蛋白质UGT142及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及蛋白质ugt142及其编码基因与应用。
背景技术：
：菘蓝(isatisindigoticafort.)为十字花科菘蓝属两年生草本植物。菘蓝根为板蓝根、叶为大青叶来源之一，均为常用中药，具有清热解毒、凉血利咽之功效，临床上常用于流行性感冒、流行性腮炎、流行性乙型脑炎、急慢性肝炎、带状疱疹等疾病的治疗。木脂素及其糖苷类化合物(主要为落叶松树脂醇-4-o-β-d-葡萄糖苷和直铁线莲宁b)是菘蓝抗病毒重要活性物质基础之一，其合成途径上大部分关键酶基因已被鉴定，但催化关键糖基化修饰的糖基转移酶的编码基因仍然没有被鉴定。糖基转移酶(glycosyltransferases)是将糖基从活化的核苷酸—糖供体的单糖转移到糖基受体形成糖苷键，在植物糖苷类成分的生物合成及生长过程中起着关键作用。由于落叶松树脂醇-4-o-β-d-葡萄糖苷和直铁线莲宁b在菘蓝原植物中含量较低，这很大程度限制其在临床上的应用。由此可见，菘蓝糖基转移酶编码基因的克隆为解析木脂素生物合成途径进而利用代谢工程调节菘蓝中木脂素糖苷的含量或直接通过合成生物学策略合成这类化合物提供重要基础。技术实现要素：本发明的目的是提供一种糖基转移酶，糖基转移酶可以将落叶松树脂醇转化成落叶松树脂醇-4-o-β-d-葡萄糖苷和/或落叶松树脂醇-4’-o-β-d-葡萄糖苷和/或直铁线莲宁b。本发明提供的糖基转移酶，名称为蛋白质ugt142，来源于菘蓝(isatisindigoticafort.)。所述蛋白质ugt142可为如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有糖基转移酶活性的蛋白质。其中，序列表中序列2由486个氨基酸残基组成。为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码所述蛋白质ugt142的核酸分子也属于本发明的保护范围。所述编码蛋白质ugt142的核酸分子具体可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：b1)编码区是序列表中序列1所示的dna分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的dna分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于菘蓝且编码所述蛋白质ugt142的dna分子；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，来源于菘蓝且编码所述蛋白质ugt142的dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。其中，序列表中序列1由1461个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质ugt142的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质ugt142的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质ugt142，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质ugt142的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入序列表的序列1所示的dna分子得到的重组质粒。所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体具体可为实施例提及的重组质粒pet28a-his-mbp-ugt142。所述重组质粒pet28a-his-mbp-ugt142为将pet28a-his-mbp原核表达载体的限制性内切酶bamhi识别序列和限制性内切酶noti识别序列间的dna小片段替换为核苷酸序列是序列表的序列1所示的dna分子，得到的重组质粒。所述pet28a-his-mbp原核表达载体(环形)的核苷酸序列可如序列表中序列3所示。所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为将含有上述任一所述核酸分子的重组载体导入出发微生物得到的重组菌。所述出发微生物可为大肠杆菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌transetta(de3)。所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物具体可为实施例提及的重组菌甲。本发明还保护上述任一所述蛋白质ugt142，或，上述任一所述核酸分子，或，含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，的应用，可为如下c1)或c2)：c1)作为糖基转移酶的应用；c2)在制备具有糖基转移酶功能的产品中的应用。本发明还保护上述任一所述蛋白质ugt142，或，上述任一所述核酸分子，或，含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，的应用，可为如下c3)或c4)：c3)在生产落叶松树脂醇单葡萄糖苷和/或落叶松树脂醇双葡萄糖苷中的应用；c4)在制备用于生产落叶松树脂醇单葡萄糖苷和/或落叶松树脂醇双葡萄糖苷的产品中的应用。上述应用中，所述“生产落叶松树脂醇单葡萄糖苷和/或落叶松树脂醇双葡萄糖苷”可以落叶松树脂醇和尿苷二磷酸-β-o-d-葡萄糖作为原料。上述任一所述的应用中，所述落叶松树脂醇单葡萄糖苷可为落叶松树脂醇-4-o-β-d-葡萄糖苷和/或落叶松树脂醇-4’-o-β-d-葡萄糖苷。上述任一所述的应用中，所述落叶松树脂醇双葡萄糖苷可为直铁线莲宁b。本发明还保护上述任一所述蛋白质ugt142，或，上述任一所述核酸分子，或，含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，的应用，可为如下c5)或c6)：c5)在转化落叶松树脂醇中的应用；c6)在制备用于转化落叶松树脂醇的产品中的应用。实验证明，蛋白质ugt142具有糖基转移酶的活性，可高效转化落叶松树脂醇生成落叶松树脂醇-4-o-β-d-葡萄糖苷和/或落叶松树脂醇-4’-o-β-d-葡萄糖苷和/或直铁线莲宁b。落叶松树脂醇-4-o-β-d-葡萄糖苷和直铁线莲宁b均为菘蓝抗病毒重要活性物质。本发明具有重要的应用价值。附图说明图1为ugt系统进化树(邻接法)分析。图2为重组质粒pet28a-his-mbp-ugt142的构建示意图和表达产物的sds-page。图3为实施例2中的uplc检测结果。图4为实施例2中的q-tof-ms检测结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。大肠杆菌transetta(de3)感受态细胞、peasy-uniseamlesscloningandassemblykit和dna凝胶回收试剂盒均为北京全式金生物技术有限公司的产品。primescript1ststrandcdnasynthesiskit为宝生物(大连)工程有限公司的产品。prestainedproteinladder为neb公司的产品。kod-plus-neo高保真pcr酶为东洋纺(上海)生物科技有限公司的产品。iptg和pmsf均为美国sigma公司的产品。下述实施例中的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。下述实施例中的测序均由北京擎科生物技术有限公司完成。pet28a-his-mbp原核表达载体(环形)的核苷酸序列如序列表中序列3所示。实施例1、重组糖基转移酶的制备一、来源于菘蓝的糖基转移酶的编码基因(ugt142基因)的获得1、分别提取菘蓝组织(根、茎、叶或花)的总rna，然后通过illuminahiseq4000平台测序，质量检测。2、完成步骤1后，分别取质量检测合格的菘蓝组织的总rna，等比例混合建库。3、完成步骤2后，测序，利用trinity软件对转录组进行组装，得到57072个unigene，总长为47238106bp。4、完成步骤3后，通过ncbi公共数据库和kegg对参与直铁线莲宁b生物合成的基因做注释。通过go注释、blast对比分析和mega7.0构建系统发育树等软件分析，获得菘蓝中糖基转移酶编码基因的系统进化信息。本发明的发明人经过大量实验发现了菘蓝中糖基转移酶的编码基因(ugt142基因)。ugt142基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。ugt142基因编码蛋白质ugt142，蛋白质ugt142的氨基酸序列如序列表中序列2所示。将蛋白质ugt142的氨基酸序列用ncbi数据库中的blast程序在non-redundantgenbankcdstranslation+pdb+swissprot数据库中进行同源性检索。ugt系统进化树(邻接法)见图1。结果表明，在氨基酸水平上蛋白质ugt142与其它物种中的ugt有较高的同源性，同时具有典型的活性位点结构域。二、重组质粒pet28a-his-mbp-ugt142的构建重组质粒pet28a-his-mbp-ugt142的构建示意图见图2中a。