:92)、tttttttttaatttacagagaaatctc(seqidno:93)、ttttttaattactagctacagagaaat(seqidno:94)、tttttttaattactagctacagagaaa(seqidno:95)或ttttttttttaatttctagctacagag(seqidno:96)，和/或包含以下序列的探针可用于检测编码v600e突变的braf蛋白的突变(例如，c.1799_1800tg>aadna突变)：tttttttatgtctagctacagaaaaat(seqidno:52)、ttttatgtctagctacagaaaaatc(seqidno:97)、ttttttttatttttagctacagaaaaa(seqidno:98)、tttttttatttctagctacagaaaaat(seqidno:99)或ttttttttattctagctacagaaaaatc(seqidno:100)(还设想了包含这些不包含5'腺嘌呤和/或胸腺嘧啶的序列的探针)。
在一些实施方案中，对ctnnb1基因中的dna突变具有特异性的探针包含序列aggagctgtggcag(seqidno:16)、ggagctgtgata(seqidno:17)、tttaccactcagaaaag(seqidno:21)、taccactcagaggag(seqidno:22)、aggagctgtggcagt(seqidno:205)、aggagctgtggcagtg(seqidno:206)、gctgtggcagtggc(seqidno:207)、gctgtggcagtggca(seqidno:208)、aaggagctgtggcag(seqidno:209)、ggagctgtgatagtgg(seqidno:210)、gagctgtgatagtggc(seqidno:211)、agctgtgatagtggca(seqidno:212)、agaaggagctgtgata(seqidno:213)、ggagctgtgat(seqidno:214)、actcagaaaaggagct(seqidno:215)、taccactcagaaaagga(seqidno:216)、tttaccactcagaaaaggag(seqidno:217)、ttaccactcagaaaag(seqidno:218)、cagaaaaggagctgtg(seqidno:219)、actcagaggaggagc(seqidno:220)、ttaccactcagagga(seqidno:221)、ttaccactcagaggagg(seqidno:222)、ttaacactcagaggag(seqidno:223)或ttaccaatcagaggagg(seqidno:224)。例如，包含以下序列的探针可用于检测编码t41a突变的ctnnb1蛋白的突变：aggagctgtggcag(seqidno:16)、aggagctgtggcagt(seqidno:205)、aggagctgtggcagtg(seqidno:206)、gctgtggcagtggc(seqidno:207)、gctgtggcagtggca(seqidno:208)或aaggagctgtggcag(seqidno:209)；包含以下序列的探针可用于检测编码t41i突变的ctnnb1蛋白的突变：ggagctgtgata(seqidno:17)、ggagctgtgatagtgg(seqidno:210)、gagctgtgatagtggc(seqidno:211)、agctgtgatagtggca(seqidno:212)、agaaggagctgtgata(seqidno:213)或ggagctgtgat(seqidno:214)；包含以下序列的探针可用于检测编码s45f突变的ctnnb1蛋白的突变：tttaccactcagaaaag(seqidno:21)、actcagaaaaggagct(seqidno:215)、taccactcagaaaagga(seqidno:216)、tttaccactcagaaaaggag(seqidno:217)、ttaccactcagaaaag(seqidno:218)或cagaaaaggagctgtg(seqidno:219；和/或包含以下序列的探针可用于检测编码s45p突变的ctnnb1蛋白的突变：taccactcagaggag(seqidno:22)、actcagaggaggagc(seqidno:220)、ttaccactcagagga(seqidno:221)、ttaccactcagaggagg(seqidno:222)、ttaacactcagaggag(seqidno:223)或ttaccaatcagaggagg(seqidno:224)。如上所述，在一些实施方案中，本公开的一种或多种探针可在其5'末端处包含8个或更多个核苷酸(例如，腺嘌呤或胸腺嘧啶)和/或包含至少24个总核苷酸。在某些实施方案中，包含以下序列的探针可用于检测编码t41a突变的ctnnb1蛋白的突变：tttttttttttaggagctgtggcag(seqidno:53)、tttttttttttaggagctgtggcagtg(seqidno:101)、tttttttttttagctgtggcagtggc(seqidno:102)、tttttttttttgctgtggcagtggca(seqidno:103)或ttttttttttaaggagctgtggcag(seqidno:104)；包含以下序列的探针可用于检测编码t41i突变的ctnnb1蛋白的突变：tttttttttttttggagctgtgata(seqidno:54)、tttttttttggagctgtgatagtgg(seqidno:105)、tttttttttgagctgtgatagtggc(seqidno:106)、tttttttttagctgtgatagtggca(seqidno:107)、tttttttttagaaggagctgtgata(seqidno:108)或ttttttttttttttggagctgtgat(seqidno:109)；包含以下序列的探针可用于检测编码s45f突变的ctnnb1蛋白的突变：tttttttttttaccactcagaaaag(seqidno:55)、tttaattttactcagaaaaggagct(seqidno:110)、ttttttaataccactcagaaaagga(seqidno:111)、ttttttttaccactcagaaaaggag(seqidno:112)、ttttttttattaccactcagaaaag(seqidno:113)或tttttttttcagaaaaggagctgtg(seqidno:114)；和/或包含以下序列的探针可用于检测编码s45p突变的ctnnb1蛋白的突变：tttttttttaataccactcagaggag(seqidno:56)、tttttttttaaaactcagaggaggagc(seqidno:115)、tttttttttttattaccactcagagga(seqidno:116)、tttttttttattaccactcagaggagg(seqidno:117)、ttttttttttattaacactcagaggag(seqidno:118)或tttttttttattaccaatcagaggagg(seqidno:119)(还设想了包含这些不包含5'腺嘌呤和/或胸腺嘧啶的序列的探针)。
在一些实施方案中，对apc基因中的dna突变具有特异性的探针包含序列actgctgaaaagagagagt(seqidno:26)、gaaataaaagattgg(seqidno:30)、ttttgggtgtctaag(seqidno:34)、caaaccaagtgagaa(seqidno:38)、agaggcagaaaaaaact(seqidno:42)、aaatagcagaaataaaag(seqidno:225)、gaaataaaagattggaa(seqidno:226)、agaaataaaagattg(seqidno:227)、gaaataaatgaatgg(seqidno:228)、cagaaataaaagatt(seqidno:229)、tttgggtgtctaag(seqidno:230)、gggtgtctaagcaccact(seqidno:231)、ctaagcaccactttt(seqidno:232)、ttttgggtgtctaa(seqidno:233)、ggtgtctaagcacca(seqidno:234)、aagtgagaagtacctaa(seqidno:235)、tcaaaccaagtgag(seqidno:236)、accaagtgagaagta(seqidno:237)、agctcaaaccaagtgag(seqidno:238)、gcacctactgctgaa(seqidno:239)、acctactgctgaaaag(seqidno:240)、tgctgaaaagagagagt(seqidno:241)、cctactgctgaaaagaga(seqidno:242)、gcagaaaaaaactattg(seqidno:243)、cagaaaaaaactattgatt(seqidno:244)、agaaagaggcagaaaaaaact(seqidno:245)或gaggcagaaaaaaacta(seqidno:246)。例如，包含以下序列的探针可用于检测编码s1465遗码突变的apc蛋白的突变：actgctgaaaagagagagt(seqidno:26)、gcacctactgctgaa(seqidno:239)、acctactgctgaaaag(seqidno:240)、tgctgaaaagagagagt(seqidno:241)或cctactgctgaaaagaga(seqidno:242)；包含以下序列的探针可用于检测编码e1309遗码突变的apc蛋白的突变：gaaataaaagattgg(seqidno:30)、aaatagcagaaataaaag(seqidno:225)、gaaataaaagattggaa(seqidno:226)、agaaataaaagattg(seqidno:227)、gaaataaatgaatgg(seqidno:228)或cagaaataaaagatt(seqidno:229)；包含以下序列的探针可用于检测编码q1367*突变的apc蛋白的突变：ttttgggtgtctaag(seqidno:34)、tttgggtgtctaag(seqidno:230)、gggtgtctaagcaccact(seqidno:231)、ctaagcaccactttt(seqidno:232)、ttttgggtgtctaa(seqidno:233)或ggtgtctaagcacca(seqidno:234)；包含以下序列的探针可用于检测编码r1450*突变的apc蛋白的突变：caaaccaagtgagaa(seqidno:38)、aagtgagaagtacctaa(seqidno:235)、tcaaaccaagtgag(seqidno:236)、accaagtgagaagta(seqidno:237)或agctcaaaccaagtgag(seqidno:238)；和/或包含以下序列的探针可用于检测编码t1556遗码突变的apc蛋白的突变：gcagaaaaaaactattg(seqidno:243)、agaggcagaaaaaaact(seqidno:42)、cagaaaaaaactattgatt(seqidno:244)、agaaagaggcagaaaaaaact(seqidno:245)和gaggcagaaaaaaacta(seqidno:246)。如上所述，在一些实施方案中，本公开的一种或多种探针可在其5'末端处包含8个或更多个核苷酸(例如，腺嘌呤或胸腺嘧啶)和/或包含至少24个总核苷酸。在某些实施方案中，包含以下序列的探针可用于检测编码s1465遗码突变的apc蛋白的突变：ttttttttactgctgaaaagagagagt(seqidno:57)、ttttttttttgcacctactgctgaa(seqidno:134)、tttttttttacctactgctgaaaag(seqidno:135)、tttttttttgctgaaaagagagagt(seqidno:136)或tttttttttcctactgctgaaaagaga(seqidno:137)；包含以下序列的探针可用于检测编码e1309遗码突变的apc蛋白的突变：tttttttttttttgaaataaaagattgg(seqidno:58)、ttttttttttaaatagcagaaataaaag(seqidno:120)、tttttttttttgaaataaaagattggaa(seqidno:121)、tttttttttttttagaaataaaagattg(seqidno:122)、tttttttttttttgaaataaatgaatgg(seqidno:123)或tttttttttttttcagaaataaaagatt(seqidno:124)；包含以下序列的探针可用于检测编码q1367*突变的apc蛋白的突变：tttttttttttttgggtgtctaag(seqidno:59)、tttttttttatttgggtgtctaag(seqidno:125)、ttttttgggtgtctaagcaccact(seqidno:126)、tttttttttctaagcaccactttt(seqidno:127)、ttttttttttttttgggtgtctaa(seqidno:128)或tttttttttggtgtctaagcacca(seqidno:129)；包含以下序列的探针可用于检测编码r1450*突变的apc蛋白的突变：tttttttttacaaaccaagtgagaa(seqidno:60)、ttttttttaagtgagaagtacctaa(seqidno:130)、ttttttttttttcaaaccaagtgag(seqidno:131)、ttttttttttaccaagtgagaagta(seqidno:132)或ttttttttagctcaaaccaagtgag(seqidno:133)；和/或包含以下序列的探针可用于检测编码t1556遗码突变的apc蛋白的突变：ttttttttttagaggcagaaaaaaact(seqidno:61)、ttttttttttgcagaaaaaaactattg(seqidno:138)、tttttttttttcagaaaaaaactattgatt(seqidno:139)、tttttttagaaagaggcagaaaaaaact(seqidno:140)或tttttttttttgaggcagaaaaaaacta(seqidno:141)(还设想了包含这些不包含5'腺嘌呤和/或胸腺嘧啶的序列的探针)。
检测
在一些实施方案中，本公开的方法包括检测扩增的dna与本公开的探针是否存在杂交。扩增的dna与探针之一之间的杂交表明在扩增的dna中存在对应于探针的dna突变。本文描述和举例说明了示例性杂交条件和检测技术。在一些实施方案中，使用5xsspe缓冲液进行杂交。
在一些实施方案中，用检测试剂标记扩增的dna，并通过例如在洗涤步骤(以减少或消除非特异性结合)后与微载体缔合的检测试剂的信号测量杂交。在一些实施方案中，本公开的引物对包含与检测试剂偶联的一种或两种引物。因此，在使用一种或多种标记的引物pcr扩增后用检测试剂标记扩增的dna。在一些实施方案中，检测试剂可以是基于荧光的，包括但不限于藻红蛋白(pe)、蓝色荧光蛋白质、绿色荧光蛋白质、黄色荧光蛋白质、青色荧光蛋白质及其衍生物。
在其它实施方案中，检测试剂可以是基于放射性同位素的，包括但不限于用32p、33p、22na、36cl、2h、3h、35s和123i标记的分子。在其它实施方案中，检测试剂是基于光的，包括但不限于荧光素酶(例如基于化学发光的)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶及其衍生物。在一些实施方案中，可在与微载体组合物接触之前用检测试剂标记扩增的dna。在一些实施方案中，检测试剂在接近探针时发出信号，例如与
在一些实施方案中，检测试剂可以是荧光检测试剂。在一些实施方案中，通过荧光显微镜检测(例如，荧光显微镜或读板器)检测扩增的dna与探针是否存在杂交。在一些实施方案中，检测试剂可以是基于比色的。在一些实施方案中，检测试剂可以是基于发光的。在一些实施方案中，通过发光显微镜检测(例如，发光显微镜或读板器)检测扩增的dna与探针是否存在杂交。
在一些实施方案中，检测试剂包含标签或其它部分，所述标签或其它部分可通过添加与缀合至信号发射实体(例如，如上所述的)的第二试剂来检测。例如，在一些实施方案中，检测试剂包含生物素(例如，引物诸如反向或反义引物可在5'末端处用生物素标记)。因此，在一些实施方案中，检测杂交是否存在可包括，在杂交和任选的洗涤后，使一种或多种微载体与缀合至信号发射实体的第二试剂接触，并检测来自与所述一种或多种微载体缔合的信号发射实体的信号(例如，在任选的洗涤后)。例如，如果检测试剂包含生物素，则可使微载体与缀合至信号发射实体(诸如藻红蛋白(pe))的链霉亲和素接触，并且可检测来自信号发射实体的信号。
取决于特定的检测试剂，可使用多种技术来检测扩增的dna与探针的杂交。例如，如果检测试剂包含荧光检测试剂，则检测扩增的dna的杂交是否存在可包括对荧光检测试剂的荧光成像。
在一些实施方案中，检测可包括一个或多个洗涤步骤，例如，以减少污染物，去除与探针、dna和/或微载体表面等非特异性结合的任何物质。在一些实施方案中，磁分离步骤可用于洗涤含有本公开的磁性层或材料的微载体。在其它实施方案中，可使用本领域已知的其它分离步骤。
在一些实施方案中，本公开的方法包括检测扩增的dna与总共约1个至约1000个微载体/探针/测定的杂交是否存在。在一些实施方案中，本公开的方法包括检测扩增的dna与总共约1个至约1000个微载体/探针/测定板的孔的杂交是否存在。在一些实施方案中，本公开的方法包括检测扩增的dna与至少约50个微载体/探针/测定的杂交是否存在。在一些实施方案中，本公开的方法包括检测扩增的dna与至少约50个微载体/探针/测定板的孔的杂交是否存在。在一些实施方案中，本公开的微载体包含浓度为1μm的与其偶联的探针。
在一些实施方案中，本公开的方法包括检测编码微载体的标识符。例如，在一些实施方案中，可以获得并解码编码微载体的标识符的图像以鉴定微载体及其对应的探针。在一些实施方案中，一个或多个标识符检测步骤可以在一个或多个杂交检测步骤之后发生。在其它实施方案中，一个或多个标识符检测步骤可以在一个或多个杂交检测步骤之前发生。在其它实施方案中。一个或多个标识符检测步骤可以与一个或多个杂交检测步骤同时发生。在一些实施方案中，在一个或多个杂交检测步骤和一个或多个标识符检测步骤之后，本公开的方法进一步包括将检测到的微载体的标识符与检测到的扩增的dna与微载体的相应探针的杂交的存在或不存在相关联。
各种微载波编码方案描述于第iv节中。在一些实施方案中，检测编码微载体的标识符包括对微载体的数字条形码进行成像。在一个实施例中，编码微载体包含具有一系列交替的透光和不透明部分，具有相对宽度的条形码图像(例如，一系列代表“0”代码的窄狭缝和代表“1”代码的宽狭缝，或者反之亦然)的主体。当用光束照射微载体时，基于透射峰的“总强度”或来自狭缝的透射峰的“带宽”，数字条形码0或1可由线扫描相机、帧捕捉器(framegrabber)和数字信号处理器确定。在一个实施例中，具有一系列窄带和宽带的条形码图案为0和1提供了明确的信号和区分。狭缝在托盘(pallet)上的位置将确定哪个位是最低有效位(lsb)和最高有效位(msb)。将lsb放置得更靠近托盘的边缘以使其与在另一更长的末端处的msb相区别。
在一些实施方案中，检测编码微载体的标识符包括例如通过标识符的明视场成像来对微载体的标识符进行成像。
设想了各种解码技术。在一些实施方案中，使用鉴定标识符(例如，模拟编码的标识符)的模拟形状识别来检测标识符。在概念上，该解码可涉及例如对每一种微载体(例如，在溶液或样品中)的模拟代码进行成像，将每个图像与模拟代码库进行比较，并将每个图像与来自库的图像进行匹配，从而肯定地鉴定代码。任选地，如本文所述，当使用包括定向指示器(例如，不对称性)的微载体时，解码还可包括旋转每一个图像以与特定定向对准的步骤(例如，部分地基于定向指示器)。例如，如果定向指示器包括间隙，则可旋转图像直至间隙到达预定位置或定向(例如，图像的0°位置)。
