高度降解样本中植物性DNA的检测引物的制作方法

本发明属于分子生物学和基因组学实验技术领域，主要针对高度降解植物样品中dna降解程度和pcr可扩增性的快速检测。

背景技术：

dna是分子生物学和基因组学研究工作的起点，按标准采集材料获取高质量的dna是这些工作的理想条件，但在很多实际工作中，不得不面对使用低质量dna开展工作。如馆藏植物腊叶标本，对许多难以采集的物种，是一个巨大的潜在遗传信息来源库；实际工作中往往需要鉴定诸如经炮制的中草药，环境、土壤中的植物样本，甚至动物消化物中植物来源等高度降解的植物dna样品。目前，针对这些样品的dna提取和遗传信息的获取是本领域的热点之一。这些高度降解的样品中dna非常微量并且高度降解，往往只有皮克级长度在100碱基对以下的碎片，一般的凝胶和紫外检测设备无法直接检测到。

技术实现要素：

针对现有技术难以检测到高度降解样本中植物性dna的问题，本发明提供了一组用于高度降解样本中植物性dna的检测引物，本发明利用pcr扩增的高度灵敏性和多重pcr技术的高效性，设计筛选出50碱基对、70碱基对和100碱基对长度的植物高通用扩增引物，通过三重pcr扩增和凝胶检测技术，检测低质量样本中dna的降解程度和pcr的可扩增性，为这类样品的分子标记检测和遗传信息获取提供前期预测。

本发明通过对200多科270属2000多种已有维管植物叶绿体基因组的比较分析，在其共有保守区设计筛选出扩增长度为50碱基对、70碱基对和100碱基对的3对引物，使用多重pcr技术，通过对46个代表性样品和43个标本材料进行了3对引物在一个反应中同时扩增的检测实验，结果验证了引物组合的高通用性，和实验体系的高稳定性。运用该实验体系，可快速检测植物dna样本的可扩增性和降解程度，为样品设计pcr扩增长度提供参考。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：植物高通用引物+多重pcr反应体系+琼脂糖凝胶电泳检测方法；

1、植物高通用引物的设计筛选

基于植物特有的叶绿体基因组，在对已有200多科270属2000多种已有维管植物叶绿体基因组的比较分析，使用premier6.0软件进行引物开发，在其共有保守区设计筛选扩增长度为50碱基对、70碱基对和100碱基对的3对引物，其设计尽量考虑各引物的退火温度一致（52℃）和控制引物二聚体的形成；并经46份不同科植物材料验证其高通用性；

上述用于多重pcr的引物序列分别为：

100碱基引物对psb_f：5'-agcagtccaaggggttggtt-3'，

psb_r：5'-agcaaaaacatctctgaacaaggttct-3'；

70碱基引物对16s_f：5'-cgttgagtttggaaccctgaac-3'，

16s_r：5'-acttgacgtcatcctcaccttc-3'；

50碱基引物对4.5s_f：5'-gtggaagtgcagtgatgtatgc-3'，

4.5s_r：5'-gtctaccggtctgttaggatgc-3'；

2、建立针对植物dna样本的多重pcr的反应体系和反应程序

多重pcr的反应体系为：dna模板2μl、2×taqpcrmastermix(tiangen公司)11μl、混合引物(5μm)1μl、ddh2o8μl；

多重pcr的程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸35s，进行35个循环；72℃延伸5min；4℃，保存；

3、pcr扩增产物的检测

多重pcr的检测方法，取pcr扩增产物5μl，mark3μl，在4.5%琼脂糖凝胶(含4sgreenplus核酸染色剂)中电泳；电压为140v，电流为60ma，电泳时间80min。

使用多重pcr技术，通过对46个代表性样品和43个标本材料进行3对引物在一个反应中同时扩增的检测实验，验证引物组合的高通用性和实验体系的高稳定性；

所述46个代表性样品来自中国西南野生生物种质资源库，材料为近5年采集，经变色硅胶干燥后保存于密封盒中，密封盒存放在分子材料库内，库环境温度稳定在15℃，湿度稳定在15%rh；46份植物材料代表分类学上不同的科，经多重pcr电泳检测结果显示，所有材料均扩增成功，显示3条亮带，表明3对检测引物具有很高的通用性。

