本发明涉及杂交瘤细胞株、抗体及其应用，具体涉及用于检测人ctrp3b的杂交瘤细胞株、抗体及其应用。
背景技术：
：c1qandtumornecrosisfactorrelatedprotein3(ctrp3)主要是由脂肪细胞或成纤维细胞分泌的脂肪细胞因子，在肾脏、小肠、肺脏及成纤维细胞等器官、组织细胞中也有所表达。ctrp3由分泌信号肽、胶原结构域及c端球状结构域构成，成熟蛋白不含其n端信号肽(22个氨基酸残基)。c端球状结构域与c1q结构类似，可以与其他蛋白或者受体相互作用，因此被认为是其功能结构域。ctrp3具有以下功能：(1)在糖脂代谢调节、炎症反应抑制、心血管保护及减少细胞凋亡和坏死等方面具有作用；(2)能够减轻糖脂代谢紊乱、炎症反应及免疫功能不全等代谢相关疾病；ctrp3能够减少肝糖输出、促进脂肪细胞分化和脂肪酸存储；同时，ctrp3的水平也有望成为糖尿病及代谢综合征的标志分子；(3)ctrp3能够抑制nf-κb、tgf-β等信号通路参与的il-6和tnf-α等促炎因子的释放，抑制炎症反应；(4)ctrp3具有诱导骨肉瘤细胞生成、促进软骨细胞增殖、诱导脂肪细胞分化、促进血管壁平滑肌细胞增殖及心肌保护等生理作用，可以减轻心肌梗死后大鼠的心肌重构和纤维化。除此之外，ctrp3有望在治疗代谢综合征和心力衰竭等方面发挥重要作用。在人体内，ctrp3编码基因转录后，经过可变剪接，经过翻译，形成两种ctrp3：ctrp3a和ctrp3b蛋白。ctrp3b蛋白在胶原结构域比ctrp3a多七十个氨基酸残基，其余均相同。前述ctrp3研究进展均是以ctrp3a作为研究对象。我们的研究结果显示，在某些病理情况下，ctrp3b水平会有明显变化，提示可能有重要的研究价值。目前，对于人ctrp3b蛋白研究较少，尚无特异性检测ctrp3b的检测试剂盒。技术实现要素：针对现有技术的缺陷或不足，本发明提供了一对用于产生抗人ctrp3b单克隆抗体的杂交瘤细胞株：xa297-7，该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccno：c201797，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学；xa97-11，该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccno：c201798，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学。本发明的杂交瘤细胞株产生的抗体序列：xa297-7重链可变区序列如seq.id.no.1所示；轻链可变区序列如seq.id.no.2所示。本发明的xa297-11重链可变区序列如seq.id.no.3所示；轻链可变区序列如seq.id.no.4所示。本发明杂交瘤细胞株分泌产生的抗人ctrp3b单克隆抗体。本发明抗体用于检测人ctrp3b的应用。进一步，本发明抗体用于制备人ctrp3b检测试剂盒的应用。本发明还提供了人ctrp3b检测试剂盒。所提供的人ctrp3b检测试剂盒包括上述抗体。本发明的试剂盒还包括：样品稀释液、底物稀释液、底物、洗涤液、标准品和非离子活性剂。本发明操作简便、成本低廉、灵敏度高、特异性强的定量检测体液中ctrp3b浓度的elisa试剂盒及其制备方法和应用。附图说明图1为重组人ctrp3b蛋白的电泳图，1、marker；2、500mm咪唑洗脱液；3、重组人ctrp3b蛋白。图2本试剂盒典型标准曲线。具体实施方式以下通过实施例对本发明做进一步的阐述。实施例是对本发明进行详细说明，但本发明并不受这些的任何限定。以下实施例中使用的辣根过氧化物酶(hrp)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；基因序列优化、合成克隆由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成；抗体测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；ni-nta纯化柱购自ge公司；内毒素去除柱购自赛默飞世尔(中国)有限公司；dmem高塘培养基、胎牛血清为hycolon公司产品；全长ctrp3蛋白购买自aviscerabioscience公司。实施例1：本发明杂交瘤细胞株和抗体的制备根据人ctrp3b序列(genbankaccessionnm_181435.5)开放阅读框序列，并根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，进行全基因合成(序列如seq.id.no.5所示)，将合成的基因连接于pet30a(+)的ecori和hindiii之间，采用iptg(终浓度1mm)进行16℃，200rpm过夜诱导表达，4000g离心收获菌体。超声破碎后，12000g离心取上清。上清经过镍柱亲和纯化，采用咪唑浓度梯度洗脱后，通过透析更换为pbs缓冲液，采用milliporeutral-15浓缩，除去内毒素后，即为重组人ctrp3b蛋白。(参见附图1)选取6-8周龄balb/c雌性小鼠，ctrp3b蛋白作为抗原，为获得高亲和力抗体，采用小剂量(约1μg)、长时程，多次免疫的方法，选择免疫10天后，采用间接elisa方法检测血清效价(包被抗原为酶切并纯化的蛋白)，效价达到1∶5万以上准备融合。取经加强免疫的小鼠脾脏，研磨破碎，过滤洗涤之后，制成细胞悬液并计数；骨髓瘤sp2/0细胞生长至对数期，离心收集并洗涤，与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合，室温下采用peg进行促融合，将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，置37℃，5％co2，相对饱和湿度培养箱中培养。