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本申请要求于2012年8月16日提交的美国临时申请系列号61/684,076的权益，其通过引用将包括所有表格、附图和权利要求在内的全部内容并入本文。
发明领域
本发明涉及将生物信息(例如所关注的生物序列)自动转化成最终生物实体。本发明还涉及提供例如对生物威胁的快速响应。
序列表的并入
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发明背景
提供下面的发明背景描述以辅助理解本发明，但其不应视为或描述为本发明的在先技术。
遗传信息以形成dna分子的核苷酸序列的形式储存，所述dna分子从而编码所有细胞过程必需的蛋白质和肽的生物合成必需的信息。数字技术使得能够在数秒内跨越远距离发送数字信息。该信息可用于将所述数字信息转化成有用功能的任何数目的方法。拥有允许以数字形式跨越大距离发送生物信息以及然后将该数字信息转化成宽泛种类生物实体的任一种的系统将是非常令人期望的。然后，这样的生物实体可用于执行宽泛种类的生物功能(例如，对社区的生物威胁的响应)。令人期望的系统还将允许生物信息用于合成dna分子、rna分子、蛋白质、病毒及噬菌体颗粒、疫苗以及合成的细胞。
就响应生物威胁而言，一个重要方面可为提供足够量的疫苗以针对该威胁接种足够数目的群体成员。生产疫苗所需的关键信息项目是与生物威胁有关的生物序列信息。当所述生物威胁是病毒时，可通过从病毒样品衍生序列信息来得到该序列信息。一旦确定序列，可生产疫苗。这可采取多种形式，其中一种是生产该病毒威胁的蛋白质外壳或其部分，或者所述生物威胁的另一种抗原组分，这将提供刺激受接种个体针对所述生物威胁的响应的抗原。
因此，例如，可合成编码抗原的核酸序列。这可涉及多至数天的工作以协调寡核苷酸的合成，然后可组装所述寡核苷酸以形成最终核酸序列。这还可能涉及几个实验室的参与。在得到最终核酸序列后，可对其进行体外或体内翻译，以合成抗原蛋白。
在对生物威胁的响应中，时间可为最重要的，因此，可对执行响应计划或直接与受感染人员工作的医疗响应团队的成员进行接种，从而使他们获得对该生物威胁的免疫性，并且使其可继续从事他们的工作而不受阻于疾病威胁。疫苗制备的延迟还导致关键时刻准备的疫苗的量不足，并且还是响应生物威胁的重要限制因素。
此外，一个地点与另一个地点的病毒物种或其他生物威胁常常不同。因此，由于快速的病毒突变，在一个地点可能最有效的疫苗可能在另一个地点不那么有效。
因此，需要可以数字形式发送生物信息并且允许将所述数字信息转化成多种最终生物产品的系统。拥有自动化系统还将大大促进这些目标的实现。这样的系统将应付各种生物挑战，例如，对时间可能是关键的病毒和其他生物威胁进行快速和有效的响应。其还将允许在不同地点进行调节的响应以应付不同地点存在的特定威胁。
技术实现要素：
本发明提供了用于从遥远位置接收生物序列信息并基于所述生物序列信息自动合成生物实体的系统和方法。所述系统和方法使得能够对特定地点的特定病毒和其他生物威胁进行快速响应。还提供了试剂盒，其包含用于实施本发明系统的方法的材料和试剂。所述系统能够以自动化方式从生物序列信息生产生物实体，例如dna分子、rna分子、蛋白质或肽，并且还能够以自动化方式在体内生产病毒颗粒。因此，所述系统可用于生产疫苗，例如流感疫苗。
在第一方面中，本发明提供了用于接收生物序列信息并启动功能性生物实体合成的系统。所述系统具有接收单元，用于接收由发送单元发送的编码生物序列信息的信号，所述发送单元处于距所述接收单元遥远的位置。所述系统还具有连接至所述接收单元的组装单元，用于根据所述生物序列信息组装所述生物实体。所述组装单元具有或连接至包含生物构件分子和/或已合成的寡核苷酸的试剂器皿，并且还具有用于在所述系统内运输试剂以及用于执行用于合成所述功能性生物实体的自动化方法中步骤的部件。所述系统的所述接收单元接收所述生物序列信息，并将其提供至所述组装单元。
在一个实施方案中，发送单元和接收单元是作为计算机网络部分的计算机。所述生物构件分子可为dntp或核苷亚磷酰胺。所述系统还可具有用于根据所述生物序列信息将dntp或核苷亚磷酰胺组装成一组寡核苷酸的编程指令。其还可具有用于将所述一组寡核苷酸组装成dna分子的编程指令。在一个实施方案中，所述功能性生物实体是dna分子。还可为本发明的系统或方法提供已合成的寡核苷酸，并且所述系统或方法用于将所述寡核苷酸组装成dna分子。
在一个实施方案中，所述系统具有一个或多个包含用于将功能性dna分子转录和/或翻译成生物产品的试剂的器皿。所述生物序列信息可编码核酸，该核酸编码病毒颗粒或噬细菌体的至少一部分。所述组装单元还可将所述生物实体转化成生物产品，并且在一些实施方案中，所述生物产品可为病毒颗粒或病毒颗粒的一部分，或者噬菌体或细胞。所述病毒颗粒或病毒颗粒的部分可为蛋白质抗原。在一些实施方案中，所述组装单元还可具有或连接一个或多个包含宿主细胞的器皿。本发明的系统还可具有一个或多个用于将所述dna分子转录成rna分子，和/或用于将rna分子翻译成功能性肽或蛋白质的器皿和试剂，所述翻译可在体外或体内进行。所述系统还可具有用于在反应容器的不同反应区中执行自动化方法的步骤的编程指令。
在另一个方面中，本发明提供了合成功能性生物实体的方法。所述方法涉及从系统中的发送单元接收用于合成所述功能性生物实体的生物序列信息。所述方法的系统是本文描述的发明的系统。所述方法还涉及以自动化方法合成所述功能性生物实体。
在所述方法中，可以在接收所述生物序列信息之前准备所述组装单元以组装所述功能性生物实体。所述准备可涉及用生物构件或构件聚合物(例如dntp或核苷亚磷酰胺)或用已合成的寡核苷酸或肽装填所述系统的反应容器。在本发明的一些方法中，所述生物序列信息编码核酸分子，所述核酸分子编码病毒颗粒的至少一部分。在其中生产功能性蛋白质或肽的方法中，所述功能性蛋白质或肽可为病毒蛋白质或肽。所述功能性生物实体还可为大于5kb的dna分子。
在所述方法的一个实施方案中，在体外反应中链接所述构件分子以形成构件聚合物。所述构件分子可为核苷酸或核苷亚磷酰胺，并且所述构件聚合物可为寡核苷酸或肽或核糖核苷酸或者任一个的衍生物。
在一些实施方案中，所述方法包括将寡核苷酸从反应容器的第一区运输至所述反应容器的第二区。所述方法还可涉及在所述反应容器的第一反应区中进行所述方法的一个步骤，并且在所述反应容器的第二反应区中进行所述方法的第二步骤。在一个实施方案中，第一步骤是组装dna分子，并且第二步骤是将dna分子转录成rna。所述方法还可具有在所述反应容器的第三反应区中进行的第三步骤，所述第三步骤包括体内产生病毒颗粒。在其他实施方案中，合成所述生物实体包括dna组装步骤。所述方法的步骤还可涉及多水平的生物组装。因此，所述方法可具有dna组装步骤和rna转录步骤。可在所述反应容器的第一反应区中进行所述dna组装步骤，并且可在所述反应容器的第二反应区中进行所述rna转录步骤。所述方法还可具有涉及在所述反应容器的第三反应区中体内产生病毒颗粒的步骤。
上述发明概述不是限制性的，并且本发明的其他特征和优点将通过下面的发明详述以及权利要求书而明显。
