本发明涉及益生菌应用技术领域，具体涉及一种益生菌组合及其在凡纳滨对虾苗种培育中的应用。
背景技术：
近年来对虾养殖业迅速发展，中国逐渐成为世界范围内的对虾养殖大国。凡纳滨对虾(litopenaeusvannamei)是我国的主要对虾养殖品种，每年的养殖产量已接近160万吨，占对虾总产量的90％，而维持这一养殖规模所需要的苗种数量，每年在5000亿尾以上。对虾苗种是对虾养殖业发展的基础，投放健康苗种，是对虾养殖成功的先决条件。弧菌是不仅是海水，也是凡纳滨对虾幼体体内存在的优势菌群，但一些弧菌是条件致病菌，一旦养殖环境恶化或对虾免疫力下降将会引起细菌在体内的大量繁殖而导致对虾或幼体死亡。控制由弧菌引发的病害的发生与流行，是凡纳滨对虾健康苗种生产的关键环节。
在育苗过程中使用消毒剂、抗生素等药物不仅会破坏水体的正常微生物生态平衡，还容易导致幼体变态时间长、种苗大小参差不齐、抗病力差、养殖过程中生长慢等问题。有益微生物一般是从天然环境中经严格筛选分离而来，在水产养殖中，它具有改善水产动物的生存环境、抵抗疾病、促进生长的功效，因而受到了广泛的关注。通过益生菌的使用可以提高水体微生物的多样性，改变优势种群的种类和结构，减少有害菌或条件有害菌的数量，从而达到控制病害发生与流行的目的。近年来，国内外大量文献报道了益生菌在海淡水鱼、虾、贝类养殖方面的实验研究，已很多令人瞩目的进展。但有关益生菌在水生动物苗种培育中的报道多见于贝类和蟹类，而在对虾育苗中使用益生菌的报道多集中于光合细菌(photosyntheticbacteria)的应用。
技术实现要素：
为了解决现有凡纳滨对虾养殖过程中水体中弧菌易引发病害的问题，我们提出了一种益生菌组合及其在凡纳滨对虾苗种培育中的应用，该发明可增加凡纳滨对虾苗种培育池水体有益微生物数量，减少水体中弧菌的数量，改善水体微生物结构，增强凡纳滨对虾幼体的免疫水平，特别是提高凡纳滨对虾苗种出苗率。
本发明是通过以下技术方案实现的：
为实现上述目的，本发明提供一种益生菌组合，包括有金丽假交替单胞菌(pseudoalteromonasflavipulchra)cdm8菌株、短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)yh012菌株和海水芽孢杆菌(bacillusaquimaris)bc109菌株；
其中金丽假交替单胞菌(pseudoalteromonasflavipulchra)cdm8菌株于2017年11月22日在中国武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：cctccm2017712。
其中短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)yh012菌株于2017年11月22日在中国武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：cctccm2017713。
其中海水芽孢杆菌(bacillusaquimaris)bc109菌株于2017年11月22日在中国武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：cctccm2017711。
优选地，上述金丽假交替单胞菌cdm8的发酵液成分质量百分比为：大豆蛋白胨，1.5％；蔗糖，1.0％；氯化钠，2.5％；磷酸高铁，0.001％；硫酸镁，0.02％；硫酸锰，0.05％；金丽假交替单胞菌(pseudoalteromonasflavipulchra)cdm8发酵菌液制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于lb固体培养基，在28℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于lb培养液中，28℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于金丽假交替单胞菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在28℃；当发酵液od600值达到1.5～1.7时，终止发酵，获得发酵菌液。
优选地，上述金丽假交替单胞菌cdm8的发酵液中金丽假交替单胞菌活菌浓度≥109cfu/ml。
