本发明属于食品生物技术领域，具体是涉及一种活性羊肚菌硒肽及其微波制备方法，以及在人体抗氧化和降血糖中的用途。
背景技术：
羊肚菌是一种名贵的药食兼用大型真菌，其口感好，味道鲜美，深受人们的喜爱。羊肚菌富含蛋白质、多糖、维生素、矿物质及脂肪酸等多种营养成分，具有降血脂、增强机体免疫力、抗炎、抗氧化、抗疲劳、抗病毒和抗肿瘤等诸多功效。羊肚菌中的蛋白质含量占子实体干重的32.7％，含有8种人体所必需氨基酸，氨基酸构成比例与联合国粮食及农业组织(fao)标准相当，是营养和功能性食品开发的良好基料。虽然羊肚菌的商业化人工栽培尚未大面积推广，但有研究表明，采用液体发酵培养法获得的羊肚菌菌丝体的营养成分几乎与子实体相当，所以，随着生物发酵技术的快速发展，羊肚菌源功能性食品的开发已呈现出极为广阔的前景。
硒是人体生命活动必需的微量元素之一，也是多种抗氧化酶的组成成分，可以提高机体的抗氧化水平，改善免疫功能。多种疾病如糖尿病、克山病、心血管疾病及肿瘤等都与机体缺硒有关。天然食物中硒的含量普遍较低，一般从饮食中摄入的硒不足以满足人体的正常需要，因此，硒营养不良已成为世界各国人群普遍存在的一个问题。硒的存在形式有无机硒和有机硒两种，常见的无机硒主要是亚硒酸钠和硒酸钠，有机硒有硒多糖、硒蛋白和硒肽等。与无机硒相比，有机硒的毒性低，活性强，更易于被机体吸收利用。硒肽作为一种有机硒，兼有肽和硒两方面的功能，是一种安全、有效、健康的硒营养源，其开发和利用已引起广泛关注。目前，有机硒的制备主要有生物富集和化学合成2种方法，生物富集法得到的有机硒的硒含量普遍偏低，且生产周期长，而化学合成法生产工艺复杂、大多使用吡啶、苯、硝酸等有毒试剂，影响有机硒在食品中的应用。
微波是频率在0.3～300ghz之间的电磁波，能够使电磁能通过分子运动而转化为热能，还可以降低化学反应的活化能，加速反应的发生。由于微波加热具有操作简便，效率高及环境友好等优点，在许多有机合成反应中得到了广泛的应用，但有关微波法制备活性羊肚菌硒肽的研究尚未见报道。
技术实现要素：
为克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种活性羊肚菌硒肽的微波制备方法，该方法反应时间短，工艺简单，成本低，安全可靠，且易于实施；由上述微波制备方法制备的活性羊肚菌硒肽，充分发挥羊肚菌肽和硒的生理活性来实现抗氧化和降血糖作用。
本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种活性羊肚菌硒肽的微波制备方法，包括以下步骤：
(1)提取羊肚菌蛋白：利用碱溶酸沉法提取羊肚菌菌丝体中的蛋白质，得羊肚菌蛋白；
(2)酶解：采用木瓜蛋白酶对步骤(1)得到的羊肚菌蛋白进行酶解，灭酶，冷冻干燥，得羊肚菌肽；
(3)制备活性羊肚菌硒肽：将步骤(2)得到的羊肚菌肽溶解在水中配置羊肚菌肽水溶液，其中，所述羊肚菌肽的质量分数为1.0～5.0％；再按亚硒酸钠与所述羊肚菌肽的质量比为1～5∶1向上述羊肚菌肽水溶液中加入亚硒酸钠，并用0.5～3mol/l的hcl将ph调节至2.0～6.0，在微波加热条件下发生螯合反应；反应结束后透析、冷冻干燥，得活性羊肚菌硒肽；其中，所述微波加热功率为300～600w，加热反应时间为10～30min。
进一步地，步骤(1)中，所述碱溶酸沉法为：将液体发酵培养获得的羊肚菌菌丝体粉碎，将粉碎后的菌丝体与蒸馏水以质量比1∶20～80充分混合，用0.5～3mol/l的naoh调节ph至9.0～13.0，于30～60℃条件下浸提30～100min，离心；上清液用0.5～3mol/l的hcl调节ph至3.5～4.5，再次离心，沉淀透析脱盐，冷冻干燥，得羊肚菌蛋白。