在融合24小时后，依次采用5×hat选择培养液、1×hat/ht选择培养液和1×ht培养液进行融合骨髓瘤细胞筛选。采用间接elisa方法筛选克隆(ctrp3阴性，ctrp3b阳性)，并进行连续克隆化。最终筛选得到能够稳定分泌抗ctrp3b单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为xa297-7和xa297-11，均保藏于中国典型培养物保藏中心,地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号分别为：cctccno:c201797和cctccno:c201798。抗人ctrp3b单克隆抗体的制备:取8-10周龄babl/c雌性小鼠，按照200μl/只，腹腔注射石蜡油，1-2周之后，杂交瘤细胞株(cctccno:c201797或cctccno:c201798)，以106个/只的量，腹腔注射，7-10天后，采集小鼠腹水，用间接elisa方法检测单抗的效价。腹水4℃、12000rpm离心15min，与2倍体积的醋酸缓冲液(0.06m，ph4.8)混合，逐滴加入正辛酸，室温搅拌30min，4℃静置其充分沉淀。离心后取上清过滤，加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.1m，ph7.4)，并用2mnaoh调节ph至7.4。采用硫酸铵沉淀将抗体沉淀，离心后取沉淀，用含有0.2mmedta磷酸盐缓冲液溶解，并透析过夜。采用离子交换层析进行纯化，所用缓冲液：平衡缓冲液为20mmph7.5的tris-hcl缓冲液、洗脱缓冲液为含1.0mnacl的20mmph7.5的tris-hcl缓冲液。nacl浓度梯度洗脱结合的抗体蛋白，检测a280，收集洗脱的抗体蛋白。用本领域常用bca法测定抗体含量，用间接elisa法检测抗体效价。抗体的测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，其步骤为：杂交瘤细胞采用rpmi1640加20％血清培养24h，离心，弃去上清，采用trizol重悬细胞，106个细胞/ml。提取dna后，采用rt-pcr扩增重链和轻链基因，克隆至t载体后进行dna测序。抗体命名为：xa297-7重链可变区(fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4)：evmlvesgggfvkpggsqklscvasgftlsnyamswvrqtpekrlewvatistggsyiyyadsvkgrftisrddakntlflqmsslrsedtamyycaslyivtvlvqdywghgttltvss；xa297-7轻链可变区(fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4)：davmtqtplslpvslgaqasiscrssqslvhsngytylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsthvpytfgggtkleik；xa297-11重链可变区(fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4)：evqlqqsgpelvkpgasvkiscktsgytfneyvihwvkqshgrslewigginpnnvstnynqkfkgkatltvdkssstaymelrrltsdasavyycvgygyyvywgqgtlvtvs；xa297-11轻链可变区(fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4)：dvlmtqtplslpvslgdqasisckssqsivhsdgntylewylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyyclqgshvpwtfgggtkleik。实施例2：人ctrp3belisa试剂盒试剂盒组成：抗人ctrp3b单克隆抗体xa297-7包被的酶标板，标准品(纯化的ctrp3b蛋白，冻干粉)，检测抗体：抗体xa297-11，样品稀释液，tmb酶底物显色液，洗涤液及反应终止液。tmb酶底物显色液：0.03％过硼酸钠，用之前10min加入tmb盐酸盐，终浓度0.01％；反应终止液：1mol/l硫酸溶液；样品稀释液：含0.1％bsa及0.1％tween-20的pbs缓冲液；洗涤液:含有0.1％tween-20的pbs缓冲液。(1)酶标板包被：(1.1)杂交瘤细胞株xa297-7(编号cctccno:c201797)所产生单克隆抗体xa297-7作包被用抗体，用50mm、ph9.6碳酸盐缓冲液稀释至2μg/ml加至96孔板，100μl/孔，4℃包被过夜；(1.2)洗涤：用300μl含0.1％吐温的磷酸盐缓冲液洗板3次，甩干；(1.3)干燥保存：存于加干燥剂的密封袋中，4℃保存备用。(2)检测抗体酶标辣根过氧化物酶(hrp)5mg/1ml加入0.2ml0.1m过碘酸钠，室温下避光搅拌20min。将上述溶液对1mmph4.4醋酸钠缓冲液4℃透析过夜。20μl0.2mph9.5碳酸盐缓冲液调节ph到9.0-9.5加入10mg抗体xa297-11(由杂交瘤细胞株xa297-11，编号cctccno:c201798产生)，室温避光轻轻搅拌2h。加0.1ml硼氢化钠溶液(4mg/ml)，混匀静置2小时，4℃透析过夜。逐滴加入等体积饱和硫酸铵溶液4℃静置1小时，离心30min，弃去上清。