一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法与流程

1.一种基于两亲性多孔核壳微球的糖肽富集方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)采用分散固相萃取模式，大孔核壳微球依次用洗脱液①活化和上样液①平衡；将样品溶解于上样液①中并与平衡后的大孔核壳微球混合，孵化，离心得上清液①，上清液①旋干，得到粉末①；

2)采用分散固相萃取模式，小孔核壳微球依次用洗脱液②活化和上样液②平衡；将步骤1)得到的粉末①溶解于上样液②中并与平衡后的小孔核壳微球混合，孵化，离心弃上清液得沉淀②；沉淀②用淋洗液②冲洗，震荡后，再次离心弃上清液得吸附有糖肽的小孔核壳微球，用洗脱液②洗脱小孔核壳微球上吸附的糖肽，浓缩即可。

2.根据权利要求1所述的糖肽富集方法，其特征在于，步骤2)可替换为采用固相萃取模式，小孔核壳微球装填到末端带有筛板的SPE小柱上依次用洗脱液②冲洗和上样液②平衡；将步骤1)得到的粉末①溶解于上样液②中并加载到装填有小孔核壳微球的末端带有筛板的SPE小柱上，用淋洗液②冲洗吸附有糖肽的小孔核壳微球，再用洗脱液②洗脱小孔核壳微球上吸附的糖肽，即可。

3.根据权利要求1或2所述的糖肽富集方法，其特征在于，所述多孔核壳微球的直径为500nm～100μm；所述大孔核壳微球的平均孔径大小为20nm～100nm；所述小孔核壳微球的平均孔径大小为0.5nm～20nm。

4.根据权利要求1或2所述的糖肽富集方法，其特征在于，所述大孔核壳微球和小孔核壳微球均为壳层为亲水聚合物、内核为疏水聚合物的多孔核壳微球；

其中，所述亲水聚合物为聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚异丙基丙烯酰胺、聚N，N-亚甲基双丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯中一种或多种的共聚物；

所述疏水聚合物为聚苯乙烯、聚二乙烯基苯、聚9-乙烯基蒽、聚α-甲基苯乙烯、聚4-氨基苯乙烯、聚1，2-二氯乙烯、聚邻-氯苯乙烯、聚4-乙烯基联苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚三氯乙烯、聚丙烯酸六氟丁酯、聚甲基丙烯酸六氟丁酯、聚乙烯基正丁醚、聚2-乙烯基萘、聚9-乙烯基咔唑、聚乙烯基环己烷、聚4-溴苯乙烯、聚环己基乙烯基醚一种或多种的共聚物。

5.根据权利要求1或2所述的糖肽富集方法，其特征在于，上样液①组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积百分比为0-35％，缓冲盐溶液的浓度为0-200mM，pH在3-12范围内；

洗脱液①组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积百分比为20-90％，缓冲盐溶液的浓度为0-50mM，pH在3-12范围内；

其中，所述有机溶剂为乙腈、甲醇、乙醇中的一种或多种的混合物，所述缓冲盐为甲酸/甲酸铵、乙酸/乙酸铵、碳酸氢铵、Tris中一种或多种的混合物。

6.根据权利要求1或2所述的糖肽富集方法，其特征在于，上样液②组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积百分比为80-95％，缓冲盐溶液的浓度为0-50mM，pH在3-12范围内；

淋洗液②组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂所占的体积百分比为80-95％，缓冲盐溶液的浓度为0-50mM，pH在3-12范围内；

洗脱液②组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积百分比为0-70％，缓冲盐溶液的浓度为0-50mM，pH在3-12范围内；

其中，所述有机溶剂为乙腈、甲醇、乙醇中的一种或多种的混合物，所述缓冲盐为甲酸/甲酸铵、乙酸/乙酸铵、碳酸氢铵、Tris中一种或多种的混合物。

7.根据权利要求1或2所述的糖肽富集方法，其特征在于，步骤1)采用分散固相萃取模式，洗脱液①的体积为大孔核壳微球孔体积的3-500倍，上样液①体积为大孔核壳微球孔体积的3-500倍，样品的体积为大孔核壳微球孔体积的3-1000倍，淋洗液①体积为大孔核壳微球孔体积的2-1000倍；

步骤2)采用分散固相萃取模式，洗脱液②的体积为小孔核壳微球孔体积的3-500倍，上样液②体积为小孔核壳微球孔体积的3-500倍，淋洗液②体积为小孔核壳微球孔体积的3-1000倍，洗脱液②体积为小孔核壳微球孔体积的5-100倍；

或步骤2)采用固相萃取模式，洗脱液②的体积为小孔核壳微球孔体积的2-50倍，上样液②体积为小孔核壳微球孔体积的2-50倍，淋洗液②体积为小孔核壳微球孔体积的2-100倍，洗脱液②体积为小孔核壳微球孔体积的2-30倍。

8.根据权利要求1或2所述的糖肽富集方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)所述孵化的温度为15-50℃，时间为3-180min。

9.根据权利要求1或2所述的糖肽富集方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)所述震荡的转速为100-2500rpm，时间为1-30min。