优选地，上述短小芽孢杆菌yh012的发酵液成分质量百分比为：蛋白胨，0.5％；酵母粉，0.1％；蔗糖，1.5％；氯化钠，2.5％；硫酸铁，0.05％；硫酸镁，0.004％；硫酸锰，0.01％；短小芽孢杆菌yh012发酵菌液制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于2216e固体培养基，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216e培养液中，37℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于地衣芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在37℃；当发酵液od600值达到1.2～1.4时，终止发酵，获得发酵菌液；
优选地，上述短小芽孢杆菌yh012的发酵液中短小芽孢杆菌yh012活菌浓度≥109cfu/ml。
优选地，上述海水芽孢杆菌bc109的发酵液成分质量百分比为：蛋白胨，0.75％；酵母粉，0.2％；氯化钠，1.0％；硫酸铁，0.01％；氯化钙，0.03％；海水芽孢杆菌bc109发酵菌液制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于2216e固体培养基，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216e培养液中，37℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于海水芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在28℃；当发酵液od600值达到1.2～1.4时，终止发酵，获得发酵菌液。
优选地，上述海水芽孢杆菌bc109的发酵液中海水芽孢杆菌bc109活菌浓度≥109cfu/ml。
一种益生菌组合在凡纳滨对虾苗种培育中的应用，步骤如下：
(1)幼体变态后的第一天添加金丽假交替单胞菌cdm8发酵液；
(2)第二天添加短小芽孢杆菌yh012和海水芽孢杆菌bc109的发酵菌液；
(3)第三天添加与第二天相同浓度的短小芽孢杆菌yh012和海水芽孢杆菌bc109的发酵菌液。
优选地，上述的一种益生菌组合在凡纳滨苗种培育中的应用，其特征在于：所述金丽假交替单胞菌cdm8发酵液在水体中菌浓度达到0-108cfu/ml；短小芽孢杆菌yh012和海水芽孢杆菌bc109在水体中的浓度各达到0-108cfu/ml。
优选地，上述凡纳滨对虾苗种幼体变态包括无节幼体变态为蚤状幼体、蚤状幼体变态为糠虾幼体和糠虾幼体变态为仔虾幼体。即受精卵孵化出无节幼体后第一天添加金丽假交替单胞菌cdm8发酵液，使其在水体中菌浓度达到0-108cfu/ml，第二天添加短小芽孢杆菌yh012和海水芽孢杆菌bc109发酵液，使短小芽孢杆菌yh012、海水芽孢杆菌bc109在水体中的浓度各达到0-108cfu/ml，连续添加两天。无节幼体变态为蚤状幼体后第一天添加金丽假交替单胞菌cdm8发酵液，使其在水体中菌浓度达到0-108cfu/ml，第二天添加短小芽孢杆菌yh012和海水芽孢杆菌bc109发酵液，使短小芽孢杆菌yh012、海水芽孢杆菌bc109在水体中的浓度各达到0-108cfu/ml，连续添加两天。蚤状幼体变态为糠虾幼体后第一天添加金丽假交替单胞菌cdm8发酵液，使其在水体中菌浓度达到0-108cfu/ml，第二天添加短小芽孢杆菌yh012和海水芽孢杆菌bc109发酵液，使短小芽孢杆菌yh012、海水芽孢杆菌bc109在水体中的浓度各达到0-108cfu/ml，连续添加两天。糠虾幼体变态为仔虾幼体后第一天添加金丽假交替单胞菌cdm8发酵液，使其在水体中菌浓度达到0-108cfu/ml，第二天添加短小芽孢杆菌yh012和海水芽孢杆菌bc109发酵液，使短小芽孢杆菌yh012、海水芽孢杆菌bc109在水体中的浓度各达到0-108cfu/ml，连续添加两天。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)此菌株组合使用可增加凡纳滨对虾苗种培育池水体有益微生物数量，减少水体中弧菌的数量，改善水体微生物结构，增强凡纳滨对虾幼体的免疫水平，特别是提高凡纳滨对虾苗种出苗率。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通或改变都落入本发明保护范围；且下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：
金丽假交替单胞菌的筛选及应用
