本发明涉及法医学技术领域，具体涉及基于二代测序技术检测X-STR基因座的试剂盒及其专用引物组合。
背景技术：
在现代法医学中，DNA物证起着重要的作用，而且将随着技术的发展而变得越发重要。当前，DNA物证主要是利用毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)针对STR基因座进行长度多态性方面的分型检测。但是CE只能对基因座的长度进行分型，核苷酸数量相等的所有等位基因被认为是同一个等位基因，容易导致一些序列不同但长度相同的等位基因被判别为同一等位基因，而且侧翼部分存在的序列差异也无法检测并利用，这些都严重影响案件中不同个体的识别。近年来，二代测序(Next generation sequencing，NGS)技术逐渐应用于法医学STR分型研究。相比于CE分型，NGS技术在STR分析中具有很多优势：1、能够得出完整的STR的碱基序列，不同个体的STR基因座之间的差别一目了然；2、能够全部覆盖 STR基因座的每个碱基并通过产出的高测序深度保证数据的精确性；3、样本输入量低，对于微量样本以及高降解的样本的分型更具有优势；4、具有开放性，发现能力和寻找新信息能力上更胜一筹，对于STR基因座意味着新的分型以及新的突变；5、成本低，通过对每个样本检材添加标签一次可以同时对多个样本进行平行测序，既节约了时间又降低了测序成本。
人类的X染色体短串联重复(X-chromosome short tandem repeats，X-STR)是指存在于X染色体上非重组区的短串联重复片段。基因座具有伴性遗传的特征，其遗传特征既不同于常染色体，也不同于Y染色体，表现为性连锁特征，在某些亲缘关系鉴定中具有重要的参考价值。对于一些男女混合检材，由于男性X-STR只有一个等位基因，不能够完全覆盖女性的X-STR等位基因峰，进行X-STR分型比常染色体STR分型能取得更好的效果。对于父女关系和同父姐妹关系的鉴定，X-STR分型具有特殊的价值，若两被鉴定人的X-STR表型不同，即可排除亲缘关系。同时，X-STR对于某些亲缘关系，例如祖孙女、姑侄女等的鉴定也具有一定的作用。
目前已有的X染色体的商业化CE试剂盒有Investigator Argus X-12Kit(Fa.Qiagen) 和Mentype1Argus X-8PCR amplification kit(Biotype AG，Dresden，Germany)等，但由于只能测出其长度多态性，具有一定的局限性。Illumina公司也推出了包含X-STR的二代测序试剂盒，即ForenSeqTM DNA Signature Prep Kit，但其中只包含了7个X-STR基因座 (DXS10135、DXS8378、DXS7132、DXS10074、DXS10103、HPRTB和DXS7423)，且该试剂盒配套的数据分析程序只能针对试剂盒中固有基因座的测序数据进行分析，具有一定的局限性。鉴于X-STR的特殊性及CE的局限性，开发基于二代测序技术的检测X-STR基因座的试剂盒具有重要价值。
技术实现要素：
本发明的目的是进行X-STR分型。
本发明首先保护一种引物组合，该引物组合可由引物1、引物2、引物3、引物4、引物 5、引物6、引物7、引物8、引物9、引物10、引物11、引物12、引物13、引物14、引物 15、引物16、引物17、引物18、引物19、引物20、引物21、引物22、引物23、引物24、引物25、引物26、引物27、引物28、引物29、引物30、引物31和引物32组成。
所述引物1可为如下A1)或A2)：
A1)序列表中的序列1所示的单链DNA分子；
A2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子。
所述引物2可为如下A3)或A4)：
A3)序列表中的序列2所示的单链DNA分子；
A4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
所述引物3可为如下A5)或A6)：
A5)序列表中的序列3所示的单链DNA分子；
A6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。
所述引物4可为如下A7)或A8)：
A7)序列表中的序列4所示的单链DNA分子；
A8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。
所述引物5可为如下A9)或A10)：
A9)序列表中的序列5所示的单链DNA分子；
A10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。
所述引物6可为如下A11)或A12)：
A11)序列表中的序列6所示的单链DNA分子；
A12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。
所述引物7可为如下A13)或A14)：
A13)序列表中的序列7所示的单链DNA分子；
A14)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子。
所述引物8可为如下A15)或A16)：
A15)序列表中的序列8所示的单链DNA分子；
A16)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子。
所述引物9可为如下A17)或A18)：
A17)序列表中的序列9所示的单链DNA分子；
A18)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子。
所述引物10可为如下A19)或A20)：
A19)序列表中的序列10所示的单链DNA分子；
A20)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子。
所述引物11可为如下B1)或B2)：
B1)序列表中的序列11所示的单链DNA分子；
B2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子。
所述引物12可为如下B3)或B4)：
B3)序列表中的序列12所示的单链DNA分子；
B4)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子。
所述引物13可为如下B5)或B6)：
B5)序列表中的序列13所示的单链DNA分子；
