本发明涉及一种酯酶突变体，以及其在制备光学活性2-芳基丙酸中的应用。
背景技术：
：：2-芳基丙酸(2-apa)类的nsaid的对映体中只有右旋的构型显示高的药理活性，左旋构型活性低或无作用。鉴于一般化学反应所产生的手性中心总是得到等量的一对对映体混合物，称之为外消旋体。欲得到光学纯右旋2-apa，拆分外消旋体是主要方法之一。酮洛芬是2-芳基丙酸类非甾体抗炎药(nsaids)，其消炎镇痛作用是阿司匹林的150倍，解热作用是阿司匹林的100倍。本药自70年代以来报道合成的方法很多，但均为合成外消旋体，因此，制备右旋酮洛芬或者将左旋酮洛芬转变成右旋酮洛芬具有巨大的经济效益。一般来说采用化学拆分需用手性衍生试剂，价格昂贵，且过程冗长，较难得到满意的结果。而用微生物酶法拆分则可提供一个经济的选择。文献“cloningandcharacterizationofthermostableesterasefromarchaeoglobusfulgidus”中记载seung-bumkim等在极端微生物archaeoglobusfulgidusdsm4304中分离得到一种热稳定的酯酶est-af，est-af热稳定性极好，能够耐受70～90℃高温，但其在酮洛芬的立体选择性方面较差(右旋酮洛芬ee％＝30.2％)。技术实现要素：本发明的目的是通过饱和突变技术对酯酶est-af基因进行改造，使改造后的基因工程酯酶est-af在仍然具备热稳定性的前提下，手性选择性方面有所提高，使其符合在催化生产右旋2-芳基丙酸工业化应用的需求。本发明采用的技术方案是：本发明提供一种酯酶突变体，所述酯酶的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述酯酶突变体为在seqidno.1的基础上进行一个或多个位点上的氨基酸突变。在一些实施例中，所述突变位点为第138位和/或第200位。在一些实施例中，所述酯酶突变体，第138位的缬氨酸被突变为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸；和/或，第200位的亮氨酸被突变为异亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸。在一些实施例中，所述酯酶突变体第138位的缬氨酸被突变为苯丙氨酸，且第200位的亮氨酸被突变为丙氨酸。本发明还涉及一种多核苷酸，其编码本发明所述的酯酶突变体。本发明还涉及一种包含本发明多核苷酸的重组载体。本发明还提供一种由本发明所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。此外，本发明还提供一种本发明所述酯酶突变体在制备光学活性2-apa中的应用。优选地，在制备右旋酮洛芬中的应用。本发明提供了一种酯酶突变体，该突变体与野生型酯酶相比，在保留了热稳定性的基础上具有更高的酶活和/或立体选择性，该酯酶突变体在制备光学活性2-apa中的应用，尤其是在制备右旋酮洛芬中的应用，可以直接以酮洛芬为底物，加入甲醇(或乙醇、丙醇)，直接拆分出s-酮洛，较化学合成法，能够降低生产成本，提高生产效率，适应工业化生产的需求。附图说明附图1实施例1密码子优化后的核苷酸序列gc含量分布图；附图2实施例2质粒转化验证凝胶电泳图；附图3实施例2重组表达质粒pet28a-est1示意图。具体实施方式本发明的其他特点和优越性可通过以下详细的描述体现。但是，应该理解的是，仅以示例性的方式给出详细描述和具体实施例以表明本发明的实施方案，这是因为对于本领域熟练技术人员从所述的详细描述中，在本发明的实质和范围内多种改变和改良是显而易见的。术语定义本发明所述“2-芳基丙酸(2-apa)”是指具有式(ⅰ)结构的化合物，也被称为芳基-2-丙酸。其中，ar为芳基。术语“芳基”可以是单环，双环，和三环的碳环体系，其中，至少一个环体系是芳香族的，其中每一个环体系包含3-7个原子。具体来说，本文所述具有消炎作用的2-芳基丙酸类药物包括但不限于如下举例，例如酮洛芬(ketoprofen)，甲氧基甲基萘乙酸(naproxene)、异丁苯丙酸(ibrufen)、舒洛芬(sutoprofen)、非诺洛芬(fenoprofen)、苯恶洛芬(bennoxaprofen)、卡布洛芬(carprofen)、环洛芬(cicloprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)和氟洛芬(fluprofen)等。本文所述“光学活性2-芳基丙酸”，是指具有药理活性的2-芳基丙酸，更进一步的，为s(+)-2-apa。本文所述“转化率”以酮洛芬为例按如下公式计算，本文所述“ee％”意为对映体超量，即在手性合成中，生成目标产物(某一种特定的立体异构体)的百分含量减去副产物(另一种异构体)的百分含量。例如，ee％为98％，即表示生成的目标产物的含量为99％。本文所述“右旋ee％”，以酮洛芬为例：实施例本文中所用到的材料均可通过市售得到。