本发明的金丽假交替单胞菌(pseudoalteromonasflavipulchra)cdm8菌株筛选自凡纳滨对虾消化道。将采集的健康对虾样品放在盛有海水的充气袋中运回实验室。无菌操作台上用75％的酒精擦拭活虾体表进行消毒，无菌操作将活虾解剖，取出对虾肠道组织。将取出的肠道组织用无菌的pbs(ph＝7.0)缓冲液冲洗3-4次后，用无菌研磨棒研磨均匀。之后用无菌pbs缓冲液适当稀释，取0.1ml涂布于2216e固体培养基上，倒置于28℃恒温培养箱中培养16h-20h。观察2216e平板上细菌的菌落形态，对菌落形态一致的细菌进行编号，无菌条件下用接种环挑取优势菌单菌落接种于2216e海水固体培养基中进行反复纯化培养。纯化后的单菌落接种于2216e海水液体培养基，在转速为180rpm/min，28℃振荡培养箱中培养16h-20h，取0.8ml菌悬液放入保种管中，再加入0.2ml的70％灭菌甘油，混匀，用封口膜封好，放于-80℃冰箱保存。
筛选的金丽假交替单胞菌cdm8在2216e经28℃培养24h左右可形成典型的菌落，菌落形态：单个菌落圆形，淡黄色，湿润，半透明，单个呈短链状排列，边缘整齐，易挑取，直径为1-2mm。
生理生化特性：d-葡萄糖、5-酮基葡糖酸盐、脂酶、赖氨酸脱羧酶、l-阿拉伯醇、l-阿拉伯糖、d-甘露醇、肌醇、丙二酸盐、d-半乳糖酸盐同化、d-阿拉伯醇、d-纤维二糖、l-天冬氨酸方胺酶、侧金盏花醇等api反应阴性，d-海藻糖、α-葡萄糖苷酶、d-麦芽糖、古老糖等api反应阳性。
金丽假交替单胞菌cdm8菌株可用于制备金丽假交替单胞菌cdm8发酵菌液。
金丽假交替单胞菌cdm8发酵菌液制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于2216e固体培养基，在28℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于lb培养液中，28℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于金丽假交替单胞菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在37℃；当发酵液od600值达到1.2～1.4时，终止发酵，获得发酵菌液；发酵液中金丽假交替单胞菌cdm8活菌浓度≥109cfu/ml。
金丽假交替单胞菌cdm8的发酵液成分质量百分比为：大豆蛋白胨，1.5％；蔗糖，1.0％；氯化钠，2.5％；磷酸高铁，0.001％；硫酸镁，0.02％；硫酸锰，0.05％。
将暂养7天的实验对虾随机置于容积为50l的8只白色整理箱中，分为饲料中添加金丽假交替单胞菌的实验组(饲料中活菌浓度为106cfu/ml)和未添加益生菌的普通商业饲料的对照组，每组4个重复，每个重复包含25尾对虾。每日投喂三次，投喂量为虾体重的3％，每日9:00换水一次，养殖实验共持续28天，之后挑选个体大小相近的20尾虾，采用反式注射法进行副溶血弧菌的感染实验，以0.04％酚红溶液作为颜色指示剂，每尾对虾注射1×107cfu/ml的菌液50μl。凡纳滨对虾感染副溶血弧菌后的累计死亡率结果显示，感染后的前3h，对照组与实验组累计死亡率之间的差异并不显著(p＞0.05)，感染后3h-9h，各组对虾的累计死亡率都呈显著增长的趋势，且实验组和对照组相比死亡率明显减低，且差异显著(p＜0.05)，感染9h后，凡纳滨对虾的累计死亡率逐渐趋于稳定，感染实验结束后对照组的累计死亡率达到95.0％，而实验组的累计死亡率只有30.0％，差异显著。即饲料中添加金丽假交替单胞菌cdm8可显著降低副溶血弧菌攻毒后凡纳滨对虾的累计死亡率。
实施例2
短小芽孢杆菌的筛选及应用
本发明的短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)yh012菌株筛选自凡纳滨对虾消化道。将采集的健康对虾样品放在盛有海水的充气袋中运回实验室。无菌操作台上用75％的酒精擦拭活虾体表进行消毒，无菌操作将活虾解剖，取出对虾肠道组织。将取出的肠道组织用无菌的pbs(ph＝7.0)缓冲液冲洗3-4次后，用无菌研磨棒研磨均匀。之后用无菌pbs缓冲液适当稀释，取0.1ml涂布于2216e固体培养基上，倒置于28℃恒温培养箱中培养16h-20h。观察2216e平板上细菌的菌落形态，对菌落形态一致的细菌进行编号，无菌条件下用接种环挑取优势菌单菌落接种于2216e海水固体培养基中进行反复纯化培养。纯化后的单菌落接种于2216e海水液体培养基，在转速为180rpm/min，28℃振荡培养箱中培养16h-20h，取0.8ml菌悬液放入保种管中，再加入0.2ml的70％灭菌甘油，混匀，用封口膜封好，放于-80℃冰箱保存。