各种形状识别软件、工具和方法在本领域中是已知的。此类api和工具的实例包括但不限于
本领域技术人员将理解，本文所述的方法和微载体可适用于各种成像装置，包括但不限于显微镜、读板器等。在一些实施方案中，解码标识符(例如，模拟代码)可包括通过使光穿过微载体的基本上透明的部分(例如，一个或多个基本上透明的聚合物层)和/或周围溶液。然后，光可能不能通过或以较低强度或其它可感知的差异通过微载体的基本上不透明的部分(例如，一个或多个基本上不透明的聚合物层)以生成对应于标识符的模拟编码光图案。也就是说，成像光的图案可以对应于微载体的基本上透明/基本上不透明的区域的图案，从而产生模拟代码标识符的图像。该成像可包括步骤，包括但不限于捕获图像、对图像进行阈值处理以及期望用以实现标识符的更准确、精确或稳健的成像的任何其它图像处理步骤。
任何类型的光学显微镜可以用于本公开的方法，包括但不限于以下中的一种或多种：明视野显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、微分干涉差(dic)显微镜、nomarski干涉差(nic)显微镜、nomarski，霍夫曼调制对比(hmc)显微镜或荧光显微镜。在某些实施方案中，可以使用明视野显微镜解码标识符，并且可以使用荧光显微术检测杂交。
在一些实施方案中，解码标识符还可包括使用模拟形状识别来使模拟编码的图像与模拟代码匹配。在一些实施方案中，可使图像与预定阈值内的模拟代码(例如，来自图像文件库的图像文件，其中每个图像文件对应于独特的二维形状/模拟代码)匹配，所述预定阈值，例如，使得容忍图像与示例性模拟代码图像之间的预定量的偏差或错配。这样的阈值可以凭经验确定，并且可自然地基于用于模拟代码的特定类型的二维形状以及该组潜在二维形状之间的变化程度。
在一些实施方案中，本公开的方法还包括使用具有对应于阳性或阴性对照的标识符的微载体。在一些实施方案中，本公开的方法包括使用对阳性对照dna序列具有特异性的引物对扩增阳性对照dna序列。阳性对照dna序列可以是可能存在于给定类型的所有样品中的任何序列，例如来自样品所获自的生物体的非突变或内源基因序列。阳性对照表明dna(例如，人dna)以足以检测的水平存在于样品中。与目标突变的dna序列一样，通过使用对阳性对照dna序列具有特异的引物对扩增阳性对照dna序列来检测阳性对照序列；使扩增的阳性对照基因序列与对阳性对照基因序列具有特异性的探针(对阳性对照基因序列具有特异性的探针偶联至具有对应于阳性对照的标识符的微载体)杂交；检测扩增的阳性对照dna序列与对阳性对照基因序列具有特异性的探针是否杂交；和检测具有对应于阳性对照的标识符的微载体的模拟代码。
在一些实施方案中，如下文所举例说明的，阳性对照dna序列包含人白细胞抗原(hla)基因的序列。超过150个hla基因的序列是已知的，包括但不限于hla-dra(参见ncbientrezgeneid号3122)、hla-drb1(参见ncbientrezgeneid号3123)、hla-a(参见ncbientrezgeneid号3105)、hla-b(参见ncbientrezgeneid号3106)、hla-c(参见ncbientrezgeneid号3107)、hla-dqb1(参见ncbientrezgeneid号3119)、hla-dpb1(参见ncbientrezgeneid号3115)、hla-e(参见ncbientrezgeneid号3133)、hla-dqa2(参见ncbientrezgeneid号3118)、hla-dpa1(参见ncbientrezgeneid号3113)、hla-g(参见ncbientrezgeneid号3135)、hla-drb5(参见ncbientrezgeneid号3127)、hla-f(参见ncbientrezgeneid号3134)和hla-doa(参见ncbientrezgeneid号3111)。关于其它hla基因的描述，参见shiina,t.等(2009)j.hum.genet.54:15-39。
在一些实施方案中，对阳性对照dna序列具有特异性的引物对包含序列tgagtgttacttcttcccacactc(seqidno:43)和attgcttttgcgcaatccct(seqidno:44)。在一些实施方案中，对阳性对照dna序列具有特异性的探针对包含序列ttttttttttttggagacggtctg(seqidno:45)。在一些实施方案中，对阳性对照dna序列具有特异性的引物对包含序列aatcccatcaccatcttcca(seqidno:71)和tggactccacgacgtactca(seqidno:72)。在一些实施方案中，对阳性对照基因序列具有特异性的探针对包含序列ctgtcttccactcactcc(seqidno:73)。
在一些实施方案中，本公开的方法包括检测扩增的dna与具有对应于阴性对照的标识符的微载体的杂交的不存在。例如，具有对应于阴性对照的标识符的微载体可包含不与扩增的dna杂交的探针。具有对应于阴性对照的标识符的微载体的使用提高了检测杂交存在或不存在的可靠性。在一些实施方案中，微载体包含含有序列aatataatatattat(seqidno:46)的探针。
下文中提供了适用于本公开的方法的微载体及其任选方面的示例性和非限制性描述。
iv.编码微载体
本文提供了适用于分析物检测例如多重分析物检测的编码微载体。本文设想、描述和举例说明了编码微载体的多种配置。如本文中所用，“编码的”微载体可以指具有标识符的微载体，所述标识符对应于与其偶联的探针的身份。这使得能够将使用微载体的测定的数据与探针的身份相关联，允许在单个多重测定中使用多种微载体，因为任何单种微载体的结果可以与其探针的身份相关联。下文描述标识符的示例性类型，包括数字条形码和模拟代码。
在一些方面，本公开的方法和试剂盒使用数字条形码标识符。例如，在一些实施方案中，编码微载体包括：第一光聚合物层；第二光聚合物层；和第一层与第二层之间的中间层。在一些实施方案中，中间层具有表示限定于其上的标识符的编码图案，其中所述中间层是部分地基本上透光的以及部分地基本上不透光的，表示对应于微载体的代码，其中微载体的最外表面包含光致抗蚀剂光聚合物，并且用对dna突变具有特异性的探针官能化所述光致抗蚀剂光聚合物，并且其中所述微载体具有与水大致相同的密度。示例性的微载体描述可见于例如美国专利第7,858,307号、第7,871,770号、第8,148,139号、第8,232,092号和第9,255,922号以及uspg公开第us2009/201504、2011/0007955和2012/0088691中。
在一个实施例中，本公开的数字编码微载体包括具有一系列交替的透光和不透明部分的主体，其具有类似于1d或2d条形码图像的相对位置、宽度和/或间隔(例如，形成二进制代码的一系列代表“0”代码的窄的狭缝(例如，宽度为约1至5微米)和代表“1”代码的宽狭缝(例如，宽度为约1至10微米)，或者反之亦然)。在一个实施方案中，将微载体的尺寸设计并配置成150×50×10μm或者比例更小，并且狭缝宽度为约2.5μm。这种微载体上的每个数字条形码可由多至14个狭缝(或位)组成，允许16,384个独特代码。在一个实施方案中，编码微载体的主体可被配置成具有至少两个相对几何形状和/或尺寸不同的正交横截面。另外，横截面的几何形状可以是对称或不对称和/或规则或不规则的形状。在一个实施方案中，编码微载体的最长正交轴小于1mm。在一个实施方案中，为编码微载体提供反射薄膜(例如，用金属薄膜电镀或涂覆编码微载体或提供金属薄膜的中间层)以提高用于解码的图像识别的对比度和光学效率。一个替代实施方案可通过适当地修改上述过程，将金属层包括作为夹在两个聚合物层之间的层。利用该实施方案，可使微载体的两个暴露的平面表面的表面状况相同，以提供类似的表面涂覆和固定条件。另一个实施方案是用聚合物或功能性分子(诸如本公开的探针)涂覆微载体；因此，整个微载体具有相同的分子固定条件。
在一些方面，本公开的方法和试剂盒使用模拟代码标识符。例如，在一些实施方案中，本公开的方法和试剂盒使用编码微载体，其包含：具有第一表面和第二表面的基本上透明的聚合物层，所述第一表面与所述第二表面彼此平行；基本上不透明的聚合物层，其中基本上不透明的聚合物层被固定至基本上透明的聚合物层的第一表面并包围基本上透明的聚合物层的中心部分，并且其中基本上不透明的聚合物层包含代表模拟代码的二维形状；和对dna突变具有特异性的本公开的探针，其中在基本上透明的聚合物层的至少中心部分中所述探针与与基本上透明的聚合物层的第一表面和第二表面的至少之一偶联。模拟代码代表标识符。因此，微载体包含至少两层(表示模拟代码标识符的二维形状主)：其中一层是基本上透明的，而其中另一层是基本上不透明的。
有利地，这些微载体可以采用各种二维形状，同时仍然保持均匀的整体形式(例如，基本上透明的聚合物层的周边)，以实现各方面的均匀性，包括例如整体尺寸、物理性质和/或溶液中的行为。这是有利的，例如，在不同种类的微载体之间允许更大的均匀性(即，所述微载体中的每一种具有由透明聚合物层提供的相同的周边形状)。这种类型的微载体及其方面的实例在图1a-5b中示出(参见，例如，图4b)。
图1a和1b显示示例性微载体100的两个视图。微载体100是直径为约50μm且厚度为10μm的圆盘。图1a提供观察盘的圆形面的微载体100的视图，而图1b显示与图1a中所示的表面垂直的微载体100的侧视图。显示了微载体100的两个组分。首先，基本上透明的聚合物层102提供微载体的主体。如上所述的，层102可以例如使用聚合物诸如su-8来产生。
基本上不透明的聚合物层104被固定至层102的表面。虽然图1b中所示的微载体100的横截面显示层104的不连续视图，但图1a中显示的视图示出了层104的形状类似于具有多个齿的圆形齿轮。这些齿轮齿的形状、数量、尺寸和间隔构成二维形状，并且齿轮齿的这些方面中的一个或多个方面可被修改，以便产生用于模拟编码的多个二维形状。有利地，层104的齿轮齿的外边缘适配在层102的周边内。这允许各种模拟代码，每个模拟代码代表一个种类的微载体的独特标识符，同时在多个种类的微载体间保持均匀的整体形状。换句话说，多个种类群体中的每一种微载体种类可具有不同的二维齿轮形状(即，模拟代码)，但每一种微载体将具有相同的周边，导致物理性质(例如，尺寸、形状、溶液中的行为等)的更大均匀性。如上所述，层104可以例如使用与染料混合的聚合物诸如su-8，或使用黑色基质抗蚀剂产生。
层104围绕层102的中心部分106。探针在层102的一个或两个表面(即，上/下表面)上偶联至至少中心部分106。有利地，这允许中心部分106成像而无任何由层104引起的干扰的可能性。
图1c和1d显示使用微载体100进行分析物检测的示例性测定。图1c显示微载体100可包含在至少中心部分106中耦合至一个或多个表面的探针108。使微载体100与含有扩增的dna110的溶液接触，所述扩增的dna110在接触微载体100之前已被变性，并与探针108杂交。如上所述，扩增的dna110耦合至检测试剂。在本实例中，检测试剂是生物素(例如，由使用生物素标记的引物扩增dna产生)。因此，扩增的dna110包括dna110a(例如，包含本文所述的突变的基因座)和生物素110b。图1c示出了单个微载体种类(即，微载体100)，其捕获扩增的dna110，但是在多重测定中使用多种微载体种类，每种种类具有识别特定dna突变的特定探针。
图1d示出了用于“读取”微载体100的示例性过程。该过程包括可以同时或分开完成的两个步骤。首先，检测探针108与扩增的dna110的杂交。在图1d所示的实例中，第二检测试剂114(例如，缀合至pe的链霉亲和素)通过生物素:链霉亲和素相互作用与扩增的dna110结合。未与被耦合至微载体100的探针杂交的扩增的dna可在检测之前被洗掉，使得仅检测到结合至微载体100的dna。第二检测试剂114的pe部分，当在pe的激发光谱内的波长下被光116激发时，发射光118(诸如，光子)。光118可以通过任何合适的检测手段诸如荧光显微镜、读板器等检测。
另外，读取微载体100的独特标识符。在图1d所示的实例中，光112用于照射包含微载体100的视野(在一些实施方案中，光112可具有与光116和118不同的波长)。当光112照射包含微载体100的视野时，其穿过基本上透明的聚合物层102，但被基本上不透明的聚合物层104阻挡，如图1d所示。这生成可以例如通过光学显微镜成像(例如，使用微分干涉差或dic显微镜)的光图案。该光图案基于微载体100的二维形状(即，模拟代码)。标准图像识别技术可用于解码由微载体100的图像表示的模拟代码。
如下文中更详细地描述的，分析物检测和标识符成像步骤可以以任何顺序发生或同时发生。有利地，图1d中所示的两个检测步骤均包可以在一个成像设备上完成。作为一个实例，可以使用能够同时进行荧光和光(诸如，明视野)显微术的显微镜来定量结合至微载体100的扩增的dna110的量(例如，如通过检测试剂114所检测的)并且对由层102和104产生的模拟代码进行成像。这允许更高效的测定过程，同时需要更少的设备。
在一些实施方案中，微载体还包括固定至基本上透明的聚合物层的表面的基本上不透明的磁层，所述磁层包围基本上透明的聚合物层的中心部分。在一些实施方案中，基本上不透明的磁层位于基本上不透明的聚合物层与基本上透明的聚合物层的中心部分之间。
在一些实施方案中，微载体还包括与第一基本上透明的聚合物层对齐并固定于其的第二基本上透明的聚合物层。在一些实施方案中，第一基本上透明的聚合物层和第二基本上透明的聚合物层各自具有中心部分，并且第一基本上透明的聚合物层和第二基本上透明的聚合物层的中心部分是对齐的。在一些实施方案中，微载体还包括基本上不透明的磁层，其包围第一基本上透明的聚合物层和第二基本上透明的聚合物层的中心部分。在一些实施方案中，基本上不透明的磁层被固定在第一基本上透明的聚合物层与第二基本上透明的聚合物层之间。在一些实施方案中，基本上不透明的磁层位于基本上不透明的聚合物层与第一基本上透明的聚合物层和第二基本上透明的聚合物层的中心部分之间。
现在转向图2a和图2b，显示了另一示例性微载体200。与微载体100一样，微载体200包含基本上透明的聚合物层202和基本上不透明的聚合物层204。另外，微载体200包含磁层206。如图2a所示，磁层206可被塑形为中心部分208与基本上不透明的层204之间的环。
图2b显示磁层206可被嵌入层202内。层202还可包含不止一个层，使得磁层206夹在两个基本上透明的聚合物层之间(例如，如在图2b中)。或者，磁层206可被固定至层202的与层204相同的表面，或者磁层206可被固定至层202的与层204相对的表面。在一些实施方案中，磁层206可以包含镍。
磁层206赋予微载体200磁性，这有利地可用于许多应用。例如，可以在洗涤步骤期间通过磁吸引将微载体200固定至表面，从而允许有效洗涤而不会损失或以其它方式破坏微载体。
除了其磁性以外，层206也基本上是不透明的。当如图1d所示成像(例如，使用光112)时，层206将部分或全部阻挡透射光，从而产生用于成像的图案。如图2a所示，层206也是不对称的-在该实例中，其包含间隙210。这种不对称性产生了可以使用光112成像的定向指示器，例如，如图1d所示。有利地，可以在图像识别期间利用定向指示器来将由成像层204产生的二维形状定向成均匀定向，以便更容易地进行模拟代码识别。这允许解码在任何方向上成像的微载体。
在一些实施方案中，基本上不透明的磁层的厚度为约50nm至约10μm。在一些实施方案中，基本上不透明的磁层的厚度小于约以下厚度(以nm为单位)中的任何厚度：10000、9500、9000、8500、8000、7500、7000、6500、6000、5500、5000、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或100。在一些实施方案中，基本上不透明的磁层的厚度大于约以下厚度(以nm为单位)中的任何厚度：50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000或9500。即，基本上不透明的磁层的厚度可以是具有为10000、9500、9000、8500、8000、7500、7000、6500、6000、5500、5000、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或100的上限以及为50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000或9500的独立选择的下限的厚度(以nm为单位)范围中的任何厚度范围，其中下限小于上限。
在一些实施方案中，基本上不透明的磁层的厚度为约0.1μm。在一些实施方案中，基本上不透明的磁层的厚度为约50nm、约100nm、约150nm、约200nm、约250nm、约300nm、约350nm、约400nm、约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约700nm、约750nm、约800nm、约850nm、约900nm、约950nm、约1μm、约1.5μm、约2μm、约2.5μm、约3μm、约3.5μm、约4μm、约4.5μm、约5μm、约5.5μm、约6μm、约6.5μm、约7μm、约7.5μm、约8μm、约8.5μm、约9μm、约9.5μm或约10μm。在一些实施方案中，基本上不透明的磁层的厚度为约0.01μm、约0.02μm、约0.03μm、约0.04μm、约0.05μm、约0.06μm、约0.07μm、约0.08μm、约0.09μm、约0.1μm、约0.11μm、约0.12μm、约0.13μm、约0.14μm、约0.15μm、约0.16μm、约0.17μm、约0.18μm、约0.19μm、约0.20μm、约0.25μm、约0.30μm、约0.35μm、约0.40μm、约0.45μm或约0.50μm。
在一些实施方案中，微载体还包含用于对基本上不透明的聚合物层的模拟代码进行定向的定向指示器。可通过成像(例如，本文所述的显微或其它成像形式)和/或通过图像识别软件看到和/或检测到的微载体的任何特性可以用作定向指示器。定向指示器可以用作参考点，例如，用于图像识别算法，以以均匀定向对模拟代码的图像(即，基本上不透明的聚合物层的形状)进行定向。有利地，这简化了图像识别，因为算法仅需要将特定模拟代码的图像与在相同定向上的模拟代码库进行比较，而不与包括在所有可能定向上的所有模拟代码的库进行比较。在一些实施方案中，定向指示器可以独立于基本上不透明的聚合物层。例如，其可以形成为磁层和/或基本上透明的聚合物层的一部分。在其它实施方案中，定向指示器可以形成为基本上不透明的聚合物层的一部分。在一些实施方案中，定向指示器包含基本上不透明的磁层的不对称性(例如，如图2a中的间隙210所示的)。
在一些实施方案中，微载体还包括从微载体表面(例如，微载体的顶部和/或底部表面)突出的一个或多个柱。如本文中所用，“柱”可以指从珠表面突出，并且不一定表示维度上的任何规则性，也不表示任何圆柱形特征的任何几何形状。例如，柱的外表面可以与微载体表面平行或不平行。可以从微载体突出的柱状形状的实例包括但不限于矩形棱柱、三角形、棱锥体、立方体、圆柱体、球体或半球体、圆锥体等。在一些实施方案中，一个或多个柱不在第一基本上透明的聚合物层和/或第二基本上透明的聚合物层的中心部分内。在一些实施方案中，一个或多个柱可以从第一基本上透明的聚合物层和第二基本上透明的聚合物层中的一个或多个面向外的表面(例如，未固定至另一层的表面)突出。在一些实施方案中，从基本上不透明的磁性聚合物层制备一个或多个柱。应注意，本文中对微载体厚度的任何描述都不包括所述维度中的一个或多个柱。也就是说，如本文所述的微载体厚度与从其突出的任何可选的柱无关。
现在转向图5a和图5b，显示了另一示例性微载体500。与微载体200一样，微载体500包含基本上透明的聚合物层502、基本上不透明的聚合物层504、磁层506和中心部分508。另外，微载体500具有4个柱(包括柱510)，所述柱可具有从层502的表面延伸的任何形状。如图5a所示，这些柱可以与磁层506对齐排列，防止任何干扰中心部分508中的分析物检测或读取层504的二维形状(即，模拟代码)的可能性。图5b显示这些柱可以从微载体500的上表面和下表面延伸。柱510可以例如使用与层502相同的基本上透明的聚合物制成(示例性生产方法在下文中描述)。有利地，可以使用一个或多个柱(诸如柱510)来防止微载体彼此粘附和/或粘附(例如通过光学接触粘合)至容器(例如，多孔板中的孔的侧面)。
