本发明涉及医学检测技术。更具体地，涉及一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法。
背景技术：
人类许多重大的疾病的发生往往与内源性糖肽的过表达相关。如抑郁症、癌症、老年痴呆症等。因此，内源性糖肽的检测具有重要的意义。然而内源性糖肽在体液中含量极少(丰度为pg/mL数量级)，其检测受高丰度蛋白(血液中蛋白约30-50mg/mL)、非糖肽等影响较大，因此在分析检测糖肽之前要先将糖肽从蛋白、非糖肽的混合物中分离、富集。目前糖肽富集的方法主要有：超滤、有机溶剂沉淀、固相萃取等。依靠超滤和有机溶剂沉淀的方法存在蛋白去除不彻底、糖肽回收率低、分离特异性差等问题。几年来，依靠固相萃取从溶液中富集糖肽的亲水材料得到了广泛的研究，这些材料表面的亲水基团和糖肽的结合较强。然而，目前仅仅依靠亲水材料富集糖肽，还存在效率较低的问题。
因此，发展新型的、高效的糖肽富集方法具有重大的科学意义以及实用价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法，该方法以不同孔径的多孔核壳微球作为基体材料，通过两步的方案实现糖肽的选择性富集；第一步用大孔核壳微球去除样品中的蛋白、非糖肽等杂质，第二步用小孔核壳微球富集糖肽。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法，包括以下步骤：
1)采用分散固相萃取模式(dSPE)，大孔核壳微球依次用洗脱液①活化和上样液①平衡；将样品溶解于上样液①中并与平衡后的大孔核壳微球混合，孵化，离心得上清液①，上清液①旋干，得到粉末；
2)采用分散固相萃取模式(dSPE)，小孔核壳微球依次用洗脱液②冲洗和上样液②平衡；将步骤1)得到的粉末①溶解于上样液②中并与平衡后的小孔核壳微球混合，孵化，离心弃上清液得沉淀②；沉淀②用淋洗液②冲洗，震荡后，再次离心弃上清液得吸附有糖肽的小孔核壳微球，用洗脱液②洗脱小孔核壳微球上吸附的糖肽，即可。
进一步，所述步骤2)还可以采用固相萃取模式(SPE)，小孔核壳微球装填到末端带有筛板的SPE小柱上依次用洗脱液②冲洗和上样液②平衡；将步骤1)旋干得到的粉末溶解于上样液②中并加载到装填有小孔核壳微球的末端带有筛板的SPE小柱上，用淋洗液②冲洗吸附有糖肽的小孔核壳微球，再用洗脱液②洗脱小孔核壳微球上吸附的糖肽，即可。
本发明方法以不同孔径的多孔核壳微球作为基体材料，通过两步的方案实现糖肽的选择性富集。第一步用大孔核壳微球去除样品中的蛋白、非糖肽等杂质，第二步用小孔核壳微球富集糖肽。
进一步，所述多孔核壳微球的直径为500nm～100μm；所述大孔核壳微球的平均孔径大小为20nm～100nm；所述小孔核壳微球的平均孔径大小为0.5nm～20nm。
进一步，所述大孔核壳微球和小孔核壳微球均为壳层为亲水聚合物、内核为疏水聚合物的多孔核壳微球。
其中，所述亲水聚合物包括但不局限于：聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚异丙基丙烯酰胺、聚N，N-亚甲基双丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯中一种或多种的共聚物；
所述疏水聚合物包括但不局限于：聚苯乙烯、聚二乙烯基苯、聚9-乙烯基蒽、聚α-甲基苯乙烯、聚4-氨基苯乙烯、聚1，2-二氯乙烯、聚邻-氯苯乙烯、聚4-乙烯基联苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚三氯乙烯、聚丙烯酸六氟丁酯、聚甲基丙烯酸六氟丁酯、聚乙烯基正丁醚、聚2-乙烯基萘、聚9-乙烯基咔唑、聚乙烯基环己烷、聚4-溴苯乙烯、聚环己基乙烯基醚一种或多种的共聚物。
进一步，上样液①组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积百分比为0-35％，缓冲盐溶液的浓度为0-200mM，pH在3-12范围内；
洗脱液①组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积百分比为20-90％，缓冲盐溶液的浓度为0-50mM，pH在3-12范围内。
上样液②组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积百分比为80-95％，缓冲盐溶液的浓度为0-50mM，pH在3-12范围内；
淋洗液②组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂所占的体积百分比为80-95％，缓冲盐溶液的浓度为0-50mM，pH在3-12范围内；
洗脱液②组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积百分比为0-70％，缓冲盐溶液的浓度为0-50mM，pH在3-12范围内。
其中，所述有机溶剂包括但不局限于乙腈、甲醇、乙醇中的一种或多种的混合物，所述缓冲盐包括但不局限于甲酸/甲酸铵、乙酸/乙酸铵、碳酸氢铵、Tris中一种或多种的混合物。
进一步，步骤1)采用dSPE模式，洗脱液①的体积为大孔核壳微球孔体积的3-500倍，上样液①体积为大孔核壳微球孔体积的3-500倍，样品的体积为大孔核壳微球孔体积的3-1000倍，淋洗液①体积为大孔核壳微球孔体积的2-1000倍。
步骤2)采用dSPE模式，洗脱液②的体积为小孔核壳微球孔体积的3-500倍，上样液②体积为小孔核壳微球孔体积的3-500倍，淋洗液②体积为小孔核壳微球孔体积的3-1000倍，洗脱液②体积为小孔核壳微球孔体积的5-100倍。
或步骤2)采用SPE模式，洗脱液②的体积为小孔核壳微球孔体积的2-50倍，上样液②体积为小孔核壳微球孔体积的2-50倍，淋洗液②体积为小孔核壳微球孔体积的2-100倍，洗脱液②体积为小孔核壳微球孔体积的2-30倍。
进一步，步骤1)和步骤2)所述孵化的温度为15-50℃，时间为3-180min。
进一步，步骤1)和步骤2)所述震荡的转速为100-2500rpm，时间为1-30min。
本发明中所用各原材料如无特殊说明均可通过商业市售购买获得。另外注意的是，如果没有特别说明，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及以端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
本发明的有益效果如下：
本发明提出一种普适的从大量蛋白、非糖肽的样品中富集痕量糖肽的方法。该方法基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法以不同孔径的多孔核壳微球作为基体材料，通过两步的方案实现糖肽的选择性富集。第一步用大孔核壳微球去除样品中的蛋白、非糖肽等杂质，第二步用小孔核壳微球富集糖肽。该方法过程简单、条件易控，适用于含有不同类型的蛋白、非糖肽、糖肽的样品，可用于与糖肽相关的疾病诊断、治疗等领域。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出实施例5富集的糖肽质谱图。