筛选的短小芽孢杆菌在2216e培养基上的菌落形态：菌落直径约1-2mm，菌落呈圆形，乳白色、不透明，表面呈蜡状，有凸起且边缘整齐。
碳源利用情况为d-葡萄糖、l-阿拉伯醇、d-甘露醇、丙二酸盐、d-阿拉伯醇、l-天冬氨酸方胺酶、精氨酸双水解酶、β-葡萄糖苷酶、α-麦芽糖、β-n-乙酰葡萄糖胺、l-鼠李糖、鸟氨酸脱羧酶等api反应阴性，脂酶、d-海藻糖、d-麦芽糖、蔗糖等api反应阳性。
短小芽孢杆菌yh012菌株可用于制备短小芽孢杆菌yh012发酵菌液。
短小芽孢杆菌yh012发酵菌液制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于2216e固体培养基，在28℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216e培养液中，37℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于短小芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在37℃；当发酵液od600值达到1.2～1.4时，终止发酵，获得发酵菌液；发酵液中短小芽孢杆菌yh012活菌浓度≥109cfu/ml。
短小芽孢杆菌yh012的发酵液成分质量百分比为：蛋白胨，0.5％；酵母粉，0.1％；蔗糖，1.5％；氯化钠，2.5％；硫酸铁，0.05％；硫酸镁，0.004％；硫酸锰，0.01％。
将暂养7天的实验对虾随机置于容积为50l的8只白色整理箱中，分为饲料中添加短小芽孢杆菌yh012的实验组(饲料中活菌浓度为106cfu/ml)和未添加益生菌的普通商业饲料的对照组，每组2个重复，每个重复包含25尾对虾。每日投喂三次，投喂量为虾体重的3％，每日9:00换水一次，养殖实验共持续21天。养殖实验期间于第7，14，21天各取实验组和对照组的对虾2尾，用酒精棉球在虾的体表擦拭，无菌操作分离虾的肠道，加入pbs缓冲液后研磨，再依次以10倍梯度稀释，选取合适稀释度涂布至tsa和tcbs的平板，28℃培养24h后观察和记录可培养细菌数量及弧菌数量。弧菌数占可培养细菌总数的比例分析结果显示：实验的第7天，实验组为4.83％，对照组为6.94％；第14天，实验组为0.93％，对照组为5.58％；第21天时，实验组只有0.42％，对照组为4.03％；均呈显著性差异。证实饲料中添加短小芽孢杆菌yh012可以在不影响细菌总量的基础上来降低凡纳滨对虾肠道内的弧菌的数量。
实施例3
海水芽孢杆菌的筛选及应用
本发明的海水芽孢杆菌(bacillusaquimaris)bc109菌株筛选自凡纳滨对虾养殖池塘水体。选择凡纳滨对虾生长正常的养殖池塘，使用3个水样采集器分表采集上层、中层、下层水样，马上运回实验室。无菌操作台上混合水样，取0.1ml涂布于2216e固体培养基上，倒置于28℃恒温培养箱中培养16h-20h。观察2216e平板上细菌的菌落形态，对菌落形态一致的细菌进行编号，无菌条件下用接种环挑取优势菌单菌落接种于2216e海水固体培养基中进行反复纯化培养。纯化后的单菌落接种于2216e海水液体培养基，在转速为180rpm/min，28℃振荡培养箱中培养16h-20h，取0.8ml菌悬液放入保种管中，再加入0.2ml的70％灭菌甘油，混匀，用封口膜封好，放于-80℃冰箱保存。
筛选的海水芽孢杆菌在2216e平板上经37℃培养24h左右即可形成典型菌落，单个菌落呈圆形，中间略微凸起，直径在2mm左右。进行革兰氏染色镜检，为革兰氏阳性，细胞呈球杆状，有椭圆芽孢，且有一根端极鞭毛。
biolog碳源利用情况：在培养6h和24h能够利用α-环式糊精、α-d-葡萄糖、β-环式糊精、β-甲基-d-葡萄糖苷、n-乙酰-β-d-甘露糖胺、n-乙酰-d-葡萄糖胺、d-阿洛酮糖、d-核糖、d-木糖、d-海藻糖、d-甘露醇、d-果糖、l-阿拉伯糖、l-丙氨酰-甘氨酸、l-丙氨酸、l-丝氨酸、l-谷氨酸、2'-脱氧腺苷麦芽糖、3-甲基-d-葡萄糖、丙酮酸、甘油/丙三酸、麦芽三糖、蔗糖、甘露聚糖、胸苷、尿苷、肌苷/次黄苷等碳源。
海水芽孢杆菌bc109菌株可用于制备海水芽孢杆菌bc109发酵菌液。
海水芽孢杆菌bc109发酵菌液制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于2216e固体培养基，在28℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216e培养液中，37℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于海水芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在33℃；当发酵液od600值达到1.2～1.4时，终止发酵，获得发酵菌液；发酵液中海水芽孢杆菌bc109活菌浓度≥109cfu/ml。
