本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种新型的大豆疫霉转化氟噻唑吡乙酮抗性筛选标记。
背景技术：
卵菌(oomycetes)是一类与真菌相似的真核生物，研究人员已发现至少1800种卵菌，除了一些腐生卵菌外，大部分卵菌是植物、动物以及其他生物的病原菌，给人类造成了巨大的经济损失。植物病原卵菌主要包括霜霉(downymildews)、疫霉(phytophthora)，腐霉(pythium)和白锈病菌(albugo)。与真菌相比，卵菌具有一些独特的生理生化特征，例如：营养体为二倍体；细胞壁的主要组成成分是纤维素；大多数卵菌为甾醇营养缺陷型；通过二氨基庚二酸途径产生赖氨酸；菌丝没有或有很少的隔膜；对dmi(steroldemethylationinhibitor)杀菌剂不敏感，而对苯酰胺类杀菌剂和羧酸酰胺类杀菌剂敏感等。
疫霉属(phytophthoara)病原菌是最重要的植物病原卵菌种类。2014年公布的十大植物病原卵菌其中包括6种疫霉属病原菌—p.infestans、p.ramorum、p.sojae、p.capsici、p.cinnamomi和p.parasitica(kamounetal.,2015)。p.sojae属于同宗配合卵菌，寄主范围较窄，在田间能对大豆生产造成严重的经济损失(dorranceetal.,2007)。p.sojae室内易分离培养，离体易诱导产生无性孢子，且能够在体外通过同宗配合进行有性生殖供遗传学研究，目前大豆疫霉菌的基因组已被测序公开，基于以上特点，p.sojae已逐渐成为卵菌科学研究的模式植物病原菌。
2016年，brettm.tyler教授课题组在大豆疫霉中建立了基因编辑crispr(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences)技术体系，并利用crispr技术验证了效应因子avr4/6在大豆疫霉和寄主互作过程中的功能(fangandtyler,2016)，为卵菌基因功能的研究奠定了技术基础。
对于基因功能的研究，基因的敲除和互补转化子的获得尤为关键。但是目前卵菌中可利用的筛选标记非常有限，唯一的可靠筛选标记是nptⅱ基因，其通过卵菌通用强启动子ham34启动编码的蛋白可使得卵菌对遗传霉素(g418)的抗性，从而使转化子被筛选出来。但是nptii用于crispr/cas9基因敲除体系时，因携带该标记的转化子具有了g418抗性而不能被再次利用进行回补实验；由于筛选标记的限制，对于获得的具有g418抗性的敲除转化子其他基因的再敲除仍难以实现。因此，开发新型卵菌转化筛选标记，对于卵菌基因功能的研究具有重要意义。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种新型的卵菌转化筛选标记—氟噻唑吡乙酮抗性相关蛋白及其编码基因psorp1δn777，以及其作为大豆疫霉转化筛选标记，在进行大豆疫霉筛选转化时的应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种氟噻唑吡乙酮抗性相关蛋白及其编码基因，所述氟噻唑吡乙酮抗性基因编码卵菌(特别是大豆疫霉)中靶标蛋白psorp1δn777，即氟噻唑吡乙酮抗性相关蛋白，是如下1)或2)所示的蛋白质：
1)由序列表中的seqidno.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
2)将序列表中的seqidno.2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与seqidno.2所示蛋白具有相同活性的由seqidno.2衍生的蛋白质。
为了便于序列1编码的psorp1δn777纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如poly-arg、poly-his、flag、strep-tagii、c-myc等标签。
所述psorp1δn777的序列可由seqidno.2经几个氨基酸的突变，但仍具有相同的活性，比如，在不同卵菌的不同菌种中，可能该蛋白会有个别氨基酸的不同，包括，取代、缺失、添加等的突变，但是，当第777位天冬氨酸缺失后，可以引起卵菌抗氟噻唑吡乙酮浓度提高100-500倍以上的抗性功能。
