本发明属于微生物农药
技术领域：
，具体涉及一种用于防治小麦叶锈病菌的多粘类芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
：小麦叶锈病由叶锈菌Pucciniatriticina引起，是世界小麦生产上的主要病害之一，发生严重时可使小麦减产40％以上。在我国主要麦区曾发生4次中度以上的小麦叶锈病大暴发，给小麦生产带来严重的产量损失。近年来该病害在我国呈现扩大发展的趋势，2012年在甘肃、河南、陕西、安徽和四川等地小麦叶锈病大面积发生。针对小麦叶锈病的防治方法多以选用抗病品种和化学防治为主，化学杀菌剂的使用易使病原菌产生抗药性，污染环境，危害生态平衡，而具有防效好、无毒性、无污染等特点的生物防治的报道却不多。利用生防菌诱导防控小麦叶锈病具有十分重要的意义，而目前对防控小麦叶锈病的生防细菌和具体应用方法甚少，很大程度上制约了该病的生物防治。本发明以小麦叶锈病为靶标，从生防细菌的筛选中寻找具有诱导抗叶锈病的生防细菌，为研究开发新型生物杀菌剂寻找新的资源。技术实现要素：为了弥补上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于防治小麦叶锈病菌的多粘类芽孢杆菌及其应用，该多粘类芽孢杆菌经发酵培养后对小麦种子进行包衣处理后，能够抑制小麦叶锈病的侵染，在制备防治小麦叶锈病的生防菌剂中具有良好的应用前景。本发明是通过以下技术方案实现的，一种用于防治小麦叶锈病菌的多粘类芽孢杆菌及其应用，所述多粘类芽孢杆菌的分类命名为多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14879，保藏日期为2017年11月14日。多粘类芽孢杆菌菌落特征：在NA培养基上菌落表面光滑，呈乳白色，半透明，挑起有粘性。菌体为杆状，单个或排列分布，大小为(1.2-2.3)μm×(0.3-0.7)μm。芽孢呈椭圆形，胞囊膨大，中生到端生。革兰氏染色为阳性，鞭毛为周生。如本发明所述的多粘类芽孢杆菌在防治小麦叶锈病的中的应用。进一步的，如本发明所述的多粘类芽孢杆菌在防治小麦叶锈病的中的应用，具体是指，所述的多粘类芽孢杆菌制成的液体菌剂，用于防治小麦叶锈病。进一步的，用于防治小麦叶锈病的多粘类芽孢杆菌菌剂的制备方法，具体为：将多粘类芽孢杆菌的试管菌种活化后，接种至液体发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养3d后，得到生防菌代谢产物的发酵液，所述液体发酵培养基的配方为：酵母浸膏0.5-2.0g、蛋白胨4.0-8.0g、牛肉浸膏2.0-5.0g、蔗糖10-20g，琼脂17-20g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌30min。进一步的，所述的多粘类芽孢杆菌菌剂防治小麦叶锈病的方法为：小麦种子用75％乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗5次。采用1mL/50g(发酵液体积/种子质量)的比例进行种子处理，即将50g小麦种子与1mL发酵液搅拌充分混匀，多粘类芽孢杆菌浓度为1.0×108cfu/mL。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种具有对小麦叶锈病具有诱导抗性的多粘类芽孢杆菌，可以制成用于防治小麦叶锈病的生物防治菌剂，可以有效防治小麦叶锈病侵染，效果显著，且能够改善土壤微环境，同时能够促进植株生长，在防治小麦叶锈病方面具有良好的应用前景。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。本发明以下实施例中，若没有特殊说明，所用试剂皆可在市场上购买得到，若没有特殊说明，所涉及的方法皆为常规方法。本发明提供了一种对小麦具有诱导抗性防控小麦叶锈病的多粘类芽孢杆菌，申请人将它命名为Sneb1462，已于2017年11月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.14879，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)。下面结合相关实验数据，说明本发明多粘类芽孢杆菌Sneb1462的菌落形态、基因结构特征以及其防控效果。1.菌落形态特征多粘类芽孢杆菌(Sneb1462)的培养条件如下：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(NA)固体培养基(1L)配方：酵母浸膏1g、蛋白胨5g、牛肉浸膏3g、蔗糖10g，完全溶解后，再加入17-20g琼脂，最后蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌30min，自然pH。