附图详述
图1提供了本发明用途的图示说明，大体描述了生物信息的发送以及将其转化成有用的生物实体。
图2示例说明了显示来自各种流感病毒毒株的核酸构建体ha(h)和na(n)的组装的0.8％预制琼脂糖凝胶，其每一个都通过使用本发明方法在本发明系统中从96个汇集的寡核苷酸组装。构建体ha和na二者都为约3kb。图2a-泳道1：a/brisbane/10/2010(h1n1)_ha；泳道2：a/brisbane/10/2010(h1n1)_na；泳道3：x179a_td(h1n1)_ha；泳道4：x179a(h1n1)_na；泳道5：a/victoria/361/2011_cdc/e3(h3n2)_ha；泳道6：a/victoria/361/2011(h3n2)_na；泳道7：a/brisbane/256/2011_p2/e3(h3n2)_ha；泳道8：a/brisbane/256/2011_p2/e3(h3n2)_na；标准品泳道。图2b-标准品泳道；泳道1：b/texas/06/2011_bx-45_ha；泳道2：b/texas/06/2011_bx-49_na；泳道3：b/new_hampshire/1/2012_ha；泳道4：b/new_hampshire/1/2012_na；泳道5：b/brisbane/60/08_ha；泳道6：b/brisbane/60/08_na；泳道7：b/nevada/03/2011_v2_ha；泳道8：b/nevada/03/2011_v2_na。
发明详述
本发明提供了用于以数字形式跨越远距离发送生物信息以及随后并快速地将该信息转化成最终生物实体的系统。所述生物序列信息可为合成dna分子、rna分子、蛋白质或肽、病毒和/或噬菌体颗粒、疫苗、合成的细胞或任何生物实体必需的信息。可由位于待组装或合成生物实体的特定地点的本发明系统来合成生物实体。
本发明在快速响应生物威胁方面提供了许多优点。在一个实施方案中，所述生物威胁是病毒威胁。本发明使得生物序列信息能够快速发送至处于生物威胁的位置，例如遥远位置，并立即用于制备合适响应必需的疫苗或其他材料的过程中。所述威胁可为流感病毒或其他病毒威胁。
在一个实施方案中，所述生物序列信息是配制病毒疫苗必需的序列信息，即，病毒颗粒的一个或多个变化区的序列。因此，本发明允许提前设置本发明的系统并准备好必需试剂，以使所述系统可接收生物序列信息并立即以自动化方式开始制备疫苗或其他合适的生物响应，从而在接收所述序列信息后立即处理威胁。因此，处于威胁下的社区可具有准备接受序列信息的多个或大规模系统，以使在短时间范围内可获得用于接种群体来对抗生物威胁的疫苗供应最大化。本发明是通用的，并且允许订制用于处理特定地点的特定病毒威胁的疫苗。因此，在病毒的不同毒株感染不同地点的情况下，每个地点可调节对感染该地点的特定毒株的疫苗响应，以针对威胁进行最准确和最有效的响应。通过减少或消除开始制备疫苗之前经过的小时数，并且通过制备对目标地点最有效的疫苗，大大改进了针对生物威胁的响应的效力。
本发明还适用于对与生物恐怖主义相关的生物威胁进行响应，其中响应的速度和准确性可赋予该响应关键且挽救生命的效力。因此，面临此类威胁的地点可通过设置本文公开的系统来准备，以能够产生最快速且最准确的响应，并因此得到以最小损伤战胜威胁的最大机会。
可设计本发明的系统，使得可以在包含多个其中可操作样品的反应区域的任何反应容器上进行所述方法。所述反应区域可为限定的(即，由容器上的物理边界限定)或非限定的(即，仅由样品占据的空间限定)。在一个实施方案中，反应容器是标准96孔板，其包含多个容纳待操作样品的小反应区域，即，板的每个孔。这很方便，因为本发明的系统和方法中所用的热循环器通常被设计成支持96孔板。但是，应认识到，支持多个包含待操作样品的反应区域的任何类型的反应容器也将在本发明中起作用。例如，具有非96孔的反应板将是本方法中合适的反应容器，或者具有多个可操作样品的反应区域陪替式培养皿也是合适的，即使所述反应区域未被物理边界限定。甚至生物芯片也可为反应容器，因为芯片上具有多个反应区域。
通过限定和利用反应容器上的反应区，发现可以设计系统使得可以自动化方法进行从合成寡核苷酸至生产蛋白质或疫苗的多水平方法以及其他方法。这通过在位于反应容器上的特定反应区中的反应区域中进行特定步骤来实现。
通过在本发明中使用机器人技术，可将样品从反应容器的特定反应区运输至其他反应区，并且可在一个反应容器中进行自动化方法。样品不会被在相同容器中进行方法的后续步骤的条件(例如，温度)损害或损毁，因为可在系统将样品移动进入进行下一步的反应区之前在该反应容器上建立后续步骤的合适条件。因此，在进行每个后续步骤并且在用于该后续步骤的反应容器上创立条件时，可使反应样品跨反应容器移动并进入新区，并且可以自动化方法在相同反应容器中完成整个过程。因此，在一些实施方案中，本发明的系统执行自动化方法。
自动化方法是在起始方法后无需人为干预的方法—所述方法从起始点进行至完成的过程中没有人进行任何操作，并且所述方法产生功能性生物实体。例如，在一个实施方案中，自动化方法是其中由本发明的系统接收序列指令后不进行人为干预的方法，并且所述系统执行所述方法以产生功能性核酸分子。人为干预是由人采取的使该方法向完成移动的任何操作。人为干预包括但不限于：将样品或反应容器从一个位置手动移动到另一个位置，或涉及制备或移动样品或试剂、提供或再供应试剂或反应物、打开或关闭所述系统的任何部件在内的动作，或者完成执行所述方法必需的任何其他动作。在一个自动化方法的实例中，所述方法起始于从发送单元接收生物序列信息。所述方法可作为自动化方法继续进行，以导致产生dna分子，并且在一个实施方案中，所述方法具有多水平的生物组装，并且继续进行以转录dna产生mrna，并且还可进一步进行以将mrna翻译成蛋白质生物产品。
本发明的系统可具有多水平的生物组装，从而可例如将合成的dna分子转录成rna分子，并且将rna分子进一步翻译成所关注的蛋白质或肽，或与细胞培养物组合，导致产生药物产品或合成完整疫苗。所述系统还可进一步处理翻译的蛋白质，以产生例如病毒颗粒或疫苗，或其部分。组装水平包括：1)从链接核苷酸或核苷亚磷酰胺合成dsdna或ssdna分子；2)通过接合寡核苷酸来组装dsdna分子(dna组装步骤)；3)根据dna分子合成/转录rna分子(转录步骤)；4)通过接合氨基酸来合成蛋白质或肽，或者通过接合肽来合成蛋白质；5)根据rna分子序列合成/翻译蛋白质或肽(翻译步骤)；6)将两种或更多种蛋白质(或蛋白质亚基)组装成具有四级结构的蛋白质(例如，病毒颗粒或其部分)。本发明的系统和方法可进行任何这些水平的组装。进行这些合成水平中至少两个的系统或方法是具有多水平生物组装的系统或方法，但是系统和方法还可设计成具有至少3个水平或至少4个水平或至少5个水平的生物组装。在一个实施方案中，本发明的系统和方法用核苷酸(包括衍生物)或核苷亚磷酰胺(包括衍生物)合成dsdna分子。在另一个实施方案中，本发明的系统和方法由寡核苷酸合成ssdna或dsdna分子。在另一个实施方案中，本发明的系统和方法用氨基酸合成蛋白质或肽。还可如本文所述修饰、衍生化或标记本发明的寡核苷酸或肽。