B6)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子。
所述引物14可为如下B7)或B8)：
B7)序列表中的序列14所示的单链DNA分子；
B8)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子。
所述引物15可为如下B9)或B10)：
B9)序列表中的序列15所示的单链DNA分子；
B10)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子。
所述引物16可为如下B11)或B12)：
B11)序列表中的序列16所示的单链DNA分子；
B12)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子。
所述引物17可为如下B13)或B14)：
B13)序列表中的序列17所示的单链DNA分子；
B14)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子。
所述引物18可为如下B15)或B16)：
B15)序列表中的序列18所示的单链DNA分子；
B16)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子。
所述引物19可为如下B17)或B18)：
B17)序列表中的序列19所示的单链DNA分子；
B18)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的DNA分子。
所述引物20可为如下B19)或B20)：
B19)序列表中的序列20所示的单链DNA分子；
B20)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子。
所述引物21可为如下C1)或C2)：
C1)序列表中的序列21所示的单链DNA分子；
C2)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子。
所述引物22可为如下C3)或C4)：
C3)序列表中的序列22所示的单链DNA分子；
C4)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子。
所述引物23可为如下C5)或C6)：
C5)序列表中的序列23所示的单链DNA分子；
C6)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相同功能的DNA分子。
所述引物24可为如下C7)或C8)：
C7)序列表中的序列24所示的单链DNA分子；
C8)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的DNA分子。
所述引物25可为如下C9)或C10)：
C9)序列表中的序列25所示的单链DNA分子；
C10)将序列25经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列25具有相同功能的DNA分子。
所述引物26可为如下C11)或C12)：
C11)序列表中的序列26所示的单链DNA分子；
C12)将序列26经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列26具有相同功能的DNA分子。
所述引物27可为如下C13)或C14)：
C13)序列表中的序列27所示的单链DNA分子；
C14)将序列27经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列27具有相同功能的DNA分子。
所述引物28可为如下C15)或C16)：
C15)序列表中的序列28所示的单链DNA分子；
C16)将序列28经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列28具有相同功能的DNA分子。
所述引物29可为如下C17)或C18)：
C17)序列表中的序列29所示的单链DNA分子；
C18)将序列29经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列29具有相同功能的DNA分子。
所述引物30可为如下C19)或C20)：
C19)序列表中的序列30所示的单链DNA分子；
C20)将序列30经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列30具有相同功能的DNA分子。
所述引物31可为如下D1)或D2)：
D1)序列表中的序列31所示的单链DNA分子；
D2)将序列31经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列31具有相同功能的DNA分子。
所述引物32可为如下D3)或D4)：
D3)序列表中的序列32所示的单链DNA分子；
D4)将序列32经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列32具有相同功能的DNA分子。
所述引物组合中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述引物7、所述引物8、所述引物9、所述引物10、所述引物11、所述引物12、所述引物13、所述引物14、所述引物15、所述引物16、所述引物17、所述引物18、所述引物19、所述引物20、所述引物21、所述引物22、所述引物23、所述引物24、所述引物25、所述引物26、所述引物27、所述引物28、所述引物29、所述引物30、所述引物31和所述引物32的摩尔比具体可为1：1：1：1：1：1：1：1：2：2：2：2：1：1：2：2：1：1：2： 2：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1。
本发明还保护一种基于X-STR基因座的复合扩增体系，可包括上述任一所述引物组合。
所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述引物 7、所述引物8、所述引物13、所述引物14、所述引物17、所述引物18、所述引物21、所述引物22、所述引物23、所述引物24、所述引物25、所述引物26、所述引物27、所述引物 28、所述引物29、所述引物30、所述引物31和所述引物32在所述复合扩增体系中的浓度具体可为0.3μM。