在一些实施方案中，一个或多个柱的高度为约1μm至约10μm。在一些实施方案中，一个或多个柱的高度为约1μm、高度为约1.5μm、高度为约2μm、高度为约2.5μm、高度为约3μm、高度为约3.5μm、高度为约4μm、高度为约4.5μm、高度为约5μm、高度为约5.5μm、高度为约6μm、高度为约6.5μm、高度为约7μm、高度为约7.5μm、高度为约8μm、高度为约8.5μm、高度为约9μm、高度为约9.5μm或高度为约10μm。在一些实施方案中，一个或多个柱小于约以下高度(以μm为单位)中的任何高度：10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5。在一些实施方案中，一个或多个柱大于约以下高度(以μm为单位)中的任何高度：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5。也就是说，一个或多个柱可以是具有为10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5的上限以及为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的独立选择的下限的高度范围中的任何高度范围，其中下限小于上限。
在一些实施方案中，一个或多个柱可以是圆柱形的。在一些实施方案中，一个或多个柱的直径为约1μm至约10μm。在一些实施方案中，一个或多个柱的直径为约1μm、约1.5μm、约2μm、约2.5μm、约3μm、约3.5μm、约4μm、约4.5μm、约5μm、约5.5μm、约6μm、约6.5μm、约7μm、约7.5μm、约8μm、约8.5μm、约9μm、约9.5μm或约10μm。在一些实施方案中，一个或多个柱的直径小于约以下长度(以μm为单位)中的任何长度：10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5。在一些实施方案中，所述一个或多个柱的直径大于约以下长度(以μm为单位)中的任何长度：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5。也就是说，一个或多个柱可具有拥有为10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5的上限以及为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的独立选择的下限的直径范围中的任何直径范围，其中下限小于上限。在其它实施方案中，一个或多个柱可具有与上文所述的任何直径大致相同的宽度，或者与上文所述的任何直径范围大致相同的宽度范围，但一个或多个柱可采用椭圆柱体、抛物面柱体、双曲面柱体的形状或本文所述或本领域已知的任何其它圆柱形或多面体形状。
在其它方面，本文提供了编码微载体，其包含具有第一表面和第二表面的基本上不透明的聚合物层，所述第一表面与所述第二表面彼此平行，其中基本上不透明的聚合物层的轮廓包含代表模拟代码的二维形状；和用于捕获分析物的捕获剂，其中捕获剂在至少基本上不透明的聚合物层的中心部分中与基本上不透明的聚合物层的第一表面和第二表面中的至少一个耦合。因此，微载体由微载体本身的形状(例如，轮廓)：表示模拟代码的二维形状编码。有利地，这些微载体可被高效且高精度地制造，允许高度精确的解码和成本有效的生产。这种类型的微载体及其方面的实例示于图6a-9c中。
图6a和6b显示这种类型的示例性微载体600。微载体600是直径约为80μm且高度为15μm的齿轮形盘，其包含任选的柱元件(类似于如上所述的柱510)。微载体600由单个不透明的聚合物层602制成，而不是由单独的透明聚合物层和不透明聚合物层制成。微载体600可以如图1d所示成像，但其模拟代码基于整个微载体形状(诸如，不透明聚合物层的周边)成像。微载体600的一个或两个表面可用于如上所述地偶联捕获剂，并且可以使用中心部分或整个表面。
图6c显示了微载体600的齿轮齿604的尺寸。如图所示，在该实施方案中，齿轮齿604的宽度为4μm并且与相邻的齿轮齿606间隔4μm。由于微载体600的二维形状是模拟编码的，因此相邻齿轮齿之间的周长可以是可变的，从而允许多个齿轮齿形状。例如，齿轮齿604的高度相对于紧邻左侧或右侧的相邻周边区段分别延伸4μm或6.5μm。
图7示出了这种类型的微载体的另一个实施方案微载体700。与微载体600一样，微载体700由不透明的聚合物层702制成。另外，微载体包含磁层704。磁层704可被固定至微载体700的表面之一，或者其可以嵌入微载体700内(例如，在两个不透明的聚合物层之间)。例如，可以通过沉积镍来生成磁层704。如上所述，磁层允许额外的功能，诸如在磁性地附连至另一表面的同时洗涤微载体700的选项。
在一些实施方案中，微载体还包括从基本上不透明的聚合物层的表面突出的一个或多个柱。如上文中更详细地描述的，“柱”可以指从微载体表面突出并且不一定表示一个或多个柱状维度中的任何规则性的任何几何形状。可以使用上述示例性柱状形状的任何形状。
在一些实施方案中，一个或多个柱的高度为约1μm至约10μm。在一些实施方案中，一个或多个柱的高度为约1μm、高度为约1.5μm、高度为约2μm、高度为约2.5μm、高度为约3μm、高度为约3.5μm、高度为约4μm、高度为约4.5μm、高度为约5μm、高度为约5.5μm、高度为约6μm、高度为约6.5μm、高度为约7μm、高度为约7.5μm、高度为约8μm、高度为约8.5μm、高度为约9μm、高度为约9.5μm或高度为约10μm。在一些实施方案中，一个或多个柱小于约以下高度(以μm为单位)中的任何高度：10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5。在一些实施方案中，一个或多个柱大于约以下高度(以μm为单位)中的任何高度：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5。也就是说，一个或多个柱可以是具有为10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5的上限以及为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的独立选择的下限的高度范围中的任何高度范围，其中下限小于上限。
在一些实施方案中，一个或多个柱可以是圆柱形的。在一些实施方案中，一个或多个柱的直径为约1μm至约10μm。在一些实施方案中，一个或多个柱的直径为约1μm、约1.5μm、约2μm、约2.5μm、约3μm、约3.5μm、约4μm、约4.5μm、约5μm、约5.5μm、约6μm、约6.5μm、约7μm、约7.5μm、约8μm、约8.5μm、约9μm、约9.5μm或约10μm。在一些实施方案中，一个或多个柱的直径小于约以下长度(以μm为单位)中的任何长度：10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5。在一些实施方案中，所述一个或多个柱的直径大于约以下长度(以μm为单位)中的任何长度：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5。也就是说，一个或多个柱可具有拥有为10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5的上限以及为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的独立选择的下限的直径范围中的任何直径范围，其中下限小于上限。在其它实施方案中，一个或多个柱可具有与上文所述的任何直径大致相同的宽度，或者与上文所述的任何直径范围大致相同的宽度范围，但一个或多个柱可采用椭圆柱体、抛物面柱体、双曲面柱体的形状或本文所述或本领域已知的任何其它圆柱形或多面体形状。
在一些实施方案中，微载体还包括包含被固定至基本上不透明的聚合物层的表面的磁性材料的磁层。在一些实施方案中，磁层不延伸超出基本上不透明的聚合物层的二维形状。也就是说，如果要对基本上不透明的聚合物层的轮廓进行成像，则所得图像不会因磁层的存在或不存在而改变。在一些实施方案中，磁层可包括上述的一个或多个柱。也就是说，上述一个或多个柱可以由本文所述的磁性材料制成。
在一些实施方案中，微载体还包含用于对基本上不透明的聚合物层的模拟代码进行定向的定向指示器。可通过成像(例如，本文所述的显微或其它成像形式)和/或通过图像识别软件看到的和/或检测的微载体的任何特性可以用作定向指示器。定向指示器可以用作参考点，例如，用于图像识别算法，以以均匀定向对模拟代码的图像(即，基本上不透明的聚合物层的形状)进行定向。有利地，这简化了图像识别，因为算法仅需要将特定模拟代码的图像与在相同定向上的模拟代码库进行比较，而不与包括在所有可能定向上的所有模拟代码的库进行比较。在一些实施方案中，定向指示器包含基本上不透明的聚合物层的轮廓的不对称性。例如，定向指示器可包括微载体轮廓的可见特性，诸如不对称性(例如，如下文中所述的图8a和9a中的起始位置804和904所示的)。
现在转到图8a，显示了另一示例性微载体800。与微载体700一样，微载体800包含不透明的聚合物层802(以及任选地，磁层诸如层704)。另外，微载体800包含起始位置804，其具有与微载体800的周边的其余部分不同的形状。起始位置804可被用作用于图像识别的定向指示器，如上面针对图2a中所示的间隙210所描述的。
图8b示出了可以使用的编码方案。图8b显示微载体810，其与微载体800一样包含不透明的聚合物层812和起始位置814(以及任选地，磁层诸如层704)。在该方案中，例如在位置820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842和844处标记齿轮周围的潜在形状变化点。如图8b所示，即使只有两个潜在形状可以用于位置820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842和844，该实施方案允许多达213个独特的代码。另外，如上所述，模拟编码的使用通过允许在周边周围的任何或所有指示位置处(例如，在图8b中标记的每个形状变化点处)使用多于两种的潜在形状极大地扩展了该数量。
图9a-9c示出了另一个可能的实施方案微载体900。与微载体800一样，微载体900是齿轮形微载体，其包含不透明的聚合物层902和起始位置904(以及任选地，磁层诸如层704)。另外，微载体900可具有一个或多个被固定至微载体900的一个或两个表面的柱(例如，柱906)。如图9b中的横截面所示，柱906从层902的表面延伸。有利地，柱906有助于降低光学接触粘合的可能性(如上文针对柱510所述的)。
图9c示出了柱906的尺寸。在该实施例中，柱906是高度为3μm且直径为3μm的圆柱体，然而如上所述，此类柱绝不限于圆柱形。在一些实施方案中，柱906由磁性材料诸如镍制成。这允许柱906另外用作用于微载体900的磁操纵的磁性元件，如上所述的。
本文所述的微载体中的任何微载体可包括下文所述的一个或多个特性、元件或方面。另外，取决于微载体的实施方案，一个或多个下面所述的特性、元件或方面可以采用不同的特征，例如，如上所述的。
在一些实施方案中，本公开的基本上透明的聚合物包括环氧基聚合物。用于制造本文所述组合物的合适的环氧基聚合物包括但不限于由hexionspecialtychemicals,inc.(columbus,oh)提供的epontm家族的环氧树脂和由thedowchemicalcompany(midland,mi)提供的任何编号的环氧树脂。合适的聚合物的许多实例是本领域公知的，包括但不限于su-8、epon1002f、epon165/154和聚(甲基丙烯酸甲酯)/聚(丙烯酸)嵌段共聚物(pmma-co-paa)。对于另外的聚合物，参见，例如，warad,icpackaging:packageconstructionanalysisinultrasmallicpackaging,laplambertacademicpublishing(2010)；theelectronicpackaginghandbook,crcpress(blackwell，编辑),(2000)；和pecht等，electronicpackagingmaterialsandtheirproperties,ccrpress，第1版，(1998)。这些类型的材料具有在水性环境中不溶胀的有利方面，这确保了在微载体群内保持均匀的微载体尺寸和形状。在一些实施方案中，基本上透明的聚合物是光致抗蚀剂聚合物。在一些实施方案中，环氧基聚合物是基于环氧基负性近紫外光致抗蚀剂。在一些实施方案中，环氧基聚合物是su-8。
在一些实施方案中，基本上不透明的聚合物是与一种或多种不透明或有色染料混合的本文所述的聚合物(例如，su-8)。在其它实施方案中，基本上不透明的聚合物是黑色基质抗蚀剂。可以使用本领域已知的任何黑色基质抗蚀剂；关于示例性黑色基质抗蚀剂和与其相关的方法，参见，例如，美国专利第8,610,848号。在一些实施方案中，黑色基质抗蚀剂可以是用黑色色素着色的光致抗蚀剂，例如，如在lcd的滤色器上作为黑色基质的一部分图案化的。黑色基质抗蚀剂可包括但不限于由toppanprintingco.(tokyo)、tokyoohkakogyo(kawasaki)和daxinmaterialscorp.(taichungcity,taiwan)销售的那些。
在一些实施方案中，可以参考一个或多个聚合物层的中心部分。本公开的中心部分可以采用任何形状。在一些实施方案中，中心部分的形状可以反映或对应于相应聚合物层的形状(例如，轮廓)。在其它实施方案中，中心部分的形状可以与对应的聚合物层的形状(例如，轮廓)无关。例如，圆形微载体表面的中心部分在一些实施方案中可以是圆形的，而在其它实施方案中可以是正方形。在一些实施方案中，正方形微载体表面的中心部分可以是正方形，而在其它实施方案中可以是圆形。
在一些实施方案中，本公开的聚合物层的中心部分为约5％、约7％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％或约90％的聚合物层的表面积。在一些实施方案中，本公开的聚合物层的中心部分小于约基本上透明的聚合物层的以下分数(以％计)中的任何分数：90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或7。在一些实施方案中，本公开的聚合物层的中心部分大于约基本上透明的聚合物层的以下分数(％)中的任何分数：5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或85。也就是说明，包含在中心部分中的聚合物层表面积的分数可以是具有为90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或7的上限以及为5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或85的独立选择的下限的百分比范围中的任何百分比范围，其中下限小于上限。在一些实施方案中，聚合物层的中心部分包含约25％的聚合物层的表面积。在一些实施方案中，微载体表面的中心部分包括整个表面减去微载体的轮廓部分。
如上所述，本公开的微载体还可包含磁层，其可以采用如本文所述的各种形状。在一些实施方案中，磁层可以是基本上不透明的层。在一些实施方案中，磁层可包括磁性材料。本公开的磁层可以由任何合适的磁性材料(诸如具有顺磁性、铁磁性或亚铁磁性的材料)制成。磁性材料的实例包括但不限于铁、镍、钴和一些稀土金属(例如，钆、镝、钕等)，以及其合金。在一些实施方案中，磁性材料包含镍，包括但不限于元素镍和磁性镍合金，诸如铝镍钴合金和坡莫合金。在本公开的微载体中包含磁层例如在促进磁性分离方面可以是有利的，所述磁层可用于洗涤、收集和以其它方式操作一种或多种微载体。
如上所述，在一些实施方案中，磁层可被固定至基本上透明的聚合物层的表面上并且包围基本上透明的聚合物层的中心部分。在其它实施方案中，如上所述，磁层可包括一个或多个柱；即，上述一个或多个柱可由本文所述的磁性材料制成。
在一些方面，本文提供了编码微载体，其包含：具有第一表面和第二表面的基本上透明的聚合物层，所述第一表面与所述第二表面彼此平行；被固定至基本上透明的聚合物层的第一表面并且包围基本上透明的聚合物层的中心部分的基本上不透明的磁性聚合物层；以及对kras、braf、ctnnb1或apc基因中的dna突变具有特异性的探针，其中所述探针在至少基本上透明的聚合物层的中心部分中与基本上透明的聚合物层的第一表面和第二表面中的至少一个耦合。在一些实施方案，基本上不透明的磁性聚合物层包含表示模拟代码的二维形状的至少一部分。例如，二维形状的部分可由基本上不透明的非磁性聚合物层制成，并且二维形状的部分可由基本上不透明的非磁性聚合物层(例如，如本文所述的su-8)制成。在其它实施方案中，基本上不透明的磁性聚合物层包含所有表示模拟代码的二维形状。因此，微载体包含至少两层：其中一层基本上是基本上透明的，并且其中另一层是基本上不透明的磁性二维形状，其表示模拟代码。
有利地，这些微载体可以采用各种二维形状，同时仍然保持均匀的整体形式(例如，基本上透明的聚合物层的周边)，以实现各方面的均匀性，包括例如整体尺寸、物理性质和/或溶液中的行为。该类型的微载体的各个任选方面和元件示于图1a-5b(参见，例如，图4b)中。磁层有利地组合用于模拟编码的二维形状主，同时还提供允许例如促进磁性分离的磁性功能性，所述磁层可用于洗涤、收集和以其它方式操作一种或多种微载体。
在一些实施方案中，本公开的模拟代码由基本上不透明的磁性聚合物层的二维形状制成。有利地，这提供了可以大规模高效生产(例如，使用本文所述的技术)的微载体。此外，使用基本上不透明的磁性聚合物层生成模拟代码通过允许多种不同的微载体种类(每种都具有独特的模拟代码)同时还通过所得的微载体的磁性性质提供简便的操作来促进多重测定。
在一些实施方案中，基本上不透明的磁层的厚度为约50nm至约10μm。在一些实施方案中，基本上不透明的磁层的厚度小于约以下厚度(以nm为单位)中的任何厚度：10000、9500、9000、8500、8000、7500、7000、6500、6000、5500、5000、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或100。在一些实施方案中，基本上不透明的磁层的厚度大于约以下厚度(以nm为单位)中的任何厚度：50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000或9500。即，基本上不透明的磁层的厚度可以是具有为10000、9500、9000、8500、8000、7500、7000、6500、6000、5500、5000、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或100的上限以及为50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000或9500的独立选择的下限的厚度(以nm为单位)范围中的任何厚度范围，其中下限小于上限。
在一些实施方案中，基本上不透明的磁层的厚度为约0.1μm。在一些实施方案中，基本上不透明的磁层的厚度为约50nm、约100nm、约150nm、约200nm、约250nm、约300nm、约350nm、约400nm、约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约700nm、约750nm、约800nm、约850nm、约900nm、约950nm、约1μm、约1.5μm、约2μm、约2.5μm、约3μm、约3.5μm、约4μm、约4.5μm、约5μm、约5.5μm、约6μm、约6.5μm、约7μm、约7.5μm、约8μm、约8.5μm、约9μm、约9.5μm或约10μm。在一些实施方案中，基本上不透明的磁层的厚度为约0.01μm、约0.02μm、约0.03μm、约0.04μm、约0.05μm、约0.06μm、约0.07μm、约0.08μm、约0.09μm、约0.1μm、约0.11μm、约0.12μm、约0.13μm、约0.14μm、约0.15μm、约0.16μm、约0.17μm、约0.18μm、约0.19μm、约0.20μm、约0.25μm、约0.30μm、约0.35μm、约0.40μm、约0.45μm或约0.50μm。