参考图1，描述了本发明的一个实施方案。发送单元1将生物序列信息3从一个位置发送至位于距发送单元1遥远位置的本发明各系统的接收单元2。接收单元2接收编码生物序列信息3的信号，并向组装单元提供该生物序列信息。组装单元组装生物实体4，其在该实施方案中为dna分子。在该实施方案中，组装单元还将生物实体转化成生物产品5，其可为病毒外壳或其部分5a，或病毒5b，或蛋白质抗原5c。所述生物产品可用作疫苗6。
接收单元
接收单元接收编码生物序列信息的信号。在一个实施方案中，接收单元是接收来自发送单元的数字编码的生物序列信息的计算机。因此，可使接收单元连接至互联网，和/或使其以其他方式连接至允许在连接至网络的计算机之间进行信息交换的计算机网络。作为术语在本文使用时，互联网也是计算机网络。在一个实施方案中，发送单元位于距接收单元遥远的位置，例如位于另一个城市或另一个地区或国家。接收单元甚至可位于离开地球或者地球大气之外的地方，例如，轨道空间站中或者甚至月球或除地球以外的行星上。在一些实施方案中，发送单元位于距接收单元遥远的位置，即，至少10英里或至少25英里或至少50英里或至少100英里或至少250英里或至少1000英里。在一些实施方案中，接收单元接收生物序列信息，并将其以组装单元可转化成用于组装生物学序列的编程指令的形式提供至组装单元。因此，可通过计算机网络将接收单元连接至发送单元。还将接收单元连接至组装单元。在各个实施方案中，接收单元还可为计算机或电路板或者整合进组装单元或组装单元的子单元的计算机的部分。接收单元与发送单元之间的连接可为间接的，即，通过置于它们之间的一个或多个附加计算机、路由器或其他电子装置。所述连接还可通过无线连接或卫星连接。所述连接还可为直接的，如发送单元与接收单元通过计算机网络直接连接。但是，接收单元将接收由发送单元发送的信号。在一个实施方案中，接收单元接收电磁波形式的生物序列，并将所述序列提供至用于组装生物实体或生物产品的组装单元。
发送单元
发送单元将生物序列信息发送至所述系统的接收单元。数字信号可表示一系列二进制数字形式的信息。本领域普通技术人员理解，实际上包括生物序列信息在内的任何类型的信息都可容易地作为数字信号进行发送。容易通过可跨越地球的计算机网络来发送这些类型的信息。在本发明的一个实施方案中，发送单元是连接至计算机网络的计算机，所述计算机网络使信息能够从一个计算机发送至另一个计算机，或在连接至网络(例如，互联网)的计算机之间进行交换。因此，在一个实施方案中，发送单元和接收单元是作为计算机网络部分的计算机，并且发送单元具有用于获取序列信息或将序列信息转化成数字格式并将所述序列信息发送至接收单元(例如通过计算机网络)的硬件和/或软件。在其他实施方案中，发送单元是电话或键盘，并且操作者可手动键入生物序列信息。发送单元还可为将消息以任意格式(例如，html)发送至接收单元的电子装置。数据编码和发送的格式可为可由接收单元转化成用于合成生物序列的指令的任何方便格式。发送单元可从输入信息的人得到所述信息，或者可从确定所述序列的仪器以自动化方式得到所述信息。生物序列信息的源可为病毒或其他生物实体的样品。
所述生物序列信息可为一系列核苷酸、亚磷酰胺(例如，核苷亚磷酰胺)、氨基酸，或提供合成生物实体一级结构必需信息的任何序列。生物序列信息还可提供为可译解而得到合成所述生物实体的一级结构必需信息的密码。
通常的情况是，用具有该技术领域特殊专家的科学机构来译解生物实体(例如，病毒)的序列。dna测序技术是本领域广泛已知的，并且分离dna和进行测序的各种方法是可获得的。因此，可使用标准的已知技术来译解所述序列，所述技术例如通过合成测序、双脱氧法或链终止(sanger)法、化学降解法、热循环测序、焦磷酸测序，或边杂交边测序。这些仅是dna测序方法的一些例子，本领域技术人员知晓许多其他方法。确切的测序方法不重要，只要通过从发送单元发送至接收单元的发送单元获取生物实体的序列即可。所述序列可为译解序列，并且还可为预测序列，所述预测序列可基于病毒逐年变化的趋势或衍生的信息。所述病毒的逐年变化可为例如至少2年或至少3年或至少5年或至少10年时段中的变化。
在一个实施方案中，发送单元还可包括dna测序仪，或与dna测序仪结合，或具有dna测序的能力。因此，发送单元可具有确定生物体或生物样品的dna序列并且将生物序列信息发送至遥远位置的接收单元的能力。因此，本发明的系统和方法可具有从遥远位置(包括地球大气之外的位置，如月球或其他行星)返回样品的能力。
组装单元
组装单元根据由接收单元从发送单元接收的信息来合成生物序列。本发明系统中布置的组装单元可以连接至接收单元。如其他系统部件一样，所述连接可为单元之间的直接连接，或可为通过置于单元之间的一个或多个附加计算机、路由器或其他电子装置的间接连接。组装单元可与接收单元进行通信，从而使当接收单元接收来自发送单元的含有生物序列信息的信号时，将所述信息提供至组装单元，组织单元可立即开始以自动化方法合成序列。组装单元可具有多种功能，包括但不限于核酸分子合成、核酸分子扩增以及核酸分子转录和/或翻译成肽或蛋白质中的一种或多种。
在一些实施方案中，组装单元具有进行第二(或第三或第四)水平生物组装的能力，例如，将产生的生物实体组装成更大的生物实体。因此，在一个实施方案中，组装单元可以自动化方法合成寡核苷酸，并随后将所述寡核苷酸组装成更大的dsdna分子。在一个实施方案中，所合成的寡核苷酸可为所关注的dna分子的片段，或所关注的dna分子的部分或变体。可按需要以组合方式序贯或同时组装寡核苷酸。典型的寡核苷酸可为40至100个核苷酸，或30至110个核苷酸，或50至90个核苷酸，或约60个核苷酸。但是，在各个其他实施方案中，由组装单元生产的dna分子大于100bp，或大于200bp，或大于300bp，或大于400bp，或大于500bp，或大于600bp，或大于700bp，或大于800bp，或大于900bp，或大于1000bp，或者为100bp至1000bp，或200bp至1000bp，或300bp至1000bp，或400bp至1000bp，或500bp至1000bp，或600bp至1000bp，或700bp至1000bp。所记载的长度可为具有或不具有单链突出端(即，“粘性末端”)的长度。
在各个实施方案中，组装单元包括核酸合成器、蛋白质和肽合成器、pcr热循环器中的一个或多个子单元，以及用于对样品进行体外转录和/或翻译的一个或多个子单元。可提供另一个子单元用于在细胞培养物中孵育生物实体，和/或用于在细胞培养物中维持细胞。
组装单元的任何一个子单元或任何子单元组合或所有子单元都可为自动化的。本发明的系统可包括自动化的核酸和/或氨基酸合成器。本发明的组装单元可包括多个具有进行核酸或蛋白质和肽合成所必需的化学物质、试剂、生物构件或构件聚合物的器皿或容器，以及允许或限制试剂流所必需的阀，以及用于进行某些化学反应的器皿。这些还可存在于组装单元之外，具有使组装单元访问它们的通道。所述生物构件分子可为例如合成期望的生物序列必需的氨基酸、dntp和/或核苷亚磷酰胺。生物构件还可包括单糖、二糖或多糖。当生物实体或生物产品包含多于一种类型的分子(例如糖蛋白)时，生物构件将按需要包含氨基酸和单糖、二糖或多糖。还可在容器或容器中提供寡核苷酸或其他已经组装的构件聚合物。