进一步地，步骤(2)中，将步骤(1)得到的羊肚菌蛋白溶解在水中使所述羊肚菌蛋白的质量分数为1.0～5.0％，沸水浴加热20～40min，冷却后用0.5～3mol/l的hcl将溶液ph调节到5.0～7.0，温度保持在40～60℃，加入质量为所述羊肚菌蛋白质量的1～5％的木瓜蛋白酶，酶解3～5h，沸水浴灭酶10min，离心，上清液冷冻干燥，得羊肚菌肽。
本发明的第二方面，一种活性羊肚菌硒肽由上述活性羊肚菌硒肽的微波制备方法制得，其中，硒含量为25.9～59.5mg/g。
本发明的第三发明，上述活性羊肚菌硒肽在人体抗氧化和降血糖中的用途。
需要说明的是，在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件可以任意组合即得本发明各较佳实施例。另外，本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外均市售可得，采用的技术手段中除有说明外，离心、冷冻干燥和透析等工序均为本领域常规技术手段。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明中活性羊肚菌硒肽的微波制备方法简单快速，不使用任何有机溶剂，生产成本低，后处理容易，反应条件可控，重复性好，容易实现工业化生产。
(2)本发明通过将无机硒引入到羊肚菌肽中，有效降低了亚硒酸基团的毒性，制备的羊肚菌硒肽中硒含量高，为25.9～59.5mg/g，可作为安全、有效、健康的硒营养源。
(3)相比于原羊肚菌肽，本发明制备的活性羊肚菌硒肽具有更强的抗氧化和降血糖活性，有望在保健品和功能性食品中得到广泛的应用。
附图说明
图1为羊肚菌硒肽中测定硒含量的硒浓度-吸光度标准曲线图；
图2为羊肚菌肽和活性羊肚菌硒肽的红外光谱图；
图3和图4分别为羊肚菌肽和活性羊肚菌硒肽的能量散射光谱图(eds)；
图5为羊肚菌肽和活性羊肚菌硒肽的高效凝胶渗透色谱图(hpgpc)；
图6和图7为羊肚菌肽和活性羊肚菌硒肽的抗氧化活性图；
图8和图9为羊肚菌肽和活性羊肚菌硒肽的降血糖活性图。
具体实施方式
下面结合具体实施实例，进一步详细地说明本发明。应理解下面实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
实施例1制备活性羊肚菌硒肽ⅰ
(1)羊肚菌蛋白提取
将羊肚菌菌丝体粉碎，将粉碎后的菌丝体与蒸馏水按质量比1∶35混合，用1.0mol/l的naoh调节ph至11.0，于35℃条件下提取80min，离心；再用1mol/l的盐酸将上清液的ph调节至4.0，离心，沉淀物透析脱盐，冷冻干燥，得羊肚菌蛋白。
(2)酶解
将步骤(1)中羊肚菌蛋白溶解于水中，其中羊肚菌蛋白的质量分数为1.0％，沸水浴中加热20min，冷却后用1mol/l的盐酸将溶液ph调节到6.5，在温度为45℃的条件下加入质量为羊肚菌蛋白质量的1.0％的木瓜蛋白酶酶解3h，然后在沸水浴中灭酶10min，离心，上清液冷冻干燥，得羊肚菌肽。
(3)活性羊肚菌硒肽的制备
将步骤(2)中羊肚菌肽溶解于水中配制羊肚菌肽水溶液，其中，羊肚菌肽的质量分数为2.0％；再按亚硒酸钠与羊肚菌肽的质量比为2∶1向上述羊肚菌肽水溶液中加入亚硒酸钠，并用1mol/l的hcl将ph调节至3.0，在微波加热条件下发生螯合反应，微波加热功率为300w，加热反应时间为15min；反应结束后透析、冷冻干燥，得活性羊肚菌硒肽ⅰ。
实施例2制备活性羊肚菌硒肽ⅱ
(1)羊肚菌蛋白提取
