本发明高分子化学与物理以及生物医用材料领域，涉及一种在单细胞表面制备厚度可控的聚合物壳层方法。
背景技术：
在自然界中，许多细胞具有“隐生”的特性来帮助他们躲避外界的苛刻的生存环境。例如，一些细菌在不适应自身生存的状况下，如辐射条件、干燥环境以及营养不足等情况，会形成保持有原始细胞形态的孢子状态来度过危机。这种孢子实际上就是在细胞的表面形成一层坚韧的壳层，这种壳层可以有效地帮助细胞抵御苛刻的生存环境。等到环境再次适合其生存时，细胞便会突破壳层并继续生长增殖。除了单细胞的生命体具有这种“隐生”的特性外，一些纤毛虫，更甚至是一些高级的生命体，如水熊虫等生物都具有这种特性。但是大多数的细胞不具有这种特性，无法产生坚韧的壳层来帮助其抵御苛刻的生存环境。单细胞技术在应用过程中，难免会遇到许多不利于细胞生存的实验环境，这样便导致这些细胞的操作稳定性变差。因此对细胞表面修饰，赋予细胞坚韧的人工壳层，可以有效地增强其抵御外界环境变化的能力。
当前制备单细胞人工壳层的方法主要有层层自组装法和生物矿化法等，其中层层自组装法又是研究最广泛的方法，其原理是利用在一定的条件下细胞表面呈现出负电状态，通过加入带有正电的物质，通过静电吸附的作用使得细胞表面吸附上该正电物质，从而使得细胞变为正电状态。进一步的加入带有负电的物质时，又会在具有正电的细胞上继续静电吸附。如此循环便可以在细胞表面制备成一种人工壳层。这种方法的优点是可以在较好的保存细胞的活性的前提下实现单细胞的包覆并且可以实现人工壳层厚度的可控。但是这种方法操作复杂，并且通过静电吸附的壳层强度不足，材料的选择范围窄，难以实现壳层的功能化。生物矿化的原理是利用将无机物通过沉淀反应沉积在细胞表面，该方法可以模拟细胞自身成壳的方式进行制备人工壳层，但无机壳层限制了人工壳层的功能化。
细胞表面接枝方法可以在细胞表面原位合成聚合物壳层，并实现聚合物壳层厚度的可控。同时由于高分子聚合物聚合单体的多样性和聚合物表面改性方法的多样性，可以很容易地实现细胞表面人工壳层功能化，实现多功能用途的人工壳层。但是由于聚合物制备过程中所需要无氧条件以及自由基的存在对细胞具有致命的伤害，严重地限制了细胞表面高分子原位聚合的广泛应用。因此对于细胞表面接枝方法制备人工壳层的研究极少。
为实现在细胞表面通过高分子聚合反应实现人工壳层的制备与功能化，我们发明了一套操作简便的具有良好的细胞相容性的单细胞表面接枝方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用可见光活性接枝聚合反应在不损失细胞活性的前提下，实现单细胞表面接枝厚度可控的聚合物层的方法。该方法具有良好的细胞相容性，并且反应的过程之中无需去除反应体系中氧气，最大程度地保存了细胞的活性。
由于对细胞表面直接改性会导致细胞受到自由基攻击而失活，因此在本发明中首先利用细胞表面带有负点的特性，通过静电吸附作用在单细胞表面吸附一层具有活泼氢的带有正电的聚合物，这样可以使得聚合反应位点远离细胞。同时，我们选用可室温下进行引发聚合的硫杂蒽酮类衍生物作为可见光引发剂。硫杂蒽酮类衍生物可以在极低用量(小于单体用量的千分之一)有效地在可见光的照射下通过夺氢反应形成具有引发活性的自由基和硫杂蒽酮衍生物半频哪醇自由基，该半频哪醇自由基会与自由基偶合在一起形成休眠种，这样便降低了自由基的浓度，这样有利于细胞活性的保存。在可见光照射条件下，半频哪醇休眠种会重新形成自由基，从而进一步引发单体的表面接枝交联聚合，在细胞表面形成一个完整而均匀的聚合物壳层。
为此，本发明的技术方案如下：
(1)取细胞悬浮液，用0.1-0.5m氯化钠溶液或磷酸盐缓冲溶液(ph为5-7)离心洗涤数次后得到细胞沉淀。
(2)将洗涤后的细胞加入到带有正电的聚合物溶液中(ph为3-6)，浸泡10-30分钟，随后利用0.1-1m柠檬酸-柠檬酸钠溶液(ph为3-6)洗涤1-3次后得到吸附有带有正电的聚合物的细胞。
(3)将步骤(2)得到的细胞加入到反应器中，并加入50-100ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、0.01-0.1g的硫杂蒽酮衍生物、以及1-10g聚合单体，于可见光照射下(光照强度为3mw/cm2-9mw/cm2)反应10-60分钟后得到具有人工聚合物壳层的细胞。
在步骤(1)中所述的细胞为酵母细胞、jurkat细胞、t细胞、血红细胞或哺乳动物组织细胞。
在步骤(2)中所述的带有正电的聚合物为聚乙二胺或聚乙烯亚胺。
在步骤(3)中所述硫杂蒽酮衍生物包括过氧乙酸基硫杂蒽酮或双过氧乙酸酸基硫杂蒽酮。
在步骤(3)中所述可聚合单体包括聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇双甲基丙烯酸酯或亚甲基双丙烯酰胺。