在一些实施方案中，本公开的微载体可以用构成二维形状的基本上不透明的层编码。例如，如上所述，二维形状可以构成与微载体的基本上透明的层形成对比的基本上不透明的层的形状，或者其可以构成微载体本身的形状(例如，周边)。可使用任何可包括多种可分辨和区别的变化种类的二维形状。在一些实施方案中，二维形状包括线性、圆形、椭圆形、矩形、四边形或更高多边形外观、元件和/或形状中的一种或多种。在一些实施例中，可以使用本公开的基本上不透明的磁层来产生二维形状。
图4a示出了图3中所示的编码方案的三个示例性实施方案：微载体400、402和404。微载体400、402和404的独特代码是使用图3的简单“填充或未填充”方案生成的。重要的是，如上所述，使用模拟图像识别可获得更复杂的编码方案，从而极大地扩增了潜在的独特代码的数量。在一些实施方案中，基本上不透明的聚合物层的二维形状包括包围基本上透明的聚合物层的中心部分的一个或多个环。在一些实施方案中，一个或多个环中的至少一个包含不连续性。使用具有不同数量和构型的不连续性的一个或多个环(例如，两个环)形成的示例性和非限制性二维形状示于图4b中。图4b示出了代码的10个示例性实施方案，尤其是在形状的数量(例如，如与代码zn_10中的七种不同形状相比，代码zn_3中的两种不同形状)和/或形状的大小(例如，代码zn_2中大、小和中等尺寸的形状)方面。
在一些实施方案中，基本上不透明的聚合物层的二维形状包括齿轮形状。本文中使用的齿轮形状可以指排列在基本上圆形、椭圆形或圆形体的周边上的多个形状(例如，齿轮齿)，其中多个形状中的至少两个在空间上是分开的。在一些实施方案中，齿轮形状包含多个齿轮齿。在一些实施方案中，模拟代码由选自所述多个齿轮齿中的一个或多个齿轮齿的高度、所述多个齿轮齿中的一个或多个齿轮齿的宽度、所述多个齿轮齿中的齿轮齿的数量以及所述多个齿轮齿内一个或多个齿轮齿的排列的一个或多个方面表示。有利地，齿轮形状包括多个方面，包括齿轮齿的高度、齿轮齿的宽度、齿轮齿的数量、以及齿轮齿的排列，所述方面可以变化以生成种类繁多的潜在独特的二维形状。然而，应当理解，由于本公开的齿轮形状用于编码并且不需要与另一齿轮物理地相互啮合(例如，与传递扭矩的机械齿轮一样)，本公开的齿轮齿不受相同或相互啮合形状的需要约束，无论是在一个齿轮形状内还是在多个齿轮形状之间。因此，可以被认为是本公开的齿轮齿的形状的多样性明显大于机械齿轮。
图3显示使用图1a-2b中所示的齿轮形状的可能的大量潜在模拟代码。图3示出了示例性编码方案，其中例如，在示例性微载体300上的位置302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326和328处标记了多个形状变化点。即使使用简单的“填充或未填充”方案，基于14个形状变化点的使用，可能有最多达214个独特代码。该方案便于制造和生成易于区分以用于图像识别分析的二维形状。然而，由于使用模拟编码，因此使用多于2种可能性的更复杂方案(例如，在如图3中标记的每个形状变化点处)是可能的，从而指数地扩展独特标识符的数量。例如，多个齿轮齿形状和/或多个尺寸的齿轮齿是可能的。如图1a-3所示的二维齿轮形状有助于广泛的独特模拟代码，同时提供用于分析物检测的大的中心部分(例如，中心部分106和208)。
在一些实施方案中，多个齿轮齿包括宽度为约1μm至约10μm的一个或多个齿轮齿。在一些实施方案中，多个齿轮齿包括一个或多个齿轮齿，所述齿轮齿的宽度为约1μm、宽度为约1.5μm、宽度为约2μm、宽度为约2.5μm、宽度为约3μm、宽度为约3.5μm、宽度为约4μm、宽度为约4.5μm、宽度为约5μm、宽度为约5.5μm、宽度为约6μm、宽度为约6.5μm、宽度为约7μm、宽度为约7.5μm、宽度为约8μm、宽度为约8.5μm、宽度为约9μm、宽度为约9.5μm或宽度为约10μm。在一些实施方案中，多个齿轮齿包括一个或多个齿轮齿，所述齿轮齿的宽度小于以下宽度(以μm为单位)中的任何宽度：10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5。在一些实施例中，多个齿轮齿包括一个或多个齿轮齿，所述齿轮齿的宽度大于以下宽度(以μm为单位)中的任何宽度：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5。也就是说，多个齿轮齿可包含一个或多个齿轮齿，所述齿轮齿可以是具有为10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5的上限以及为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的独立选择的下限的宽度范围中的任何宽度范围，其中下限小于上限。
在一些实施方案中，多个齿轮齿包括一个或多个齿轮齿，所述齿轮齿的高度为约1μm至约10μm。在一些实施方案中，多个齿轮齿包括一个或多个齿轮齿，所述齿轮齿的高度约1μm、高度为约1.5μm、高度为约2μm、高度为约2.5μm、高度为约3μm、高度为约3.5μm、高度为约4μm、高度为约4.5μm、高度为约5μm、高度为约5.5μm、高度为约6μm、高度为约6.5μm、高度为约7μm、高度为约7.5μm、高度为约8μm、高度为约8.5μm、高度为约9μm、高度为约9.5μm、高度为约10μm。在一些实施方案中，所述多个齿轮齿包括一个或多个齿轮齿，所述齿轮齿小于约以下高度(以μm为单位)中的任何宽度：10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5。在一些实施方案中，所述多个齿轮齿包括一个或多个齿轮齿，所述齿轮齿大于约以下高度(以μm为单位)中的任何高度：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5。也就是说，多个齿轮齿可包含一个或多个齿轮齿，所述齿轮齿可以是具有为10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5的上限以及为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的独立选择的下限的高度范围中的任何高度范围，其中下限小于上限。应当理解，如果齿轮齿从其延伸的相邻周边区段是不均匀的，则取决于参考点，齿轮齿可具有不同的可测量的高度(参见，例如，图6c中的齿轮齿602，取决于参考点，其高度可为4或6.5μm)。
在一些实施方案中，多个齿轮齿包括一个或多个齿轮齿，所述齿轮齿间隔约1μm至约10μm。在一些实施方案中，多个齿轮齿包括一个或多个齿轮齿，所述齿轮齿间隔约1μm、间隔约1.5μm、间隔约2μm、间隔约2.5μm、间隔约3μm、间隔约3.5μm、间隔约4μm、间隔约4.5μm、间隔约5μm、间隔约5.5μm、间隔约6μm、间隔约6.5μm、间隔约7μm、间隔约7.5μm、间隔约8μm、间隔约8.5μm、间隔约9μm、间隔约9.5μm或间隔约10μm。在一些实施方案中，多个齿轮齿包括一个或多个齿轮齿，所述齿轮齿间隔小于约以下宽度(以μm为单位)中的任何宽度：10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5。在一些实施方案中，多个齿轮齿包括一个或多个齿轮齿，所述齿轮齿间隔大于约以下宽度(以μm为单位)中的任何宽度：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5。也就是说，多个齿轮齿可包含一个或多个齿轮齿，所述齿轮齿可间隔具有为10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5的上限以及为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的独立选择的下限的宽度间隔范围中的任何宽度间隔范围，其中下限小于上限。
在一些实施方案中，本公开的微载体是基本上圆形的盘。如本文中所用，基本上圆形的形状可以指在所述形状周边的所有点与形状的几何中心之间具有大致相同距离的任何形状。在一些实施方案中，如果连接几何中心和周边上的给定点的任何潜在半径之间的变化表现出10％或更小的长度变化，则认为形状基本上是圆形的。如本文中所用，基本上圆形的圆盘可以指任何基本上圆形的形状，其中形状的厚度显著小于其直径。例如，在一些实施方案中，基本上圆形的盘的厚度可小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％的其直径。在某些实施方案中，基本上圆形的盘的厚度可为其直径的约20％。应当理解，其轮廓为齿轮形状的本公开的微载体也可以被认为是基本上圆形的盘；例如，除了一个或多个齿轮齿之外的微载体的形状可包含基本上圆形的盘。
在一些实施方案中，微载体的直径小于约200μm。例如，在一些实施方案中，微载体的直径小于约200μm、小于约180μm、小于约160μm、小于约140μm、小于约120μm、小于约100μm、小于约80μm、小于约60μm、小于约40μm或小于约20μm。
在一些实施方案中，微载体的直径为约180μm、约160μm、约140μm、约120μm、约100μm、约90μm、约80μm、约70μm、约60μm、约50μm、约40μm、约30μm、约20μm或约10μm。在某些实施方案中，微载体的直径为约60μm。
在一些实施方案中，微载体的厚度小于约50μm。例如，在一些实施方案中，微载体的厚度小于约70μm、约60μm、约50μm、约40μm、约30μm、小于约25μm、小于约20μm、小于约15μm、小于约10μm或小于约5μm。在一些实施方案中，微载体的厚度小于约以下厚度(以μm为单位)中的任何厚度：70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2。在一些实施方案中，微载体的厚度大于约以下厚度(以μm为单位)中的任何厚度：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或65。也就是说，微载体的厚度可以是具有为70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2的上限和为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或65的独立选择的下限的厚度(以μm为单位)范围中的任何厚度范围，其中下限小于上限。
在一些实施方案中，微载体的厚度为约50μm、约45μm、约40μm、约35μm、约30μm、约25μm、约20μm、约19μm、约18μm、约17μm、约16μm、约15μm、约14μm、约13μm、约12μm、约11μm、约10μm、约9μm、约8μm、约7μm、约6μm、约5μm、约4μm、约3μm、约2μm或约1μm。在某些实施方案中，微载体的厚度为约10μm。
可以使用多种技术将本公开的探针偶联至编码微载体。在一个实施方案中，将探针偶联至微载体的表面(在一些实施方案中，在微载体表面的至少中心部分)。在一些实施方案中，可将探针可偶联至聚合物层的第一表面或第二表面之一或两者。在一些实施方案中，聚合物包含环氧基聚合物或以其它方式含有环氧基团。
在一些实施方案中，可将探针化学连接至微载体上。在其它实施方案中，可将探针物理吸附至微载体的表面。在一些实施方案中，捕获剂与珠表面之间的连接键联可以是共价键。在其它实施方案中，探针与微载体表面之间的连接键联可以是非共价键，包括但不限于盐桥或其它离子键、一个或多个氢键、疏水相互作用、范德瓦尔斯力、伦敦分散力、机械键、一个或多个卤键、亲金作用、嵌入或堆积。
在一些实施方案中，偶联探针包括使聚合物与光致产酸剂和光反应以生成交联聚合物。在一些实施方案中，光具有激活光致产酸剂的波长，例如uv或近uv光。光致产酸剂可从sigma-aldrich(st.louis)和basf(ludwigshafen)商购获得。可使用本领域已知的任何合适的光致产酸剂，包括但不限于三苯基或三芳基锍六氟锑酸盐；三芳基锍六氟磷酸盐；三苯基锍全氟-1-丁烷磺酸盐；三苯基锍三氟甲磺酸盐；三(4-叔-丁基苯基)锍全氟-1-丁烷磺酸盐或三氟甲磺酸盐；含双(4-叔-丁基苯基)碘鎓的光致产酸剂，诸如双(4-叔-丁基苯基)碘鎓全氟-1-丁烷磺酸盐，对-甲苯磺酸盐和三氟甲磺酸盐；boc-甲氧基苯基二苯基锍三氟甲磺酸盐；(叔-丁氧基羰基甲氧基萘基)-二苯基锍三氟甲磺酸盐；(4-叔-丁基苯基)二苯基锍三氟甲磺酸盐；二苯基碘鎓六氟磷酸盐、硝酸盐、全氟-1-丁烷磺酸盐、三氟甲磺酸盐或对-甲苯磺酸盐；(4-氟苯基)二苯基锍三氟甲磺酸盐；n-羟基萘酰亚胺三氟甲磺酸盐；n-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺全氟-1-丁烷磺酸盐；(4-碘苯基)二苯基锍三氟甲磺酸盐；(4-甲氧基苯基)二苯基锍三氟甲磺酸盐；2-(4-甲氧基苯乙烯基)-4,6-双(三氯甲基)-1,3,5-三嗪；(4-甲基苯基)二苯基锍三氟甲磺酸盐；(4-甲基硫代苯基)甲基苯基锍三氟甲磺酸盐；(4-苯氧基苯基)二苯基锍三氟甲磺酸盐；(4-苯基硫代苯基)二苯基锍三氟甲磺酸盐；或product-finder.basf.com/group/corporate/product-finder/de/literature-document:/brand+irgacure-brochure--photoacid+generator+selection+guide-english.pdf中描述的光致产酸剂中的任何光致产酸剂。在一些实施方案中，光致产酸剂是含锍的光致产酸剂。
在一些实施方案中，偶联探针包括使交联聚合物的环氧化物与官能团诸如胺、羧基、巯基等反应。或者，可将表面上的环氧基团氧化成羟基，其随后用作水溶性聚合物诸如聚(丙烯酸)的接枝聚合的引发位点。然后使用聚(丙烯酸)中的羧基与捕获剂中的氨基或羟基形成共价键。例如，在某些实施方案中，聚(丙烯酸)中的羧基用于与探针中的氨基形成共价键。
在一些实施方案中，偶联探针包括使交联聚合物的环氧化物与含有胺和羧基的化合物反应。在一些实施方案中，化合物的胺与环氧化物反应以形成化合物偶联的交联聚合物。不希望受理论束缚，认为可在聚合物交联之前将探针偶联至聚合物；然而，这可降低所得表面的均匀性。可使用任何具有伯胺和羧基的化合物。化合物可包括但不限于甘氨酸、氨基十一烷酸、氨基己酸、丙烯酸、2-羧基乙基丙烯酸、4-乙烯基苯甲酸、3-丙烯酰胺基-3-甲基-1-丁酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯等。在一些实施方案中，化合物偶联的交联聚合物的羧基与探针的胺(例如，伯胺)反应，以将捕获剂偶联至基本上透明的聚合物。
v.试剂盒
本文还提供了包含多个本公开的微载体的试剂盒或制品。这些试剂盒或制品尤其可用于进行多重测定，诸如本文所述的示例性多重测定(参见，例如，上文第iii部分)。本文所述的任何微载体(参见，例如，第iv部分)可用于本公开的试剂盒或制品。
在一些实施方案中，本公开的试剂盒或制品包含至少四种编码微载体。在一些实施方案中，四种编码微载体中的每一种包含(i)偶联至微载体的对kras、braf、ctnnb1或apc基因中的dna突变具有特异性的探针；和(ii)对应于探针的标识符。在一些实施方案中，所述试剂盒包含至少一种包含对kras基因中的dna突变具有特异性的探针的微载体、至少一种包含对braf基因中的dna突变具有特异性的探针的微载体、至少一种包含对ctnnb1基因中的dna突变具有特异性的探针的微载体和至少一种包含对apc基因中的dna突变具有特异性的探针的微载体。也就是说，kras、braf、ctnnb1和apc基因中的每一种都通过微载体呈现于试剂盒中，所述微载体具有对基因中的突变具有特异性的探针。上文描述了示例性kras、braf、ctnnb1和apc基因和突变。在一些实施方案中，kras、braf、ctnnb1和apc基因是人基因。在一些实施方案中，该试剂盒包含具有适合于检测以下突变中的每一种突变的探针的微载体(例如，在试剂盒中具有至少一种针对每种突变的微载体+探针种类)：编码g12d、g12v、g12s和g13d突变的kras蛋白的dna突变；编码v600e突变的braf蛋白的一个或多个dna突变；编码t41a和t41i突变的ctnnb1蛋白的dna突变；编码s45f和s45p突变的ctnnb1蛋白的dna突变；和编码q1367*、r1450*、e1309移码、s1465移码和t1556移码突变的apc蛋白的dna突变。
在一些实施方案中，试剂盒还包含至少四种阻断核酸。在一些实施方案中，所述至少四种阻断核酸与对应于kras、braf、ctnnb1和apc基因中的每一种中的dna突变的野生型dna基因座杂交。阻断核酸的示例性描述在第iii部分中提供。在一些实施方案中，试剂盒包含含有以下序列的阻断核酸：tacgccaccagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:3)；ttggagctggtggcgtainvdtinvdtinvdt(seqidno:142)；gctggtggcgtaggcainvdtinvdtinvdt(seqidno:143)；gctggtggcgtaggcinvdtinvdtinvdt(seqidno:144)或ttggagctggtggcgtinvdtinvdtinvdt(seqidno:145)；含有以下序列的阻断核酸：gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:10)；gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:146)；gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:147)；gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:148)或gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:149)；含有以下序列的阻断核酸gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:15)；tgccactaccacaginvdtinvdtinvdt(seqidno:150)；cactaccacagctccinvdtinvdtinvdt(seqidno:151)；gccactaccacagctinvdtinvdtinvdt(seqidno:152)或gccactaccacagctinvdtinvdtinvdt(seqidno:153)和/或含有以下序列的阻断核酸：gctccttctctgagtinvdtinvdtinvdt(seqidno:20)；tccttctctgagtgginvdtinvdtinvdt(seqidno:174)；gctccttctctgagtinvdtinvdtinvdt(seqidno:175)；tccttctctgagtgginvdtinvdtinvdt(seqidno:176)或gctccttctctgagtinvdtinvdtinvdt(seqidno:177)；以及以下序列的一个或多个序列：含有以下序列的阻断核酸：gtgctcagacaccinvdtinvdtinvdt(seqidno:33)、gtgctcagacaccinvdtinvdtinvdt(seqidno:158)、agtggtgctcagacacccainvdtinvdtinvdt(seqidno:159)、agtggtgctcagacacccainvdtinvdtinvdt(seqidno:160)或agtggtgctcagacacccainvdtinvdtinvdt(seqidno:161)；含有以下序列的阻断核酸：cttctcgcttggttinvdtinvdtinvdt(seqidno:37)、gtacttctcgcttggtinvdtinvdtinvdt(seqidno:162)、cttctcgcttggttinvdtinvdtinvdt(seqidno:163)、gtacttctcgcttggtinvdtinvdtinvdt(seqidno:164)或gtacttctcgcttggtinvdtinvdtinvdt(seqidno:165)；含有以下序列的阻断核酸cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:29)、cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:154)、cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:155)、cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:156)或cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:157)；含有以下序列的阻断核酸：ccactctctctcttttcagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:25)、taggtccactctctctcttttcagcainvdtinvdtinvdt(seqidno:166)、taggtccactctctctcttttcagcainvdtinvdtinvdt(seqidno:167)、ccactctctctcttttcagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:168)或taggtccactctctctcttttcagcainvdtinvdtinvdt(seqidno:169)；以及含有以下序列的阻断核酸：caatagttttttctgccinvdtinvdtinvdt(seqidno:41)、gaatcaatagttttttctgcctcinvdtinvdtinvdt(seqidno:170)、tcagaatcaatagttttttctginvdtinvdtinvdt(seqidno:171)、gaatcaatagattttactgcctcinvdtinvdtinvdt(seqidno:172)或aatcaatagttttttctgcctcinvdtinvdtinvdt(seqidno:173)，(斜体核酸表示锁核酸)。
