本发明涉及一种用于微生物培养基凝胶基质及其应用，特别涉及一种耐受嗜中温细菌分解的冷水可溶性凝胶基质及其应用。
背景技术：
：通常菌落总数计数使用倾注法、表面涂布法、螺旋接种法或膜过滤法，所有这些方法都无一例外的使用琼脂培养基和玻璃或塑料的培养皿。琼脂是一种从石花菜等红紫色海洋藻类中提取的胶质。琼脂最初应用于微生物学是1881年由范尼.赫塞提出。到20世纪初琼脂由于在高温培养某些致病菌过程中仍然保持凝胶强度而开始替代明胶作为凝固剂的首选。琼脂在常温下为凝胶状态，在高达65℃条件下依然为坚硬的凝胶。琼脂在大约85℃熔化，而在32～40℃左右开始凝固。细菌学的琼脂需要有良好的透明度、可控的凝固温度和熔化温度、良好的扩散性、无细菌抑制毒性及相对缺乏代谢有用的矿物质和化合物。琼脂通常可以抵抗微生物酶的分解，对温度、离子、ph等因素较稳定。琼脂用于凝固培养基通常终浓度为1～2％。传统琼脂培养基需加水煮沸溶解并高压蒸汽灭菌，冷却至合适温度时使用。已灭菌的瓶装培养基使用前仍需长时间水浴或流动蒸汽加热熔解，然后冷至50℃左右再倾注到多个梯度的样品中，充分摇动混匀并冷却凝固。整个过程需消耗大量水电资源，并需使用高压设备，制备时间长且过程复杂，工作效率低。分装过程需要在高洁净度的空间环境，但长时间的冷却凝固过程仍易造成污染。食品等样品菌落总数计数采用倾注平板法，将高压蒸汽灭菌并冷至45℃左右的培养基与菌液混匀后倾注无菌平板，较高的温度对微生物特别是受损伤微生物造成进一步损害甚至导致其死亡。表面螺旋接种需要借助螺旋接种仪、划线、涂布接种需每次灼烧接种环或换用新的一次性接种环。在进行大量样本检测时，操作极为不便，效率低下。近几年来发展的微生物纸片法以高分子透气隔水材料为载体，以冷水可溶性凝胶作为凝固剂，为即用型无菌产品，无需培养基的制备，使用简便，只需加样、培养、计数三个步骤，测试程序简化，可大幅精简微生物定性定量指标测试的流程，并在更短时间内获得测试的结果。在不牺牲产品质量的情况下使产品快速上架销售，降低仓储成本。纸片法可以用来计数食品等样品中的嗜中温菌落总数，如3mpetrifilmaerobicplatecount。菌落总数通常是指需氧条件下嗜中温(30℃或36℃)细菌在平板计数琼脂上培养48或72h形成的菌落数。其中芽孢杆菌对外界有害因子抵抗力强，分布广泛，普遍存在于水、空气、土壤中。其生长繁殖迅速，在较短培养时间内即可产生大量酶使微生物纸片法的纸片发生液化。所以，当食品等样品含有芽孢类杆菌时，3m纸片在培养时会液化，菌落较多时红色连成片难以观察计数。其它梅里埃tempotvc采用mpn法计数，16孔乘3行的卡，三行孔容量分别为225μl、22.5μl、2.25μl，充满样液后培养会分解底物产生荧光信号，计算机通过读取信号数量和位置来计算最大可能数。soleristvc通过菌生长产生co2通过防水透气膜使底部指示剂颜色变化来检测微生物的污染。simplate稀释后加入培养观察颜色变化孔数，通过表转换成权重再乘以稀释倍数。这些计数方法虽然检测效果与传统方法相当，但需复杂的仪器设备来配套，价格昂贵，难以在基层推广使用。用于微生物培养用的凝胶基质，要求对微生物的生长基本无影响。这大大限制了其选择范围。同时，为保证微生物的生长，要求凝胶基质强度要适宜，强度过大会抑制微生物的生长，影响检测结果；而强度过低，又不利于观察。开发出一种耐受嗜中温细菌，特别是耐受芽孢类杆菌分解的冷水可溶性凝胶基质是制备得到计数结果更为准确的微生物检测片的关键。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种耐受嗜中温细菌分解的冷水可溶性凝胶基质及其应用。本发明所采取的技术方案是：一种耐受嗜中温细菌分解的冷水可溶性凝胶基质，其凝胶剂为卡拉胶或其改性修饰物中的至少一种，凝胶基质中添加有凝胶强度调整剂、卡拉胶酶抑制剂。