所述43个植物标本材料中25份来自中科院昆明植物研究所标本馆，材料为采集时间15年以上腊叶标本，存放环境为常温，空调具一定的除湿功能，定期杀虫，与外界相对隔离。经多重pcr电泳检测结果显示，pcr扩增均成功出现3条亮带的材料13份（引物分别为4.5s_f/r、16s_f/r和psb_f/r，对应条带大小为50碱基对、70碱基对和100碱基对）；pcr扩增出现2条亮带的材料10份（引物分别为4.5s_f/r和16s_f/r，对应条带大小为50碱基对和70碱基对）；pcr扩增出现1条亮带（引物4.5s_f/r，条带大小50碱基对）和无条带的材料各1份。以上结果表明大约52%的材料所提取的dna大小在100碱基对以上；大约40%的材料其dna大小在70碱基对可扩增，少数材料的dna已降解为50碱基对及以下片段。

另外18份材料来自中科院华南植物园标本馆，3份为当年采集制作的腊叶标本；15份为采集时间25年以上的腊叶标本，叶片碎裂发黑，失去韧性。上述18份来自中科院华南植物园标本馆的植物材料，经多重pcr电泳检测结果显示，3份当年采集制作的腊叶标本均扩增成功出现3条亮带（引物分别为4.5s_f/r、16s_f/r和psb_f/rf，对应条带大小为50碱基对、70碱基对和100碱基对）。15份采集时间25年以上的腊叶标本材料中，pcr扩增成功出现3条亮带的材料1份（引物分别为4.5s_f/r、16s_f/r和psb_f/rf，对应条带大小为50碱基对、70碱基对和100碱基对）；pcr扩增出现2条亮带的材料2份（引物分别为4.5s_f/r和16s_f/r，对应条带大小为50碱基对和70碱基对）；pcr扩增出现1条亮带（引物4.5s_f/r，条带大小50碱基对）和无条带的材料各6份。以上结果表明，3份当年采集制作的腊叶标本dna扩增均获得成功，dna大小在100碱基对或100碱基对以上；15份采集时间25年以上腊叶标本材料中，80%的材料dna已降解为50碱基对及以下片段，只有20%的材料dna在70碱基对可扩增。

本发明的优点和技术效果：

本发明设计了3对针对降解植物材料dna的多重pcr扩增引物，以及提供了针对植物降解材料dna的多重pcr扩增反应体系、反应程序和琼脂糖凝胶电泳检测的方法；与传统dna质量检测相比，多重pcr检测灵敏度高，数据可靠，重复性强，同时本发明在电泳检测中提供了分子量梯度为10碱基对的dnamarker和空白对照，提高了结果准确性，可以定量检测dna降解程度，为降解植物材料的基因测序，物种鉴定等工作提供基础保障，具有广泛的应用前景；运用该实验体系，可快速检测植物dna样本的可扩增性和降解程度，为样品设计pcr扩增长度提供参考。

附图说明

图1为用于植物高通用引物筛选的46份植物材料dna中部分材料的多重pcr电泳图；

图2为用于植物高通用引物筛选的46份植物材料dna中部分材料的多重pcr电泳图；

图3为来源于中科院昆明植物研究所标本馆馆藏25份植物材料dna多重pcr电泳图；

图4为来源于中科院华南植物园标本馆馆藏18份植物材料dna多重pcr电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明；以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，该领域的技术人员可以根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整；下述实施例中，若非特异表明，所用试剂均为常规市售试剂；文中未注明具体条件的实验方法，通常按照《分子克隆实验指南》中所述常规条件，或试剂制造厂商所建议的条件实施；除非另行定义，文中所使用的所有专业和科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。

实施例1：植物高通用引物的设计筛选

在中科院昆明植物研究所分子生物学实验中心植物基因库数据中，通过对200多科270属2000多种已有维管植物叶绿体基因组的比较分析，使用premier6.0软件进行引物设计，筛选出通用性较高的引物3对，引物名称为psb_f/r，16s_f/r，4.5s_f/r，引物序列分别为：

（1）扩增大小为100碱基对长度的引物核苷酸序列组成如下：

psb_f：5'-agcagtccaaggggttggtt-3'

psb_r：5'-agcaaaaacatctctgaacaaggttct-3'；

（2）扩增大小为70碱基对长度的引物核苷酸序列组成如下；

16s_f：5'-cgttgagtttggaaccctgaac-3'