生物构件还可经修饰、衍生化或标记。例如，生物构件可为核苷亚磷酰胺或核苷三磷酸(ntp)，或者任一者的衍生物。在各个实施方案中，经修饰、衍生化或标记的构件可为氨基烯丙基、生物素或2'氟修饰的或标记的ntp或亚磷酰胺。其他经修饰、衍生化或标记的构件包括2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-溴脱氧尿嘧啶、反向dt(防止不期望的5'连接)、双脱氧胞嘧啶、5-甲基dc、脱氧肌苷、5-硝基吲哚、羟甲基dc、异dc和异dg，或者锁核酸，以在需要的情况下改进稳定性。组装单元可包括包含化学物质、试剂或生物构件的容器，或者所述容器可处于所述组装单元外并且例如通过管或其他运送材料的途径连接至组装单元。该仪器通常包括以自动化方式控制所述仪器以及合成核酸或蛋白质/肽必需的软件编程指令。因此，所述软件编程指令可为指导组装单元的部分的操作以根据生物序列信息用生物构件(例如，dntp或核苷亚磷酰胺)合成一组寡核苷酸的指令，和/或可包括用于将寡核苷酸组装成更大的dna分子的指令，并且还可包括用于将dna分子转录成rna以及将rna翻译成蛋白质分子的指令，并且还可包括用于将蛋白质分子组装成更大的蛋白质结构的指令。在一个实施方案中，所述指令用于将寡核苷酸组装成dna分子或rna分子。在一个实施方案中，所述指令用于将蛋白质分子组装成病毒或病毒的部分。并且，在另一个实施方案中，所述系统包括用于在反应容器的不同区中执行自动化方法的步骤的编程指令。
所述组装单元可为单一的整体单元，或可具有执行不同功能的多个子单元。因此，在一个实施方案中，组装单元的子单元进行寡核苷酸合成，例如使用寡核苷酸合成器。可包括机械臂以进行反应容器(例如，96孔板)从合成器至具有热循环能力的液体处理器的转移。还可向另一个反应容器，或相同容器的另一个区，或向组装单元的另一个子单元提供合成的寡核苷酸用于扩增(例如，向pcr热循环器)和/或组装。在一个实施方案中，所述系统被提供已合成的寡核苷酸，并将寡核苷酸组装成一个或多个dna分子。并且一个或多个其他子单元可进行将所合成的核酸转录和/或翻译成蛋白质产品，例如自动化的体外翻译系统，或者也可在相同反应容器的另一个区中执行这些功能。在每种情况下，所述子单元准备了以自动化方式执行所述功能所必需的试剂、化学物质和生物构件。因此，组装单元可在从接收单元提供生物序列信息后立即开始执行一种或所有功能。
组装单元根据由接收单元从发送单元接收的信息或根据以其他方式向组装单元提供的序列信息来合成生物序列。因此，组装单元可以自动化方式指导期望的生物实体的合成。包括组装单元在内的系统中的所有单元都可配备必需的软件并在需要的容器中预装必需的试剂和化学物质，以使接收单元可接收生物序列信息，并且组装单元可立即开始合成期望的生物实体。因此，可在接收所述生物序列信息之前使组装单元准备组装或合成生物实体。
在合成寡核苷酸或肽后，组装单元还可具有将寡核苷酸组装成更大核酸分子以及分别将肽组装成多肽和蛋白质的能力。所述系统和方法还可用寡核苷酸组装dna分子。因此，可通过一系列反应来组装核酸分子或者蛋白质或肽。在用于核酸分子的一个实施方案中，使用gibson
组装单元或其子单元包括一个或多个包括用于执行组装单元或其子单元的功能的试剂、化学物质、生物构件或构件聚合物的器皿。所述器皿可为由玻璃或另一合适的材料制成的容器，并且可由使用者在接收单元接收来自发送单元的生物序列信息之前预先填充。因此，可设置组装单元，并等待接收来自发送单元的生物序列信息。在一些实施方案中，通过指导来自各个器皿的材料组合的合适软件管理和安排组装单元或其子装置的功能。组装单元的每个子单元都可在收到所需信息后由其本身的软件运行，或者组装单元可具有一种指导可构成所述组装单元的各个子单元的程序。
可使用本领域普通技术人员已知的许多方法进行体外和/或体内转录和翻译。在不同的方案中，将兔网织红细胞、小麦胚芽、大肠杆菌的提取物以及人细胞裂解物用于蛋白质合成。当生物实体是用于对抗人病原体的疫苗时，人体外翻译系统可能是有用的。提取物可以被制备并且包含细胞翻译机制的必要组分，例如核糖体、trna、氨酰基-trna合成酶、起始因子、延伸因子和终止因子、能量源(例如atp)、必需的辅因子以及其他蛋白质。可以高速度以及微升或纳升水平进行体外转录和翻译反应。多种市售试剂盒也可用于方便的设置并且已经成功使用，但是也可通用地组装必要组分。无论使用试剂盒还是通用材料，在一些实施方案中，都采用包含细胞翻译机制的必要组分的无细胞溶液。
在一种体外翻译方法中，使用永生化的人细胞系来提供核糖体、起始因子和延伸因子、trna以及蛋白质合成所需的其他基本组分。一些系统利用专有辅助蛋白、atp以及能量再生系统来维持从dna模板合成靶蛋白。提取物可以被制备并预装进组装单元的器皿中，并且可在需要时用于进行合成核酸的翻译。组装单元可将这些提取物维持在需要的温度以延长其使用寿命。还可将用于进行转录和/或翻译的一个或多个器皿连接至将使用pcr来合成和扩增dna并然后转录成rna的器皿。在rna转录后，可将一部分反应物转移至进行翻译的器皿中，或者转录反应和翻译反应可在单一的器皿中进行。在一些实施方案中，生物实体需要在生物实体具有活性或完全活性之前必须进行的蛋白修饰，例如糖基化的残基、再折叠步骤或酶修饰。为此目的，还可将试剂或编程方案包括在组装单元中。
所有这些反应都可在反应容器本身的特定反应区域或区中进行。本发明的系统还可包括用于纯化生物产品的子单元、反应区域或反应区。
在一个方面中，本发明提供了用于根据所提供的生物序列信息来合成功能性生物实体的系统。所述系统具有用于根据所提供的生物序列信息组装生物实体的组装单元。组装单元包括或连接至包含生物构件分子或构件聚合物的器皿，并且具有用于转运所述系统内的试剂以及用于执行用于合成所述功能性生物实体的本发明自动化方法中步骤的组件。这些系统还可具有本文描述的任何组件或特征。生物实体可为本文描述的任何一种(例如，dna分子)。所述系统还可具有用于接收具有生物序列信息的信号或数据的接收单元。如本文所述，可经电子界面手动键入序列或通过将来自发送单元的序列发送至接收单元来提供生物序列信息。
生物实体
生物实体是多核苷酸或dna分子，或者多核糖核苷酸或rna分子，或者肽或多肽或蛋白质。在一些实施方案中，生物实体是核酸或dna分子。当生物实体是dna或rna分子时，其可转化成生物产品。dna或rna可为单链dna或rna，或者双链dna或rna。当生物实体是dna分子时，其可为功能性dna分子，意味着其可转录成可翻译成功能性蛋白质或肽的rna，或者可作为dna分子直接使用(例如，dna疫苗)。功能性rna分子可翻译成功能性蛋白质或肽。功能性蛋白质或肽是在疾病或病症的治疗中具有临床用途的蛋白质或肽，或者直接用于一些生物环境(例如，作为结构蛋白或用作酶)。在各个实施方案中，功能性蛋白质或肽可为蛋白质的结构域、结合亚基、酶或具有酶活性的酶亚基、可用于产生疫苗的具有抗原活性的蛋白质或肽、病毒蛋白质或其亚基、病毒外壳蛋白(例如，ha或na蛋白)，或者当在体外组合或当在宿主细胞中进行体外组合时形成病毒颗粒的多个蛋白质或肽。因此，所述临床用途可为产生抗原应答或者蛋白质或肽结合至特异性结合分子或受体，但在一个实施方案中，所述抗原应答是促进疾病或病症治疗的抗原应答(例如，生成流感疫苗)，或者在测定中用于鉴别表位的存在。功能性蛋白质或肽还可提供期望的性质，例如期望的味道、构造、气味或另一性质。在一个实施方案中，功能性蛋白至或肽具有除生成免疫应答或抗原应答之外的功能。