作为上述冷水可溶性凝胶基质的进一步改进，凝胶强度调整剂选自淀粉、尿素中的至少一种。作为上述冷水可溶性凝胶基质的进一步改进，凝胶强度调整剂的用量为凝胶剂质量的1～5％。作为上述冷水可溶性凝胶基质的进一步改进，卡拉胶酶抑制剂选自碱金属或碱土金属盐、尿素、β巯基乙醇、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸或其盐。作为上述冷水可溶性凝胶基质的进一步改进，卡拉胶酶抑制剂的用量为凝胶剂质量的0.01％～0.05％。一种微生物检测片，检测片上吸附有培养基，培养基包括营养物质、显色指示剂、悬浮剂和冷水可溶性凝胶基质，冷水可溶性凝胶基质如上所述。作为上述微生物检测片的进一步改进，营养物质和冷水可溶性凝胶基质的混合比为1：(2～8)，优选1：(4～8)。作为上述微生物检测片的进一步改进，悬浮剂的添加量为培养基干重的30～60％。作为上述微生物检测片的进一步改进，悬浮剂为水溶解或有机溶剂溶解后可形成透明或半透明的粘稠溶液的高分子聚合物。作为上述微生物检测片的进一步改进，悬浮剂选自壳聚糖、葡聚糖、透明质酸、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、聚乙二醇中的至少一种。本发明的有益效果是：本发明的微生物检测片，由于选用了不易被嗜中温细菌直接分解的冷水凝胶，同时加入特殊抑制凝胶酶分解的酶抑制剂和凝胶强度调整剂，保证了微生物的正常生长，避免了不利影响，因而使得含芽孢杆菌的样品在培养过程中不液化、不扩散、单菌落清晰易观察计数。由于形成琼脂样有一定凝胶强度的透明凝胶，大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌等培养后形成的菌落边缘相对更规则且颜色更明亮，特征与传统琼脂培养基接近，更典型。附图说明图1是解淀粉芽孢杆菌在3m菌落总数纸片上的液化照片；图2是解淀粉芽孢杆菌在本发明检测片上的生长情况。具体实施方式一种耐受嗜中温细菌分解的冷水可溶性凝胶基质，其凝胶剂为卡拉胶或其改性修饰物中的至少一种，凝胶基质中添加有凝胶强度调整剂、卡拉胶酶抑制剂。特别的，嗜中温细菌为芽孢杆菌。作为上述冷水可溶性凝胶基质的进一步改进，凝胶强度调整剂选自淀粉、尿素等的至少一种。淀粉可选择来源于大米、小麦、玉米、马铃薯等天然淀粉，可以是直链的可溶性淀粉，优选食品级冷水可完全溶解的改进型淀粉。作为上述冷水可溶性凝胶基质的进一步改进，凝胶强度调整剂的用量为凝胶剂质量的1～5％。作为上述冷水可溶性凝胶基质的进一步改进，卡拉胶酶抑制剂选自碱金属或碱土金属盐、尿素、β巯基乙醇、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸或其盐。作为上述冷水可溶性凝胶基质的进一步改进，卡拉胶酶抑制剂的用量为凝胶剂质量的0.01％～0.05％。一种微生物检测片，检测片上吸附有培养基，培养基包括营养物质、显色指示剂、悬浮剂和冷水可溶性凝胶基质，冷水可溶性凝胶基质如上所述。作为上述微生物检测片的进一步改进，营养物质和冷水可溶性凝胶基质的混合比为1：(2～8)，优选1：(4～8)。作为上述微生物检测片的进一步改进，悬浮剂的添加量为培养基干重的30～60％。作为上述微生物检测片的进一步改进，悬浮剂为水溶解或有机溶剂溶解后可形成透明或半透明的粘稠溶液的高分子聚合物。作为上述微生物检测片的进一步改进，悬浮剂选自壳聚糖、葡聚糖、透明质酸、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、聚乙二醇中的至少一种。作为凝固助剂可以是多糖、淀粉、小分子尿素等，优选冷水溶解的改进型淀粉等。作为卡拉胶酶抑制剂可以是sds、edta、egta、硝酸钠等，优选edta或其盐中的至少一种。