图2示出实施例10富集的糖肽质谱图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法
一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法，包括以下步骤：
1)在dSPE模式下，将50μL大孔聚二乙烯基苯-聚异丙基丙烯酰胺核壳微球(粒径6μm，平均孔径35nm)装入EP管中，分别用150μL 20％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)和甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)活化和平衡。将样品(10μL去盐旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)与300μg牛血清白蛋白)溶于1mL甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)中，和平衡后的大孔聚二乙烯基苯-聚异丙基丙烯酰胺核壳微球混匀，在温度为15℃孵化120min，离心取上清液①。上清液①旋干，得到粉末①。
2)在SPE模式下，将3μL小孔聚二乙烯基苯-聚异丙基丙烯酰胺核壳微球(粒径6μm，平均孔径5nm)装入末端带有筛板的SPE小柱上，分别用9μL40％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)和90％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)活化和平衡此材料。将步骤1)得到的粉末①溶解于60μL 90％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)中，并加载到装填有小孔核壳微球的末端带有筛板的SPE小柱上，用60μL 90％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)淋洗吸附有糖肽的小孔聚二乙烯基苯-聚异丙基丙烯酰胺核壳微球。最后用20μL40％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)洗脱小孔聚二乙烯基苯-聚异丙基丙烯酰胺核壳微球上吸附的糖肽。最后得到了14个糖肽分子。
实施例2一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法，包括以下步骤：
1)在dSPE模式下，将30μL大孔聚二乙烯基苯-聚异丙基丙烯酰胺核壳微球(粒径10μm，平均孔径20nm)装入EP管中，分别用150μL 40％乙腈/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)和乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)活化和平衡。将样品(10μL去盐旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)与300μg牛血清白蛋白)溶于1mL乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝6.0)中，和平衡后的大孔聚二乙烯基苯-聚异丙基丙烯酰胺核壳微球混匀，在温度为50℃孵化10min，离心取上清液①，上清液①旋干，得到粉末。
2)在SPE模式下，将3μL小孔聚二乙烯基苯-聚异丙基丙烯酰胺核壳微球(粒径10μm，平均孔径0.5nm)装入到末端带有筛板的SPE小柱上，分别用30μL 40％乙腈/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)和90％乙腈/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)活化和平衡此材料。将步骤1)旋干得到的粉末溶解于60μL 85％乙腈/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝6.0)中，并加载到装填有小孔聚二乙烯基苯-聚异丙基丙烯酰胺核壳微球的末端带有筛板的SPE小柱上，用60μL 85％乙腈/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝6.0)淋洗吸附有糖肽的小孔聚二乙烯基苯-聚异丙基丙烯酰胺核壳微球。最后用30μL 40％乙腈/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝6.0)洗脱小孔聚二乙烯基苯-聚异丙基丙烯酰胺核壳微球上吸附的糖肽。最后得到了11个糖肽分子。
实施例3一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法
一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法，包括以下步骤：
1)在dSPE模式下，将20μL大孔聚二乙烯基苯-聚甲基丙烯酰胺核壳微球(粒径100μm，平均孔径500nm)装入EP管中，分别用2000μL 50％乙腈碳酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝8.1)和3％乙腈/碳酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝8.1)活化和平衡此材料。将样品(10μL去盐旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)与300μg牛血清白蛋白)溶于1.5mL 3％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)中，和平衡后的大孔聚二乙烯基苯-聚异丙基丙烯酰胺核壳微球混匀，在温度40℃孵化90min，离心取上清液①，上清液①旋干，得到粉末①。
2)在dSPE模式下，将3μL小孔聚二乙烯基苯-聚甲基丙烯酰胺核壳微球(粒径100μm，平均孔径20nm)装入EP管中，分别用1500μL 40％甲醇/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)和85％甲醇/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)活化和平衡此材料。将步骤1)得到的粉末①溶解于100μL 90％甲醇/碳酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝8.1)中，并和平衡后的小孔聚二乙烯基苯-聚异丙基丙烯酰胺核壳微球混匀，在温度为15-50℃孵化40min，离心弃上清液得沉淀②。用100μL 83％甲醇/碳酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝8.1)淋洗沉淀②，混合以2500rpm转速震荡10min，离心弃上清液得吸附有糖肽的小孔聚二乙烯基苯-聚异丙基丙烯酰胺核壳微球。用40μL 40％乙腈/碳酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝8.1)洗脱小孔聚二乙烯基苯-聚异丙基丙烯酰胺核壳微球上吸附的糖肽，浓缩即可。最后得到了8个糖肽分子。