生物实体可为任何大小。可组装达约200bp的寡核苷酸，但是通常可通过合成较小的寡核苷酸实现更高的准确度。在各个实施方案中，生物实体是以下长度的单链或双链dna分子：大于100碱基对，或大于200bp，或大于300bp，或大于400bp，或大于500bp，或大于1kb，或大于2.5kb，或大于3kb，或大于4kb，或大于5kb，或大于6kb，或大于7kb，或大于8kb，或大于9kb，或者为1kb至10kb，或1kb至9kb，或1kb至8kb，或2kb至10kb，或2kb至9kb，或2kb至8kb。使用其他技术，本领域普通技术人员参考本公开内容将意识到，还可使用本文描述的方法来结合作为寡核苷酸合成的dna序列以组装大于1kb、或大于2kb、或大于3kb、或大于5kb、或大于6kb、或大于7kb的dna分子。在其他实施方案中，可使用本发明的系统和方法组装大于100kb、或大于200kb、或小于200kb、或大于300kb、或小于300kb、或大于500kb、或大于800kb、或大于1兆碱基、或小于1兆碱基的dna分子。
生物序列信息是合成生物实体(例如核酸、肽或蛋白质)必需的序列信息。在一些实施方案中，生物序列信息是核苷酸、氨基酸或其他构件的序列(或顺序)，其包括作为生物实体的核酸或肽或蛋白质的一级结构。在不同的实施方案中，可以二进制形式或以其他编码形式向接收单元提供该信息。
生物产品
生物产品是使用生物实体提供的序列信息合成或组装的生物分子。因此，在不同的实施方案中，生物实体是dna分子或rna分子，并且生物产品可为由其制成的任何生物产品，例如，病毒基因组或其部分、病毒颗粒或病毒外壳或任一的部分、噬细菌体或其部分、病毒颗粒或病毒外壳的抗原部分、细菌基因组或其部分、基因、核酸序列、单链dna分子(ssdna)、双链dna分子(dsdna)、rna分子、反义rna部分、sirna部分、rnai部分、双链rna部分、蛋白质分子或蛋白质部分、蛋白质抗原或其部分、酶、结构蛋白、调节蛋白、营养蛋白、结合蛋白、转运蛋白、肽分子、真菌的基因或基因组或其部分，或者合成细胞。生物产品还可为已经过修饰的蛋白质、肽或多肽，所述修饰例如某些氨基酸残基的糖基化以产生糖蛋白，或者由两种或更多种生物构件形成的另一种分子。在其他实施方案中，生物产品是合成细菌的基因组或其部分。在一个具体实施方案中，生物产品是流感病毒，并且序列信息是用于制备对抗生物威胁的疫苗的信息。当生物产品是病毒或病毒颗粒时，其可为减毒病毒或灭活病毒或无害病毒。在一些实施方案中，生物实体本身还可为生物产品。生物实体是生物产品的一个例子是dna疫苗，其中dna分子本身可用作疫苗。dna疫苗可包含多个编码病原体蛋白质的dna。在注射进入身体后，宿主细胞合成病原体蛋白质，刺激了免疫应答。在一个实施方案中，生物实体是可组装成双链dna(dsdna)的多个单链dna(ssdna)或寡核苷酸。分子、病毒或其他生物实体的一“部分”可为原始分子或生物实体的至少10％，或至少20％，或至少30％，或至少40％，或至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％。
在一些实施方案中，可利用宿主细胞的行为来得到生物产品。在使用宿主细胞的系统和方法中，可使宿主细胞处于组装单元的子单元中，所述子单元可从另一个子单元接收生物实体用于进一步加工，或可简单地将宿主细胞维持在所述反应容器的区中。例如，可将宿主细胞维持在该子单元中的容器中。宿主细胞可在本发明的系统和方法中用于多种目的。虽然可在本发明的系统和方法中使用体外翻译，但是，也可由宿主细胞来进行分子亚基的转录、翻译以及组装。宿主细胞还可用于接收生物实体，并将其用于合成生物产品。在一个实施方案中，用作为由组装单元的子单元合成的生物实体的多种dna转染宿主细胞。宿主细胞可使用dna来制备宿主细胞内的蛋白质和/或将所述蛋白质组装成生物产品，例如病毒颗粒或其部分，或者具有多个亚基的蛋白质或酶。宿主细胞还可用于在感染或转染后复制噬菌体或病毒颗粒。
方法
本发明提供了合成功能性生物实体的方法。在本发明中，可将数字dna序列或编码序列输入针对所接收的dna序列自动设计合成方案的软件程序(例如，
可对位于反应容器的一个或多个反应区域中的一种或多种样品进行所述方法。在一些实施方案中，所述反应容器是反应板。反应板的一个例子是96孔板，但是要意识到，可在具有任意数目的反应区域的反应容器上进行所述方法。当所述反应容器是反应板时，其可具有任何方便的反应孔(区域)数，例如，标准96孔板上的96个反应孔。在一些实施方案中，所述方法涉及一个或多个将样品从器皿的一个区运输至所述容器的第二区的步骤。
在一些实施方案中，可在单一反应容器上完成所述方法。这些实施方案可涉及将反应容器分成反应区，并且将一个或多个样品从反应容器的一个区运输至反应容器的第二区，以进行方法的不同步骤，但还可涉及使所有或部分样品处于原位，并且移动所述反应容器的一个或多个区暴露在不同的环境中。例如，在涉及pcr的步骤中，所述区可位于所述系统中使其暴露于热循环进程的点。在dna组装步骤中，反应容器可位于所述系统中使其暴露于适合dna组装的条件的另一个点。可通过物理移动所述反应容器，或者通过移动所述系统的一个或多个单元，来实现位置变化。因此，反应容器可相对于本发明的系统移动反应容器。
反应容器的区是反应容器的不同区域，包括收集样品的一个或多个反应区域。正常而言，反应容器的每个区都将包含多个反应区域，例如反应板上的孔。但是，反应区域不需要物理屏障或边界—其仅需可以在反应区域中相对于其他反应区域进行不同反应。反应容器可具有任何数目的区，但是每个区都具有用于收集和维持样品的一个或多个反应区域。反应容器的每个区以相同方式处理，或者在给定时段内经历相同的处理或加工。例如，可使存在于区中的样品都在反应容器的该区上所执行的pcr循环的相同温度下循环，或者可以自动化方式挑选反应区中的所有反应样品，并将其移动至相同反应容器的另一个区。
因此，在所述方法的一个实施方案中，在反应容器的第一反应区中进行pcr步骤，并在反应容器的第二区中进行误差校正步骤，并在反应容器的第三反应区中进行第二pcr步骤。所述方法还可具有在反应容器的另一个反应区中进行的dna组装步骤，以及在反应容器的另一个反应区中进行的转录步骤，以及在反应容器的另一个反应区中进行的翻译步骤，以及在反应容器的另一个反应区中进行的转染步骤。因此，任何本文描述的方法的每一步都可在反应容器的不同反应区中进行。
试剂盒
