合成辛伐他汀的重组菌株、方法以及相关酶与流程

本发明属于生物技术和药物
技术领域：
，涉及辛伐他汀的合成。
背景技术：
：心脑血管疾病已成为人类的头号杀手，发病率逐年上升。高血脂是引起心脑血管疾病的主要原因之一，因此，降低血脂可以有效降低心脑血管疾病的风险。目前临床上采用的调脂药物中以他汀类最为常用。1979年默克公司的科学家从土曲霉的代谢产物中分离到了洛伐他汀，1987年美国fda批准该物质为世界上第一个批准上市的他汀类药物。接着，该公司又以洛伐他汀为原料合成了辛伐他汀，其c-8位丁酸酯侧链的α-碳原子上比洛伐他汀多一个甲基，二者的作用机制相同。近年来，临床研究表明降低低密度脂蛋白胆固醇效果最好的是阿托伐他汀，其次是辛伐他汀，因此，二者的销售额也在排行榜上名列前茅。而生产辛伐他汀的工艺和成本已成为该产品市场竞争的重要因素。目前，辛伐他汀的生产工艺主要是化学合成法，如cn1290261a、cn1612872a、cn1493570a所述，基本生产工艺是由两步反应组成，第一步由洛伐他汀生成莫那可林j，第二步由莫那可林j生成辛伐他汀。这些工艺的缺点是转化时间长，反应条件苛刻，环境污染大，需要昂贵和危险的化学试剂。随着生物技术的发展，辛伐他汀的生物合成越来越受到人们的关注。其中第二步反应的生物转化技术已有报道，该反应利用了酰基转移酶，它可以将α-二甲基丁酰巯基丙酸甲酯(dmb-s-mmp)等酰基硫酯的酰基基团转移至莫那可林j的c8位羟基上合成辛伐他汀，如cn102703539a、cn103725726a、cn102695792a、cn102574896a、cn101490271、cn102712678a所述。然而，到目前为止第一步反应的生物转化技术尚不成熟。相关文献报道了一种2-甲基丁酰侧链水解酶(pcest)，该酶可以特异性地水解洛伐他汀生成莫那可林j，通过将pcest引入至洛伐他汀高产菌株中，得到了生产莫纳可林j的土曲霉菌株，水解效率高达90％以上(huangxn,liangyj,yangy,luxf.(2017).single-stepproductionofthesimvastatinprecursormonacolinjbyengineeringofanindustrialstrainofaspergillusterreus.metab.eng.,42,109-114)。然而，这种方式仅是改进了第一步反应，想要得到辛伐他汀还得进行第二步反应，相对繁琐。技术实现要素：本发明主要目的是通过在一株微生物体内同时生产2-甲基丁酰侧链水解酶和酰基转移酶，开发出以洛伐他汀和酰基硫酯为底物的高效、低成本、绿色环保的辛伐他汀全生物合成工艺。在第一个方面，本发明提供一种2-甲基丁酸侧链水解酶，是通过定点突变野生型pcest(seqidno:1)得到的突变体，突变位点包括第106位、第140位和第304位，突变形式为d106g、q140l和s304g，因此，所述2-甲基丁酸侧链水解酶的序列为：mdttfqaaidtgkingavvcatdaqghfvynkatgertllsgekqpqqlddvlylasatklittiaalqcvedgllsldgdlssiapelaakyvltgftddesplx106dpparpitlkmllthssgtsyhfldpsiakwrax140yanpenekprlveemftyplsfqpgtgwmygpgldwagrvvervtggtlmefmqkrifdplgitdsqfypvtredlrarlvdlnpsdpgalgsaviggggemnlrgrgafgghglfltgldfvkilrsllandgmllkpaavdnmfqqhlgpeaaashraalax304plgpffrvgtdpetkvgyglgglltledvdgwygertltwgggltltwfidrknnlcgvgaiqavlpvdgdlmadlkqtfrhdiyrkysawkgqq，其中，x106为d或g，x140为q或l，x304为s或g，且所述序列不是seqidno:1所示序列。