在一些实施方案中，试剂盒还包含一个或多个引物对，例如以用于扩增目标dna突变的基因座。在一些实施方案中，试剂盒包含对kras、braf、ctnnb1和apc基因中的每一种中的一个或多个dna突变的基因座具有特异性的引物对，例如至少4个引物对。在一些实施方案中，试剂盒包含含有序列gtactggtggagtatttgatagtg(seqidno:1)和atcgtcaaggcactcttgcctac(seqidno:2)的引物对以用于扩增包含kras突变(例如，编码g12d、g12v、g12s和g13d突变的kras蛋白的一种或多种kras突变)的基因座；含有序列ggacccactccatcgagattt(seqidno:8)和cagatatatttcttcatgaagacctcacagtaa(seqidno:9)的引物对以用于扩增包含braf突变(例如，编码v600e突变的braf蛋白的一种、两种或更多种braf突变)的基因座；含有序列ggaatccattctggtgccact(seqidno:13)和agaaaatccctgttcccactcata(seqidno:14)的引物对和/或含有序列ggtgccactaccacagctcct(seqidno:18)和tctcaaaactgcattctgactttca(seqidno:19)的引物对，以扩增包含ctnnb1突变(例如，编码t41a、t41i、s45f或s45p突变的ctnnb1蛋白的一种或多种ctnnb1突变)的基因座；以及以下引物对中的一个或多个引物对：包含序列taaaaataaagcacctactgctgaaa(seqidno:23)和agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)的第一引物对；包含序列taggatgtaatcagacgacacagga(seqidno:27)和cagctgacctagttccaatctttta(seqidno:28)的第二引物对；包含序列tctccctccaaaagtggtgct(seqidno:31)和tggcaatcgaacgactctcaa(seqidno:32)的第三引物对；包含序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)的第四引物对，其中斜体核酸表示锁核酸；以及包含序列caggaaaatgacaatgggaatg(seqidno:39)和atctaataggtccttttcagaatcaatag(seqidno:40)的第五引物对，以用于扩增包含apc突变(例如，编码q1367*、r1450*、e1309移码、s1465移码或t1556遗码突变的apc蛋白的一种或多种apc突变)的基因座。
可将例如与编码微载体偶联的本文所述的任何探针(例如，在第iii部分中)包括在试剂盒中。例如，用于检测kras基因中的dna突变的合适的探针可包含序列ggagctgatgg(seqidno:4)、agctgatggcgta(seqidno:178)、tggagctgatggcg(seqidno:179)、tggagctgatgg(seqidno:180)、gctgatggcgta(seqidno:181)、ggagctgttgg(seqidno:5)、tggagctgttggtggc(seqidno:182)、ggagctgttggtg(seqidno:183)、tggagctgttggt(seqidno:184)、tggagctgtaggtgg(seqidno:185)、tggagctagtgg(seqidno:6)、ttggagctagtggcgta(seqidno:186)、gctagtggcgtaggc(seqidno:187)、agctagtggcgt(seqidno:188)、gttggagctagtgg(seqidno:189)、ggagctagtgg(seqidno:190)、tggagctggtgacgt(seqidno:7)、ggtgacgtaggcaa(seqidno:191)、tgacgtaggcaagag(seqidno:192)、gctggtgacgtagg(seqidno:193)、agctggtgacgtag(seqidno:194)、ggagctggtgacgt(seqidno:195)、ttttttttttttaaggagctgatgg(seqidno:47)、ttttttttttttagctgatggcgta(seqidno:74)、ttttttttttatggagctgatggcg(seqidno:75)、ttttttttttttatggagctgatgg(seqidno:76)、tttttttttttttgctgatggcgta(seqidno:77)、ttttttttttttaaggagctgttgg(seqidno:48)、ttttttttatggagctgttggtggc(seqidno:78)、ttttttttttaaggagctgttggtg(seqidno:79)、tttttttttttatggagctgttggt(seqidno:80)、tttttttttatggagctgtaggtgg(seqidno:81)、tttttttttttatggagctagtgg(seqidno:49)、ttttttttttggagctagtggcgta(seqidno:82)、tttttaatttgctagtggcgtaggc(seqidno:83)、tttttttttatttagctagtggcgt(seqidno:84)、tttttttttttgttggagctagtgg(seqidno:85)、ttttttttttttaaggagctagtgg(seqidno:86)、tttttttttatggagctggtgacgt(seqidno:50)、ttttttttaaaggtgacgtaggcaa(seqidno:87)、tttttttttatgacgtaggcaagag(seqidno:88)、tttttttttttgctggtgacgtagg(seqidno:89)、ttttttttttaagctggtgacgtag(seqidno:90)和tttttttttaaggagctggtgacgt(seqidno:91)。在一些实施方案中，本公开的探针可在其5'末端处包含8个或更多个核苷酸(例如，腺嘌呤或胸腺嘧啶)。用于检测braf基因中的dna突变的合适的探针可包含序列tctagctacagagaaat(seqidno:11)、gtctagctacagaaaaat(seqidno:12)、tacagagaaatctcgat(seqidno:196)、tacagagaaatctc(seqidno:197)、ctagctacagagaaat(seqidno:198)、ctagctacagagaaa(seqidno:199)、tctagctacagag(seqidno:200)、ttttttaatttctagctacagagaaat(seqidno:51)、tttttttttatacagagaaatctcgat(seqidno:92)、tttttttttaatttacagagaaatctc(seqidno:93)、ttttttaattactagctacagagaaat(seqidno:94)、tttttttaattactagctacagagaaa(seqidno:95)、ttttttttttaatttctagctacagag(seqidno:96)、tttttttatgtctagctacagaaaaat(seqidno:52)、ttttatgtctagctacagaaaaatc(seqidno:97)、ttttttttatttttagctacagaaaaa(seqidno:98)、tttttttatttctagctacagaaaaat(seqidno:99)和/或ttttttttattctagctacagaaaaatc(seqidno:100)。用于检测ctnnb1基因中的dna突变的合适的探针可包含序列aggagctgtggcag(seqidno:16)、ggagctgtgata(seqidno:17)、tttaccactcagaaaag(seqidno:21)、taccactcagaggag(seqidno:22)、tttttttttttaggagctgtggcag(seqidno:53)、tttttttttttaggagctgtggcagtg(seqidno:101)、tttttttttttagctgtggcagtggc(seqidno:102)、tttttttttttgctgtggcagtggca(seqidno:103)、ttttttttttaaggagctgtggcag(seqidno:104)、tttttttttttttggagctgtgata(seqidno:54)、tttttttttggagctgtgatagtgg(seqidno:105)、tttttttttgagctgtgatagtggc(seqidno:106)、tttttttttagctgtgatagtggca(seqidno:107)、tttttttttagaaggagctgtgata(seqidno:108)、ttttttttttttttggagctgtgat(seqidno:109)、tttttttttttaccactcagaaaag(seqidno:55)、tttaattttactcagaaaaggagct(seqidno:110)、ttttttaataccactcagaaaagga(seqidno:111)、ttttttttaccactcagaaaaggag(seqidno:112)、ttttttttattaccactcagaaaag(seqidno:113)、tttttttttcagaaaaggagctgtg(seqidno:114)、tttttttttaataccactcagaggag(seqidno:56)、tttttttttaaaactcagaggaggagc(seqidno:115)、tttttttttttattaccactcagagga(seqidno:116)、tttttttttattaccactcagaggagg(seqidno:117)、ttttttttttattaacactcagaggag(seqidno:118)和/或tttttttttattaccaatcagaggagg(seqidno:119)。用于检测apc基因中的dna突变的合适探针包含序列actgctgaaaagagagagt(seqidno:26)、gaaataaaagattgg(seqidno:30)、ttttgggtgtctaag(seqidno:34)、caaaccaagtgagaa(seqidno:38)、agaggcagaaaaaaact(seqidno:42)、ttttttttactgctgaaaagagagagt(seqidno:57)、ttttttttttgcacctactgctgaa(seqidno:134)、tttttttttacctactgctgaaaag(seqidno:135)、tttttttttgctgaaaagagagagt(seqidno:136)和tttttttttcctactgctgaaaagaga(seqidno:137)、tttttttttttttgaaataaaagattgg(seqidno:58)、ttttttttttaaatagcagaaataaaag(seqidno:120)、tttttttttttgaaataaaagattggaa(seqidno:121)、tttttttttttttagaaataaaagattg(seqidno:122)、tttttttttttttgaaataaatgaatgg(seqidno:123)、tttttttttttttcagaaataaaagatt(seqidno:124)、tttttttttttttgggtgtctaag(seqidno:59)、tttttttttatttgggtgtctaag(seqidno:125)、ttttttgggtgtctaagcaccact(seqidno:126)、tttttttttctaagcaccactttt(seqidno:127)、ttttttttttttttgggtgtctaa(seqidno:128)、tttttttttggtgtctaagcacca(seqidno:129)、tttttttttacaaaccaagtgagaa(seqidno:60)、ttttttttaagtgagaagtacctaa(seqidno:130)、ttttttttttttcaaaccaagtgag(seqidno:131)、ttttttttttaccaagtgagaagta(seqidno:132)、ttttttttagctcaaaccaagtgag(seqidno:133)、ttttttttttagaggcagaaaaaaact(seqidno:61)、ttttttttttgcagaaaaaaactattg(seqidno:138)、tttttttttttcagaaaaaaactattgatt(seqidno:139)、tttttttagaaagaggcagaaaaaaact(seqidno:140)和/或tttttttttttgaggcagaaaaaaacta(seqidno:141)(还设想了包含这些不包含5'腺嘌呤和/或胸腺嘧啶的序列的探针)。在一些实施方案中，每一种探针偶联至具有独特的标识符的本公开的微载体。
适合于检测kras基因中的突变(例如，编码g12d、g12v、g12s和g13d突变的kras蛋白的kras突变)的本公开的试剂盒或制品可任选地包括：对kras基因中的一个或多个突变具有特异性的本公开的4种探针，其中所述四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体；包含序列gtactggtggagtatttgatagtg(seqidno:1)和atcgtcaaggcactcttgcctac(seqidno:2)的引物对；和/或包含以下序列的阻断核酸：tacgccaccagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:3)；ttggagctggtggcgtainvdtinvdtinvdt(seqidno:142)；gctggtggcgtaggcainvdtinvdtinvdt(seqidno:143)；gctggtggcgtaggcinvdtinvdtinvdt(seqidno:144)或ttggagctggtggcgtinvdtinvdtinvdt(seqidno:145)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，试剂盒包含：分别含有以下序列的四种探针：ggagctgatgg(seqidno:4)、ggagctgttgg(seqidno:5)、tggagctagtgg(seqidno:6)和tggagctggtgacgt(seqidno:7)；分别包含以下探针的四种探针：包含选自以下序列的序列的第一探针：ggagctgatgg(seqidno:4)、agctgatggcgta(seqidno:178)、tggagctgatggcg(seqidno:179)、tggagctgatgg(seqidno:180)或gctgatggcgta(seqidno:181)；包含选自以下序列的序列的第二探针：ggagctgttgg(seqidno:5)、tggagctgttggtggc(seqidno:182)、ggagctgttggtg(seqidno:183)、tggagctgttggt(seqidno:184)或tggagctgtaggtgg(seqidno:185)；包含选自以下序列的序列的第三探针：ttggagctagtggcgta(seqidno:186)、gctagtggcgtaggc(seqidno:187)、agctagtggcgt(seqidno:188)、gttggagctagtgg(seqidno:189)或ggagctagtgg(seqidno:190)；以及包含选自以下序列的序列的第四探针：ggtgacgtaggcaa(seqidno:191)、tgacgtaggcaagag(seqidno:192)、gctggtgacgtagg(seqidno:193)、agctggtgacgtag(seqidno:194)或ggagctggtgacgt(seqidno:195)；或分别包含以下探针的四种探针：包含选自以下序列的序列的第一探针：ttttttttttttaaggagctgatgg(seqidno:47)、ttttttttttttagctgatggcgta(seqidno:74)、ttttttttttatggagctgatggcg(seqidno:75)、ttttttttttttatggagctgatgg(seqidno:76)和tttttttttttttgctgatggcgta(seqidno:77)；包含选自以下序列的序列的第二探针：ttttttttttttaaggagctgttgg(seqidno:48)、ttttttttatggagctgttggtggc(seqidno:78)、ttttttttttaaggagctgttggtg(seqidno:79)、tttttttttttatggagctgttggt(seqidno:80)和tttttttttatggagctgtaggtgg(seqidno:81)；包含选自以下序列的序列的第三探针：tttttttttttatggagctagtgg(seqidno:49)、ttttttttttggagctagtggcgta(seqidno:82)、tttttaatttgctagtggcgtaggc(seqidno:83)、tttttttttatttagctagtggcgt(seqidno:84)、tttttttttttgttggagctagtgg(seqidno:85)和ttttttttttttaaggagctagtgg(seqidno:86)；和tttttttttatggagctggtgacgt(seqidno:50)(还设想了包含这些不包含5'腺嘌呤和/或胸腺嘧啶的序列的探针)。试剂盒可以任选地包括下文中所述的用于检测braf、ctnnb1和/或apc基因中的突变的任何元件。在一些实施方案中，每一种探针偶联至具有独特的标识符的本公开的微载体。