实施例1est-af的密码子优化根据e.coli的密码子使用频率分布表，将酯酶est-af序列seqidno:1中的所有氨基酸均采用密码子使用频率分布表中的最优密码子来进行翻译。此外还需避免出现重复序列，避开密码子优化过程中产生的ncoi和hindiii限制性内切酶位点。最终得到优化后的序列seqidno:2。优化后的序列gc含量分布如图1所示。最后在序列的两端加上ncoi和hindiii酶切位点，由通用生物系统(安徽)有限公司合成，合成的序列命名为est1。实施例2est1表达菌株的构建以合成的est1序列为模板，使用下述引物扩增长约740bp大小的est1基因片段。5’-ccccatggaacgtattaccctg-3’(seqidno:3)5’-ccaagcttttacagtttttcaataaa-3’(seqidno:4)pcr体系为：5×primestarpcrhsbuffer10μl，上游引物和下游引物各1μl(10pm)，dna模板1μl(0.1μg)，dntps(2.5mm)4μl，primestarpcrhspolymerase0.5μl和ddh2o至50μl。pcr扩增步骤为：(1)98℃，预变性20s；(2)98℃，变性10s；(3)60℃退火10s；(4)72℃延伸60s；(2)～(4)重复30个循环；(5)72℃继续延伸10min。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收1100bp左右的目标条带。pcr产物在37℃用限制性内切酶ncoi和hindiii双酶切2h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收目标片段，其中含有正确的插入片段。将目标片段与同样经ncoi和hindiii酶切后的质粒pet28a混合，在t4dna连接酶的作用下，16℃连接5h，然后转化到e.colitop10感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板(培养基成分lb培养基，蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，氯化钠10g/l和琼脂2％，抗生素含量50mg/l)上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，培养重组菌株，提取质粒，使用ncoi和hindiii酶切验证(见图2)，得到的重组表达质粒命名为pet28a-est1(见图3)。将上述重组表达质粒转化至e.colibl21(de3)感受态细胞中。转化液涂布到含有卡那霉素(50mg/l)的lb平板上，37℃倒置培养过夜，获得阳性重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pet28a-est1，命名为hec-est1。实施例3重组酯酶的表达将实施例2所得的重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pet28a-est1，接种至含卡那霉素(50mg/l)的lb培养基中，37℃振荡培养过夜。按2‰(v/v)的接种量接入装有50mllb培养基的250ml三角烧瓶中，置37℃、200rpm摇床震荡培养。当培养液的od600达到0.8时，加入终浓度为0.5mmol/l的iptg进行诱导。30℃诱导8h后，将培养液离心，收集细胞，得大约0.3g湿细胞。实施例4利用est1拆分酮洛芬分别将酮洛芬20mg，丙醇20mg，加入10ml环己烷中进行溶解，30℃、250rpm条件下反应孵育10min，然后加入酯酶est1湿细胞0.3g，混匀，反应24h。5000g离心5min去除细胞，得到的上清液分别用旋转蒸发仪于40℃条件下蒸干，取200μl90％正己烷(异丙醇)复溶，过0.45μm滤膜，进hplc进行转化率和手性检测。hplc检测分析条件为：色谱柱，chiralnd柱；柱温，30℃；流动相，正己烷(0.15％tfa)：异丙醇＝93:7。est1催化酮洛芬进行手性拆分反应，最终整个反应中酮洛芬的转化率为54％，得到的右旋酮洛芬ee值为30.2％。实施例5：est1的饱和突变改造为了分别对位点v138和l200进行饱和突变，以est1基因序列(seqidno.1)为参考设计了两对引物v138-f/v138-r和l200-f/l200-r对est1进行饱和突变。具体实施方法为：以重组质粒pet28a-est1为模板，分别以v138-f/v138-r和l200-f/l200-r为引物，对质粒pet28a-est1扩增。v138-f：gccgaagccgcagaactgnnnagtaaatatgcctttagc(seqidno:5)v138-r：gctaaaggcatatttactnnncagttctgcggcttcggc(seqidno:6)l200-f：gtgggcgaaaaagatgcannnaccccggtgaaatatagc(seqidno:7)l200-r：gctatatttcaccggggtnnntgcatctttttcgcccac(seqidno:8)pcr体系为：5×primestarpcrhsbuffer10μl，上游引物和下游引物各1μl(10pm)，dna模板5μl(0.5μg)，dntps(2.5mm)4μl，primestarpcrhspolymerase0.5μl和ddh2o至50μl。