所述引物9、所述引物10、所述引物11、所述引物12、所述引物15、所述引物16、所述引物19和所述引物20在所述复合扩增体系中的浓度具体可为0.6μM。
所述复合扩增体系还可包括进行PCR扩增反应所需的试剂；所述“进行PCR扩增反应所需的试剂”不包括PCR扩增反应所需的引物。
上述任一所述复合扩增体系可包括Master Mix、引物组合的水溶液和人类基因组DNA(作为模板)。
上述任一所述复合扩增体系可为20μL，包括10μL Master Mix、4μL引物组合的水溶液和1ng人类基因组DNA(作为模板)。
上述任一所述复合扩增体系可为20μL，具体可由10μL Master Mix、4μL引物组合的水溶液、2.5μL浓度为0.425ng/mL的女性口腔上皮细胞的基因组DNA水溶液和3.5μL ddH2O组成。
上述任一所述Master Mix具体可为公安部物证鉴定中心产品。
本发明还保护一种试剂盒，其可含有上述任一所述引物组合或上述任一所述复合扩增体系；所述试剂盒的用途可为如下(h1)或(h2)或(h3)或(h4)：(h1)X-STR分型；(h2) SNP分型；(h3)Indel分型；(h4)检测遗传标记。
本发明还保护上述任一所述复合扩增体系或所述试剂盒的制备方法；该制备方法可包括将上述任一所述引物组合中的各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护上述任一所述引物组合或上述任一所述复合扩增体系在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途可为如下(h1)或(h2)或(h3)或(h4)：(h1)X-STR分型；(h2) SNP分型；(h3)Indel分型；(h4)检测遗传标记。
本发明还保护上述任一所述引物组合或上述任一所述复合扩增体系在检测X-STR分型和 /或SNP分型和/或Indel分型和/或检测遗传标记中的应用。
本发明还保护一种检测待测样本X-STR基因座的基因型的方法，具体可包括如下步骤：
(1)以待测样本的基因组DNA为模板，采用上述任一所述引物组合进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物；
(2)将所述PCR扩增产物进行二代测序，根据测序结果判断X-STR基因座的基因型。
上述方法中，所述X-STR基因座可为DXS6804、DXS10079、GATA31E08、GATA172D05、 DXS7423、DXS7424、DXS8378、DXS9895、DXS7132、DXS7133、DXS6789、DXS101、DXS6800、 GATA165B12、DXS9902和DXS6799中的16个、任意15个、任意14个、任意13个、任意12 个、任意11个、任意10个、任意9个、任意8个、任意7个、任意6个、任意5个、任意 4个、任意3个、任意2个或任意1个。
上述方法中，所述待测样本可为人口腔上皮细胞。
相比于illumina公司的ForenSeqTM DNA Signature Prep Kit，本发明提供的基于二代测序技术的检测X-STR基因座的试剂盒中包含16个X-STR基因座，提供更多新的遗传信息。而且本发明提供的复合扩增体系中所有X-STR基因座的最大扩增子长度都小于300bp，有利于降解检材的分析。实验证明，采用本发明提供的基于二代测序技术检测X-STR基因座的试剂盒检测女性口腔上皮细胞的基因组DNA中16个X-STR基因座的STR分型，分型结果准确。本发明提供的试剂盒具有重要的应用价值。
附图说明
图1为各个X-STR基因座对应的引物在hg19人类参考基因组中的PCR扩增产物的长度。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
Agencourt AMPure XP 5mL Kit为Beckman Coulter公司的产品，产品目录号为A63880。 NanoDrop 2000定量仪为Thermo Fisher Scientific公司的产品。Miseq FGx二代测序仪为 Illumina公司的产品。TruSeq DNA PCR-Free HT Library Prep Kit为Illumina公司的产品，产品目录号为FC-121-3003。KAPA Library Quantification Kit为KAPA公司的产品，产品目录号为KK4824。
实施例1、基于二代测序技术的检测X-STR基因座的试剂盒的制备
一、引物组合的制备
引物组合由32条引物组成，用于检测16个X-STR基因座。各个X-STR基因座的名称、扩增X-STR基因座对应的引物名称、引物的核苷酸序列和等位基因基因型的范围等信息详见表1。各个X-STR基因座对应的引物在hg19人类参考基因组(hg19人类基因组的信息见网址http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/hg19.2bit)中的 PCR扩增产物的长度和核苷酸序列详见表2。
表1
表2
二、基于二代测序技术的检测X-STR基因座的试剂盒的制备
基于二代测序技术的检测X-STR基因座的试剂盒包括引物混合物。引物混合物由步骤一制备的32条引物混合而成。
实施例2、基于二代测序技术检测X-STR基因座的试剂盒的应用
一、DNA样本准备
提取一女性口腔上皮细胞样本的基因组DNA，然后用超纯水稀释，获得浓度为 0.425ng/μL的女性口腔上皮细胞的基因组DNA水溶液。
二、文库制备
1、PCR扩增
以步骤一获得的女性口腔上皮细胞的基因组DNA水溶液为模板，以实施例1步骤二制备的引物混合物为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应体系为20μL，由10μL Master Mix(公安部物证鉴定中心的产品)、4μL引物混合物、2.5μL女性口腔上皮细胞的基因组DNA水溶液和3.5μL ddH2O组成。该反应体系中，引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6、引物7、引物8、引物13、引物14、引物 17、引物18、引物21、引物22、引物23、引物24、引物25、引物26、引物27、引物28、引物29、引物30、引物31和引物32的浓度均为0.3μM，引物9、引物10、引物11、引物 12、引物15、引物16、引物19和引物20的浓度均为0.6μM。