在步骤(3)中所用的光源为led灯或氙灯。该方法可以调节步骤(3)中所述的光照时间、单体浓度或、和光照强度实现接枝层厚度的可控，一般这几个参数越大厚度越大。
本发明的优点在于：
(1)反应是在室温下进行，光源为可见光，可以有效地保护细胞的活性。同时反应无需出去体系中氧气，这样使得该反应具有极大的普适性。
(2)通过该反应在细胞表面制备的聚合物壳层均匀完整，厚度可以通过调节聚合反应的反应时间、光照强度以及单体浓度等实现可控特征。
(3)通过对细胞表面聚合物壳层的控制可以实现对细胞的保护作用。
以下结合实例详述本发明。
附图说明
图1.细胞表面接枝聚合物壳层流程图
(a)带有正电的聚合物在细胞表面的吸附。(b)可见光引发剂硫杂蒽酮衍生物在带有正电的聚合物表面的偶合。(c)可见光照射引发可控活性聚合在细胞表面制备聚合物壳层。
具体实施方式：
实例1：
取酵母细胞悬浮液30ml，细胞浓度为(1×107个/ml)单位，用0.2m的氯化钠溶液洗涤三次后加入0.05mg/ml的聚乙烯亚胺溶液(ph为5)浸泡10min。随后再用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1m，ph为5)洗涤未吸附的聚乙烯亚胺后，得到吸附有聚乙烯亚胺的酵母细胞。将其加入50ml的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1m，ph为5)中，并加入5g聚乙二醇二丙烯酸酯、0.05g双过氧乙酸硫杂蒽酮。led灯(光照强度为3mw/cm2)照射下反应10min后，所制备形成的壳层均匀完整，并且利用细胞切片透射电镜的方式测定接枝壳层厚度为10nm。反应60min后接枝层厚度为50nm。壳层保护下的酵母细胞，在溶壁酶作用两小时后，依然保持80％的原始活性，而游离的酵母细胞则完全被溶壁酶破坏分解。
实例2：
取jurkat细胞悬浮液50ml，细胞浓度为(1×106个/ml)，用0.5m的磷酸盐缓冲溶液(ph为6)三次后加入0.05mg/ml的聚乙烯亚胺溶液(ph为6)浸泡10min。随后再用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.2m，ph为6)洗涤未吸附的聚乙烯亚胺后，得到吸附有聚乙烯亚胺的酵母细胞。将其加入50ml的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.2m，ph为6)中，并加入5g聚乙二醇二丙烯酸酯、0.05g双过氧乙酸硫杂蒽酮。led灯(光照强度为3mw/cm2)照射下反应10-60min后，所制备形成的壳层均匀完整，并且利用细胞切片透射电镜的方式测定接枝壳层厚度为10nm。反应60min后接枝层厚度为50nm。壳层保护下的jurkat细胞，在紫外光(光照强度为0.2mw/cm2)照射10min后，依然保持75％的原始活性，而游离的jurkat细胞则完全失活。
实例3：
取t细胞悬浮液50ml，细胞浓度为(1×106个/ml)，用磷酸盐缓冲溶液(0.5m，ph为6)三次后加入0.05mg/ml的聚乙烯亚胺溶液(ph为6)浸泡10min。随后再用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液洗涤未吸附的聚乙烯亚胺后，得到吸附有聚乙烯亚胺的酵母细胞。将其加入50ml的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.5m，ph为6)中，并加入3g聚乙二醇二丙烯酸酯、0.01g双过氧乙酸硫杂蒽酮。led灯(光照强度为3mw/cm2)照射下反应10min后，所制备形成的壳层均匀完整，并且利用细胞切片透射电镜的方式测定接枝壳层厚度为5nm。反应60min后接枝层厚度为50nm。壳层保护下的t细胞，在紫外灯(光照强度为0.2mw/cm2)照射二十分钟后，依然保持60％的原始活性，而游离的t细胞则完全失活。
实例3：
取牛全血50ml，通过离心法将红细胞从全血中提取出来后，细胞浓度为(1×105个/ml)，用0.5m的磷酸盐缓冲溶液(ph为6)三次后加入0.05mg/ml的聚乙烯亚胺溶液(ph为6)浸泡10min。随后再用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.5m，ph为6)洗涤未吸附的聚乙烯亚胺后，得到吸附有聚乙烯亚胺的酵母细胞。将其加入50ml的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.5m，ph为6)中，并加入3g聚乙二醇二丙烯酸酯、0.01g双过氧乙酸硫杂蒽酮。led灯(光照强度为9mw/cm2)照射下反应10min后，所制备形成的壳层均匀完整，并且利用细胞切片透射电镜的方式测定接枝壳层厚度为5nm。反应60min后接枝层厚度为50nm，并且细胞活性保留65％。