悬浮剂，营养成份、显色指示剂等均为本领域常用的原料，本领域技术人员可以根据需要进行相应的选择。作为悬浮剂可以是壳聚糖、葡聚糖、透明质酸、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚氧化乙烯等，经水或有机溶剂溶解形成一定粘度的透明或半透明溶液。作为营养成份可以使用蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、大豆胨、月示胨、牛肉提取物、脑心提取物、马铃薯提取物、麦芽汁提取物、蔗糖、乳糖、甘氨酸、色氨酸、丙酮酸钠等。作为显色指示剂可以使菌落较小肉眼难观察时着鲜艳的颜色便于观察。常用指示剂有氯化三苯基四氮唑、四氮唑蓝、噻唑蓝等细胞色素c氧化酶指示剂，微生物呼吸过程使其还原成有颜色的水不溶性物质。也可以是中性红、酚红、碱性品红等，微生物生长代谢产酸或产碱使菌落和或其周围ph发生变化，指示剂颜色随之发生变化。实施例1不同凝胶强度助剂对凝胶强度的影响卡拉胶(100％)分别与5％的水溶性淀粉、5％的尿素、5％氯化钠、2.5％氯化钙、1％醋酸钠混合均匀，取1.5g悬浮于20ml10％(w/v)聚乙二醇-6000甲醇溶液，取2ml加入检测片中央干燥。加入1ml无菌去离子水复溶过夜后，观察并用手按压测试凝胶强度，结果见表1。表1凝胶强度助剂对凝胶强度的影响备注：“+”代表凝胶强度。加入氯化钠或醋酸钠的凝胶强度与空白卡拉胶无明显区别，氯化钙、尿素及淀粉对凝胶强度有较明显增强，这可能是ca2+与卡拉胶中的硫酸酯等基团通过分子间作用力缔合提高了凝胶强度。尿素中的多氨基与卡拉胶中的基团相互作用使交链区更加稳定。高分子多糖淀粉可能通过直链与支链和卡拉胶分子间发生协同作用而增加凝胶强度。实施例2不同因素对卡拉胶酶酶活的影响称取45.04mgd半乳糖，用双蒸水溶解定容至50ml即成5μmol/ml的标准溶液，分别加入试剂混匀然后在沸水浴条件下显色10min冷至室温，双蒸水补足至5ml。520nm测定吸光值，以吸光值为横坐标，d半乳糖含量为纵坐标绘制标准曲线。采用3，5二硝基水杨酸(dns)法测定酶活。取50μl卡拉胶酶液，添加于550μl0.05m磷酸盐(pbs)缓冲液(ph7.0)的0.5％的卡拉胶溶液中，分别加入氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、edta、sds、β巯基乙醇、尿素60℃水浴20min，快速加入900μldns沸水浴10min，冷至室温，双蒸水补足至5ml。520nm测定吸光值，根据标准曲线计算酶活。未加入任何物质的原始酶液的酶活为100％。结果见表3。表2标准曲线制备012345678910标准液00.20.40.60.811.21.41.61.82双蒸水21.81.61.41.210.8.060.40.20取液量0.60.60.60.60.60.60.60.60.60.60.6dns0.90.90.90.90.90.90.90.90.90.90.9表3不同因素对卡拉胶酶酶活的影响结果表明，na+、k+对卡拉胶酶促进作用不明显，ca2+、mg2+有较明显促进作用，β巯基乙醇、尿素对酶活有一定抑制作用，edta和sds有较明显的抑制作用。但sds通常在较低浓度时对细菌生长有较明显的抑制作用，因此低剂量的edta对酶表达有较好的控制作用。综上，耐受嗜中温细菌分解的冷水可溶性凝胶基质组成优选为卡拉胶100％，凝胶强度调整剂为3～5％的水溶性淀粉，卡拉胶酶抑制剂为0.03～0.05％的edta或其钾、钠盐。实施例3酶抑制剂edta制备的菌落总数检测片的效果胰蛋白胨5g、酵母膏粉2.5g、葡萄糖1g、ttc0.1g，分别与卡拉胶34g、2g的水溶性淀粉、0.015gedta，球磨混匀，将干粉固定到培养装置上制作成检测片。用钴60在15kgy剂量辐照灭菌。