沉淀物少量0.15mph7.4的磷酸盐缓冲液并透析，上清即为酶标抗体xa297-11-hrp。(3)样品加入：将标准品(待测样本)加入包被孔内，室温振荡反应1h。(4)酶联反应：洗涤4次后加入辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体xa297-11-hrp100μl/孔，反应1h。(5)显色反应：洗涤4次后再加入底物液(含0.03％过硼酸钠和0.01％盐酸tmb)100μl，振荡显色10分钟。(6)终止反应：以1mol/l硫酸终止反应。(7)拟合曲线与读值：在酶标仪上读波长为405nm的od值得出标准曲线和浓度。该实施例试剂盒典型标准曲线见附图2。利用标准品测定该实施例试剂盒相关指标：(1)线性范围：该试剂盒检测ctrp3b含量的线性范围为0.375-60ng/ml。(2)回收率：采用1ng/ml，10ng/ml，15ng/ml的ctrp3b溶液(溶剂为样品稀释液)，测的回收率为95.4％-104.5％。(3)批内差异为3.5％-6.2％。(4)批间差异为6.6％-10.4％。实施例3：用本发明试剂盒检测动脉粥样硬化患者及正常对照组血清中ctrp3b含量采用本发明所述试剂盒，检测50例正常人和50例动脉粥样硬化患者血清中ctrp3b含量。结果如表1所示。表1血清中ctrp3b的检测结果(x±s，ng/ml)血清中ctrp3b含量正常组动脉粥样硬化患者ng/ml263.9±87.273±68.2p<0.001动脉粥样硬化患者血清中ctrp3b含量明显低于正常人，差异显著(p＜0.01)。以上结果表明，利用本发明试剂盒能定量检测出体液标本中ctrp3b的含量，对临床检测具有较高的敏感性和特异性，对诊断该病具有重要参考价值，为及早防治该病提供了一个有效途径。核苷酸序列表电子文件<110>中国人民解放军第四军医大学<120>杂交瘤细胞株及抗人ctrp3b的单克隆抗体和其应用<141><160><210>1<211>120<212>氨基酸<213>xa297-7重链可变区<220><223><400>1evmlvesgggfvkpggsqklscvasgftlsnyamswvrqtpekrlewvatistggsyiyyadsvkgrftisrddakntlflqmsslrsedtamyycaslyivtvlvqdywghgttltvss<210>2<211>112<212>氨基酸<213>xa297-7轻链可变区<220><223><400>2davmtqtplslpvslgaqasiscrssqslvhsngytylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsthvpytfgggtkleik<210>3<211>115<212>氨基酸<213>xa297-11重链可变区<220><223><400>3evqlqqsgpelvkpgasvkiscktsgytfneyvihwvkqshgrslewigginpnnvstnynqkfkgkatltvdkssstaymelrrltsdasavyycvgygyyvywgqgtlvtvsa<210>4<211>112<212>dna<213>xa297-11轻链可变区<220><223><400>4dvlmtqtplslpvslgdqasisckssqsivhsdgntylewylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyyclqgshvpwtfgggtkleik<210>5<211>897<212>dna<213>人ctrp3b全基因合成序列<220><223><400>5atgcaagatgaatacatggaggtgagcggaagaactaataaagtggtggcaagaatagtgcaaagccaccagcagactggccgtagcggctccaggagggagaaagtgagagagcggagccatcctaaaactgggactgtggataataacacttctacagacctaaaatccctgagaccagatgagctaccgcaccccgaggtagatgacctagcccagatcaccacattctggggccagtctccacaaaccggaggactacccccagactgcagtaagtgttgtcatggagactacagctttcgaggctaccaaggcccccctgggccaccgggccctcctggcattccaggaaaccatggaaacaatggcaacaatggagccactggtcatgaaggagccaaaggtgagaagggcgacaaaggtgacctggggcctcgaggggagcgggggcagcatggccccaaaggagagaagggctacccggggattccaccagaacttcagattgcattcatggcttctctggcaacccacttcagcaatcagaacagtgggattatcttcagcagtgttgagaccaacattggaaacttctttgatgtcatgactggtagatttggggccccagtatcaggtgtgtatttcttcaccttcagcatgatgaagcatgaggatgttgaggaagtgtatgtgtaccttatgcacaatggcaacacagtcttcagcatgtacagctatgaaatgaagggcaaatcagatacatccagcaatcatgctgtgctgaagctagccaaaggggatgaggtttggctgcgaatgggcaatggcgctctccatggggaccaccaacgcttctccacctttgcaggattcctgctctttgaaactaagtaa当前第1页12