实施例4一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法
一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法，包括以下步骤：
1)在dSPE模式下，将50μL大孔聚苯乙烯-聚丙烯酰胺核壳微球(粒径500nm，平均孔径20nm)装入EP管中，分别用500μL 30％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)和碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)活化和平衡此材料。将样品(10μL去盐旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)与300μg牛血清白蛋白)溶于1.5mL碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)中，和平衡后的大孔聚苯乙烯-聚丙烯酰胺核壳微球混匀，在温度为30℃孵化50min，离心取上清液①，上清液①旋干，得到粉末①。
2)在SPE模式下，将3μL小孔聚二乙烯基苯-聚甲基丙烯酰胺核壳微球(粒径500nm，平均孔径0.5nm)装入到末端带有筛板的SPE小柱上，分别用30μL 40％乙腈/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)和90％乙腈/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)活化和平衡此材料。将步骤1)得到的粉末①溶解于60μL 90％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)中，并加载到装填有小孔聚二乙烯基苯-聚甲基丙烯酰胺核壳微球的末端带有筛板的SPE小柱上，用60μL 90％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)淋洗吸附有糖肽的聚二乙烯基苯-聚甲基丙烯酰胺核壳微球。最后用60μL 40％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)洗脱聚二乙烯基苯-聚甲基丙烯酰胺核壳微球材料上吸附的糖肽。最后得到了18个糖肽分子。
实施例5一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法
一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法，包括以下步骤：
1)在dSPE模式下，将30μL大孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-聚甲基丙烯酰胺核壳微球(粒径28μm，平均孔径50nm)装入EP管中，分别用600μL 30％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为10mM，pH＝8.4)和碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为10mM，pH＝8.4)活化和平衡此材料。将样品(10μL去盐旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)与300μg牛血清白蛋白)溶于1mL碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)中，和平衡后的大孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-甲基聚丙烯酰胺核壳微球混匀，在温度为30℃孵化100min，离心取上清液①，上清液①旋干，得到粉末①。
2)在dSPE模式下，将3μL小孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-聚甲基丙烯酰胺核壳微球(粒径28μm，平均孔径7nm)装入EP管中，分别用15μL 55％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)活化及平衡。将步骤1)旋干得到的粉末溶解于100μL 85％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/mL，pH＝8.4)中，并和平衡后的小孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-甲基聚丙烯酰胺核壳微球混匀，在温度为50℃孵化40min，离心弃上清液得沉淀②。用100μL 83％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/mL，pH＝8.4)淋洗沉淀②，混合震荡10min以2500rpm转速震荡20min，离心弃上清液得吸附有糖肽的小孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-甲基聚丙烯酰胺核壳微球。用40μL 65％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/mL，pH＝8.4)洗脱小孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-甲基聚丙烯酰胺核壳微球上吸附的糖肽，浓缩即可。结果如图1所示，得到了28个糖肽分子。
实施例6一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法
一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法，包括以下步骤：
1)在dSPE模式下，将100μL大孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-聚甲基丙烯酰胺核壳微球(粒径60μm，平均孔径100nm)装入EP管中，分别用1000μL 40％乙腈/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)和乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)活化和平衡此材料。将样品(10μL去盐旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)与1mg牛血清白蛋白)溶于2mL乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)中，和平衡后的大孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-聚甲基丙烯酰胺核壳微球混匀，在温度为35℃孵化100min，离心取上清液①，上清液①旋干，得到粉末①。