pcr扩增步骤为：(1)98℃，预变性20s；(2)98℃，变性10s；(3)60℃退火10s；(4)72℃延伸5min；(2)～(4)重复30个循环；(5)72℃继续延伸10min。pcr产物直接回收。对回收pcr产物分别使用takaraquickcutdpni在37度酶切1h，去除模板质粒pet28a-est1。将酶切后的产物转化bl21(de3)感受态细胞。然后转移细胞至含卡那霉素(终浓度为50μg/ml)的lb平板在37℃条件下培养过夜，生长出的克隆即为est1的v138和l200位点饱和突变库。将这些突变库接入96孔板中(内含自诱导液体培养基，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，na2hpo425mm，nh4cl50mm，mgso42mm，甘油5g/l，葡萄糖0.5g/l，α-乳糖2g/l。)，30℃培养48h，获得种子液。使用排枪将培养好的孔板每孔转移200μl至新的孔板中，盖上封口胶塞，4℃保存。将复制后剩余的孔板在离心机最大转速中4℃离心10min收集湿细胞。使用排枪每孔分别加入500μl酮洛芬底物溶液(酮洛芬20mg，丙醇20mg，环己烷10ml配制而成)，于30℃、200rpm条件下中反应48h后，测定反应液中右旋酮洛芬的ee值。结果表明，筛选的大量突变库中获得6个右旋酮洛芬ee值提高的est1突变体，分别命名为est1-1、est1-2、est1-3、est1-4、est1-5、est1-6。测序分析，发现它们分别含如下突变：v138l、v138i、v138f、l200i、l200v、l200a。按照实施例3的诱导方法和实施例4的反应方法对这6个est1突变体进行酶催化反应再验证，检测得到这些突变体的ee值分别为52.1％、69.5％、83.6％、76.7％、91.2％、98.2％。表1酯酶点突变右旋酮洛芬ee值est1-1v138l52.1％est1-2v138i69.5％est1-3v138f83.6％est1-4l200i76.7％est1-5l200v91.2％est1-6l200a98.2％实施例6：est1的饱和突变改造从est1-3突变体菌株中提取出pet28a-est1-3质粒，该质粒上的酯酶est1-3带有v138f突变。以l200a-f和l200a-r为引物，对pet28a-est1-3质粒进行扩增。l200a-f：gtgggcgaaaaagatgcagcaaccccggtgaaatatagc(seqidno:9)l200a-r：gctatatttcaccggggttgctgcatctttttcgcccac(seqidno:10)pcr体系为：5×primestarpcrhsbuffer10μl，上游引物和下游引物各1μl(10pm)，dna模板5μl(0.5μg)，dntps(2.5mm)4μl，primestarpcrhspolymerase0.5μl和ddh2o至50μl。pcr扩增步骤为：(1)98℃，预变性20s；(2)98℃，变性10s；(3)60℃退火10s；(4)72℃延伸5min；(2)～(4)重复30个循环；(5)72℃继续延伸10min。pcr产物直接回收。对回收pcr产物分别使用takaraquickcutdpni在37℃酶切1h，去除模板质粒pet28a-est1-3。将酶切后的产物转化bl21(de3)感受态细胞。然后转移细胞至含卡那霉素(终浓度为50μg/ml)的lb平板在37℃条件下培养过夜，挑取，生长出的克隆经过pcr验证和测序验证筛选，得到同时带有v138f和l200a两点突变的est1突变体est1-7。按照实施例3的诱导方法和实施例4的反应方法对est1-7进行酶催化反应，该突变体的转化率49.8％，右旋酮洛芬ee值达到99.3％。序列表<110>黄石世星药业有限责任公司东莞东阳光药物研发有限公司<120>酯酶突变体及其应用<130>2018<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>247<212>prt<213>archaeoglobusfulgidus<400>1metgluargilethrleugluileaspalaleulysileservalleu151015lysglylysglulysaspvalmettyrilehisglyserglycysasp202530alathrleutrpgluargglnleugluaspvalglyglytyralaile354045aspleuproasnhisglyargsercysalaalagluileargaspile505560glyasptyralatyrphevalalalysthrvallyslysleumetgly65707580lysalavalilevalglyhisserleuglyglyalavalalaglnlys859095iletyrleuglutyrprolysvalvallysalaleuvalleuvalgly100105110thrglyalaargleuargvalmetprogluileleuthrmetleulys115120125glulysproalaglualaalagluleuglyserlystyralapheser130135140asnglngluleualalysglupheserlysvalphealagluargala145150155160glyvalleuhisleuaspleuserleucysaspargpheaspleuleu165170175gluasptyrargserglylysvallysvalaspileprothrleuleu180185190ilevalglyglulysaspalaargthrprovallystyrsergluphe195200205phelyslyshisileproseralaglumetvalvalileprogluala210215220glyhismetvalmetleuglulysproaspglupheasnargalaleu225230235240lysasnpheileglulysleu245<210>2<211>741<212>dna<213>artificialsequence<400>2atggaacgtattaccctggaaattgatgccctgaaaattagtgttctgaaaggcaaagaa60aaggatgttatgtatatccacggtagtggttgtgatgccaccctgtgggaacgtcagctg120gaagatgttggcggttatgccattgatctgccgaatcatggccgcagttgcgccgccgaa180attcgtgatattggcgattatgcctattttgttgccaaaaccgttaaaaaactgatgggt240aaagccgttattgtgggtcatagtctgggcggtgccgttgcacagaaaatttatctggaa300tatccgaaagtggtgaaagcactggttctggttggcaccggcgcacgcctgcgtgttatg360ccggaaattctgaccatgctgaaagaaaaaccggccgaagccgcagaactgggtagtaaa420tatgcctttagcaatcaggaactggcaaaagaatttagcaaagtttttgcagaacgtgca480ggtgtgctgcatctggatctgagcctgtgtgatcgttttgatctgctggaagattatcgt540agcggtaaagttaaagttgatattccgaccctgctgattgtgggcgaaaaagatgcacgt600accccggtgaaatatagcgaattttttaaaaagcacatcccgagcgcagaaatggttgtt660attccggaagcaggtcatatggtgatgctggaaaaaccggatgaatttaatcgcgccctg720aaaaattttattgaaaaactg741<210>3<211>22<212>dna<213>artificialsequence<400>3ccccatggaacgtattaccctg22<210>4<211>26<212>dna<213>artificialsequence<400>4ccaagcttttacagtttttcaataaa26<210>5<211>39<212>dna<213>artificialsequence<400>5gccgaagccgcagaactgnnnagtaaatatgcctttagc39<210>6<211>39<212>dna<213>artificialsequence<400>6gctaaaggcatatttactnnncagttctgcggcttcggc39<210>7<211>39<212>dna<213>artificialsequence<400>7gtgggcgaaaaagatgcannnaccccggtgaaatatagc39<210>8<211>39<212>dna<213>artificialsequence<400>8gctatatttcaccggggtnnntgcatctttttcgcccac39<210>9<211>39<212>dna<213>artificialsequence<400>9gtgggcgaaaaagatgcagcaaccccggtgaaatatagc39<210>10<211>39<212>dna<213>artificialsequence<400>10gctatatttcaccggggttgctgcatctttttcgcccac39当前第1页12当前第1页12