适合于检测braf基因中的突变(例如，编码v600e突变的braf蛋白的两种或更多种braf突变)的本公开的试剂盒或制品可任选地包括：对braf基因中的一个或多个突变具有特异性的本公开的两种探针，其中所述两种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体；包含序列ggacccactccatcgagattt(seqidno:8)和cagatatatttcttcatgaagacctcacagtaa(seqidno:9)的引物对；和/或包含以下序列的阻断核酸：gagatttcactgtagc(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:10)；gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:146)；gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:147)；gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:148)或gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:149)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，试剂盒包含：分别包含序列tctagctacagagaaat(seqidno:11)和gtctagctacagaaaaat(seqidno:12)的两种探针；分别包含序列ttttttaatttctagctacagagaaat(seqidno:51)和tttttttatgtctagctacagaaaaat(seqidno:52)的两种探针；(1)包含选自以下序列的序列的第一探针：tacagagaaatctcgat(seqidno:196)、tacagagaaatctc(seqidno:197)、ctagctacagagaaat(seqidno:198)、ctagctacagagaaa(seqidno:199)和tctagctacagag(seqidno:200)；和(2)分别包含选自以下序列的序列的第二探针：gtctagctacagaaaaatc(seqidno:201)、gtctagctacagaaaaat(seqidno:12)、tagctacagaaaaa(seqidno:202)、tctagctacagaaaaat(seqidno:203)和tctagctacagaaaaatc(seqidno:204)；或(1)包含选自以下序列的序列的第一探针：ttttttaatttctagctacagagaaat(seqidno:51)、tttttttttatacagagaaatctcgat(seqidno:92)、tttttttttaatttacagagaaatctc(seqidno:93)、ttttttaattactagctacagagaaat(seqidno:94)、tttttttaattactagctacagagaaa(seqidno:95)和ttttttttttaatttctagctacagag(seqidno:96)；和(2)分别包含选自以下序列的序列的第二探针：tttttttatgtctagctacagaaaaat(seqidno:52)、ttttatgtctagctacagaaaaatc(seqidno:97)、ttttttttatttttagctacagaaaaa(seqidno:98)、tttttttatttctagctacagaaaaat(seqidno:99)和ttttttttattctagctacagaaaaatc(seqidno:100)(还设想了包含这些不包含5'腺嘌呤和/或胸腺嘧啶的序列的探针)。试剂盒可以任选地包括下文中所述的用于检测kras基因中的突变的任何元件，和/或下文中所述的用于检测ctnnb1和/或apc基因中的突变的任何元件。在一些实施方案中，每一种探针偶联至具有独特的标识符的本公开的微载体。
适合于检测ctnnb1基因中的突变(例如，编码t41a、t41i、s45f和s45p突变的ctnnb1蛋白的ctnnb1突变)的本公开的试剂盒或制品可任选地包含：对ctnnb1基因中的一个或多个突变具有特异性的本公开的四种探针，其中所述四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体；包含序列ggaatccattctggtgccact(seqidno:13)和agaaaatccctgttcccactcata(seqidno:14)的第一引物对，和包含序列ggtgccactaccacagctcct(seqidno:18)和tctcaaaactgcattctgactttca(seqidno:19)的第二引物对；和/或包含以下序列的第一阻断核酸：gccactaccacagct(invdt)n，其中n为1、2或3(seqidno:15)；tgccactaccacaginvdtinvdtinvdt(seqidno:150)；cactaccacagctccinvdtinvdtinvdt(seqidno:151)；gccactaccacagctinvdtinvdtinvdt(seqidno:152)或gccactaccacagctinvdtinvdtinvdt(seqidno:153)，和包含以下序列的第二阻断核酸：gctccttctctgagtinvdtinvdtinvdt(seqidno:20)、tccttctctgagtgginvdtinvdtinvdt(seqidno:174)、gctccttctctgagtinvdtinvdtinvdt(seqidno:175)、tccttctctgagtgginvdtinvdtinvdt(seqidno:176)和gctccttctctgagtinvdtinvdtinvdt(seqidno:177)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，试剂盒包含：分别包含以下序列的四种探针：aggagctgtggcag(seqidno:16)、ggagctgtgata(seqidno:17)、tttaccactcagaaaag(seqidno:21)和taccactcagaggag(seqidno:22)；包含以下探针的四种探针：包含选自以下序列的序列的第一探针：aggagctgtggcagt(seqidno:205)、aggagctgtggcagtg(seqidno:206)、gctgtggcagtggc(seqidno:207)、gctgtggcagtggca(seqidno:208)和aaggagctgtggcag(seqidno:209)；包含选自以下序列的序列的第二探针：ggagctgtgatagtgg(seqidno:210)、gagctgtgatagtggc(seqidno:211)、agctgtgatagtggca(seqidno:212)、agaaggagctgtgata(seqidno:213)和ggagctgtgat(seqidno:214)；包含选自以下序列的序列的第三探针：actcagaaaaggagct(seqidno:215)、taccactcagaaaagga(seqidno:216)、tttaccactcagaaaaggag(seqidno:217)、ttaccactcagaaaag(seqidno:218)和cagaaaaggagctgtg(seqidno:219)；以及(4)包含选自以下序列的序列的第四探针：actcagaggaggagc(seqidno:220)、ttaccactcagagga(seqidno:221)、ttaccactcagaggagg(seqidno:222)、ttaacactcagaggag(seqidno:223)和ttaccaatcagaggagg(seqidno:224)；或包含以下探针的四种探针：包含选自以下序列的序列的第一探针：tttttttttttaggagctgtggcag(seqidno:53)、tttttttttttaggagctgtggcagtg(seqidno:101)、tttttttttttagctgtggcagtggc(seqidno:102)、tttttttttttgctgtggcagtggca(seqidno:103)和ttttttttttaaggagctgtggcag(seqidno:104)；包含选自以下序列的序列的第二探针：tttttttttttttggagctgtgata(seqidno:54)、tttttttttggagctgtgatagtgg(seqidno:105)、tttttttttgagctgtgatagtggc(seqidno:106)、tttttttttagctgtgatagtggca(seqidno:107)、tttttttttagaaggagctgtgata(seqidno:108)和ttttttttttttttggagctgtgat(seqidno:109)；包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：tttttttttttaccactcagaaaag(seqidno:55)、tttaattttactcagaaaaggagct(seqidno:110)、ttttttaataccactcagaaaagga(seqidno:111)、ttttttttaccactcagaaaaggag(seqidno:112)、ttttttttattaccactcagaaaag(seqidno:113)和tttttttttcagaaaaggagctgtg(seqidno:114)；和(4)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：tttttttttaataccactcagaggag(seqidno:56)、tttttttttaaaactcagaggaggagc(seqidno:115)、tttttttttttattaccactcagagga(seqidno:116)、tttttttttattaccactcagaggagg(seqidno:117)、ttttttttttattaacactcagaggag(seqidno:118)和tttttttttattaccaatcagaggagg(seqidno:119)，其中所述四种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体(还设想了包含这些不包含5'腺嘌呤和/或胸腺嘧啶的序列的探针)。试剂盒可任选地包括上文所述的用于检测kras和/或braf基因中的突变的任何元件和/或上文所述的用于检测apc基因中的突变的任何元件。在一些实施方案中，每一种探针偶联至具有独特标识符的本公开的微载体。
适合于检测apc基因中的突变(例如，编码q1367*、r1450*、e1309移码、s1465移码和t1556遗码突变的apc蛋白的apc突变)的本公开的试剂盒或制品可任选地包括：对apc基因中的一个或多个突变具有特异性的本公开的五种探针，其中所述五种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体；包含序列taaaaataaagcacctactgctgaaa(seqidno:23)和agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)的第一引物对；包含序列taggatgtaatcagacgacacagga(seqidno:27)和cagctgacctagttccaatctttta(seqidno:28)的第二引物对；包含序列tctccctccaaaagtggtgct(seqidno:31)和tggcaatcgaacgactctcaa(seqidno:32)的第三引物对；包含序列gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)和ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)的第四引物对，其中斜体核酸表示锁核酸；以及包含序列caggaaaatgacaatgggaatg(seqidno:39)和atctaataggtccttttcagaatcaatag(seqidno:40)的第五引物对；和/或包含以下序列的第一阻断核酸：ccactctctctcttttcagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:25)、taggtccactctctctcttttcagcainvdtinvdtinvdt(seqidno:166)、taggtccactctctctcttttcagcainvdtinvdtinvdt(seqidno:167)、ccactctctctcttttcagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:168)或taggtccactctctctcttttcagcainvdtinvdtinvdt(seqidno:169)；包含以下序列的第二阻断核酸：cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:29)、cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:154)、cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:155)、cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:156)或cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:157)；包含以下序列的第三阻断核酸：gtgctcagacaccinvdtinvdtinvdt(seqidno:33)、gtgctcagacaccinvdtinvdtinvdt(seqidno:158)、agtggtgctcagacacccainvdtinvdtinvdt(seqidno:159)、agtggtgctcagacacccainvdtinvdtinvdt(seqidno:160)或agtggtgctcagacacccainvdtinvdtinvdt(seqidno:161)；包含以下序列的第四阻断核酸：cttctcgcttggttinvdtinvdtinvdt(seqidno:37)、gtacttctcgcttggtinvdtinvdtinvdt(seqidno:162)、cttctcgcttggttinvdtinvdtinvdt(seqidno:163)、gtacttctcgcttggtinvdtinvdtinvdt(seqidno:164)或gtacttctcgcttggtinvdtinvdtinvdt(seqidno:165)以及包含以下序列的第五阻断核酸：caatagttttttctgccinvdtinvdtinvdt(seqidno:41)、gaatcaatagttttttctgcctcinvdtinvdtinvdt(seqidno:170)、tcagaatcaatagttttttctginvdtinvdtinvdt(seqidno:171)、gaatcaatagattttactgcctcinvdtinvdtinvdt(seqidno:172)或aatcaatagttttttctgcctcinvdtinvdtinvdt(seqidno:173)，其中斜体核酸表示锁核酸。在一些实施方案中，试剂盒包含：分别包含以下序列的五种探针：actgctgaaaagagagagt(seqidno:26)、gaaataaaagattgg(seqidno:30)、ttttgggtgtctaag(seqidno:34)、caaaccaagtgagaa(seqidno:38)和agaggcagaaaaaaact(seqidno:42)；分别包含以下探针的五种探针：(1)包含选自以下序列的序列的第一探针：aaatagcagaaataaaag(seqidno:225)、gaaataaaagattggaa(seqidno:226)、agaaataaaagattg(seqidno:227)、gaaataaatgaatgg(seqidno:228)和cagaaataaaagatt(seqidno:229)；(2)包含选自以下序列的序列的第二探针：tttgggtgtctaag(seqidno:230)、gggtgtctaagcaccact(seqidno:231)、ctaagcaccactttt(seqidno:232)、ttttgggtgtctaa(seqidno:233)和ggtgtctaagcacca(seqidno:234)；(3)包含选自以下序列的序列的第三探针：aagtgagaagtacctaa(seqidno:235)、caaaccaagtgagaa(seqidno:38)、tcaaaccaagtgag(seqidno:236)、accaagtgagaagta(seqidno:237)和agctcaaaccaagtgag(seqidno:238)；(4)包含选自以下序列的序列的第四探针：gcacctactgctgaa(seqidno:239)、acctactgctgaaaag(seqidno:240)、tgctgaaaagagagagt(seqidno:241)、actgctgaaaagagagagt(seqidno:26)和cctactgctgaaaagaga(seqidno:242)；以及(5)包含选自以下序列的序列的第五探针：gcagaaaaaaactattg(seqidno:243)、agaggcagaaaaaaact(seqidno:42)、cagaaaaaaactattgatt(seqidno:244)、agaaagaggcagaaaaaaact(seqidno:245)和gaggcagaaaaaaacta(seqidno:246)；或分别包含以下探针的五种探针：(1)包含选自由以下组成的组的序列的第一探针：tttttttttttttgaaataaaagattgg(seqidno:58)、ttttttttttaaatagcagaaataaaag(seqidno:120)、tttttttttttgaaataaaagattggaa(seqidno:121)、tttttttttttttagaaataaaagattg(seqidno:122)、tttttttttttttgaaataaatgaatgg(seqidno:123)和tttttttttttttcagaaataaaagatt(seqidno:124)；(2)包含选自由以下组成的组的序列的第二探针：tttttttttttttgggtgtctaag(seqidno:59)、tttttttttatttgggtgtctaag(seqidno:125)、ttttttgggtgtctaagcaccact(seqidno:126)、tttttttttctaagcaccactttt(seqidno:127)、ttttttttttttttgggtgtctaa(seqidno:128)和tttttttttggtgtctaagcacca(seqidno:129)；(3)包含选自由以下组成的组的序列的第三探针：tttttttttacaaaccaagtgagaa(seqidno:60)、ttttttttaagtgagaagtacctaa(seqidno:130)、ttttttttttttcaaaccaagtgag(seqidno:131)、ttttttttttaccaagtgagaagta(seqidno:132)和ttttttttagctcaaaccaagtgag(seqidno:133)；(4)包含选自由以下组成的组的序列的第四探针：ttttttttactgctgaaaagagagagt(seqidno:57)、ttttttttttgcacctactgctgaa(seqidno:134)、tttttttttacctactgctgaaaag(seqidno:135)、tttttttttgctgaaaagagagagt(seqidno:136)和tttttttttcctactgctgaaaagaga(seqidno:137)；以及(5)包含选自由以下组成的组的序列的第五探针：ttttttttttagaggcagaaaaaaact(seqidno:61)、ttttttttttgcagaaaaaaactattg(seqidno:138)、tttttttttttcagaaaaaaactattgatt(seqidno:139)、tttttttagaaagaggcagaaaaaaact(seqidno:140)和tttttttttttgaggcagaaaaaaacta(seqidno:141)；其中所述五种探针中的每一种偶联至具有不同标识符的微载体(还设想了包含这些不包含5'腺嘌呤和/或胸腺嘧啶的序列的探针)。试剂盒可任选地包括上文所述的用于检测kras、braf和/或ctnnb1基因中的突变的任何元件。在一些实施方案中，每一种探针偶联至具有独特标识符的本公开的微载体。在任何上文实施方案的一些实施方案中，可以以任何顺序或组合来组合针对1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种或15种本文所述的突变的引物、探针和/或阻断核酸的组合。