本发明还提供用于本发明的系统和方法的试剂盒。所述试剂盒可包含组装生物产品必需的试剂和组分，例如用于在本发明系统上进行本发明方法的生物构件、构件聚合物、缓冲剂或其他试剂的任何组合。无论上述试剂和组分是单独还是以任何组合，所述试剂盒还可包含用于进行本发明方法的反应容器。可在具有所述试剂盒的成员的容器中提供试剂或反应组分或反应容器的任何组合。还可在安装于本发明系统的界面上的试剂器皿中提供试剂和试剂组分。
所述试剂盒还可包含已设计成安装在本发明系统的界面上的一个或多个反应容器，并且还可使所述反应容器准备有或预装有使用本发明系统合成生物实体所必需的试剂和/或生物构件和/或构件聚合物。所述试剂盒还可包含用于使反应容器或试剂器皿附着于本发明系统的说明书，和/或在本发明方法中使用反应容器或试剂器皿的说明书。还可在网站上提供所述说明书，并且所述试剂盒可包含网站链接，用于代替或补充试剂盒提供的说明书。
本发明的任何试剂盒都可包含用于进行本发明测定的说明书，和/或提供相同信息或者关于制备和/或使用本发明系统以合成生物实体和/或关于使容器准备或预装合成生物实体必需的试剂、组分和/或生物构件的信息的网站链接。例如，所述说明书可提供对将在所述系统和方法中使用的试剂的类型和量的指导。可将所述试剂盒提供或包装于单一容器中或多个容器中。所述容器可由玻璃、塑料或任何合适材料制成，并且也可为无菌的。可在包含所述试剂盒的容器中提供处于无菌容器中的一个或多个容器。
系统的其他方面
本发明系统可通过进行自动化方法来产生生物实体。所述生物实体可为任何期望序列。在一个实施方案中，可预先对本发明系统进行编程，以包括期望序列或构建体作为生物实体的部分。例如，可预先对本发明的系统进行编程以使操作者能够将待合成的特定序列添加至质粒或其他期望的载体，以进一步使用所合成的序列。在其他实施方案中，所述系统可合成请求序列，并将调控序列或启动子序列或反式作用因子的结合元件或信号序列添加至所请求序列作为生物实体的部分。因此，当操作者知晓将合成随后用于特定宿主生物体中的序列时，所述系统可合成具有针对宿主生物体的调控序列或其他期望序列的请求序列，从而进一步简化并加速生物实体或生物产品的制备。除了通过本发明的系统和方法合成外，还可将调控序列、启动子序列、信号序列以及反式作用因子的结合元件作为预先制成的序列预装至本发明的试剂器皿/或反应容器中用于期望用途。还可将这些预先制成的序列包括进本发明的任何试剂盒中。
在一个实施方案中，对本发明的系统编程以进行生物安全性筛选，以鉴别禁止序列。通过比较系统已经收到(在所有6个阅读框中)并被请求针对预先编程的禁止序列数据库合成的序列来进行生物安全性筛选。所述禁止序列可来自被当地政府禁止合成的病原体、生物武器或其他生物安全威胁的清单。所述禁止序列可为一种或多种dna或rna或蛋白质或肽。还可对所述系统编程以使得当收到鉴别为所述禁止序列清单上的序列时，所述系统不可操作，或者以其他方式不合成禁止序列。还可从国际基因合成联盟(internationalgenesynthesisconsortium)得到禁止序列。所述系统还可针对来自禁止序列清单的蛋白质序列进行筛选。
本发明系统的一些实施方案例如在系统的子单元中对合成后的dna进行修饰。在其他实施方案中，所述系统还可进行转录后和/或翻译后修饰。在一个实施方案中，所述系统产生dna分子，然后可修饰dna分子以产生经修饰的dna分子。在一个实施方案中，所述修饰是在特定核苷酸或核苷酸类似物上的dna甲基化。在另一个实施方案中，本发明的子单元还可包含甲基转移酶和/或具有在本发明的生物实体或生物产品上进行磷酸化或去磷酸化的能力。还可由所述系统以酶促或化学方式产生2'氟和2'o-甲基ntp，以改进dna或rna的体内稳定性。在另一个实施方案中，所述系统产生请求的rna分子，并在5'末端添加7-甲基尿苷残基作为5'帽，或添加5'-5'磷酸键作为帽，然后所述系统可由此甲基化以形成成熟mcap。尿苷-5'-三磷酸-5'尿苷也可用作rna帽。所述系统还可使用2'o-甲基对rna碱基进行转录后修饰，以提高熔化温度并增加稳定性。在另一个实施方案中，所述系统产生具有任意a残基数目的聚a尾的请求rna分子。其他实施方案包括将切割信号或序列或富gu序列纳入生物实体中，这也可针对用于后续程序的特定宿主细胞进行调整。在其他实施方案中，本发明的系统产生请求的肽、多肽或蛋白质序列。
实施例1-功能性ha和nadna分子以及蛋白质部分的合成
本实施例描述来自寡核苷酸池的ha和na基因的dna构建体的自动化组装，及其转染进入产生病毒颗粒的宿主细胞中。流感病毒由包裹于中央核心的包含糖蛋白的病毒包膜制成。所述中央核心包含病毒rna基因组，以及包装和保护所述rna的其他病毒蛋白质。流感基因组通常包含八条rna，每一条都包含一个或两个编码病毒蛋白质的基因。在甲型流感的情况下，基因组包含八条rna上的11个基因，编码包括血凝素(ha)和神经酰胺酶(na)在内的11种蛋白质。其他蛋白质包括核蛋白(np)、m1、m2、ns1、ns2、pa、pb1、pb1-f2和pb2。
血凝素(ha)和神经酰胺酶(na)是存在于病毒颗粒外侧的糖蛋白。这些糖蛋白在病毒生命周期中具有关键功能，包括协助结合至宿主细胞以及再生病毒颗粒。因此，包含这些蛋白质的经组装的病毒可用于生产疫苗。
寡核苷酸合成和组装
向本发明的组合单元提供代表ha和na基因的dna构建体序列的96个寡核苷酸的池。ha和na构建体为约3kb长，并且在所述方法中由96个寡核苷酸组装而成。第一个寡核苷酸和最后一个寡核苷酸包含用于pcr扩增的引物结合结构域，以及，如果需要组装更大片段的话，用于在扩增后释放引物结合结构域并暴露用于dna组装的重叠区的noti限制位点。
组装单元采用具有集成热循环能力的
对组装单元编程，以进行所述过程中的若干个不同步骤，即，1)用于扩增寡核苷酸的prc1扩增；2)对pcr1扩增的寡核苷酸的误差校正步骤；3)用于扩增经校正的寡核苷酸的pcr2步骤；4)用于提供纯的经扩增的寡核苷酸的pcr产物纯化步骤；5)用于将所述寡核苷酸产物组装成基因的组装步骤。可在反应容器(其为96孔板)的不同反应区中进行每个过程，并且所述反应区可为96孔板上的一列或多列。组装反应在50℃下进行30分钟至60分钟，然后反应温度改变并保持在10℃。
第一pcr和误差校正
1.对于每个组装产物，以自动化方式进行pcr反应：
25μl
2μl1％peg8000
0.25μl末端引物1(100um)
0.25μl末端引物2(100um)
20μlmbg水
将上述寡核苷酸池的2.5μl作为模板以50nm转移至包含pcr主混合物(mastermix)的反应容器的反应区中(或随后合并)。
2.使用以下参数进行热循环：
98℃1分钟
30x(98℃30秒，65c6分钟，并通过15秒/循环进行延伸
72℃5分钟
10℃不限时
误差校正
通过使用以下参数的热循环进行变性/退火:
98℃2分钟
2℃/秒至85℃
85℃2分钟
0.1℃/秒至25c
25℃2分钟
10℃不限时
取出2.7μl并添加至8.3ul包含5.3ul水/2ulsurveyortm核酸酶(transgenomic,inc.,omaha,ne)/1ul1:4000稀释的exoiii的误差校正混合物中。