将羊肚菌菌丝体粉碎，将粉碎后的菌丝体与蒸馏水按质量比1∶40混合，用2.0mol/l的naoh调节ph至12.0，于45℃条件下浸提60min，离心；用2.0mol/l的盐酸将上清液的ph调节至4.1，离心，取沉淀透析脱盐，冷冻干燥，得羊肚菌蛋白。
(2)酶解
将步骤(1)中羊肚菌蛋白溶解于水中，其中羊肚菌蛋白的质量分数为2.0％，沸水浴中加热30min，冷却后用2mol/l的盐酸将溶液ph调节到6.0，在温度为50℃的条件下加入质量为羊肚菌蛋白质量的2.0％的木瓜蛋白酶酶解5h，然后在沸水浴中灭酶10min，离心，上清液冷冻干燥，得羊肚菌肽。
(3)活性羊肚菌硒肽的制备
将步骤(2)中羊肚菌肽溶解于水中配制羊肚菌肽水溶液，其中，羊肚菌肽的质量分数为1.0％；再按亚硒酸钠与羊肚菌肽的质量比为4∶1向上述羊肚菌肽水溶液中加入亚硒酸钠，并用2mol/l的hcl将ph调节至5.0，在微波加热条件下发生螯合反应，微波加热功率为450w，加热反应时间为12min；反应结束后透析、冷冻干燥，得活性羊肚菌硒肽ⅱ。
实施例3测定活性羊肚菌硒肽的硒含量
准确称取0.2189g亚硒酸钠，用硝酸消化溶解后定容至50ml，配成2mg/ml的硒标准溶液。移取上述标准液1ml置于小烧杯中，加入0.1％邻苯二胺溶液10ml，调ph值至2.5，用水稀释到50ml，并在阴暗处放置40min。将其转入分液漏斗中，加8.0ml甲苯反复萃取后静置，重复3～4次，取萃取后的溶液1ml，用甲苯定容至25ml；取0，1，2，3，4，5ml上述溶液6份，分别用甲苯补足到5ml，在334nm处测相应的吸光度。以硒浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线如附图1所示，其回归方程为y＝41.564x+0.0395，r2＝0.9903。
准确称取0.005g活性羊肚菌硒肽于烧杯中，加入混酸(hclo4：hno3：h2so4＝1：4：1(v/v))静置24h后，按上述操作进行测定，将测定结果代入标准曲线的回归方程，经计算，实施例1和2中活性羊肚菌硒肽ⅰ、ⅱ的硒含量分别为：25.9mg/g和59.5mg/g。
实施例4验证活性羊肚菌硒肽
(1)红外光谱
分别取羊肚菌肽以及实施例2制备的活性羊肚菌硒肽ⅱ少许，加入kbr压片后进行红外扫描，结果如附图2所示。通过对比可以看到，活性羊肚菌硒肽在966处出现了se-o键的特征吸收峰，在815cm-1和863cm-1处出现了se＝o键的特征吸收峰，而羊肚菌肽中没有出现。由此可见硒与肽有效结合在了一起，本发明的产物为活性羊肚菌硒肽。
(2)能量散射光谱(eds)
利用扫描电镜(sem)附带的能量色散光谱仪对羊肚菌肽和活性羊肚菌硒肽的元素组成进行表征，结果如附图3和4所示，羊肚菌肽的eds谱中没有硒的吸收峰，而活性羊肚菌硒肽在1.4kev附近出现了较强的硒元素的特征峰。经软件分析计算，羊肚菌肽中不含硒元素，而活性羊肚菌硒肽中硒元素的质量百分比为5.98％，原子数百分比为1.12％，表明羊肚菌肽成功硒化，所得产物为活性羊肚菌硒肽。
实施例5测定活性羊肚菌硒肽的分子量
采用高效凝胶渗透色谱法(hpgpc)测定羊肚菌肽及活性羊肚菌硒肽的分子量，色谱柱为tosohbiosepg4000swxl(300mm×7.8mm)，柱温为40℃，上样量为60μl，用ph为6.5、浓度为1mol/l的氯化钠溶液洗脱，示差折光检测器检测；以不同标准品葡聚糖分子量的对数对保留时间作图绘制标准曲线(y＝-0.5851x+10.234，r2＝0.9853)，再根据标准曲线计算样品的分子量。