具体地，所述2-甲基丁酸侧链水解酶分别为：(1)pcest/d106g：即，野生型pcest氨基酸序列第106位由d突变为g；其氨基酸序列如seqidno:3所示；(2)pcest/q140l：即，野生型pcest氨基酸序列第140位由q突变为l；其氨基酸序列如seqidno:4所示；(3)pcest/s304g：即，野生型pcest氨基酸序列第304位由s突变为g；其氨基酸序列如seqidno:5所示；(4)pcest/d106g/q140l：即，野生型pcest氨基酸序列第106位由d突变为g，同时，第140位由q突变为l；其氨基酸序列如seqidno:6所示；(5)pcest/d106g/s304g：即，野生型pcest氨基酸序列第106位由d突变为g，同时，第304位由s突变为g；其氨基酸序列如seqidno:7所示；(6)pcest/q140l/s304g：即，野生型pcest氨基酸序列第140位由q突变为l，同时，第304位由s突变为g；其氨基酸序列如seqidno:8所示；或(7)pcest/d106g/q140l/s304g：即，野生型pcest氨基酸序列第106位由d突变为g，同时，第140位由q突变为l，同时，第304位由s突变为g；其氨基酸序列如seqidno:9所示。在本申请文件中，如无具体说明，pcest/d106g缩写为d106g，表示蛋白突变体。本领域技术人员根据上下文内容，可以清楚地区分d106g表示的是突变形式还是突变体。其它蛋白突变体的表示方式同理。第二个方面，提供与本发明的2-甲基丁酸侧链水解酶相关的生物材料，为：(1)核酸分子，所述核酸分子编码本发明的2-甲基丁酸侧链水解酶；优选地，所述2-甲基丁酸侧链水解酶的氨基酸序列如seqidno:3-9所示；进一步优选地，所述核酸分子为pcest/d106g(seqidno:12)、pcest/q140l(seqidno:13)、pcest/s304g(seqidno:14)、pcest/d106g/q140l(seqidno:15)、pcest/d106g/s304g(seqidno:16)、pcest/q140l/s304g(seqidno:17)、pcest/d106g/q140l/s304g(seqidno:18)；或者(2)包含(1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组微生物。关于上述生物材料，本领域技术人员根据提供的2-甲基丁酸侧链水解酶的氨基酸序列可以容易地得知编码该酶的核酸分子的序列，并能够容易地选择、制备和使用包含所述核酸分子从而表达蛋白的表达盒、重组载体、重组细胞和重组微生物。第三个方面，提供本发明的2-甲基丁酸侧链水解酶在水解含有2-甲基丁酸侧链的他汀类物质中的应用；优选地，所述含有2-甲基丁酸侧链的他汀类物质为洛伐他汀、美伐他汀或普伐他汀；进一步优选地，所述他汀类物质为酸式、内酯式或盐式。在第四个方面，本发明提供一株用于合成辛伐他汀的重组菌株，所述重组菌株同时表达本发明的2-甲基丁酸侧链水解酶和酰基转移酶。优选地，所述重组菌株为大肠杆菌；进一步优选为大肠杆菌bl21(de3)菌株。进一步优选地，所述2-甲基丁酸侧链水解酶的氨基酸序列如seqidno:3～9任一项所示，所述酰基转移酶的氨基酸序列如seqidno:2所示。进一步优选地，所述重组菌株携带有2-甲基丁酸侧链水解酶的编码基因和酰基转移酶的编码基因。进一步优选地，所述2-甲基丁酸侧链水解酶的编码基因的核苷酸序列如seqidno:12～18任一项所示，所述酰基转移酶的编码基因的核苷酸序列如seqidno:11所示。在第五个方面，提供构建本发明的重组菌株的方法，包括步骤：将携带有本发明的2-甲基丁酸侧链水解酶编码基因的质粒和携带有酰基转移酶编码基因的质粒共转化大肠杆菌，经筛选得到同时表达2-甲基丁酸侧链水解酶和酰基转移酶的重组菌株。质粒共转化的方法是本领域公知技术。本领域技术人员根据描述的内容可以选择合适的质粒和共转化方法以及筛选方法，最终获得需要的重组菌株。优选地，所述2-甲基丁酸侧链水解酶的编码基因的核苷酸序列如seqidno:12～18任一项所示，所述酰基转移酶的编码基因的核苷酸序列如seqidno:11所示。在第六个方面，提供本发明的重组菌株或其菌悬液或其发酵液或其菌粉在合成辛伐他汀中的应用。具体地，所述重组菌株能够以洛伐他汀和酰基硫酯为底物合成产物辛伐他汀：即在含有大肠杆菌重组菌株全细胞催化剂的溶液中添加洛伐他汀和酰基硫酯，洛伐他汀进入细胞内，经2-甲基丁酸侧链水解酶水解生成莫纳可林j，莫纳可林j和进入细胞内的酰基硫酯在酰基转移酶的作用下合成产物辛伐他汀，辛伐他汀向胞外转运出来。因此，在第七个方面，本发明提供一种合成辛伐他汀的方法，包括使用本发明的重组菌株，以洛伐他汀和酰基硫酯为底物，利用大肠杆菌全细胞生物催化洛伐他汀转化合成辛伐他汀。