海水芽孢杆菌bc109的发酵液成分质量百分比为：蛋白胨，0.75％；酵母粉，0.2％；氯化钠，1.0％；硫酸铁，0.01％；氯化钙，0.03％。
将将暂养的凡纳滨对虾随机分为16组，每组25尾对虾，分别置于容积为30l的白色整理箱中，其中有效水体体积为20l。按芽孢杆菌终浓度设置为104cfu/ml组、105cfu/ml组和106cfu/ml组三个实验组和一个空白对照组，每组3个重复。养殖实验共持续30d。在实验开始后的第0，5，10，15天于早上8：00分别于每个实验组取水样5ml，以实验用海水为空白对照，对水样进行亚硝酸氮含量的测定，采用的方法为盐酸-萘乙二胺分光光度法测定法。养殖水体中亚硝酸氮含量的测定结果显示：在实验开始前5天波动较小，5天之后各实验组和对照组总体呈缓慢增长趋势，但各实验组亚硝酸氮含量均低于对照组，且在第15天时三个实验组的亚硝酸氮含量分别为2.84±0.96mg/l，1.93±0.55mg/l，1.53±0.28mg/l，显著低于对照组的亚硝酸氮含量3.68±0.06mg/l(p＜0.05)，但各实验组之间亚硝酸氮含量差异并不显著(p＞0.05)。证实凡纳滨对虾养殖水体中添加海水芽孢杆菌可有效降低水体中亚硝酸氮的含量。
实施例4：
将凡纳滨对虾受精卵孵化而成的无节幼体随机分到装有75l过滤海水(预先加入4×10-6edta-2na,充气并预热)的pvc桶中，每桶1.5万尾，密度为20万尾/m3。蚤状幼体开始投喂配合饲料,每天投喂12次；实验期间水温根据变态发育的需要从30℃逐渐升温到33℃；实验期间育苗水体充气,充气量大小随幼体大小进行调整。实验设立实验组和对照组2个处理组，每组3个重复，实验组从无节幼体开始及每次变态后的第一天添加假交替单胞菌cdm8发酵液，使其在水体中菌浓度达到106cfu/ml。24小时后，添加短小芽孢杆菌yh012和海水芽孢杆菌bc109发酵液，使其在水体中的浓度各达到0.5×106cfu/ml，连续添加两天。对照组不添加任何益生菌。实验持续一个完整的苗种培育周期，分别统计无节幼体到蚤状幼体、蚤状幼体到糠虾幼体、糠虾幼体到仔虾幼体的变态率。到仔虾幼体第5天(p5)结束实验，记录每个实验组和对照组的存活幼体，统计存活率。
实验期间各发育期幼体变态率见下表，从表中数据可以看出：实验组蚤状幼体期变态率相较于对照组显著提高(p<0.05)，糠虾幼体期和仔虾幼体期实验组实验组的变态率高于对照组，但差异不显著。到实验结束时，实验组的平均存活率为56.30％，对照组为40.89％，实验组的存活率相较于对照组提升了15.41％，差异显著(p<0.05)。
实施例5：
将凡纳滨对虾受精卵孵化而成的无节幼体随机分到装有75l过滤海水(预先加入4×10-6edta-2na,充气并预热)的pvc桶中，每桶1.5万尾，密度为20万尾/m3。蚤状幼体开始投喂配合饲料,每天投喂12次；实验期间水温根据变态发育的需要从30℃逐渐升温到33℃；实验期间育苗水体充气,充气量大小随幼体大小进行调整。实验设立实验组和对照组2个处理组，每组3个重复，实验组从无节幼体开始及每次变态后的第一天添加假交替单胞菌cdm8发酵液，使其在水体中菌浓度达到106cfu/ml。24小时后，添加短小芽孢杆菌yh012和海水芽孢杆菌bc109发酵液，使其在水体中的浓度各达到0.5×106cfu/ml，连续添加两天。对照组不添加任何益生菌。实验持续一个完整的苗种培育周期，每个幼体期各取实验组和对照组的混合水样100毫升和幼体20尾；幼体经无菌海水反复冲洗，加入pbs缓冲液后研磨；水样和幼体依次以10倍梯度稀释，选取合适稀释度涂布至tsa和tcbs的平板，28℃培养24h后观察和记录可培养细菌数量及弧菌数量。
育苗水体和各期幼体弧菌数占可培养细菌总数的比例的分析结果见下表1和表2。随着幼体的发育，水体中弧菌数量占可培养细菌总数的比例逐步提高，但各期幼体实验组显著低于对照组，约为对照组的1/3-1/2。随着幼体的发育，幼体体内弧菌数量占可培养细菌总数的比例逐步降低，而且各期幼体实验组显著低于对照组，蚤状幼体期比例最高，为对照组的1/2，到仔虾幼体期，仅为对照组的1/4.5。按照本实施例在凡纳滨对虾苗种培育过程中添加益生菌可有效控制育苗水体和幼体体内的弧菌数量。
表1各幼体发育期水体中弧菌数量占总可培养细菌总数的比例
表2各幼体发育期幼体体内弧菌数量占总可培养细菌总数的比例