实例4：
取小鼠组织一块，利用胰蛋白酶将组织细胞解离为单分散细胞悬浮液，细胞浓度为(1×105个/ml)，用0.5m的磷酸盐缓冲溶液(ph为6)三次后加入0.05mg/ml的聚乙烯亚胺溶液(ph为6)浸泡10min。随后再用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(ph为6)洗涤未吸附的聚乙烯亚胺后，得到吸附有聚乙烯亚胺的酵母细胞。将其加入10ml的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.5m，ph为6)中，并加入1g聚乙二醇二丙烯酸酯、0.01g双过氧乙酸硫杂蒽酮。led灯(光照强度为6mw/cm2)照射下反应10min后，所制备形成的壳层均匀完整，并且利用细胞切片透射电镜的方式测定接枝壳层厚度为3nm。反应60min后接枝层厚度为15nm，并且细胞活性保留70％。
实例5：
取酵母细胞悬浮液30ml，细胞浓度为(1×107个/ml)，用0.2m的氯化钠溶液洗涤三次后加入0.05mg/ml的聚乙二胺溶液(ph为5)浸泡10min。随后再用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(1m，ph为5)洗涤未吸附的聚乙烯亚胺后，得到吸附有聚乙烯亚胺的酵母细胞。将其加入50ml的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(1m，ph为5)中，并加入5g聚乙二醇二丙烯酸酯、0.05g过氧乙酸硫杂蒽酮。led灯(光照强度为3mw/cm2)照射下反应10min后，所制备形成的壳层均匀完整，并且利用细胞切片透射电镜的方式测定接枝壳层厚度为10nm。反应60min后接枝层厚度为50nm，并且细胞活性保留80％。
实例6：
取酵母细胞悬浮液30ml，细胞浓度为(1×107个/ml)，用0.2m的氯化钠溶液洗涤三次后加入0.05mg/ml的聚乙二胺溶液(ph为5)浸泡10min。随后再用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.5m，ph为5)洗涤未吸附的聚乙烯亚胺后，得到吸附有聚乙二胺的酵母细胞。将其加入50ml的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.5m，ph为5)中，并加入5g亚甲基双丙烯酰胺、0.05g双过氧乙酸硫杂蒽酮。led灯(光照强度为3mw/cm2)照射下反应10min后，所制备形成的壳层均匀完整，并且利用细胞切片透射电镜的方式测定接枝壳层厚度为5nm。反应60min后接枝层厚度为25nm，并且细胞活性保留85％。
实例7：
取酵母细胞悬浮液30ml，细胞浓度为(1×107个/ml)，用0.2m的氯化钠溶液洗涤三次后加入0.05mg/ml的聚乙二胺溶液(ph为5)浸泡10min。随后再用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.5m，ph为5)洗涤未吸附的聚乙二胺后，得到吸附有聚乙烯亚胺的酵母细胞。将其加入50ml的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.5m，ph为5)中，并加入5g聚乙二醇双甲基丙烯酸酯、0.05g双过氧乙酸硫杂蒽酮。led灯(光照强度为9mw/cm2)照射下反应10min后，所制备形成的壳层均匀完整，并且利用细胞切片透射电镜的方式测定接枝壳层厚度为10nm。反应60min后接枝层厚度为50nm，并且细胞活性保留85％。
实例8：
取酵母细胞悬浮液30ml，细胞浓度为(1×107个/ml)，用0.2m的氯化钠溶液洗涤三次后加入0.05mg/ml的聚乙二胺溶液(ph为6)浸泡10min。随后再用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.7m，ph为6)洗涤未吸附的聚乙烯亚胺后，得到吸附有聚乙烯亚胺的酵母细胞。将其加入50ml的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.7m，ph为6)中，并加入5g亚甲基双丙烯酰胺、0.05g双过氧乙酸硫杂蒽酮。氙灯(光照强度为6mw/cm2)照射下反应10min后，所制备形成的壳层均匀完整，并且利用细胞切片透射电镜的方式测定接枝壳层厚度为10nm。反应30min后接枝层厚度为50nm，并且细胞活性保留85％。