1、提取菘蓝毛状根的总rna，然后采用primescript1ststrandcdnasynthesiskit进行反转录，得到菘蓝毛状根的cdna。2、以菘蓝毛状根的cdna为模板，采用引物f：5’-aggggcccgaattcggatccatgaagattacaagaccacatgc-3’(下划线为限制性内切酶bamhi的酶切位点)和引物r：5’-gtggtgctcgagtgcggccgcctaggcaccacgtgccattc-3’(下划线为限制性内切酶noti的酶切位点)组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。反应体系为20μl，由5μlkodbuffer(10×)(kod-plus-neo高保真pcr酶自带的组件)、5μldntp(浓度为2.0mmol/l)、2μl引物f水溶液(浓度为10μmol/l)、2μl引物r水溶液(浓度为10μmol/l)、1μlkod-plus-neo高保真pcr酶、1μl菘蓝毛状根的cdna水溶液(含20ng菘蓝毛状根的cdna)和4μl无菌双蒸水组成。反应程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸2min，34个循环；68℃延伸7min。2、取步骤1得到的pcr扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，然后利用dna凝胶回收试剂盒回收约1450bp的dna片段。3、取步骤2回收的dna片段，用限制性内切酶bamhi和noti酶切，回收约1450bp的酶切产物。4、取pet28a-his-mbp原核表达载体，用限制性内切酶bamhi和noti酶切，回收约6.5kb的载体骨架。5、将步骤3得到的酶切产物和步骤4得到的载体骨架采用peasy-uniseamlesscloningandassemblykit进行连接，得到重组质粒pet28a-his-mbp-ugt142。将重组质粒pet28a-his-mbp-ugt142进行测序。根据测序结果，对重组质粒pet28a-his-mbp-ugt142进行结构描述如下：将pet28a-his-mbp原核表达载体的限制性内切酶bamhi识别序列和限制性内切酶noti识别序列间的dna小片段替换为核苷酸序列是序列表的序列1所示的dna分子。三、重组糖基转移酶的表达1、将重组质粒pet28a-his-mbp-ugt142转化大肠杆菌transetta(de3)感受态细胞，得到重组菌甲。2、将重组菌甲的单克隆接种于5mllb液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)，37℃、250rpm振荡培养过夜，得到培养菌液。3、完成步骤2后，将培养菌液接种(接种比为1:100)于500mllb液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)，37℃、250rpm振荡培养至od600nm值为0.4-0.6，加入iptg并使其在体系中的浓度为1mm，然后16℃、250rpm振荡培养16h，4℃、5000g离心10min，收集菌体。3、取步骤2得到的菌体，用预冷纯水洗涤2次，然后加入30ml含1mmedta、1mmpmsf、10％(v/v)甘油的ph7.4、50mmtris-cl缓冲液重悬，得到重悬液。4、完成步骤4后，取所述重悬液，采用细胞破碎仪超声破碎(10kg频率下间歇5s，破碎5s，共破碎5min)，然后4℃、13000rpm离心15min，收集上清液，上清液即为即重组菌甲的粗酶液(经iptg诱导)。按照上述方法，将重组质粒pet28a-his-mbp-ugt142替换为pet28a-his-mbp原核表达载体，得到重组菌乙(作为对照菌)，然后进一步得到重组菌乙的粗酶液。按照上述方法，将步骤3替换为步骤3x，其它步骤均不变，得到重组菌甲的粗酶液(未经iptg诱导)。步骤3x为：将培养菌液接种(接种比为1:100)于500mllb液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)，37℃、250rpm振荡培养至od600nm值为0.4-0.6，然后16℃、250rpm振荡培养16h，4℃、5000g离心10min，收集菌体。将重组菌甲的粗酶液(经iptg诱导)、重组菌乙的粗酶液和重组菌甲的粗酶液(未经iptg诱导)进行sds-page。结果见图2中b(m为prestainedproteinladder，1为重组菌乙的粗酶液，2为重组菌甲的粗酶液(未经iptg诱导)，3为重组菌甲的粗酶液(经iptg诱导))。