2)在SPE模式下，将3μL小孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酰胺核壳微球(粒径60μm，平均孔径10nm)装入到末端带有筛板的SPE小柱上，分别用15μL 60％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)和90％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)活化和平衡此材料。将步骤1)得到的粉末①溶解于600μL 85％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)中，并加载到装填有小孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酰胺核壳微球的末端带有筛板的SPE小柱上，用600μL 80％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)淋洗吸附有糖肽的小孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-聚甲基丙烯酰胺核壳微球。最后用20μL 60％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)洗脱小孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-聚甲基丙烯酰胺核壳微球上吸附的糖肽。最后得到了4个糖肽分子。
实施例7一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法
一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法，包括以下步骤：
1)在dSPE模式下，将50μL大孔聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球(粒径3μm，平均孔径45nm)装入EP管中，分别用150μL 40％乙腈/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)和乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)活化和平衡此材料。将样品(10μL去盐旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)与1mg牛血清白蛋白)溶于2mL乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝6.0)中，和平衡后的大孔聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球混匀，在温度为45℃孵化90min，离心取上清液①，上清液①旋干，得到粉末①。
2)在SPE模式下，将3μL小孔聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球(粒径3μm，平均孔径5nm)装入到末端带有筛板的SPE小柱上，分别用30μL 60％乙腈/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)和80％乙腈/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)活化和平衡此材料。将步骤1)旋干得到的粉末①溶解于60μL 85％乙腈/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝6.0)中，并加载到装填有小孔聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球的末端带有筛板的SPE小柱上，用60μL 80％乙腈/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝6.0)淋洗吸附有糖肽的小孔聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球。最后用20μL 60％乙腈/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝6.0)洗脱小孔聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球上吸附的糖肽。最后得到了6个糖肽分子。
实施例8一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法
一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法，包括以下步骤：
1)在dSPE模式下，将50μL大孔聚氯乙烯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球(粒径4.5μm，平均孔径120nm)装入EP管中，分别用150μL 40％乙腈/Tris缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝7.0)和Tris缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝7.0)(缓冲盐浓度为20mM，pH＝7.0)活化和平衡此材料。将样品(10μL去盐旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)与1mg牛血清白蛋白)溶于1.5mL 3％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)中，和平衡后的大孔聚氯乙烯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球混匀，在温度为20℃孵化110min，离心取上清液①，上清液①旋干，得到粉末①。