上述psorp1δn777可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述psorp1δn777的编码基因可通过将序列表中序列1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上标签的编码序列得到。
本发明提供一种氟噻唑吡乙酮抗性基因，其cdna核苷酸序列如下1)、2)或3)所示：
1)序列表中seqidno：1的核苷酸序列；
2)在严格条件下可与1)所述的dna序列重组且编码与氟噻唑吡乙酮抗性相关蛋白，引起卵菌抗氟噻唑吡乙酮浓度提高100-500倍以上的抗性功能的dna分子；
3)与序列表中seqidno：1的核苷酸序列具有90％以上的同源性的且编码氟噻唑吡乙酮抗性相关蛋白，并可引起卵菌抗氟噻唑吡乙酮浓度提高100-500倍以上的抗性功能的dna分子。
氟噻唑吡乙酮抗性基因(筛选标记psorp1δn777)可通过pcr扩增的方法，在psorp1基因(野生型敏感基因)cds序列的第2331/2332/2333位引入c、a、a三个碱基缺失突变而获得。
含有氟噻唑吡乙酮抗性基因的表达盒、重组表达载体或转基因重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体是在以真核表达载体为出发载体，引入表达所述氟噻唑吡乙酮抗性相关蛋白的表达盒得到的重组表达载体；优选的，所述表达所述氟噻唑吡乙酮抗性相关蛋白的表达盒由依次连接的启动子、所述的氟噻唑吡乙酮抗性相关蛋白的编码基因、终止子组成。
其中，所述启动子为如下1)或2)或3)的dna分子：
1)如seqidno.3所示的dna分子；
2)在严格条件下与1)限定的dna序列且具有启动子功能的dna分子；
3)与1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性且具有启动子功能的dna分子；
所述终止子可为如下1)或2)或3)的dna分子：
1)如seqidno.4所示的dna分子；
2)在严格条件下与1)限定的dna序列具有终止子功能的dna分子；
3)与1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性且具有启动子功能的dna分子。
所述出发载体选自pbluescriptiisk+载体或peasy-t1载体。
进一步的，在本发明的具体实施方式中，通过设计引物，以野生型大豆疫霉菌株cdna为模板，扩增大豆疫霉psorp1基因全长编码序列，以野生型大豆疫霉菌株dna为模板，分别扩增大豆疫霉psorp1上游1000bp序列和下游500bp，通过in-fusion连接的方法同时将psorp1全长编码序列、psorp1上游1000bp序列、psorp1下游500bp序列连入于克隆载体pbluescriptiisk+，设计引物将psorp1编码序列第2331/2332/2333位三个碱基caa通过pcr突变移除获得所述重组表达载体，以大量克隆所述筛选标记psorp1δn777，重组表达载体的具体构建方法如下：
(1)利用限制性内切酶ecori及bamhi酶切pbluescriptiisk+载体，利用商业化的胶回收试剂盒回收线性化载体片段；
(2)以大豆疫霉野生型菌株cdna为模板，设计引物f1(序列：ggaccgagccatgcaggcgctccaggacg)和r1(序列：ctccttgttattagtggccggcagctgc)，利用takara高保真酶cloneamptmhifipcrpremix扩增psorp1基因cds序列，利用商业化的胶回收试剂盒回收扩增产物片段；
(3)以大豆疫霉野生型菌株dna为模板，设计引物f2(序列：gataagcttgatatcgaattcgatcccagttattgcaacgtca)和r2(序列：gcgcctgcatggctcggtcccgcttgcg)利用takara高保真酶cloneamptmhifipcrpremix扩增psorp1基因上游1000bp序列(启动子序列)，利用商业化的胶回收试剂盒回收扩增产物片段；