大肠埃希氏菌atcc25922、金黄色葡萄球菌atcc6538、铜绿假单胞菌atcc27853、枯草芽孢杆菌atcc6633在胰蛋白胨大豆肉汤中36±1℃培养16-18h，将增菌液摇匀用无菌生理盐水梯度稀释至约100cfu/ml。取1ml加入灭菌的检测片中央，盖上聚乙烯膜使样液扩散充满整个区域。置于36±1℃培养24h，观察结果，结果见表4。表4不同检测片对纯菌计数的结果结果表明，大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及枯草孢杆菌在卡拉胶加edta制成的检测片上生长良好，红色单菌落清晰可计。继续培养至48h时也未见有液化，卡拉胶耐酶解性能稳定。而枯草孢杆菌在单独卡拉胶制成的检测片及3m上凝胶液化成淡红色一片，无法计数。实施例4不同比例凝胶和营养制备的检测片的效果不同比例的卡拉胶和营养干粉与ttc0.1g，充分混合。分别称取1.5g凝胶营养混合干粉加入10％(w/v)聚乙二醇-6000甲醇溶液20ml，不断搅拌成均一悬浊液，取2ml涂布到检测片(d＝50mm,h＝1mm)的下层。干燥后盖上聚丙烯膜并环氧乙烷灭菌。打开上层膜分别加入1ml无菌生理盐水至检测片中央盖上上层膜，观察样液的吸收扩散。大肠埃希氏菌atcc8739、金黄色葡萄球菌atcc6538、铜绿假单胞菌atcc9027、枯草芽孢杆菌atcc6633在胰蛋白胨大豆肉汤中36±1℃培养16～18h，将增菌液摇匀用无菌生理盐水梯度稀释至约100cfu/ml。取1ml加入灭菌的检测片中央，盖上聚乙烯膜使样液扩散充满整个区域，并同时以3m产品作为对照。置于36±1℃培养24h，观察结果，结果见表5。表5不同比例凝胶和营养成份制备的检测片的效果结果表明，卡拉胶与营养成份的混合比在(1～2)：1时，干粉在悬浮液中不易分散，1ml样液有溢出，形成的凝胶较弱；混合比在(4～8)：1时，1ml样液基本充满整个区域，凝胶强度较好，目标菌生长良好；混合比为10：1时，大肠埃希氏菌及金黄色葡萄球菌菌落明显变小，可能是营养成份不足导致的。综合凝胶强度和营养情况，初步选择卡拉胶与营养成份配比为(4～8)：1，特别是4：1。实施例5混合干粉不同用量效果比对分别取1g、1.5g、2g按4：1比例的凝胶营养混合干粉加入悬浮液中，取2ml制成检测片，方法同实施例3，结果见表6。表6混合干粉不同用量效果比对结果表明1.5g左右4：1的凝胶营养混合干粉效果最优，1ml样液可使干燥培养基层完全吸收溶解并形成一定强度的凝胶，优于1g和2g的比例。实施例6芽孢杆菌的检测效果比较1)胰蛋白胨5g、酵母膏粉2.5g、葡萄糖1g、ttc0.1g、0.015gedta、2g水溶性淀粉、卡拉胶34g球磨、研磨或粉碎等方式混合2～3h成均匀的混合干粉；2)称取17g球磨的凝胶营养混合干粉加入10％(w/v)聚乙二醇-6000的甲醇溶液200ml，不断搅拌成均一悬浊液，涂布到检测片的下层；3)干燥后环氧乙烷灭菌。枯草芽孢杆菌cmcc(b)63501、ficc(b)115039～115049、枯草芽孢杆菌黑色变种atcc9372、蜡样芽孢杆菌atcc11778、cmcc(b)63303、cmcc(b)63301、环状芽孢杆菌ficc(b)115011、ficc(b)115056、坚强芽孢杆菌ficc(b)115012、缓慢芽孢杆菌ficc(b)115014、ficc(b)115015、凝结芽孢杆菌ficc(b)115059、ficc(b)115122、巨大芽孢杆菌atcc14945、ficc(b)115026、地衣芽孢杆菌ficc(b)115017、115028、蕈状芽孢杆菌atcc10206、短小芽孢杆菌ficc(b)115031、ficc(b)115032、苏云金芽孢杆菌atcc10792、ficc(b)115263、解淀粉芽孢杆菌ficc(b)11502334、ficc(b)11502335、蜂房芽孢杆菌ficc(b)11502336、11502337在胰蛋白胨大豆肉汤中36±1℃培养16-18h，将增菌液摇匀用无菌生理盐水梯度稀释至约100cfu/ml。