在42℃下热循环1小时，10℃不限时
第二pcr
主混合物配方参见上文。
将2.5μl误差校正样品用于50ul总反应体积中。
热循环器条件参见上文。
pcr纯化
使用
gibson
产生约3kb的核酸构建体。电泳凝胶在图2中示出。这些基因已经包含启动子区(poli和polii)，用于在转染进哺乳动物细胞后表达。
使用gibson
合并以下：
5μl混合物
5μldna扩增子
在热循环器上的反应容器内于50℃孵育混合物1小时，然后10℃不限时。
将质粒载体dna转化至宿主细胞中
下一步是将所述基因与不变的流感基因组合以提供完全的病毒基因组。然后将所述基因转染至mdck细胞以产生拯救病毒。然后，所述细胞产生易于收集的病毒产品。
实施例2-免疫应答的产生
在另一个实验中，以如实施例1中描述的方式合成甲型流感/shanghai/2/2013ha基因的序列。根据之前描述的自扩增rna疫苗技术(geall等，nonviraldeliveryofself-amplifyingrnavaccines,pnas,第109卷，第36期，第14604-09页(2012))将合成的ha序列克隆进入包含rna依赖的rna聚合酶基因、遗传控制元件以及t7聚合酶启动子的dna模板。在验证构建体后，进行rna的体外转录、rna的加帽以及用所述rna转染bhk细胞。通过琼脂糖凝胶电泳(未示出)证实所转录的rna的完整性。如通过凝胶电泳以及用h7-特异性抗体进行的western印迹所证实，所述细胞表达h7ha。将rna封装进脂质纳米颗粒(lnp)递送系统中，并使用该疫苗来免疫小鼠(geall等和hekele等，emergingmicrobesandinfections(2013)2,e52)。在第一次注射后两周，七只h7/lnp免疫的小鼠中的六只发生血清转化，h7-特异性血凝素抑制滴度范围从1:20至1:80(数据未示出)。
实施例3-功能性噬菌体颗粒的合成以及寡核苷酸设计
本发明可用于生产可用于噬菌体治疗的噬菌体。在一个实施方案中，所述噬菌体是噬细菌体。噬菌体治疗可用于治疗人、动物和植物中的病原细菌感染。噬菌体治疗可特别用于其中细菌对常规的控制方法无响应的应用中。
在实验室使用
寡核苷酸合成
通过本发明的接收单元接收所述生物序列信息，在该实施方案中，所述接收单元是连接至与所述发送单元相同的计算机网络的计算机。所述接收单元连接至组装单元，在该实施方案中，所述组装单元还具有bioautomationtm192e寡核苷酸合成器(bioautomationcorp.,plano,tx)作为一个子单元。在接收所述生物序列信息之前设置组装单元的所有子单元。设置包括但不限于用必需的化学物质、试剂以及生物构件装载所有器皿，以及在接收生物序列信息之前准备所有软件编程，使得可在接收序列信息后立即开始启动生物实体的合成。所述方法的每个步骤都在所述反应容器的不同反应区中进行。
在接收生物序列信息后，组装单元中的软件指导寡核苷酸的合成，所述寡核苷酸通过使用先前向系统中提供的生物构件(在本例中为核苷亚磷酰胺构件)来合成。该合成在例如寡核苷酸合成器等子单元上进行。
在合成后，通过添加浓缩的氢氧化铵并在55℃下孵育而从固体支持物切割寡核苷酸，各步骤都以自动化方式来进行而无需在设置后进行进一步人为干预。构成每个片段的寡核苷酸被单独汇集并通过包含polypaktm填充物(glenresearch,sterling,va)的柱子纯化。还可使用在ph范围1至13下稳定的其他填充物。因此，将用水稀释的氢氧化铵溶液直接加载在填充物上。在洗脱失败序列后，从支持物结合的寡核苷酸去除并洗涤三苯甲基保护基。然后，可洗脱完全脱保护的产物并通过冻干分离。使用适于自动化的脱保护程序，例如使用乙二胺(eda)/甲苯溶液的柱上脱保护。还可使用基于顺磁珠的纯化系统，其一个实例是
由于生产四个重叠phix子组件的gibson
以下步骤也由可在需要和方便时具有许多子单元的组装单元以自动化方式进行。组装单元的每个子单元预先装有进行所有步骤所必需的试剂。在寡核苷酸组装后，使用机械臂将反应容器从寡核苷酸合成器转移至具有热循环能力的液体处理器。以完全自动化的方式，将上述四个寡核苷酸池各10μl添加至10ul的pcr组装试剂——可使用约10μm的稀释液。pcr试剂的方便形式是2xhf
组装反应在50℃下进行30分钟至60分钟，然后反应温度变化并保持在10℃。
第一pcr和误差校正
1.对于每个组装产物，以自动化方式进行pcr反应：
25.00μl2×hf
0.25μl末端引物1(100μm)
0.25μl末端引物2(100μm)
22μl水
2.5μl模板(来自上文的反应产物的gibson
2.使用以下参数进行热循环：
98℃1分钟
循环25x{98℃10秒，60℃30秒，72℃1.5分钟)
72℃5分钟
98℃2分钟
2℃/秒增加至85℃
85℃2分钟
0.1℃/秒降至25℃
25℃2分钟
然后维持在10℃
3.将6.25μls/e误差校正混合物添加(以下方案)至各样品
4.在42℃下进行误差校正反应1小时，然后反应温度变化并维持在10℃。
第二pcr
1.还由组装单元的热循环子单元以自动化方式进行以下四个pcr反应：
每个反应25.00ul
0.25μl引物1(100μm)
0.25μl引物2(100μm)
22.00μlmbg水
2.50μl来自上面的误差校正模板。
用于将四个子组件组合成phix基因组的gibsonassemblytm{syntheticgenomics,sandiego,ca)
以自动化方式进行以下程序：
1.从上面的第二pcr中取出四种扩增子各2.5μl，并汇集入96孔板的另一个位置。
2.添加2μlnotl限制酶，并在37℃下孵育1小时，然后65℃20分钟以使notl酶失活。
3.添加12μl2xgibsonassemblytm(syntheticgenomics,inc.,sandiego,ca)主混合物，并在50℃下孵育1小时。
活性phix病毒的生产
在该步骤中，产生活性病毒颗粒。还可以自动化方式进行这些步骤。在如上文描述进行dna合成和组装后，将组装的φx174基因组与化学感受态大肠杆菌菌株c或另一φx174敏感的大肠杆菌菌株(例如，dh10)合并。在42℃热激后，在soc培养基中恢复细胞。
1.在容器中将5μl上面的组装反应物与50μl化学感受态dh10大肠杆菌细胞合并。
2.根据以下条件进行热循环：
4℃2分钟
42℃30秒
4℃2分钟
3.添加150μlsoc培养基，并在37℃下孵育细胞若干小时
从大肠杆菌纯化活性噬菌体颗粒，并测试其在涂布于包含大肠杆菌细胞的lb琼脂平板上时形成噬菌斑的能力(smith等，pnas2003)。
作为转化大肠杆菌细胞的替代方法，还可能测试在无细胞体系中形成活性噬菌体颗粒的能力。在该实施方案中，将合成的基因组在上述无细胞的表达试剂盒之一中孵育2小时。
试剂组分成分
gibson
1.5x等温(iso)反应缓冲液(25％peg-8000，500mmtris-hciph8.0，50mm
mgcl2，50mmdtt，4种dntp各1mm，以及5mmnad)。如下文描述的制备该缓冲液。
2.t5核酸外切酶
3.