在一些实施方案中，试剂盒包含具有对应于阳性对照的标识符并与对阳性对照基因序列具有特异性的探针偶联的微载体以及对阳性对照dna序列具有特异性的引物对。例如，在一些实施方案中，阳性对照dna序列包含人白细胞抗原(hla)基因的序列，对阳性对照dna序列具有特异性的探针对包含序列tgagtgttacttcttcccacactc(seqidno:43)和attgcttttgcgcaatccct(seqidno:44)，和/或对阳性对照基因序列具有特异性的探针包含序列ttttttttttttggagacggtctg(seqidno:45)。在一些实施方案中，阳性对照dna序列包含人甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因的序列，对阳性对照dna序列具有特异性的引物对包含序列aatcccatcaccatcttcca(seqidno:71)和tggactccacgacgtactca(seqidno:72)，和/或对阳性对照基因序列具有特异性的探针包含序列ctgtcttccactcactcc(seqidno:73)。在一些实施方案中，每一种探针偶联至具有独特标识符的本公开的微载体。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含具有对应于阴性对照的标识符，例如具有不与扩增的dna杂交的探针的本公开的微载体。在一些实施方案中，具有对应于阴性对照的标识符的微载体包含含有序列aatataatatattat(seqidno:46)的探针。
在一些实施方案中，试剂盒包含引物对，其中引物对中的一个或两个引物被检测试剂(例如，如下文中所述的)标记。在一些实施方案中，检测试剂包括荧光检测试剂。在一些实施方案中，检测试剂包含生物素，并且试剂盒包含与信号发射实体缀合的链霉亲和素(例如，与藻红蛋白缀合的链霉亲和素)。
在一些实施方案中，所述试剂盒或制品还可包括一种或多种本公开的检测试剂，用于检测与第一微载体缔合的第一分析物的量和与第二微载体缔合的第二分析物的量。在一些实施方案中，用于第一分析物的检测试剂可以与用于第二分析物的检测试剂相同。在其它实施方案中，用于第一分析物的检测试剂可以与用于第二分析物的检测试剂不同。
在一些实施方案中，试剂盒或制品还可包括使用所述试剂盒或制品检测本公开的一个或多个dna突变的说明书。这些说明书可用于将试剂盒或制品例如用于本文所述的任何方法中。
在一些实施方案中，所述试剂盒或制品还可包括一种或多种检测试剂(例如，如上所述的，例如与pe缀合的链霉亲和素)以及适用于将检测试剂偶联至一种或多种分析物或用于将检测试剂偶联至识别分析物的一种或多种大分子的任何说明书或试剂。试剂盒或制品还可包括用于在测定(例如，多重测定)中使用微载体的任何另外的组件，包括但不限于平板(例如，96孔或其它类似的微量滴定板)、培养皿、显微镜载玻片或其它合适的测定容器；非暂时性计算机可读存储介质(例如，包含用于模拟形状或代码识别的软件和/或其它指令)；洗涤剂；缓冲剂；板密封剂；混合容器；稀释剂或储存溶液等。
vi.制备编码微载体的方法
本公开的某些方面涉及制备编码微载体例如本文所述的微载体的方法。制备编码微载体的方法可包括本文中(例如，在上文第iv部分中)所述的微载体特性或方面中的一个或多个特性或方面。
在一些实施方案中，所述方法包括沉积基本上透明的聚合物层，其中所述基本上透明的聚合物层具有第一表面和第二表面，所述第一表面与所述第二表面彼此平行。在一些实施方案中，彼此平行的所述第一和第二表面可以是单层的顶表面和底表面。可使用本领域已知的或本文所述的任何合适的基本上透明的聚合物。在一些实施方案中，使用旋涂沉积基本上透明的聚合物层。
在一些实施方案中，可将基本上透明的聚合物层沉积在基板上。合适的基板可以包括用于标准半导体和/或微机电系统(mems)制造技术的基板。在一些实施方案中，基板可包括玻璃、硅、石英、塑料、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、氧化铟锡(ito)涂层等。
在一些实施方案中，可将牺牲层沉积在基板(例如，如上所述的基板)上。在一些实施方案中，牺牲层可以由聚合物(包括但不限于聚乙烯醇(pva)或omnicoattm(microchem；newton,ma))制成。可以例如根据制造商的说明施加、使用和溶解或剥离牺牲层。
在一些实施方案中，将本公开的基本上透明的聚合物层沉积在牺牲层上。为了使用基本上透明的聚合物层生成平面微载体表面，可将基本上透明的聚合物层沉积在平面牺牲层上。为了生成具有从其突出的一个或多个柱的微载体表面，可以例如通过使用标准光刻工艺，使牺牲层(例如，沉积到基板上的牺牲层)图案化而具有一个或多个柱形孔或空隙区域。在一些实施方案中，可将基本上透明的聚合物层沉积在牺牲层和任选的基板上，使得该层沉积在一个或多个柱形孔或空隙区域中。在一些实施方案中，然后可将另一个基本上透明的聚合物层沉积在牺牲层上，并且用所述第一基本上透明的聚合物层填充一个或多个柱状孔或空隙区域。在其它实施例中(例如，如图15b的框1540所示出的)，将第二基本上透明的聚合物层沉积或烘烤至第一基本上透明的聚合物层上，然后图案化以生成从第一基本上透明的聚合物层突出的一个或多个柱。
在一些实施方案中，将本公开的基本上不透明的磁层沉积在基本上透明的聚合物层的第一表面上。在一些实施方案中，通过溅射沉积基本上不透明的磁层。基本上不透明的磁层可以由例如任何本文所述的磁性材料制成。例如，在一些实施方案中，基本上不透明的磁层包含镍(例如，元素镍或其合金)。
在一些实施方案中，可以蚀刻基本上不透明的磁层，以去除沉积在基本上透明的聚合物层的中心部分上的基本上不透明的磁层的一部分。可通过本领域已知的任何方法蚀刻基本上不透明的磁层。例如，在一些实施方案中，通过常规湿法蚀刻来蚀刻基本上不透明的磁层。上文中提供了用于基本上不透明的磁层的示例性尺寸、形状和任选的不对称性。在一些实施方案中，将基本上不透明的磁层图案化成本公开的环形(例如，包围基本上透明的聚合物层的中心部分的一个或多个环，其中至少一个环包含不连续性，如图4b中所示)。在一些实施方案中，将基本上不透明的磁层图案化成本公开的齿轮形状。在一些实施方案中，将基本上不透明的聚合物层沉积在第二基本上透明的聚合物层上，并蚀刻(例如，使用标准光刻或光刻工艺)成所需的二维形状。
在一些实施方案中，将本公开的第二基本上透明的聚合物层沉积在基本上不透明的磁层上。在一些实施方案中，第二基本上透明的聚合物层具有彼此平行的第一表面和第二表面(例如，单层的顶表面和底表面)。在一些实施方案中，第二表面被固定至基本上不透明的磁层。在一些实施方案中，第二基本上透明的聚合物层与第一基本上透明的聚合物层对齐，并且具有与基本上透明的聚合物层的中心部分对齐的中心部分。上文中提供了基本上透明的聚合物层的中心部分的示例性尺寸。
在一些实施方案中，将本公开的基本上不透明的聚合物层沉积在第二基本上透明的聚合物层的第一表面上。在一些实施方案中，基本上不透明的聚合物层包围第一基本上透明的聚合物层和第二基本上透明的聚合物层的中心部分。在一些实施方案中，基本上不透明的聚合物层包含表示模拟代码的二维形状。可使用任何本文所述或示例的二维形状，例如，本公开的齿轮形状。在一些实施方案中，将基本上不透明的聚合物层沉积在第二基本上透明的聚合物层上，并蚀刻(例如，使用标准光刻工艺)成所需的二维形状。
在一些实施方案中，可将一个或多个柱沉积在基本上透明的聚合物上，例如，在未被基本上不透明的聚合物层覆盖的部分处的第二基本上透明的聚合物层的第一表面上。可以如本文所述，例如使用标准光刻工艺沉积一个或多个柱。
在采用本公开的任选的牺牲层和/或基板的一些实施方案中，可使用溶剂溶解或剥离牺牲层，和/或去除基板。用于制造的各种溶剂(例如，在标准半导体或mems制造工艺中，诸如光致抗蚀剂去除)在本领域中是已知的。在一些实施方案中，溶剂是光致抗蚀剂剥离溶剂诸如基于dmso-或1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)的溶剂。在一些实施方案中，溶剂是
在一些实施方案中，所述方法包括在本公开的基板上沉积本公开的牺牲层。例如，如上所述描述了牺牲层、基板和合适的沉积方法。
在一些实施方案中，将本公开的基本上不透明的聚合物层沉积在牺牲层上。在一些实施方案中，基本上不透明的聚合物层具有彼此平行的第一表面和第二表面(例如，单层的顶部表面和底部表面)。在一些实施方案中，第二表面被固定至牺牲层。
在一些实施方案中，将基本上不透明的聚合物层的轮廓被塑形成表示模拟代码(例如，如本文所述的模拟代码)的二维形状。基本上不透明的聚合物层可以通过本领域已知的或本文所述的任何方法(例如，使用标准光刻工艺，包括但不限于旋涂、软烤、uv曝光、蚀刻和硬烤)塑形。
在一些实施方案中，可使用溶剂(例如，如上所述的溶剂)溶解或剥离牺牲层，和/或去除基板。
在其它实施方案中，将包含本公开的磁性材料的磁层沉积在牺牲层上。上文中提供了示例性磁性材料、磁层形状/尺寸以及与其相关的沉积方法。例如，在一些实施方案中，可将磁层塑形为一个或多个柱，例如，如柱906所示的。在其它实施方案中，磁层可在两个不透明的聚合物层之间，例如，如由磁层704所示的嵌入的。磁性材料可包含例如任何本文所述的磁性材料。例如，在一些实施方案中，磁性材料包含镍(例如，元素镍或其合金)。
在一些实施方案中，将本公开的基本上不透明的聚合物层沉积在磁层上。在一些实施方案中，基本上不透明的聚合物层具有彼此平行的第一表面和第二表面(例如，单层的顶部和底部表面)。在一些实施方案中，基本上不透明的聚合物层的表面(例如，第二表面)被固定至磁层。
在一些实施方案中，将基本上不透明的聚合物层的轮廓塑形为表示模拟代码(例如，如上所述的模拟代码)的二维形状。
在一些实施方案中，可以使用溶剂(例如，如上所述的溶剂)溶解或剥离牺牲层，和/或去除基板。
在整个本公开中提供了适合于上述方法的示例性微载体形状、尺寸和可选特征。在下文中参考图10-13c描述用于制备本公开的各种微载体的示例性过程1000、1100、1200和1300。
图10中所示的过程1000。图10示出了用于制造单层微载体(诸如上述的那些微载体)的示例性工作流程。在框1002处，在基板1004上构建牺牲层1006。在一些实施方案中，基板1004可以是玻璃基板。在框1010处，将层1012沉积在牺牲层1006上。在一些实施方案中，层1012是不透明的聚合物层。在框1020处，使用光刻将层1012的周边塑形成齿轮形状(如上所述)以生成齿轮形层1022。在框1030处，将整个结构(即，层1022、牺牲层1006和基板1004)浸入溶剂中。该溶剂处理溶解牺牲层1006并从基板1004释放齿轮形层1022，从而生成微载体1032。在一些实施方案中，可以例如通过将捕获剂耦合至一个或两个表面来进一步修饰微载体1032。
如上所述，齿轮形微载体可包含任选的元件，诸如磁性组件(例如，柱和/或磁层)。图11a和11b中所示的过程1100示出了用于制造具有一个或多个磁性组件的齿轮形微载体的示例性工作流程。
如图11a所示，在框1102处，在基板1104上构建牺牲层1106。在一些实施方案中，基板1104可以是玻璃基板。在框1110处，将磁层1112沉积在牺牲层1106上。在一些实施方案中，磁层1112包含镍。在框1120处，通过光刻将磁层1112塑形为成形的磁层1122。成形的磁层1122可采用任何期望的形状，诸如，其可被塑形为一个或多个柱，如图9a中对于柱906所示出的。
如图11b所示，在框1130处，在成形的磁层1122和牺牲层1106上方沉积基本上不透明的聚合物层1132。在框1140处，通过光刻将层1132的周边塑形为齿轮形的基本上不透明的层1142(诸如图6a-9a中示出的齿轮形状之一)。在框1150处，将整个结构(即，层1142、成形的磁层1122、牺牲层1106和基板1104)浸入溶剂中。该溶剂处理溶解牺牲层1106并从基板1104释放齿轮形层1142和成形的磁层1122，从而生成微载体1152。在一些实施方案中，可以例如通过将捕获剂耦合至一个或两个表面进一步修饰微载体1152。
图12a-12e示出了过程1200，用于制造具有基本上透明的聚合物层、基本上不透明的聚合物层(其二维形状构成模拟代码)和一个或多个柱的微载体的示例性工作流程。
从图12a开始，在框1202处，将牺牲层1206沉积(诸如，通过旋涂)到基板1204上。在一些实施方案中，基板1204可以是玻璃基板。在框1208，施加掩模1210，并且用uv光对牺牲层1206进行曝光。通过掩模1210施加uv光，允许uv光段1212和1214穿过并处理牺牲层1206。在框1216处，在通过标准光刻显影对结构显影之后，作为掩蔽uv处理的结果，将牺牲层1206塑形为成形的牺牲层1218。
过程1200在框1220(图12b)处继续，其中成形的牺牲层1218中的掩模孔填充有基本上透明的聚合物，从而产生柱1222和1224。在框1226处，在柱1222和1224以及成形的牺牲层1218的上方沉积基本上透明的聚合物层1228。
过程1200在框1230(图12c)处继续，其中将磁层1232沉积在层1228上。在一些实施方案中，磁层1232包含镍。在一些实施方案中，通过溅射沉积磁层1232。在框1234处，将蚀刻块层沉积在磁层1232上方，如由蚀刻块1236和1238所示。在框1240处，蚀刻掉磁层1232的未被阻挡的区段，生成成形的磁层1242。在一些实施方案中。成形的磁层1242可以被塑形为围绕层1228的中心部分的环形状(具有用于指示定向的任选的不对称性)(参见，例如，图2a中的层206)。在框1244处，去除蚀刻块层(如由蚀刻块1236和1238所示)。
过程1200在框1246(图12d)处继续，其中将基本上透明的聚合物层1248沉积在层1228和1242上方(填充通过蚀刻阻挡产生的层1242中的任何孔)。在框1250处，在层1248的顶部上通过光刻来沉积基本上不透明的层1252并对其进行塑形。在一些实施方案中，将层1252塑形为在围绕磁层1242的环中具有一个或多个齿轮齿(参见，例如，图2a的相对于层202和层206以及中心部分208的层204)。
过程1200在框1254(图12e)处继续，其中通过在层1248顶部上进行光刻来对柱1256和1258进行塑形。在一些实施方案中，柱1256和1258由基本上透明的聚合物制成。在一些实施方案中，柱如图5a和5b中所示定位。在框1260处，将基板1204切割成一个或多个相同形状的微载体(即，为了简化解释，在图12a-12e中仅描绘了一个微载体，在过程1200中可在基板1204上构造不止一个的微载体)。同样在框1260处，将整个结构(即，包括1204、1218、1222、1224、1228、1242、1248、1252、1256和1258)浸入溶剂中。该溶剂处理溶解牺牲层1218并从基板1204释放微载体1262。在一些实施方案中，可以例如通过将捕获剂中耦合至一个或两个表面来进一步修饰微载体1262。
图13a-13c示出了过程1300，用于生成不同类型的多层微载体的示例性工作流程。从图13a开始，在框1302处，将牺牲层1306沉积在基板层1304上。在一些实施方案中，基板1304是玻璃基板。在框1308处，将基本上透明的层1310沉积在牺牲层1306上方。在框1312处，将磁层1314沉积在层1310上方。在一些实施方案中，磁层1314包含镍。
过程1300在框1316(图13b)处继续，其中将磁层1314限定为成形的磁层1318。在一些实施方案中，成形的磁层1318被限定为围绕层1310的中心部分的环形状(具有用于指示定向的任选的不对称性)(参见，例如，图2a中的层206)。在框1320处，将基本上透明的层1322沉积在层1318和1310上方，填充通过限定成形的层1318而产生的任何孔。在框1324处，将基本上不透明的聚合物层1326沉积在层1322上方。
过程1300在框1328(图13c)处继续，其中通过光刻将基本上不透明的聚合物层1326塑形为齿轮形的基本上不透明的聚合物层1330。在一些实施方案中，将层1330塑形为在围绕成形的磁层1318的环中具有一个或多个更多齿轮齿(参见，例如，图2a的相对于层202和206以及中心部分208的层204)。在框1332处，将整个结构(即，包括1304、1306、1310、1318、1322和1330)浸入溶剂中。该溶剂处理溶解牺牲层1306并从基板1304释放微载体1334。在一些实施方案中，可以例如通过将捕获剂耦合至一个或两个表面进一步修饰微载体1334。
如上所述，在一些实施方案中，本公开的微载体包括基本上不透明的磁性聚合物层，其被固定到基本上透明的聚合物层的第一表面上并且可以用于例如生成本公开的模拟代码。在下文中更详细地描述了用于制备这种微载体的示例性方法。
在一些实施方案中，所述方法包括沉积基本上透明的聚合物层，其中所述基本上透明的聚合物层具有第一表面和第二表面，所述第一和第二表面彼此平行；将所述基本上透明的聚合物层图案化成微载体形状；将基本上不透明的磁性聚合物层沉积在基本上透明的聚合物层的第一表面上；以及图案化基本上不透明的磁性聚合物层以生成表示模拟代码的二维形状。
在一些实施方案中，使用旋涂或喷涂来沉积本公开的基本上透明的聚合物层。在一些实施方案中，使用旋涂或喷涂来沉积本公开的基本上不透明的磁性聚合物层。本文描述了各种沉积技术并且所述沉积技术是本领域已知的。可使用本领域已知的用于沉积聚合物诸如su-8的任何合适的方法。
在一些实施方案中，该方法包括沉积基本上不透明的磁性聚合物层；图案化基本上不透明的磁性聚合物层以生成表示模拟代码的二维形状；将基本透明的聚合物层沉积在图形化的基本上不透明的磁性聚合物层上，其中基本上透明的聚合物层具有第一表面和第二表面，所述第一表面和第二表面彼此平行；以及将基本上透明的聚合物层图案化成微载体形状。
在一些实施方案中，本公开的探针可偶联至本公开的微载体，例如，本文描述的微载体和/或通过任何本文描述的方法产生的微载体。本文描述的任何探针可用于本公开的方法和/或微载体。在第iv部分中提供了用于将探针耦合至微载体的技术的示例性和非限制性描述。
实施例
通过参考以下实施例将更全面地理解本公开。然而，它们不应被解释为限制本公开的范围。应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且可以建议本领域技术人员对其进行各种修改或改变，并且所述修改或改变包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求的范围内。
实施例1：使用编码微载体对结直肠癌相关突变进行多重检测
如上所述，癌症相关dna突变的多重筛选代表了用于早期癌症检测的有吸引力的技术。特别地，使用从粪便样品中分离的dna对结直肠癌相关dna突变进行多重筛选代表了用于早期检测的非侵入性方法。以下实施例描述了用于多重筛选以鉴定与结直肠癌相关的多种重要dna突变的基于微载体的方法的验证。
材料和方法
dna样品制备
图14中提供了用于使用编码的微载体测试突变检测的方法的流程图。使用标准技术，从表c中描述的质粒或表b中描述的k562细胞中分离dna。根据制造商的说明，使用nanodroptmuv-vis分光光度计(thermoscientific)或
在下表a中提供在这些实验中检测到的突变。
表a.检测到的突变.
对于检测限(lod)测试(结果示于图18a和图18b中)，从k562细胞中提取dna用作“野生型”dna。使用携带突变的kras、braf、ctnnb1或apc序列的质粒获得具有各种目标突变之一的dna。将野生型和突变型dna混合并稀释以获得12.5ng/μl的总dna浓度，其中比率为1％突变型dna对比99％野生型dna。用于实验的每种dna样品的浓度示于下面的表b和表c中。
表b.野生型dna.