取1ml加入灭菌的检测片中央，盖上聚乙烯膜使样液扩散充满整个区域，并同时以3m产品作为对照。置于36±1℃培养24h，观察结果，结果见表7。表7芽孢杆菌特别检测效果比较结果表明，13株枯草芽孢杆菌、2株解淀粉芽孢杆菌在3m纸片上菌落液化成淡红色融合在一起，无法计数单菌落(图1)，而在本发明的培养基上无液化，菌落红色较大，清晰可计(图2)。其它芽孢杆菌在本发明及3m上均无明显的液化，菌落红色较大，可较清晰容易的计数。实施例7模拟表面拭子取样检测效果评估无菌不锈钢台100cm2用大肠埃希氏菌atcc25922、金黄色葡萄球菌atcc6538、铜绿假单胞菌atcc9027、枯草芽孢杆菌atcc6633的混合菌悬液5ml(约100cfu/ml)人工污染。打开包装将棉拭子浸入含10ml缓冲蛋白胨水的试管，在试管壁上挤压拭子除去多余水分。拭子以30°角在10cm2的待测表面正向来回擦拭10次放回试管充分振荡并挤出多余水分、旋转90度反向来回擦拭10次放回试管充分振荡并挤出多余水分、再旋转45度侧向来回擦拭10次放回试管。用超声波振荡1min以释放其中微生物，挤出拭子中多余水分。取原液1ml加入检测片中央，盖上上盖膜。检测片制备同实施例六。同时取1ml倾注平板计数琼脂(pca)。37℃培养48h，结果见表8。表8拭子取样后本发明和平板计数琼脂计数结果结果表明，棉拭子表面取样在本发明与pca上的计数结果无明显区别。实施例8纯菌株在本发明与3m菌落总数纸片及pca的检测效果比较检测片制备同实施例6。新鲜大肠埃希氏菌atcc25922、大肠埃希氏菌atcc35218、大肠埃希氏菌cmcc(b)44102、大肠杆菌o157:h712900、弗氏柠檬酸杆菌atcc43864、阴沟肠杆菌cmcc(b)45301、奇异变形杆菌cmcc(b)49005、阪崎肠杆菌atcc29544、硝酸盐阴性不动杆菌cmcc(b)25001、肺炎克雷伯氏菌cmcc(b)46117、伤寒沙门氏菌atcc14028、福氏志贺氏菌cmcc(b)51572、宋内志贺氏菌cmcc(b)51592、铜绿假单胞菌atcc27853、金黄色葡萄球菌atcc6538、表皮葡萄球菌atcc2069、粪肠球菌atcc29212等制成0.5mcf菌悬液，10倍梯度稀释至100cfu/ml，分别取1ml加到本发明及3m的检测片中央，同时取1ml倾注含ttc的pca为对照，37℃需氧培养48h，结果见表9。表9纯菌株的检测效果比较结果表明，非芽孢杆菌细菌在本发明的检测片上检测结果与3m纸片及平板计数琼脂一致，有较典型的菌落特征，但在pca中铜绿假单胞菌等生长缓慢为很小的红色点状。但在本发明的检测片及3m纸片上铜绿假单胞菌生长较快，24h即为较大的红色菌落。实施例9实际样品检测效果本发明与3m及pca的比较检测片制备同实施例6。以无菌操作方式分别称取25g(ml)米粉、福寿鱼、鸡肉、猪肉、乳粉、蛋糕样品加入225ml袋装磷酸盐缓冲液中，脉冲均质1min，然后用磷酸盐缓冲液10倍稀释，取1ml分别倾注pca平板，加入本发明检测片和3m纸片，36℃±1需氧培养48h，鱼30℃±1需氧培养72h，观察并计数红色菌落，结果见表10。表10实际样品检测效果比较*24h的估计值。结果表明，在实际食品样品检测菌落总数时本发明的检测片检测结果与3m及pca基本一致。在米粉和猪肉样品检测时由于含有芽孢杆菌3m纸片在48h计数时因液化而导致生长在芽孢杆菌周围的其它菌不能形成清晰单菌落，变成红色一片。而本发明的检测片未发生液化现象，单菌落规则典型，菌落间界限明显，可以很容易的观察计数。当前第1页12