结果表明，重组菌甲的粗酶液(经iptg诱导)出现一条明显的特异蛋白质表达条带，对应分子量为100kd，与预期大小一致；重组菌甲的粗酶液(未经iptg诱导)和重组菌乙的粗酶液中则没有分子量为100kda的条带。重组菌甲的粗酶液(经iptg诱导)即含有重组糖基转移酶。实施例2、重组糖基转移酶转化落叶松树脂醇生成落叶松树脂醇单葡萄糖苷和落叶松树脂醇双葡萄糖苷待测溶液为实施例1制备的重组菌甲的粗酶液(经iptg诱导)或重组菌乙的粗酶液。1、配制反应体系。反应体系由300μl待测溶液、1.5μl落叶松树脂醇溶液(溶剂为甲醇，浓度为40mm)和3μl尿苷二磷酸-β-o-d-葡萄糖溶液(溶剂为超纯水，浓度为40mm)组成。2、取步骤1配制的反应体系，30℃水浴12h。3、取完成步骤2的体系，加入2倍体积纯甲醇(目的为终止反应)，振荡提取。4、完成步骤3后，13000rpm离心15min，收集上清。5、完成步骤4后，取所述上清，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，收集滤液。将滤液和直铁线莲宁b标准品进行uplc分析。uplc条件为：色谱柱：acquityuplcbehc18(2.1mm×50mm，1.7μm)；流动相：含0.1％甲酸乙腈(a)：含0.1％甲酸的水(b)＝12：88；流速：0.4ml/min；检测波长为225nm，柱温为40℃，进样量为2μl。实验结果见图3(cb为直铁线莲宁b，lar为落叶松树脂醇，ugt142+lar为重组菌甲的粗酶液(经iptg诱导)反应后收集的滤液，vector+lar为重组菌乙的粗酶液反应后收集的滤液)。结果表明，直铁线莲宁b标准品在uplc中的保留时间为1.32min；重组菌甲的粗酶液(经iptg诱导)反应后收集的滤液在保留时间为1.32min(图3中p4)、2.41min(图3中p3)和2.82min(图3中p2)处均存在特征峰；重组菌乙的粗酶液反应后收集的滤液则没有检测到相应的特征峰。图3中p1为非特征峰。6、利用q-tof-ms对步骤5中的3个特征峰和1个非特征峰、直铁线莲宁b标准品和落叶松树脂醇进行定性分析。质谱条件为：watersxevog2-sqtof-ms质谱采用电喷雾离子化源(esi)，采用负离子检测模式；扫描范围m/z50～1500，扫描时间0.2s，毛细管电压2000v，锥孔电压40v，除溶剂气体氮气900l/h，除溶剂温度450℃，离子源温度100℃。直铁线莲宁b标准品的分析结果见图4中a。落叶松树脂醇的分析结果见图4中c。滤液的分析结果见图4中b：三个产物的分子离子峰分别为m/z729.2594[m+cooh-h]-(第一个产物，对应图4中b的p4峰)、m/z567.2075[m+cooh-h]-(第二个产物，对应图4中b的p3峰)和m/z521.2041[m-h]-(第三个产物，对应图4中b的p2峰)。结果表明，第一个产物与底物落叶松树脂醇m/z405.1573[m+cooh-h]-的分子量相差324，说明第一个产物为在落叶松树脂醇基础上加了两分子葡萄糖(即落叶松树脂醇双葡萄糖苷)；而且第一个产物与直铁线莲宁b标准品的出峰时间(分别为6.32min和6.34min)、分子量(分别为729.2594和729.2585)基本一致，说明第一个产物就是直铁线莲宁b。第二个产物和第三个产物均为在落叶松树脂醇基础上加了一分子葡萄糖(即落叶松树脂醇单葡萄糖苷)，具体结构需进一步鉴定。图4中b的p1峰与落叶松树脂醇的出峰时间(均为9.78min)、分子量(分别为405.1552和405.1573)基本一致，说明p1峰为未转化的底物落叶松树脂醇。7、为进一步确定步骤6中获得的落叶松树脂醇单葡萄糖苷(即第二个产物和第三个产物)的糖基化位置，进而系统评价实施例1制备的重组菌甲的粗酶液(经iptg诱导)的催化功能，本发明的发明人首先对有活性重组蛋白催化反应体系放大，制备中间两个产物m/z567.2354[m+cooh-h]-、m/z521.2269[m-h]-；然后利用ms、1h-nmr、13c-nmr、h-hcosy、hsqc和hmbc进行糖基化位置的确认。步骤6中获得的落叶松树脂醇单葡萄糖苷的ms、1h-nmr、13c-nmr波谱信息见表2。表2.落叶松树脂醇单葡萄糖苷的ms、1h-nmr和13c-nmr波谱信息核磁鉴定结果如下：第二个产物为落叶松树脂醇-4-o-β-d-葡萄糖苷，其结构式如式(i)所示；第三个产物为落叶松树脂醇-4’-o-β-d-葡萄糖苷，其结构式如式(ii)所示。上述结果表明，实施例1制备的重组菌甲的粗酶液(经iptg诱导)具有糖基转移酶的活性，其可将落叶松树脂醇转化成落叶松树脂醇单葡萄糖苷(落叶松树脂醇-4-o-β-d-葡萄糖苷和/或落叶松树脂醇-4’-o-β-d-葡萄糖苷)和/或落叶松树脂醇双葡萄糖苷(即直铁线莲宁b)。