(4)以大豆疫霉野生型菌株dna为模板，设计引物f3(序列：cggccactaataacaaggagcgaatgagttagacg)和r3(序列：cgctctagaactagtggatcctatcgacttggtctccataaaa)利用takara高保真酶cloneamptmhifipcrpremix扩增psorp1基因下游500bp序列(终止子序列)，利用商业化的胶回收试剂盒回收扩增产物片段；
(5)利用takara商业化in-fusionhd重组酶将步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)胶回收产物连接，实现psorp1基因的插入，获得带有psorp1表达载体(pbs-psorp1)；
(6)以含有psorp1及上游1000bp及下游500bp序列的载体质粒(pbs-psorp1)为模板，在引物中引入突变位点，设计f4(序列：gctcaacacaaagggtcctgtgcgcgtgacgttccc)，r4(序列：caggaccctttgtgttgagcatggcgttggacttgacgc)，利用takara高保真酶cloneamptmhifipcrpremix扩增pbs-psorp1载体，利用商业化的胶回收试剂盒回收扩增产物片段；
(7)利用takara商业化in-fusionhd重组酶将步骤(6)胶回收产物连接，实现psorp1基因的突变，获得带有突变psorp1表达载体(pbs-psorp1δn777，图1)；
(8)将pbs-psorp1δn777转入大肠杆菌感受态trans1-t1，涂于含氨苄青霉素的lb平板，挑取单菌落后利用通用引物m13f和m13r进行扩增，阳性菌落经测序验证后，于lb液体培养基摇培，并利用商业化的试剂盒小量提取质粒。
在上述构建方法中，步骤(1)载体可选择其他载体(例如全式金公司的peasy-t1载体等)，线性化载体所使用的限制性内切酶也可以对应载体上其他酶切位点。
在上述构建方法中，步骤(3)所用的引物f3和步骤(4)所用的引物与线性化载体两端的微同源序列需要根据步骤(1)载体或内切酶的变化而改变。
在上述构建方法中，步骤(5)和步骤(7)也可以选择其他公司具有相同功能的重组酶。
在上述构建方法中，步骤(8)lb平板抗生素的选择需要根据载体上所带有的抗生素抗性基因(如氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等)而确定。
本发明提供一种氟噻唑吡乙酮抗性基因作为卵菌转化筛选标记的应用。
其中，所述氟噻唑吡乙酮抗性基因编码大豆疫霉中靶标蛋白psorp1δn777，使其相对于野生型蛋白orp1，在第777位天冬酰胺发生氨基酸缺失。
并将该抗性基因(也可称为抗性标记基因)作为新型的卵菌转化筛选标记psorp1δn777。
所述氟噻唑吡乙酮抗性基因具体可为如下1)或2)或3)的dna分子：
1)如seqidno.1所示的dna分子；
2)在严格条件下与1)限定的dna序列重组且编码与氟噻唑吡乙酮抗性相关蛋白，并可引起卵菌对氟噻唑吡乙酮产生500倍以上抗性的dna分子；
3)与1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性且编码与氟噻唑吡乙酮抗性相关蛋白，并可引起卵菌对氟噻唑吡乙酮产生500倍以上抗性的dna分子。
所述转基因重组菌是以卵菌为出发菌株，转入上述重组表达载体，筛选得到表达本发明氟噻唑吡乙酮抗性相关蛋白的转基因重组菌。所述出发卵菌菌株优选为疫霉属(phytophthoara)病原菌，特别优选为大豆疫霉菌(phytophthoarasojae)；最优选为大豆疫霉(phytophthoarasojae)菌株p6497。本发明还要求保护一株卵菌菌株，是使出发卵菌菌株的氧化固醇结合蛋白1第777位氨基酸-天冬酰胺缺失获得的突变菌株；所述出发卵菌菌株优选为疫霉属(phytophthoara)病原菌，特别优选为大豆疫霉菌(phytophthoarasojae)；最优选为大豆疫霉(phytophthoarasojae)菌株p6497。
进一步地，本发明所述的应用具体为：将所述氟噻唑吡乙酮抗性基因连入含有大豆疫霉psorp1自身启动子和终止子的转化载体，用于大豆疫霉遗传转化的筛选。
其中，所述psorp1自身启动子为其上游序列1000bp序列，终止子为其下游500bp序列。