反应程序：95℃11min；94℃30s，60℃2min，72℃1min，28个循环；60℃60min； 4℃保存。
2、纯化和定量
(1)取PCR扩增产物，按照Agencourt AMPure XP 5mL Kit的说明书步骤进行纯化。
(2)完成步骤(1)后，将PCR扩增产物采用NanoDrop 2000定量仪进行定量，得到 PCR纯化产物。
3、文库制备
取PCR纯化产物，按照TruSeq DNA PCR-Free HT Library Prep Kit的说明书操作步骤依次进行末端修复、末端修复产物纯化、连接A-tail、连接Adapter和连接产物的纯化，然后按照KAPA Library Quantification Kit的说明书步骤进行文库定量及文库标准化，完成文库制备。
三、上样测试
取步骤二制备的文库，利用测序试剂Miseq Reagent Nano Kit v2(illumina公司的产品)在Miseq FGx二代测序仪进行测序。
实验结果见表3。结果表明，该女性口腔上皮细胞样本的基因组DNA得到了完整的STR 分型，完全能够满足法医STR检验的要求。
表3
实施例3、基于二代测序技术的检测X-STR基因座的试剂盒的准确性验证
一、DNA样本准备
提取一女性口腔上皮细胞样本的基因组DNA，然后用超纯水稀释，获得浓度为0.425ng/μL的女性口腔上皮细胞的基因组DNA水溶液。
二、毛细管电泳检测
取1ng步骤一获得的女性口腔上皮细胞的基因组DNA，按照DNATyper X19(公安部物证鉴定中心的产品)的说明书步骤进行毛细管电泳检测，得到基因座的等位基因基因型。分型结果详见表4第2列。
三、二代测序技术检测
按照实施例2的方法检测步骤一获得的女性口腔上皮细胞的基因组DNA，得到基因座的等位基因基因型。分型结果详见表4第3列。
结果表明，实施例1制备的基于二代测序技术检测X-STR基因座的试剂盒与DNATyper X19 重合的基因座，在步骤一获得的女性口腔上皮细胞的基因组DNA中的分型结果完全一致。
表4
注：“--”表示不存在。
<110> 公安部物证鉴定中心
<120> 基于二代测序技术的检测X-STR基因座的试剂盒及其专用引物组合
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
cccagatatt ttgaccacca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
cactagagtc ccaccacaca 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
tgggtgacca agtgagacc 19
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
ggcctgtagt tttctttctt tctc 24
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
cagagctggt gatgatagat ga 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
cagctgacag agcacagaga 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
agtggtgatg gttgcacaga 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
tgaaagcccg gattcaaa 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
tagcgcctgg cacatagtag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
agatttcctc cccatccatc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
ggaacacgca catttgagaa 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
ctgggaaaca caggaagacc 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 13
cgacaagagc gaaactcca 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>
<400> 14
tccatcctgg gacagttcac 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 15
tggctctgct caaggaatta 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 16
ttgggtgggg acacagag 18
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 17
ccagagaaac agaaccaata gga 23
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 18
tcccctctca tctatctgac tg 22
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 19
ttttaggtgt agcttcctta gatgg 25
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 20
catcttccaa gaatcagaag tctc 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 21
acagaaccaa taggagatag atgg 24
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 22
cctcgtgatc atgtaagttg g 21
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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