28℃培养24h。多粘类芽孢杆菌菌落特征：在NA培养基上菌落表面光滑，呈乳白色，半透明，挑起有粘性。菌体为杆状，单个或排列分布，大小为(1.2-2.3)μm×(0.3-0.7)μm。芽孢呈椭圆形，胞囊膨大，中生到端生。革兰氏染色为阳性，鞭毛为周生。2.基因结构特征对多粘类芽孢杆菌(Sneb1462)的16SrDNA序列进行PCR扩增及测序，将测得的上述16SrDNA序列于NCBI中进行同源性搜索比对，并使用BLASTN2.2.31系统在GenBank中进行同源性搜索，发现序列相似度最高的为Paenibacilluspolymyxa菌株，序列相似度为100％，表明该菌株属于多粘类芽孢杆菌。3.利用多粘类芽孢杆菌(Sneb1462)制备菌剂的方法制备方法：将多粘类芽孢杆菌Sneb1462的试管菌种活化后，接种至250mL三角瓶(每瓶装150mLNA液体发酵培养基)中进行培养，所述培养的条件为：20～28℃，120～130r/min摇床发酵3d，得到对小麦叶锈病具有诱导抗性的菌剂。上述所述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基固体培养基(1L)配方：发酵培养基的配方为：酵母浸膏0.5-2.0g、蛋白胨4.0-8.0g、牛肉浸膏2.0-5.0g、蔗糖10-20g，琼脂17-20g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌30min。4.多粘类芽孢杆菌(Sneb1462)菌剂对小麦叶锈病的防治作用测定采用上述利用多粘类芽孢杆菌(Sneb1462)制备菌剂的方法制备菌剂。小麦品种：新春20号，于种子市场购买。(1)多粘类芽孢杆菌(Sneb1462)对小麦叶锈病的室内盆栽防效试验小麦种子用75％乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗5次。采用1mL/50g(发酵液体积∶种子质量)的比例进行种子处理，将50g小麦种子与1mL发酵液搅拌充分混匀，多粘类芽孢杆菌浓度为1.0×108cfu/mL。将处理后的小麦种子播种于塑料花盆中，每盆20粒小麦种子，以空白培养基处理为对照，设计5次重复。在日光温室中正常培养。待小麦长至一叶一心期，每盆留下15株长势一致的小麦植株，进行小麦叶锈菌P.triticina喷雾接种，小麦叶锈菌浓度为1.0×105cfu/mL，接种量每盆10mL，黑暗保湿12h以上。接种后10d，随机调查20株发病情况，并计算其发病率和严重度。病害严重度计算方法：依据病叶上锈菌夏孢子堆所占据的面积与叶片总面积的百分比来确定病级，用分级法表示，设1％、5％、10％、20％、40％、60％、80％和100％八级，叶片未发病，记为“0”。调查时目测估计每片调查叶片的发病严重度，计算公式如下：平均严重度＝∑(各严重度级别×各级病叶数)/调查叶片总数；发病率(％)＝(发病的叶片数/调查的叶片总数)×100。试验结果如表1所示：表1室内多粘类芽孢杆菌Sneb1462对小麦叶锈病的盆栽防效试验处理发病率/％严重度/％多粘类芽孢杆菌Sneb146253.82±3.4010.27±2.00CK74.28±4.7620.50±3.39由表1盆栽防效试验结果可知，菌株Sneb1462处理的小麦植株的叶锈病发病率和严重度均显著低于空白对照。处理对小麦叶锈病防治效果最好，发病率为53.82％，严重度为10.27％，分别比对照处理降低27.54％和49.90％，说明菌株Sneb1462能诱导小麦产生抗性，减少叶锈病菌的侵染。(2)多粘类芽孢杆菌(Sneb1462)防治小麦叶锈病田间防效试验试验地点：辽宁省沈阳市沈阳农业大学天柱山试验田。田间小区设计：以边长2m的正方形区域为一个处理小区，每个小区含5垄。每垄播种由多粘类芽孢杆菌Sneb1462处理的小麦种子10g，以空白培养基处理为对照，共2组处理，每个处理设3次重复，小区周围设保护行。30d时,每个处理的各个重复小区均随机选取10株苗，测量其株高，并进行叶锈菌接种，接种后10d调查病害严重度。在成熟期时，每个处理随机选取30株小麦植株，测量穗长、穗重，田间试验结果如表2所示。表2多粘类芽孢杆菌Sneb1462防治小麦叶锈病田间防效试验表2结果显示在田间叶锈病发病程度上，菌株Sneb1462处理的病害严重度为26.26％，空白对照相比，降低了38.60％。菌株Sneb1462处理的小麦植株的株高和穗重也显著高于对照，分别提高16.44％和34.96％。穗长与对照相比差异不显著。上述实验表明，本发明提供的一种的多粘类芽孢杆菌Sneb1462可以有效防治小麦叶锈病侵害，效果显著，同时能够促进小麦生长，在防治防治小麦叶锈病方面具有良好的应用前景，可以制成用于防治小麦叶锈病的生物防治菌剂。当前第1页1 2 3