具体地，培养本发明菌株，使其表达2-甲基丁酸侧链水解酶和酰基转移酶，然后将菌冷冻干燥，得到菌粉；在含有洛伐他汀(15mm)和酰基硫酯(20mm)的溶液中加入上述菌粉，使其终浓度为3-6mg/ml，在25℃、200rpm条件下反应1-5h。利用高效液相色谱检测辛伐他汀、洛伐他汀和莫纳可林j的浓度，由洛伐他汀转化辛伐他汀的最高转化率达到92％。与现有技术相比，本发明是以洛伐他汀和酰基硫酯为原料，通过细胞内的水解酶和酰基转移酶作用生成辛伐他汀，不仅大大减少了反应步骤，而且通过对重组菌株进行优化，洛伐他汀合成辛伐他汀的转化率从50％左右提高到90％以上，辛伐他汀产品中的杂质含量降低，特别是洛伐他汀的残留在0.1％以下。因此，本发明提供的方法简单易操作、反应条件温和、安全、绿色环保。附图说明图1：pcr扩增得到的编码2-甲基丁酰侧链水解酶pcest野生型基因的核酸电泳图。m是dna分子量标准。pcr扩增的模板是peasy-e2-pcest质粒(huangxn,liangyj,yangy,luxf.(2017).single-stepproductionofthesimvastatinprecursormonacolinjbyengineeringofanindustrialstrainofaspergillusterreus.metab.eng.,42,109-114)。图2：pcr扩增得到的编码酰基转移酶lovd9基因的核酸电泳图。m，dna分子量标准。pcr扩增的模板是携带有经全基因合成的lovd9(pbdid:4lcm)的编码基因(根据大肠杆菌密码子的偏好性进行密码子优化)。图3：重组菌株中pcest和lovd9蛋白表达的电泳图。m是蛋白分子量标准。pl1菌株是同时编码lovd9和野生型pcest的大肠杆菌重组菌株，plm3菌株是同时编码lovd9和pcest突变体d106g/q140l/s304g的大肠杆菌重组菌株。红色箭头指出的是lovd9蛋白(46kda)，黑色箭头指出的是pcest蛋白(43kda)。s是细胞破碎上清液，即可溶性部分。i是细胞破碎沉淀，即不可溶性部分。图4：重组菌株(菌体浓度是4.38mg/ml)以洛伐他汀和酰基硫酯为底物合成辛伐他汀的高效液相色谱图。pl1菌株是同时编码lovd9和野生型pcest的大肠杆菌重组菌株，plm3菌株是同时编码lovd9和pcest突变体d106g/q140l/s304g的大肠杆菌重组菌株。莫纳可林j、洛伐他汀和辛伐他汀的保留时间分别为2.7min、9.5min和13.4min。图5：不同浓度的菌株合成的辛伐他汀的浓度随时间变化图。pl1菌株是同时编码lovd9和野生型pcest的大肠杆菌重组菌株，plm3菌株是同时编码lovd9和pcest突变体d106g/q140l/s304g的大肠杆菌重组菌株。图6：(a)是pcest野生型和突变体蛋白纯化结果的电泳分析图；(b)是酶活测定结果图，酶活力单位定义为每分钟催化产生1微摩尔莫纳可林j所需的酶量为一个活力单位(u)。图中的纵坐标表示的是每毫克酶蛋白所含有的酶活力单位数。wt：野生型pcest。图7：pcest野生型和突变体酶蛋白的米氏方程曲线图，wt：野生型pcest。图8：pcest野生型和突变体蛋白可溶性表达的电泳分析图，wt：野生型pcest。s：可溶性蛋白部分；i：不可溶性蛋白部分。图9：pcest野生型和突变体蛋白的热稳定性分析图，wt：野生型pcest。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。这些实施例给出了详细的实施方式和具体的操作过程，有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。如无明确说明，以下实施例中使用的试剂、仪器均是本领域常规试剂、仪器，可以通过商购途径获得；所使用的方法也是常规方法，本领域技术人员根据说明书内容，可以明确地知道如何完成所述实验，获得相应的结果。实施例1.用于生物催化转化洛伐他汀合成辛伐他汀大肠杆菌重组菌株的构建。1、构建携带有野生型2-甲基丁酰侧链水解酶pcest编码基因的表达载体prsfduet-pcest以引物1和引物2为引物(北京六合华大基因有限公司合成)，通过常规pcr扩增得到pcest的编码基因，引物序列如下：引物1：5’ggaattccatatggataccacctttcaggcg3’引物2：5’ccgctcgagtcactgctgacctttccaggc3’模板是peasy-e2-pcest质粒(huangxn,liangyj,yangy,luxf.