16s_r：5'-acttgacgtcatcctcaccttc-3'；

（3）扩增大小为50碱基对长度的引物核苷酸序列组成如下：

4.5s_f：5'-gtggaagtgcagtgatgtatgc-3'

4.5s_r：5'-gtctaccggtctgttaggatgc-3'。

实施例2：针对植物dna样本的多重pcr实验

1、总dna提取及预检

总dna提取采用tiangen公司植物基因组提取试剂盒，具体操作按其说明书进行，所提取的dna采用thermond-2000超微量分光光度计和1％浓度的琼脂糖胶电泳检测；

来自中国西南野生生物种质资源库的46个代表性样品，样品见下表：

；

来自中科院昆明植物研究所标本馆的25份标本，样品见下表：

；

来自中科院华南植物园标本馆的18份材料，样品见下表：

；

nd-2000检测结果显示，46份来自中国西南野生生物种质资源库的材料，其总dna浓度、曲线和各项参数均正常，琼脂糖凝胶电泳均符合dna库存要求；25份来自中科院昆明植物研究所标本馆和18份来自中科院华南植物园的标本材料所提取的总dna，除3份当年采集制作的腊叶标本材料外，其余40份材料提取的总dna使用nd-2000无法检测出浓度或浓度极低，光谱曲线和各项参数远低于正常水平，琼脂糖凝胶电泳未检出任何条带。

2、多重pcr的反应体系和反应程序

将合成好的3对引物4.5s_f/r，16s_f/r，psb__f/r稀释至5μm，分别取等体积进行混合，制备得到混合引物，对89份植物材料dna样品分别进行多重pcr扩增，pcr反应体系为：dna模板2μl、2×pcrmix11μl、混合引物(5μm)1μl、ddh2o8μl；pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸35s，进行35个循环；72℃延伸5min；4℃，保存。

3、琼脂糖凝胶电泳检测

取pcr扩增产物5μl、mark3μl、在琼脂糖凝胶(含4sgreenplus核酸染色剂)中电泳80min，然后置于凝胶成像分析系统中观察结果；经反复试验得出，采用4.5%浓度琼脂糖凝胶，0.5×tbe缓冲液，电压140v和电流60ma下进行电泳能有效区分扩增条带和dnamark，条带清晰明亮；0.5×tbe缓冲液是由10×tbe缓冲液稀释而来，10×tbe缓冲液配制方法如下：取tirs108g、硼酸55g、na2edta·2h2o7.44g，加入去离子水溶解，定容到1l，室温保存。

根据电泳图像（图1-图4），对89份不同降解程度植物材料dna的pcr扩增成功条带逐一进行计数；结果表明，3份来自华南植物园当年采集制作的腊叶标本材料和46份中国西南野生生物种质资源库的材料完整程度高，多重pcr均扩增成功，dna可扩增出100碱基对以上的片段，可能与采集时间长短（小于5年）和保存环境（硅胶干燥，密封盒保存，分子材料库温度稳定在15℃，湿度稳定在15%rh）有关系。

25份来自中科院昆明植物研究所标本馆植物材料，大约52%的dna扩增出3条亮带，可扩增100碱基对左右的片段；大约40%的dna扩增出70碱基对的片段；扩增出1条带和无条带的各1份，只有少数材料降解到50碱基对及其以下；dna的降解可能与采集时间，存放环境等有关。

15份来自中科院华南植物园标本馆的腊叶标本材料，pcr扩增成功出现3条亮带的材料1份（50碱基对、70碱基对和100碱基对）；pcr扩增出现2条亮带的材料2份（50碱基对和70碱基对）；pcr扩增出现1条亮带（50碱基对）和无条带的各6份，dna发生了很大程度的降解，可能与馆藏时间长，叶片物理性状发生变化，碎裂褐变，失去韧性有关。

序列表

<110>中国科学院昆明植物研究所

<120>高度降解样本中植物性dna的检测引物

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>1

agcagtccaaggggttggtt20

<210>2

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>2

agcaaaaacatctctgaacaaggttct27

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>3

cgttgagtttggaaccctgaac22

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>4

acttgacgtcatcctcaccttc22

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>5

gtggaagtgcagtgatgtatgc22

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>6

gtctaccggtctgttaggatgc22