羊肚菌肽和活性羊肚菌硒肽的分子量及其分布如附图5所示，羊肚菌肽的分子量主要介于200～8800da之间，峰值分子量为1655da，活性羊肚菌硒肽的分子量主要介于1000～12000da之间，峰值分子量为6300da；这进一步证明了硒化反应的发生，同时可以看出活性羊肚菌硒肽为小分子肽类，不是大分子蛋白质。
实施例6测定活性羊肚菌硒肽的抗氧化活性
(1)还原力
在试管中加入0.5ml不同浓度的样品，0.5mlph为6.6的磷酸缓冲溶液，空白管用磷酸缓冲液代替样品，各试管中再分别加入1ml质量分数为1％的铁氰化钾，混匀，置于50℃水浴中反应20min，然后加入质量分数为10％的三氯乙酸1ml，摇匀，3500r/min离心10mi；分别吸取上清液1.5ml，加入1.5ml蒸馏水和0.3ml质量分数为0.1％的fecl3，摇匀，静置3～5min，测700nm处的吸光度，吸光值越大，还原力越强。
(2)对dpph自由基的清除活性
在试管中加入2.0ml浓度为0.1mmol/l的dpph溶液，再加入1ml不同浓度的样品溶液，用蒸馏水补足到4ml，各管混匀，避光30min后于517nm测定吸光度值，以蒸馏水代替样品作为阴性对照。
对dpph自由基的清除活性按下列公式(1)计算：
式中，as为样品管的吸光度值；a0为阴性对照管的吸光度值。
结果如附图6和7所示，羊肚菌肽和活性羊肚菌硒肽均具有较强的还原性，且随着样品浓度的升高，还原力均增强，呈良好的线性关系，但活性羊肚菌硒肽的还原力明显优于原羊肚菌肽；羊肚菌肽和活性羊肚菌硒肽均对dpph自由基有较强的清除活性，羊肚菌肽清除自由基的ec50值(自由基清除率达到50％时的样品浓度)为6.31mg/ml，而活性羊肚菌硒肽清除自由基的ec50值为4.84mg/ml，说明活性羊肚菌硒肽比原羊肚菌肽具有更强的抗氧化活性。
实施例7测定活性羊肚菌硒肽的降血糖活性
(1)对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
将100μl的α-葡萄糖苷酶溶液(0.2u/ml)与1.0ml不同浓度的样品混合，用蒸馏水补到2.5ml，以蒸馏水代替样品作为阴性对照，在37℃下放置10min。随后各管迅速加入1ml浓度为0.5mmol/l的4-硝基苯基-d-吡喃葡糖苷(pnpg)作为反应底物，并在37℃下反应20min。各管立即加入4ml浓度为0.2mol/l的na2co3终止反应，用紫外分光光度计测定405nm处的吸光度值。按下列公式(2)计算抑制率：
式中，as为样品管的吸光度值；a0为阴性对照管的吸光度值。
(2)对α-淀粉酶的抑制作用
将0.5ml的α-淀粉酶溶液(2iu/ml)与0.5ml不同浓度的样品混合，以蒸馏水代替样品作为阴性对照，于25℃下放置10min。随后各管迅速加入0.5ml质量分数1％的淀粉溶液，在25℃下反应10min；最后向每管加入1ml3，5-二硝基水杨酸(dns)试剂，并将反应液沸水浴5min，冷却后，每管加入10ml蒸馏水，摇匀，于520nm处测定吸光度值，按公式(2)计算抑制率。
结果如附图8和9所示，羊肚菌肽和活性羊肚菌硒肽对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶均具有较强的抑制作用，羊肚菌肽抑制这2种酶的ic50值(抑制率达到50％时的样品浓度)分别为3.30mg/ml和4.76mg/ml，而活性羊肚菌硒肽抑制这2种酶的ic50值分别为2.08mg/ml和2.43mg/ml，说明活性羊肚菌硒肽比原羊肚菌肽具有更强的降血糖活性。
以上所述仅为本发明的部分实施例，并不意味着本发明必须依赖上述工艺流程才能实施。对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。