(2017).single-stepproductionofthesimvastatinprecursormonacolinjbyengineeringofanindustrialstrainofaspergillusterreus.metab.eng.,42,109-114)。pcr产物纯化回收后进行核酸电泳检测，结果如图1所示，dna片段大小为1200bp。利用限制性内切酶ndei和xhoi切出粘性末端，使用t4连接酶与经过同样的酶切得到的载体prsfduet-1(购自novagen公司)连接，得到重组载体prsfduet-pcest。质粒转化大肠杆菌dh5α的感受态细胞，以含有卡那霉素(终浓度是50μg/ml)的lb平板挑取转化子，测序，按照pcest野生型的核苷酸序列seqidno:10所示形式筛选正确的菌株及其包含的对应载体prsfduet-pcest。2、构建携带有酰基转移酶lovd9编码基因的表达载体pet22b-lovd利用全基因合成方法合成lovd9(pbdid:4lcm)的编码基因(北京六合华大基因有限公司合成，根据大肠杆菌密码子的偏好性进行密码子优化)。以此质粒为模板、以引物3和引物4为引物(北京六合华大基因有限公司合成)，通过常规pcr扩增得到lovd9的编码基因，引物序列如下：引物3：5’ggaattccatatgggcagcaacattgatgcggctgtggc3’引物4：5’cccaagcttttagccctgctgatactgcgcataaatcg3’pcr产物纯化回收后进行核酸电泳检测，结果如图2所示，dna片段大小为1239bp。利用限制性内切酶ndei和hindiii切出粘性末端，使用t4连接酶与经过同样的酶切得到的载体pet22b(实验室保存，将常规pet22b载体进行改造，去掉信号肽序列)连接，得到重组载体pet22b-lovd。质粒转化大肠杆菌dh5α的感受态细胞，在含有氨苄青霉素(终浓度是100μg/ml)的lb平板上挑取转化子，测序，按照lovd9的核苷酸序列seqidno:11所示形式筛选正确的菌株及其包含的对应载体pet22b-lovd。3、构建同时含有pcest和lovd9编码基因的重组大肠杆菌将prsfduet-pcest和pet22b-lovd两个载体按照1:1的摩尔比共转化进入大肠杆菌表达菌株bl21(de3)的感受态细胞中。在同时含有氨苄青霉素(终浓度是100μg/ml)和卡那霉素(终浓度是50μg/ml)的lb平板上挑取转化子，测序，按照pcest野生型(如序列seqidno:10所示)和lovd9(如序列seqidno:11所示)的核苷酸序列形式筛选正确的菌株及其包含的对应载体prsfduet-pcest和pet22b-lovd，即携带pcest和lovd9编码基因的重组大肠杆菌，命名为pl1菌株。4、pcest和lovd9蛋白的表达将pl1菌株培养100ml，37℃培养至对数生长期，加入诱导剂异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg，终浓度是0.1mm)，25℃培养16小时，诱导蛋白的表达。收集菌体，菌体用100mltris-hcl缓冲液(50mm，ph8.0)悬浮，超声破碎后离心，分开上清液和沉淀，沉淀用100mltris-hcl缓冲液(50mm，ph8.0)悬浮，取10μl上清液和沉淀部分进行sds-page电泳分析，结果如图3所示。pcest和lovd9两个蛋白在细胞内均实现了表达，但是pcest的可溶性表达量较低，说明pcest野生型在25℃条件下表达时易形成包涵体，即蛋白不能正确的折叠。5、pcest和lovd9酶活的测定将pl1菌株培养100ml，37℃培养至对数生长期，加入诱导剂iptg(终浓度是0.1mm)，25℃培养16小时，诱导蛋白的表达。收集菌体，菌体用100mltris-hcl缓冲液(50mm，ph8.0)悬浮。向上述含有菌体的tris-hcl缓冲液中加入新制的tris-hcl缓冲液(50mm，ph8.0)和洛伐他汀，使菌体终浓度是od600＝1.0、洛伐他汀的终浓度是0.5mm。25℃，200rpm反应10min，离心去掉菌体，上清液加入等量的甲醇，利用高效液相色谱(hplc)(色谱柱是agilentzorbaxxdb-c18(4.6×150mm,5μm)，流动相是乙腈:0.1％磷酸(50:50,v:v)流速是1ml/min，进样10μl)检测生成的莫纳可林j，计算得到pcest的酶活是2.54±0.07u/ml(酶活力单位u定义为每分钟催化产生1μm莫纳可林j所需的酶量)，pcest酶活性较低的原因是pcest蛋白的可溶性表达量偏低(如图3所示)。