更为具体地，所述应用为：将所述筛选标记用于进行卵菌遗传转化时转化子的筛选，或以该标记进行卵菌其他抗性标记筛选获得的基因敲除转化子的基因回补实验中的筛选，或以该标记进行卵菌其他抗性标记筛选获得的基因敲除转化子的其他靶标基因的再敲除的转化筛选。
其中，所述其他筛选标记基因可为现有技术中常用的nptii基因，但并不排除随着研究发展而开发的其他筛选标记基因。
本发明所提供的新的筛选标记弥补了现有技术中筛选标记基因单一的不足。但无论是其单独作为筛选标记，还是与其他筛选标记组合使用，以进行更为复杂的基因工程实验(多步敲除或回补实验等)，均属于本发明的保护范围。
进一步地，本发明以大豆疫霉野生型菌株p6497为实验材料，获得原生质体，通过peg-cacl2介导的方法向原生质体中转入带有氟噻唑吡乙酮抗性基因的载体(pbs-psorp1δn777)，经筛选获得阳性转化子。
所述筛选方法具体为：
18℃黑暗条件下使原生质体再生1天，利用氟噻唑吡乙酮进行转化子的第一次筛选，25℃黑暗条件下培养3天，利用氟噻唑吡乙酮进行第二次筛选，继续在25℃黑暗条件下培养2-3天，待菌落长出后将菌落转接至含有氟噻唑吡乙酮的带药v8平板，进行第三次筛选，筛选浓度为0.005μg/ml。
本发明所提供的筛选标记psorp1δn777抗药性基因来源与大豆疫霉敏感菌株orp1基因cds序列，不包含任何内含子，该基因包括2904个核苷酸，可编码967个氨基酸。通过pcr扩增的方法向orp1基因cds序列中引入核苷酸的突变，即将敏感型基因cds序列的第2331/2332/2333位的三个碱基caa敲除，对应的，该基因所编码的蛋白由自n端第777位氨基酸天冬酰胺缺失。
所述卵菌为大豆疫霉(phytophthorasojae)。本发明以大豆疫霉疫霉为例，说明该筛选标记的应用潜力，实现了良好的应用效果。
上述位点的突变仅是引起卵菌对该类杀菌剂(ptis)产生抗药性的一种情况，筛选标记若为能引起该类杀菌剂抗药性的带有其他突变位点的或其他卵菌的orp1基因也属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果在于：
本发明获得的改造载体因携带有氟噻唑吡乙酮抗性基因psorp1δn777的筛选标记，从而可以用于大豆疫霉转化时转化子的筛选，该抗药性基因作为筛选标记用于卵菌的遗传转化实验，以氟噻唑吡乙酮作为筛选药剂，具有筛选效率高、筛选阳性率高、应用范围广、成本低等显著优点，同时，该筛选标记的开发解决了卵菌转化时筛选标记单一等问题，也避免了卵菌遗传转化强启动子造成的标记基因的过量表达，引起不可控的影响，为卵菌转化时基因回补、基因多敲除等方面的工作提供了有力保障。
附图说明
图1为通过pcr扩增获得大豆疫霉抗氟噻唑吡乙酮基因psorp1δn777及其启动子和终止子的过程。a：氟噻唑吡乙酮敏感基因orp1基因组上游1000bp启动子序列；b：氟噻唑吡乙酮敏感基因orp1cds编码序列；c：氟噻唑吡乙酮敏感基因orp1基因组下游500bp终止子序列。
图2大豆疫霉转化子对氟噻唑吡乙酮的敏感性。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的菌株信息：大豆疫霉野生型菌株p6497，是经过基因组测序的标准菌株，由美国brettm.tyler教授实验室馈赠。
以上菌株仅为本发明在实施例所使用的材料，事实上，在应用本发明所述筛选标记时，可使用任何商购途径获得的卵菌菌株。
上述菌株均已经过现有的形态学和分子生物学方法鉴定。
下述实施例中所使用的筛选药剂：96.7％氟噻唑吡乙酮原药，由杜邦公司提供。药剂以二甲基亚砜配成相应浓度的母液，以千倍稀释的方法加入培养基中。
实施例1、氟噻唑吡乙酮抗性基因和其重组表达载体的获得
一、氟噻唑吡乙酮抗性基因的获得
本发明的发明人发现，当大豆疫霉野生型菌株p6497氟噻唑吡乙酮抗性基因表达的氧化固醇结合蛋白1(orp1，genbankaccessionnumber为xp_009522569.1)自氨基端第777位氨基酸(天冬酰胺)缺失时，可使菌株对氟噻唑吡乙酮的抗性提高500倍以上。即可使缺失突变菌株抗氟噻唑吡乙酮浓度提高500倍以上，在野生型不能生长的氟噻唑吡乙酮浓度提高500倍后，orp1第777位氨基酸(天冬酰胺)缺失获得的突变体仍可以生长。