表c.突变的dna.
pcr
使用突变富集pcr从上面制备的dna样品中选择性扩增具有目标突变的多核苷酸。具有3'反向dt核苷酸的锁核酸(lna)用于阻断野生型dna序列的扩增，从而富集目标突变。简而言之，在pcr反应中包含阻断核酸以阻断野生型基因座的扩增。阻断核酸与野生型基因座的有义链杂交，并阻止引物延伸以从有义链扩增，如图15所示。使用lna是因为与具有标准核酸的寡核苷酸相比，杂交更稳定。样品中存在的突变基因座的任何拷贝可以通过pcr扩增而不受阻断核酸的干扰，因为其不与突变序列杂交(图16)。使用以下引物对：seqidno:1和2、8和9、13和14、18和19、23和24、27和28、31和32、35和36、39和40。使用以下阻断核酸：seqidno:3、10、15、20、29、33、37、25和41。
将每个样品涡旋混合，然后离心并保持在冰上。pcr反应如下进行。对于每个样品，根据表d和表e中列出的量进行两次pcr反应。每个pcr反应包括4μl12.5ng/μl提取的dna，总共50ngdna。一旦在pcr管中生成pcr反应混合物，就将管通过轻敲混合，短暂旋转，并置于热循环仪中。pcr热循环条件如下表f中所述。升温速率为1℃/秒。pcr反应1包含用于检测以下突变的试剂：krasg12d、krasg12v、krasg12s、krasg13d、brafv600e1、brafv600e2、ctnnb1t41a、ctnnb1t41i、apce1309、apcq1367、apcr1450和apct1556。pcr反应2包括用于检测以下突变的试剂：ctnnb1s45f、ctnnb1s45p和apcs1465。
表d.pcr反应1.
表e.pcr反应2.
表f.pcr循环条件.
*注意：升温速率为1℃/sec。
杂交
将pcr扩增子与微载体的捕获剂探针序列杂交。探针被设计来与突变序列而不是野生型序列杂交，从而允许特异性检测突变dna(参见图15和图16)。结合使用结合野生型序列的阻断核酸，该策略使得该测定法即使在比相应野生型基因座低得多的拷贝数存在时也能检测突变体dna。使用以下探针：seqidno:47-61。
简言之，将编码的微载体(每个单独地对表a中所示的突变具有特异性)汇集到96孔板的单个孔中。通过涡旋混合微载体溶液10秒，然后如图17所示将20μl微载体溶液加入到96孔板的每个孔中。每4个孔重新涡旋微载体原液以确保均匀悬浮。向每个孔中加入100μl杂交缓冲液(5xsspe缓冲液)。将来自pcr反应1和2的pcr产物(参见表d和表e)旋转沉淀并通过加热至95℃持续5分钟变性，然后冷却至4℃。向每个孔中加入10μl变性pcr产物1或10μl变性pcr产物2。通过在37℃下以1200rpm振荡20分钟来混合测定板。然后用1x洗涤缓冲液洗涤孔。
为了检测，将50μl缀合有链霉亲和素的藻红蛋白(sa-pe)溶液加入到每个孔中，并将板再次以1200rpm在37℃下振荡10分钟。然后再次清洗孔。然后对每个孔进行模拟图像解码和荧光检测。
结果
将具有对表a所列的每种突变具有特异性的探针的微载体用于在上述lod测试测定中检测突变的dna的存在。这些实验的结果示于图18a(引物混合物1)和图18b(引物混合物2)中。基于微载体的测定以成对方式对每个突变进行验证，每次测定使用一种探针和一种突变的dna序列。列表明dna样品中存在哪种突变的dna序列。行指示哪种探针与微载体偶联用于这些测定。对于阴性对照，使用没有探针的“空白”微载体。对于阳性对照，使用对扩增的序列具有特异性的探针扩增和检测人hladna。
图18a和图18b报告了针对每个实验获得的荧光信号(以任意单位(au)表示)。如所示，在突变的dna序列与探针不匹配的几乎所有情况下，没有检测到荧光，表明探针与dna之间缺乏杂交(krasg12sdna与两种braf探针微弱交叉反应，但产生了比每种各自的brafdna样品低得多的荧光信号)。相比之下，当每种突变的dna序列与偶联有适当的微载体的探针混合时，通过强荧光信号检测到杂交。
如图18a和图18b中所示的“灵敏度”是指针对每种突变测试的lod。例如，0.10％的灵敏度表示0.1ng突变的dna与100ng的野生型dna混合。使用野生型dna未检测到阳性对照以外的信号，表明lna寡核苷酸有效阻断野生型dna扩增和/或探针序列有效消除野生型dna的杂交。
在1.0％和0.1％的灵敏度水平下进一步测试apc突变s1465的检测(图18b)。在ctnnb1s45f突变和s45p突变以及apc突变s1465之间观察到一些交叉反应性。然而，当一起测试所有基因时，检测s1465的信号，无论是否存在s45f和s45p的信号，都可以表明存在s1465突变，因为在使用s1465探针时没有观察到强烈的s45f或s45p信号。
这些结果证明了对目标个体突变的灵敏和准确的检测，即使野生型dna的存在量比目标突变序列的数量级大。有利地，串联的几个突变的多重检测产生更高的置信度和保真度，因为每个基因的检测充当所有另外的基因的内部对照。这些结果表明使用编码微载体和寡核苷酸探针鉴定来自人样品的重要癌症相关突变的快速多重策略。
实施例2：使用编码微载体对来自粪便样品的结直肠癌相关突变进行多重检测
前述实施例演示了具有寡核苷酸探针的编码的微载体用于基于分离的dna样品的癌症相关突变的多重检测癌的用途。以下实施例演示使用从粪便样品中提取的dna的该方法的功效。
材料和方法
为了从粪便样本中提取dna，将200mg的每种样本置于冰上管中，并使用
使用以上分离的dna，根据以下比例生成pcr反应物。如实施例1中所述生成引物混合物。
表g.pcr反应1.
表h.pcr反应2.
其它pcr条件(例如，热循环)、杂交条件和检测如实施例1中所述。使用以下引物对：seqidno:1和2、8和9、13和14、18和19、23和24、27和28、31和32、35和36、39和40。使用以下阻断核酸：seqidno:3、10、15、20、29、33、37、25和41。使用以下探针：seqidno:47、48、86、91、95、99、104、109、113、119、122、126、60、57和61。
结果
在结肠癌手术之前收集来自7名患者的粪便样本。从每名患者的样本中取出代表样本的不同区域的五个单独的粪便样品(每个2g)(除从患者#5中取出4外)。将每个单独的粪便样品分别在7ml稳定缓冲液(100mmedta，ph8.0)中匀浆。如上所述提取dna。从每个样品中，将10ngdna用于测定。如表i所示，从每个样品中检测到突变状态。注意，在约20名健康患者的粪便中未检测到突变。
表i.来自粪便样品的突变筛选的结果.
这些结果证明使用本文所述的方法成功地多重检测来自患者粪便样品的多种癌症相关突变。这些结果进一步证实了已知的粪便样本的异质性，证明从单个样本获得的不同样品可以产生不同的dna。而且，与实施例1相比，实施例2中使用的pcr条件可以更容易地适应具有低dna浓度的样品。在实施例1中，每个pcr反应包括4μl12.5ng/μl的提取的dna，总共50ngdna。在实施例2中，每个pcr反应可包含20μl2.5ng/μl的提取的dna，以实现总共50ngdna(或对于总共10ngdna，0.5ng/μldna原液)，从而减少起始浓度。
尽管出于清楚理解的目的通过说明和实施例详细描述了前述发明，但是描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用整体并入。
序列
除非另有说明，否则所有多肽序列均以n-末端至c-末端呈现。除非另有说明，否则所有多核苷酸序列均以5'至3'呈现。斜体核苷酸表示锁核苷酸。
krasg12和g13正向引物
gtactggtggagtatttgatagtg(seqidno:1)
krasg12和g13反向引物
atcgtcaaggcactcttgcctac(seqidno:2)
krasg12和g13阻断核酸
tacgccaccagctinvdtinvdtinvdt(seqidno:3)
krasg12d最小探针
ggagctgatgg(seqidno:4)
krasg12v最小探针
ggagctgttgg(seqidno:5)
krasg12s最小探针
tggagctagtgg(seqidno:6)
krasg13d最小探针
tggagctggtgacgt(seqidno:7)
brafv600e正向引物
ggacccactccatcgagattt(seqidno:8)
brafv600e反向引物
cagatatatttcttcatgaagacctcacagtaa(seqidno:9)
brafv600e1和v600e2阻断核酸
gagatttcactgtagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:10)
brafv600e1最小探针
tctagctacagagaaat(seqidno:11)
brafv600e2最小探针
gtctagctacagaaaaat(seqidno:12)
ctnnb1t41a和t41i正向引物
ggaatccattctggtgccact(seqidno:13)
ctnnb1t41a和t41i反向引物
agaaaatccctgttcccactcata(seqidno:14)
ctnnb1t41a和t41i阻断核酸
gccactaccacagctinvdtinvdtinvdt(seqidno:15)
ctnnb1t41a最小探针
aggagctgtggcag(seqidno:16)
ctnnb1t41i最小探针
ggagctgtgata(seqidno:17)
ctnnb1s45f和s45p正向引物
ggtgccactaccacagctcct(seqidno:18)
ctnnb1s45f和s45p反向引物
tctcaaaactgcattctgactttca(seqidno:19)
ctnnb1s45f和s45p阻断核酸
gctccttctctgagtinvdtinvdtinvdt(seqidno:20)
ctnnb1s45f最小探针
tttaccactcagaaaag(seqidno:21)
ctnnb1s45p最小探针
taccactcagaggag(seqidno:22)
apcs1465正向引物
taaaaataaagcacctactgctgaaa(seqidno:23)
apcs1465反向引物
agcttgcttaggtccactctctct(seqidno:24)
apcs1465阻断核酸
ccactctctctcttttcagcinvdtinvdtinvdt(seqidno:25)
apcs1465最小探针
actgctgaaaagagagagt(seqidno:26)
apce1309正向引物
taggatgtaatcagacgacacagga(seqidno:27)
apce1309反向引物
cagctgacctagttccaatctttta(seqidno:28)
apce1309阻断核酸
cttttcttttatttctgcinvdtinvdtinvdt(seqidno:29)
apce1309最小探针
gaaataaaagattgg(seqidno:30)
apcq1367正向引物
tctccctccaaaagtggtgct(seqidno:31)
apcq1367反向引物
tggcaatcgaacgactctcaa(seqidno:32)
apcq1367阻断核酸
gtgctcagacaccinvdtinvdtinvdt(seqidno:33)
apcq1367最小探针
ttttgggtgtctaag(seqidno:34)
apcr1450正向引物
gcagaagtaaaacacctccacca(seqidno:35)
apcr1450反向引物
ggtgctttatttttaggtacttc(seqidno:36)
apcr1450阻断核酸
cttctcgcttggttinvdtinvdtinvdt(seqidno:37)
apcr1450最小探针
caaaccaagtgagaa(seqidno:38)
apct1556正向引物
caggaaaatgacaatgggaatg(seqidno:39)
apct1556反向引物
atctaataggtccttttcagaatcaatag(seqidno:40)
apct1556阻断核酸
caatagttttttctgccinvdtinvdtinvdt(seqidno:41)
apct1556最小探针
agaggcagaaaaaaact(seqidno:42)
hla正向引物
tgagtgttacttcttcccacactc(seqidno:43)
hla反向引物
attgcttttgcgcaatccct(seqidno:44)
hla最小探针1
ggagacggtctg(seqidno:70)
阴性对照探针
aatataatatattat(seqidno:46)
krasg12d全长探针
ttttttttttttaaggagctgatgg(seqidno:47)
krasg12v全长探针
ttttttttttttaaggagctgttgg(seqidno:48)
krasg12s全长探针
tttttttttttatggagctagtgg(seqidno:49)
krasg13d全长探针
tttttttttatggagctggtgacgt(seqidno:50)
brafv600e1全长探针
ttttttaatttctagctacagagaaat(seqidno:51)
brafv600e2全长探针
tttttttatgtctagctacagaaaaat(seqidno:52)
ctnnb1t41a全长探针
tttttttttttaggagctgtggcag(seqidno:53)
ctnnb1t41i全长探针
tttttttttttttggagctgtgata(seqidno:54)
ctnnb1s45f全长探针
tttttttttttaccactcagaaaag(seqidno:55)
ctnnb1s45p全长探针
tttttttttaataccactcagaggag(seqidno:56)
apcs1465全长探针
ttttttttactgctgaaaagagagagt(seqidno:57)
apce1309全长探针
tttttttttttttgaaataaaagattgg(seqidno:58)
apcq1367全长探针
tttttttttttttgggtgtctaag(seqidno:59)
apcr1450全长探针
tttttttttacaaaccaagtgagaa(seqidno:60)
apct1556全长探针
ttttttttttagaggcagaaaaaaact(seqidno:61)
人kras氨基酸序列
人braf氨基酸序列
人ctnnb1氨基酸序列
人apc氨基酸序列
人krascdna序列
人brafcdna序列
人ctnnb1cdna序列
人apccdna序列
序列表
<110>plexbioco.,ltd.
tsao,dean
huang,chin-shiou
hu,shianpin
<120>用于dna突变的多重检测的图像差异多重测定
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<151>2017-12-08
<150>us62/432,534
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<170>fastseq用于windows4.0版
<210>1
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>合成构建体
<400>2
atcgtcaaggcactcttgcctac23
<210>3
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<223>合成构建体
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arggluilearglyshislysglulysmetserlysaspglylyslys
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<223>合成构建体
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metalaalaleuserglyglyglyglyglyglyalagluproglygln
151015
alaleupheasnglyaspmetgluproglualaglyalaglyalagly
202530
alaalaalaserseralaalaaspproalaileproglugluvaltrp
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asnilelysglnmetilelysleuthrglngluhisileglualaleu
505560
leuasplyspheglyglygluhisasnproproseriletyrleuglu
65707580
alatyrgluglutyrthrserlysleuaspalaleuglnglnargglu
859095
glnglnleuleugluserleuglyasnglythrasppheservalser
100105110
serseralasermetaspthrvalthrserserserserserserleu
115120125
servalleuproserserleuservalpheglnasnprothraspval
130135140
alaargserasnprolysserproglnlysproilevalargvalphe
145150155160
leuproasnlysglnargthrvalvalproalaargcysglyvalthr
165170175
valargaspserleulyslysalaleumetmetargglyleuilepro
180185190
glucyscysalavaltyrargileglnaspglyglulyslysproile
195200205
glytrpaspthraspilesertrpleuthrglyglugluleuhisval
210215220
gluvalleugluasnvalproleuthrthrhisasnphevalarglys
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thrphephethrleualaphecysaspphecysarglysleuleuphe
245250255
glnglypheargcysglnthrcysglytyrlysphehisglnargcys
260265270
serthrgluvalproleumetcysvalasntyraspglnleuaspleu
275280285
leuphevalserlysphephegluhishisproileproglngluglu
290295300
alaserleualagluthralaleuthrserglyserserproserala
305310315320
proalaseraspserileglyproglnileleuthrserproserpro
325330335
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hisargasnglnpheglyglnargaspargserserseralaproasn
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valhisileasnthrilegluprovalasnileaspaspleuilearg
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aspglnglypheargglyaspglyglyserthrthrglyleuserala
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thrproproalaserleuproglyserleuthrasnvallysalaleu
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glnlysserproglyproglnarggluarglysserserserserser
420425430
gluaspargasnargmetlysthrleuglyargargaspserserasp
435440445
asptrpgluileproaspglyglnilethrvalglyglnargilegly
450455460
serglyserpheglythrvaltyrlysglylystrphisglyaspval
465470475480
alavallysmetleuasnvalthralaprothrproglnglnleugln
485490495
alaphelysasngluvalglyvalleuarglysthrarghisvalasn
500505510
ileleuleuphemetglytyrserthrlysproglnleualaileval
515520525
thrglntrpcysgluglyserserleutyrhishisleuhisileile
530535540
gluthrlyspheglumetilelysleuileaspilealaargglnthr
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alaglnglymetasptyrleuhisalalysserileilehisargasp
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leulysserasnasnilepheleuhisgluaspleuthrvallysile
580585590
glyasppheglyleualathrvallysserargtrpserglyserhis
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glnphegluglnleuserglyserileleutrpmetalaprogluval
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ileargmetglnasplysasnprotyrserpheglnseraspvaltyr
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alapheglyilevalleutyrgluleumetthrglyglnleuprotyr
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serasnileasnasnargaspglnileilephemetvalglyarggly
660665670
tyrleuserproaspleuserlysvalargserasncysprolysala
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proleupheproglnileleualaserilegluleuleualaargser
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leuprolysilehisargseralasergluproserleuasnargala
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glypheglnthrgluasppheserleutyralacysalaserprolys
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thrproileglnalaglyglytyrglyalapheprovalhis
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asparglysalaalavalserhistrpglnglnglnsertyrleuasp
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serglyilehisserglyalathrthrthralaproserleusergly
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lysglyasnprogluglugluaspvalaspthrserglnvalleutyr
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agtggtgctcagacacccat20
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<223>锁核酸
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<223>锁核酸
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<223>锁核酸
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<221>尚未归类的特征
<222>27
<223>可以以多达三倍的重复序列的形式存在
<400>169
taggtccactctctctcttttcagcat27
<210>170
<211>24
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<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
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