向上述含有菌体的tris-hcl缓冲液中加入新制的tris-hcl缓冲液(50mm，ph8.0)、莫纳可林j和α-二甲基丁酰-s-甲基巯基丙酸酯(dmb-s-mmp)，使菌体终浓度是od600＝1.0、莫纳可林j终浓度是0.5mm和dmb-s-mmp终浓度是2mm。25℃，200rpm反应10min，离心去掉菌体，上清液加入等量的甲醇，利用hplc检测生成的辛伐他汀，计算得到lovd9的酶活是9.55±0.56u/ml(酶活力单位u定义为每分钟催化产生1μm辛伐他汀所需的酶量)。实施例2.大肠杆菌重组菌株pl1在全细胞生物催化转化洛伐他汀合成辛伐他汀中的应用1、菌粉的制备将pl1菌株培养1l，37℃培养至对数生长期，加入诱导剂iptg(终浓度是0.1mm)，25℃培养16小时，诱导蛋白的表达。离心收集菌体，菌体用两倍体积的pbs缓冲液(50mm，ph8.0)洗涤两次，菌体-80℃预冻过夜，再冷冻干燥24小时，得到菌粉。2、辛伐他汀的生产分别取pl1菌粉0.5g、0.7g、1.0g，加入160ml含有洛伐他汀(终浓度为15mm)和α-二甲基丁酰巯基丙酸甲酯(dmb-s-mmp)(终浓度为20mm)的tris-hcl缓冲液(50mm，ph8.0)，使菌体的终浓度分别是3.13mg/ml、4.38mg/ml、6.25mg/ml，混匀后分成相等的9份，在25℃、200rpm条件下反应。每隔一定的时间取出一份样品。分开菌体和上清液，上清液加入等体积的乙酸乙酯，混匀后经旋转蒸发仪蒸干，加入甲醇溶解样品。菌体中加入二氯甲烷/甲醇混合液(1:1,v:v)，超声萃取，经抽滤去掉不溶物，液体置于旋转蒸发仪蒸干，加入甲醇溶解。上清液和菌体部分的甲醇溶解液合并，氮气吹干后加入相同体积的甲醇，利用hplc测定生成的辛伐他汀。由图4和5可知，随着菌体浓度的升高，转化率达到最高时所用的时间减少，具体地：当菌体浓度是3.13mg/ml时，1小时后转化率达到最高，即49％；当菌体浓度是4.38mg/ml时，3小时后转化率达到最高，即51.5％；当菌体浓度是6.25mg/ml时，5小时后转化率达到最高，即53％。转化率较低的原因是pl1菌株中pcest野生型在25℃左右表达时的可溶性表达量偏低(如图3所示)，使得全细胞的pcest酶活性偏低，且显著低于lovd9的酶活性，因此野生型pcest酶催化的洛伐他汀水解反应是整个辛伐他汀合成途径中的限速步骤，使得总转化率偏低。此外，本发明人在前期研究中发现野生型pcest在37℃放置1个小时后酶活性下降了87％，说明该酶的热稳定性较差，在工业生产中会大大增加人为控制低温导致的生产成本。因此，提高酶的可溶性表达量，改善其热稳定性和活性等性能可以进一步提高该酶的应用价值。实施例3.用于转化洛伐他汀合成辛伐他汀的大肠杆菌重组菌株的优化和改进1、2-甲基丁酸侧链水解酶突变体的获得(1)野生型2-甲基丁酸侧链水解酶表达载体的构建：以引物1和引物2为引物(北京六合华大基因有限公司合成)，通过常规pcr扩增得到编码2-甲基丁酸侧链水解酶的基因。引物序列如下：引物1：5’ggaattccatatggataccacctttcaggcg3’引物2：5’ccgctcgagctgctgacctttccaggc3’。模板是peasy-e2-pcest质粒(huangxn,liangyj,yangy,luxf.(2017).single-stepproductionofthesimvastatinprecursormonacolinjbyengineeringofanindustrialstrainofaspergillusterreus.metab.eng.,42,109-114)。pcr产物纯化后用限制性内切酶ndeiandxhoi酶切，与经相同酶切的pet28a-smt3载体连接，得到的载体命名为pet-pcest，质粒转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，挑取转化子，测序，按照pcest野生型的核苷酸序列seqidno:10所示形式筛选正确的菌株及其包含的对应载体pet-pcest。(2)2-甲基丁酸侧链水解酶突变体的构建：a、单点突变体的构建(d106g、q140l、s304g)①突变pcr：采用quikchange方法进行定点突变。以pet-pcest质粒dna为模板，根据突变位点设计并合成引物(表1)，进行pcr扩增，得到编码2-甲基丁酸侧链水解酶突变体的基因。