2)在dSPE模式下，将3μL小孔聚氯乙烯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球(粒径4.5μm，平均孔径13nm)装入EP管中，分别用300μL 50％乙腈/Tris缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝7.0)和90％乙腈/Tris缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝7.0)活化和平衡此材料。将步骤1)旋干得到的粉末①溶解于100μL 80％乙腈/Tris缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝7.0)中，并和小孔聚氯乙烯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球混匀，在温度为30℃孵化40min，离心弃上清液得沉淀②。用100μL 83％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)淋洗沉淀②，混合以1700rpm转速震荡10min，离心弃上清液得吸附有糖肽的小孔聚氯乙烯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球材料。用40μL 65％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝4.8)洗脱小孔聚氯乙烯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球上吸附的糖肽，浓缩即可。最后得到了15个糖肽分子。
实施例9一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法
一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法，包括以下步骤：
1)在dSPE模式下，将50μL大孔聚甲基丙烯酸乙酯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球(粒径68μm，平均孔径500nm)装入EP管中，分别用2000μL 40％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)和90％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)活化和平衡此材料。将样品(10μL去盐旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)与1mg牛血清白蛋白)溶于1.5mL碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)中，和大孔聚甲基丙烯酸乙酯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球混匀，在温度为25℃孵化90min，离心取上清液①，上清液①旋干，得到粉末①。
2)在SPE模式下，将3μL小孔聚甲基丙烯酸乙酯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球(粒径68μm，平均孔径17nm)装入到末端带有筛板的SPE小柱上，分别用300μL 50％乙腈/Tris缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝7.0)和90％乙腈/Tris缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝7.0)活化和平衡此材料。将步骤1)旋干得到的粉末①溶解于60μL 85％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)中，并加载到装填有小孔聚甲基丙烯酸乙酯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球的末端带有筛板的SPE小柱上，用60μL 80％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)淋洗吸附有糖肽的小孔聚甲基丙烯酸乙酯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球。最后用20μL 60％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)洗脱小孔聚甲基丙烯酸乙酯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酸羟乙酯核壳微球上吸附的糖肽。最后得到了11个糖肽分子。
实施例10一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法
一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法，包括以下步骤：
1)在dSPE模式下，将50μL大孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酰胺核壳微球(粒径5μm，平均孔径24nm)装入EP管中，分别用150μL 40％乙醇/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)和乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝6.0)活化和平衡此材料。将样品(10μL去盐旋干的胎球蛋白酶解物(1mg/mL)与1mg牛血清白蛋白)溶于1.5mL碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)中，和大孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酰胺核壳微球混匀，在温度为30℃孵化90min，离心取上清液①，上清液①旋干，得到粉末①。
2)在dSPE模式下，将5μL小孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酰胺核壳微球(粒径5μm，平均孔径2nm)装入EP管中，分别用300μL 50％乙醇/Tris缓冲溶液(缓冲盐浓度为20mM，pH＝7.0)和90％乙醇/Tris缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝7.0)活化和平衡此材料。将步骤1)旋干得到的粉末①溶解于100μL 85％乙醇/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)中，并和小孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酰胺核壳微球混匀，在温度为50℃孵化40min，离心弃上清液。用100μL 83％乙醇/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)淋洗小孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酰胺核壳微球，混合以1000rpm转速震荡10min，离心弃上清液。用40μL 65％乙醇/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mM，pH＝8.4)洗脱小孔聚苯乙烯-聚二乙烯基苯-聚丙烯酰胺核壳微球上吸附的糖肽，浓缩即可。结果如图2所示，得到了28个糖肽分子。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。