4.taqdna连接酶
方法程序
1.制备5xiso缓冲液。可通过合并以下物质来制备6ml该缓冲液：
3ml1mtris-hciph8.0
300μl1mmgci2
600μl10mmdntp
300μl1mdtt(1.54g溶解于dh20至10ml)
1.5gpeg-8000
300μl100mmnad(0.66g溶解于dh20至10ml；通过在50℃下、然后连续涡旋而重悬)
添加水至6mi。等分成1ml，并储存于-20℃。
2.制备足以用于80次反应的800μl组装主混合物。这可通过合并以下物质来制备：
320μl5xiso缓冲液
6.4μl1u/μlt5exo(将酶储液以1:10稀释于1×t5exo缓冲液中)
20ui2u/μl
80μl40u/μltaq连接酶
374μidh20
使混合物充分混合并储存于-20℃，或者如果将立即使用则储存于冰上。
3.组装混合物可以-20℃储存至少一年。酶在至少10次冻融循环后仍保持活性。
该混合物理想用于组装具有20bp至150bp重叠的dna分子。
误差校正混合物组分-surveyor核酸酶+核酸外切酶iii(s/e)
250μlsurveyortm核酸酶(transgenomicinc.，omaha，ne)+0.03125μl核酸外切酶ill
phix基因组序列：
seqidno：5
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seqidno：1-片段号1：
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seqidno：2-片段号2：
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seqidno：3-片段号3：
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seqidno：4-片段号4：
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实施例4-功能性dna分子和蛋白质部分的合成
将编码功能性绿色荧光蛋白(gfp)的核酸序列以及合适的表达调控序列输入
所述系统包含具有集成热循环能力的
寡核苷酸合成
根据与上述那些相似的合成计划，如在实施例中所描述的，由本发明的接收单元接收生物序列信息。在该实施方案中，所述接收单元是连接至与所述发送单元相同的计算机网络的计算机。所述接收单元连接至组装单元，在该实施方案中，所述组装单元具有bioautomationtm192e寡核苷酸合成器(bioautomationcorp.,plano,tx)作为一个子单元。在接收生物序列信息之前，通过用必需的化学物质、试剂以及生物构件装载所有器皿，以及在接收所述生物序列信息之前准备所有软件编程，使得可在接收序列信息后立即开始启动生物实体的合成，以此来设置包括用于体外翻译的子单元在内的组装单元的所有附加子单元。
在接收生物序列信息后，组装单元中的软件指导寡核苷酸的合成，所述寡核苷酸使用先前向系统中提供的dntp或亚磷酰胺以及其他试剂来合成。以如上述实施例中相同方式进行该步骤，并产生该组寡核苷酸，然后如实施例中描述组装并扩增，以产生具有表达所必需的合适调控序列的编码gfp基因的核酸序列。
可在准备用于该目的的反应容器的不同反应区中对组装的核酸序列进行体外且自动化的转录和翻译。用于进行体外翻译和/或无细胞蛋白质表达的各种试剂盒可商业途径获得，并且可方便地用于本发明，例如
将合成的pcr产物添加至指定反应区中的蛋白表达组分。在表达反应后，将黑光维持在反应混合物上，并且通过绿光的发射证实翻译的gfp的存在。
实施例5-抗原性生物制品生物产品的合成
her-2(人表皮生长因子受体2)是其扩增或过表达在某些乳腺癌的进展中起作用的蛋白质。该蛋白质由erbb2基因编码。可使用靶向her-2的多种抗体治疗。可生产包含her-2抗原的疫苗，其可施用至患者，该患者随后形成针对该疫苗的抗原应答并产生her-2抗体。该疫苗可用于癌症治疗，并且可用于其中her-2抗体的产生得到有用应用的任何治疗中。
将her-2蛋白的序列输入软件程序，其将序列分成合适数目的代表该基因子组件的重叠片段。该序列中包含合适的调控序列。每个片段具有对于基因合成合适的长度，并且被设计成与下一片段重叠合适数目的碱基对，例如，约40bp。由发送单元将生物序列信息发送至本发明系统的接收单元。如本文所解释，基因可作为一系列重叠的寡核苷酸而组装，并且组装单元的子单元将所述寡核苷酸组装成最终dsdna分子，或者可在反应容器的不同区组装dsdna分子。包括合适的表达调控序列。如本文所解释，将所组装的基因转移至组装单元的另一个子单元中，或转移至反应容器的另一个区中并进行无细胞的体外转录，然后转移至另一个子单元或另一个区以进行dna序列的翻译。按需要进行纯化步骤。收集的her-2可作为抗原疫苗来配制和使用。
实施例6-dna疫苗的合成
本发明还可用于生产dna疫苗。将编码一种或多种hiv蛋白质的dna输入软件程序，其将dna序列分成合适长度的重叠的寡核苷酸片段，包括具有合适表达调控序列的合适质粒(例如，pga2/js2)的dna序列。
由本发明的发送单元将序列发送至本发明系统的接收单元。如本文所描述，接收单元将序列提供至本发明的组装单元，并且组装单元开始合成重叠的寡核苷酸，而重叠的寡核苷酸由组装单元的子单元(或反应容器不同区中的相同子单元)组装成全长的质粒疫苗。然后，dna可作为dna疫苗来配制和使用。当注射进患者时，该dna疫苗为细胞提供制备一种或多种hiv蛋白质的指令，所述hiv蛋白质则激发免疫应答。该技术可应用于任何dna病毒，所述dna病毒可并入可注射入待治疗的患者以提供免疫性的质粒或其他载体。
西尼罗河病毒是另一个容易通过使用prm和e基因的dna疫苗的使用来预防的病原体的实例。
实施例7-由蛋白质亚单位亚基合成疫苗
亚基疫苗提供了将抗原呈递至免疫系统而无需引入完整病毒颗粒的机会。一个例子是用于提供针对流感病毒的免疫性的
目前流感病毒的a/h3n2、a/h1n1和b毒株得自世界卫生组织毒株推荐，并且用于使用病毒表面抗原制备三价疫苗。使用合适的软件程序将核酸序列分成上述片段，包括合适的调控序列。如上文所述，在合成核酸后，将核酸转移至组装单元的子单元中(或转移至反应容器的另一个区中)，用于体外翻译。可在维持细胞培养物的子单元中生产疫苗，所述子单元预先准备有在合适培养基中建立的mdck细胞(犬肾细胞系)培养物。
实施例8-类病毒颗粒病毒样颗粒疫苗的合成
非感染性的病毒样颗粒(vlp)可用于生产具有在无需呈递组装的病毒颗粒下激活免疫系统的能力的疫苗。可使用自组装成有效作为抗原的病毒样颗粒的l1和/或l2主要衣壳蛋白来生产针对人乳头瘤病毒(hpv)的疫苗。可在酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞或细菌中组装这些vlp。该类型疫苗的一个例子是
选择选自类型6、11、16、18、31、35、45、52和58的hpv类型组合的vlp。所述vlp可具有l1或l1+l2蛋白。鉴别编码这些蛋白质的核酸序列，并且如上文所述使用合适的软件将所述序列分成片段，并且包括适于在所选细胞类型中表达的调控序列。然后由发送单元将核酸序列信息发送至位于遥远位置的本发明的接收单元。接收单元将序列信息提供至系统的组装单元，并合成vlp。如上文所述，可将dna分子从重叠的寡核苷酸片段组装成一个或多个完整的dsdna分子。
如上文所述，在合成后，将dna转移至组装单元的子单元中(或转移至反应容器的另一个区中)，用于在维持于系统上的已建立的细胞培养物中的体外翻译。由该子单元中的细胞生产疫苗。将翻译的蛋白质提供至系统的另一个子单元中，翻译的蛋白质在其中汇集并自组装成可用作对抗hpv的疫苗的vlp。
实施例9-完全病毒完整病毒疫苗的合成
在另一个实施方案中，可在细胞培养物中使用反向基因技术合成完整病毒疫苗。甲型流感基因组包含八个病毒基因区段，包括ha和na区段，其在对病毒的免疫应答中是重要的。在一个实施方案中，组装单元具有维持例如mdck细胞、293t细胞或vero细胞用于病毒生产的子单元(这些组分还可维持于反应容器的一个或多个其他区中)。可将包含多个转录盒的质粒构建为包含八个病毒基因以及必需的调控序列。如果需要，八个基因可存在于多个质粒或单一质粒上。所述ha和na区段基于衍生自带来当地威胁的病毒的序列。因此，在一个实施方案中，提前制备六个非变化基因，而仅ha和na基因由系统合成。然后，在所述方法中可将该六种非变化基因作为试剂处理。但是在另一个实施方案中，组装单元的子单元基于从接收单元接收的信息合成质粒。在任一实施方案中，合成后，都将质粒在高转染效率条件下转染进入维持于组装单元的另一个子单元的细胞培养物中。经转染的细胞产生完整病毒颗粒，而完整病毒颗粒可按需要配制成活的减毒疫苗，或配制为死的或被进一步失活的疫苗。
对本领域技术人员明显的是，可在不背离本发明的范围和精神下对本文公开的发明进行各种替换和改造。
在说明书中提到的所有专利和出版物都指示了本发明所属领域技术人员的水平。
在本文中以举例说明的方式描述的本发明可适当地在本文未具体公开的任意一种或多种要素、一种或多种限制不存在的情况下实施。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本由……组成”以及“由……组成”中的任一个可由另外两个术语之一替代。已经采用的术语和表达用作描述性而非限制性的术语，并且无意于使用这样的术语和表达来排除所示和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应认识到，各种改造可能落在要求保护的发明范围内。
此外，当本发明的特征或方面以马库什组来描述时，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什组的任意个体成员或者成员亚组来描述。例如，如果x被描述为选自由溴、氯和碘组成的组，则完全地描述了x是溴的权利要求以及x是溴和氯的权利要求。
其他实施方案在所附权利要求内。
<110>合成基因组股份有限公司
j·c·文特尔
d·g·吉布森
j·e·吉尔
<120>数字生物转化器
<130>sgi1600-1wo
<150>us61/684,076
<151>2012-08-16
<160>6
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>1400
<212>dna
<213>phix病毒
<400>1
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