pcr反应体系为:无菌水32.5μl，模板dna1μl，5×primestarhs缓冲液(mg2+plus)10μl，dntp混合液(各2.5mmol/l)4μl，正向引物(20pmol/μl)1μl，反向引物(20pmol/μl)1μl，takaraprimestarhsdna聚合酶0.5μl。反应条件为:95℃预变性5min；94℃10s、60℃15s、72℃7.5min，18个循环；最后72℃延伸10min。②酶切：将反应完成的pcr产物取出，按1:50(dpni酶:pcr产物，v:v)的比例加入dpni酶，37℃酶切1个小时。③取出，转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，在含有卡那霉素(终浓度50μg/ml)的lb平板上涂布，37℃过夜培养。转化子长出后，挑取单克隆送去测序。b、双点突变体的构建是在单点突变体(如d106g)基础上，利用其它单突变点的引物(如q140l正向和q140l反向(表1))进行pcr反应，引入其它单点突变(如q140l)的突变位点。c、三点突变体的构建是在双点突变体d106g/q140l基础上，利用引物s304g正向和s304g反向(表1)进行pcr反应，引入s304g的突变位点。表1.定点突变方法所用到的pcr引物引物序列(5’→3’)d106g正向acgaaagtccgctgggcgatccgccggcacd106g反向gtgccggcggatcgcccagcggactttcgtq140l正向caaaatggcgcgcactatacgcgaatccggq140l反向ccggattcgcgtatagtgcgcgccattttgs304g正向cgcgcagcactggcaggtccgctgggtccgs304g反向cggacccagcggacctgccagtgctgcgcg按照单点突变体的核苷酸序列seqidno:12-18所示突变形式筛选正确突变的菌株及其包含的对应载体，进行后续实验。(3)2-甲基丁酸侧链水解酶野生型和突变体蛋白质的纯化培养表达野生型酶和突变体酶的大肠杆菌bl21(de3)，37℃培养至对数生长期，加入iptg(终浓度是0.2mm)，16℃过夜诱导表达后，收集菌体，重悬于40mltris–hcl缓冲液(20mm,ph8.0)中，超声破碎菌体，得到粗酶液，经过ni-nta进行纯化。收集蛋白，用ulp1(ulp1:pcest质量比为1:50)过夜酶切，通过反挂ni柱的方式继续纯化蛋白，绝大多数目标蛋白穿出ni柱，而his-sumo与ni柱结合较紧密，需要高浓度(250mm)的咪唑才能洗脱下来，因此可以获得纯化的蛋白质(图6a)。经测序，各突变体酶的序列与预期的一致。2、2-甲基丁酸侧链水解酶突变体的表征(1)2-甲基丁酸侧链水解酶突变体酶活性的测定取以上制备的蛋白质进行酶活性测定。酶蛋白的浓度是0.05μm，底物洛伐他汀的浓度是400μm，37℃反应10分钟，利用hplc测定生成的莫纳可林j。hplc反应使用的色谱柱是agilentzorbaxxdb-c18(4.6×150mm,5μm)，流动相是乙腈:0.1％磷酸(50:50,v:v)流速是1ml/min，进样10μl。结果如图6b所示，突变体d106g、q140l、s304g、d106g/q140l、d106g/q140l/s304g的2-甲基丁酸侧链水解酶的酶活分别为野生型的2.90倍、2.51倍、1.91倍、5.10倍、6.46倍。(2)2-甲基丁酸侧链水解酶野生型和突变体酶促反应动力学参数的测定以如下浓度的酶和底物洛伐他汀测定不同条件下酶反应的初速度，绘制米氏方程曲线。如图7所示。酶浓度：野生型：0.05μm；突变体(d106g、d106g/q140l和d106g/q140l/s304g)：0.02μm。底物洛伐他汀的浓度：野生型：15μm、25μm、40μm、50μm、100μm、200μm和300μm；突变体d106g：15μm、20μm、25μm、50μm、100μm、200μm、400μm和500μm；突变体d106g/q140l：15μm、20μm、25μm、50μm、100μm、200μm、250μm、400μm、500μm和600μm；突变体d106g/q140l/s304g：15μm、20μm、25μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400μm和500μm。酶促反应动力学参数如表2所示。