序列表<110>中国中医科学院中药研究所<120>蛋白质ugt142及其编码基因与应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1461<212>dna<213>菘蓝(isatisindigoticafort.)<400>1atgaagattacaagaccacatgctgtcatgttcgctagcccaggaatgggccacgtcatc60ccggtgatcgagcttggaaaacgcttagtcggatcacacggcttccaagtcaccatcttc120gtccttgaagccgacgctgcctccgctcaatcccaatttctcaactcaactggctgcgat180gcaacacttattgacgtcatctgcctcccgactccggatatctccggtctagtggacccg240tcagcctttttcgcgatcaagctcttgaccatgatgcgtgagaccataccaaccatccga300tcaaagatcgaggagatgcagcacaaaccaacggccttgatcgtagacttgttcggtctg360gacgcgttgcggctcggtggtgagttcaacatgttgacttatgtcttcatcgcttcaaac420gcacgttttgtggcgctgactttgtatttcccaacgctggagaaagacgctgaagaggag480cacataatcaagaagaaacccttggctatgcctggatgtgaaccggttcggtttgaggat540actcttgagccattccttgacccaaccgaccagatataccggatatttgttccttttggt600ttagtatacccgacggctgatggcattattgtgaatacatgggatgatatggagcccaaa660actttgaaatctcttcaagacccaaagctcttgggccgaatcgctcgtgtaccggtttat720ccaatcggtcctttgagcagaccggttgatccatcgaaaactaaccatccggttttggat780tggttaaacaagcaacctgaggagtcagtgctatacatctcattcggaagcggcgggtct840ctctcagctaaacagctaacggaactggcttgggggctcgagttgagtcagcaacggttc900gtttgggtggtccgtcccccggtcgacagttcagcttgcagcgagtatctatcggctaac960agcggcgaagtacaagacggcacaccggactatctaccaaaagagtttattagccggact1020caagagagaggcctcgtggtcccttcatgggccccacaagcagagatcctagcacaccaa1080gccgtcggtgggtttctaactcactgtggttggaactcggttcttgaaagcgtcgttagt1140ggcgttccaatgatcacttggccgctttttgcggatcagaaaatgaatgcgacgttgctc1200aacgaggagctcggtgtggcaatccggtctaggaaactgccgtcggaggaagtgactttg1260agggtggagatagagtcgttggtgagaaggcttatggtggaggatgaaggtcgcgagatg1320agagagaaggtgaagaagctgagggatacggcagagatgtcgctgagatgcgatggtgga1380tcgtcccatgaatcgctgtcgagagtggcaaacgaatgtcaccgtcttttggagcgagcc1440agaatggcacgtggtgcctag1461<210>2<211>486<212>prt<213>菘蓝(isatisindigoticafort.)<400>2metlysilethrargprohisalavalmetphealaserproglymet151015glyhisvalileprovalilegluleuglylysargleuvalglyser202530hisglypheglnvalthrilephevalleuglualaaspalaalaser354045alaglnserglnpheleuasnserthrglycys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