突变体d106g、d106g/q140l、d106g/q140l/s304g的kcat/km比野生型提高了1.54、4.0、5.06倍。表2.2-甲基丁酸侧链水解酶野生型和突变体反应动力学参数(3)2-甲基丁酸侧链水解酶野生型和突变体蛋白可溶性表达的测定培养编码野生型和突变体2-甲基丁酸侧链水解酶的大肠杆菌bl21(de3)100ml，37℃培养至对数生长期，加入iptg(终浓度是0.2mm)，在25℃条件下进行蛋白的诱导表达，过夜后收集菌液，超声破碎后离心，分开上清液和沉淀，沉淀部分加入相同体积的tris–hcl缓冲液(50mm,ph8.0)悬浮。取相同量的上清液和沉淀蛋白液进行sds-page蛋白电泳分析，结果如图8所示。绝大部分的野生型蛋白在沉淀部分，而突变体d106g、d106g/q140l和d106g/q140l/s304g的绝大部分蛋白在上清液部分，说明突变体d106g蛋白的可溶性表达量明显提高。而q140l和s304g突变体蛋白的可溶性表达量相对于野生型也有小量提高。(4)2-甲基丁酸侧链水解酶野生型和突变体蛋白的温度稳定性的测定对pcr仪的反应槽温度条件进行设定，取出等量的野生型和突变体蛋白，放置在具有不同温度(20℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃和50℃)的反应槽中，孵育10分钟，立即放置冰上冷却10分钟，然后从中取出蛋白进行酶活性测定，测定条件是：酶的浓度是0.05μm，底物洛伐他汀的浓度是400μm，37℃反应10分钟，利用hplc测定生成的莫纳可林j。以不做温度处理的蛋白的活性为100％，计算蛋白经过不同温度处理后酶活性的相对值，绘制曲线。如图9所示，突变体d106g、q140l、s304g、d106g/q140l、d106g/q140l/s304g的t50值分别比野生型提高了4℃、3℃、2℃、5.5℃、8℃。3.构建携带有pcest突变体d106g/q140l/s304g编码基因的表达载体prsfduet-pcest-m突变pcr：采用quikchange方法进行定点突变。以prsfduet-pcest质粒dna为模板，根据突变位点设计并合成引物(表1)，进行pcr扩增，得到编码pcest突变体d106g/q140l/s304g的编码序列。单点突变体d106g构建的pcr反应体系为:无菌水32.5μl,模板dna1μl,5×primestarhs缓冲液(mg2+plus)10μl,dntp混合液(各2.5mmol/l)4μl，引物d106g正向(20pmol/μl)1μl,引物d106g反向(20pmol/μl)1μl,takaraprimestarhsdna聚合酶0.5μl。反应条件为:95℃预变性5min,94℃10s,60℃15s,72℃7.5min,18个循环,最后72℃延伸10min。酶切：将反应完成的pcr产物取出，按1:50(dpni酶:pcr产物，v:v)的比列加入dpni酶，37℃酶切1个小时。取出，转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，在含有卡那霉素(终浓度是50μg/ml)的lb平板上涂布，37℃过夜培养。转化子长出后，挑取单克隆送去测序。双点突变体d106g/q140l的构建是在单点突变体d106g基础上，利用引物q140l正向和q140l反向(表1)进行pcr反应，引入q140l的突变位点。三点突变体d106g/q140l/s304g的构建是在双点突变体d106g/q140l基础上，利用引物s304g正向和s304g反向(表1)进行pcr反应，引入s304g的突变位点。经过三次突变最终得到携带有pcest突变体d106g/q140l/s304g编码基因的表达载体prsfduet-pcest-m，核苷酸序列如序列表中seqidno:18所示，总长为1200bp。测序结果与预期一致。4.构建同时含有pcest突变体d106g/q140l/s304g编码基因和lovd9编码基因的重组大肠杆菌将prsfduet-pcest-m和pet22b-lovd两个载体按照1:1的摩尔比共转化进入大肠杆菌表达菌株bl21(de3)的感受态细胞中。在同时含有氨苄青霉素(终浓度是100μg/ml)和卡那霉素(终浓度是50μg/ml)的lb平板上生长的菌落，挑取转化子，测序，按照pcest突变体d106g/q140l/s304g(如序列seqidno:18所示)和lovd9(如序列seqidno:11所示)的核苷酸序列形式筛选正确的菌株及其包含的对应载体prsfduet-pcest-m和pet22b-lovd，即携带pcest突变体d106g/q140l/s304g和lovd9编码基因的重组大肠杆菌，命名为plm3菌株。5.plm3菌株中pcest突变体d106g/q140l/s304g和lovd9蛋白的表达将plm3菌株培养100ml，37℃培养至对数生长期，加入诱导剂iptg(终浓度是0.1mm)，25℃培养16小时，诱导蛋白的表达。收集菌体，菌体用100mltris-hcl缓冲液(50mm，ph8.0)悬浮，超声破碎后离心，分开上清液和沉淀，沉淀用100mltris-hcl缓冲液(50mm，ph8.0)悬浮。取10μl上清液和沉淀部分进行sds-page蛋白电泳分析，结果如图3所示，在plm3菌株中pcest突变体d106g/q140l/s304g和lovd9两个蛋白在细胞内都实现了表达。通过对比pl1和plm3菌株中蛋白的表达情况，可以看出，pl1菌株中表达的pcest野生型的可溶性表达量较低，而plm3菌株中表达的pcest突变体d106g/q140l/s304g的可溶性表达量较高，说明pcest突变体d106g/q140l/s304g在25℃条件下表达时蛋白能够正确的折叠。6.plm3菌株中pcest突变体和lovd9的酶活的测定将plm3菌株培养100ml，37℃培养至对数生长期，加入诱导剂iptg(终浓度是0.1mm)，25℃培养16小时，诱导蛋白的表达。收集菌体，菌体用100mltris-hcl缓冲液(50mm，ph8.0)悬浮。pcest酶活的检测方法如实施例1中所述，最终计算得到pcest的酶活是26.08±3.45u/ml(酶活力单位u定义为每分钟催化产生1μm莫纳可林j所需的酶量)，与pcest野生型相比，pcest突变体d106g/q140l/s304g酶活性显著提高，原因是pcest突变体d106g/q140l/s304g蛋白的可溶性表达量显著提高(如图3所示)。lovd9酶活的检测方法如实施例1中所述，最终计算得到lovd9的酶活是9.82±0.35u/ml(酶活力单位定义为每分钟催化产生1μm辛伐他汀所需的酶量)。7.大肠杆菌重组菌株plm3在全细胞生物催化转化洛伐他汀合成辛伐他汀中的应用制备plm3菌株的菌粉，具体操作过程如实施例2中所述。利用plm3菌粉合成辛伐他汀，具体操作过程如实施例2中所述。由图4和5可知，随着菌体浓度的升高，转化率达到最高时所用的时间减少，具体地：当菌体浓度分别是3.13mg/ml、4.38mg/ml和6.25mg/ml时，转化率达到最高所用的时间分别是1小时、3小时和5小时，转化率均是92％。与pl1菌株相比，plm3菌株的转化率提高了近1倍，原因是plm3菌株中pcest突变体d106g/q140l/s304g的可溶性表达量、酶活性和热稳定性显著提高，使得全细胞催化剂中pcest的活性增强，从而为第二步lovd的酰基化反应提供了充足的底物，最终大幅度地提高了总转化率。序列表<110>中国科学院青岛生物能源与过程研究所浙江海正药业股份有限公司<120>合成辛伐他汀的重组菌株、方法以及相关酶<130>dp1f180073zx<160>18<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>399<212>prt<213>产黄青霉(penicilliumchrysogenum)<400>1metaspthrthrpheglnalaalaileaspthrglylysileasngly151015alavalvalcysalathraspalaglnglyhisphevaltyrasnlys202530alathrglygluargthrleuleuserglyglulysglnproglngln354045leuaspaspvalleutyrleualaseralathrlysleuilethrthr505560ilealaalaleuglncysvalgluaspglyleuleuserleuaspgly65707580aspleuserserilealaprogluleualaalalystyrvalleuthr859095glyphethraspaspgluserproleuaspaspproproalaargpro100105110ileth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