据此，发明人确定了一种大豆疫霉氟噻唑吡乙酮抗性蛋白作为大豆疫霉遗传转化的筛选标记，命名为psorp1δn777。
该筛选标记蛋白的序列如序列表中序列2所示。其编码基因psorp1δn777的序列如序列表中序列1所示，其中，序列表中序列1的自5’端第1-2901位核苷酸酸为编码序列。
所述筛选标记psorp1δn777通过pcr扩增的方法，在psorp1基因(野生型敏感基因)cds序列的第2331/2332/2333位引入c、a、a三个碱基缺失突变而获得psorp1δn777基因。
上述序列表中序列1所示的片段也可以通过人工合成。
二、表达本发明氟噻唑吡乙酮抗性基因的重组表达载体的构建
通过设计引物，以野生型大豆疫霉菌株cdna为模板，扩增大豆疫霉psorp1基因全长编码序列，以野生型大豆疫霉菌株dna为模板，分别扩增大豆疫霉psorp1上游1000bp序列和下游500bp，通过in-fusion连接的方法同时将psorp1全长编码序列、psorp1上游1000bp序列、psorp1下游500bp序列连入于克隆载体pbluescriptiisk+，设计引物将psorp1编码序列第2331/2332/2333位三个碱基caa通过pcr突变移除，以大量克隆所述筛选标记psorp1δn777具体技术方案如下：
(1)利用限制性内切酶ecori及bamhi酶切pbluescriptiisk+载体，利用商业化的胶回收试剂盒回收线性化载体片段；
(2)以大豆疫霉野生型菌株p6497的cdna为模板，设计引物f1(序列：ggaccgagccatgcaggcgctccaggacg)和r1(序列：ctccttgttattagtggccggcagctgc)，利用takara高保真酶cloneamptmhifipcrpremix扩增psorp1基因cds序列，利用商业化的胶回收试剂盒回收扩增产物片段；
(3)以大豆疫霉野生型菌株dna为模板，设计引物f2(序列：gataagcttgatatcgaattcgatcccagttattgcaacgtca)和r2(序列：gcgcctgcatggctcggtcccgcttgcg)利用takara高保真酶cloneamptmhifipcrpremix扩增psorp1基因上游1000bp序列(启动子序列)，利用商业化的胶回收试剂盒回收扩增产物片段；
(4)以大豆疫霉野生型菌株dna为模板，设计引物f3(序列：cggccactaataacaaggagcgaatgagttagacg)和r3(序列：cgctctagaactagtggatcctatcgacttggtctccataaaa)利用takara高保真酶cloneamptmhifipcrpremix扩增psorp1基因下游500bp序列(终止子序列)，利用商业化的胶回收试剂盒回收扩增产物片段；
(5)利用takara商业化in-fusionhd重组酶将步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)胶回收产物连接，实现psorp1基因的插入，获得带有psorp1的重组表达载体(pbs-psorp1)；
(6)以含有psorp1及上游1000bp序列的载体质粒(pbs-psorp1)为模板，在引物中引入突变位点，设计f4(序列：gctcaacacaaagggtcctgtgcgcgtgacgttccc)，r4(序列：caggaccctttgtgttgagcatggcgttggacttgacgc)，利用takara高保真酶cloneamptmhifipcrpremix扩增pbs-psorp1载体，利用商业化的胶回收试剂盒回收扩增产物片段；
(7)利用takara商业化in-fusionhd重组酶将步骤(6)胶回收产物连接，实现psorp1基因的突变，获得带有突变psorp1δn777基因的表达载体(pbs-psorp1δn777，图1)；pbs-psorp1δn777中，序列3所示的启动子、序列1所示的psorp1δn777基因和序列4所示的终止子依次连接，实现psorp1δn777基因的表达。
(8)将pbs-psorp1δn777转入大肠杆菌感受态trans1-t1，涂于含氨苄青霉素的lb平板，挑取单菌落后利用通用引物m13f和m13r进行扩增，阳性菌落经测序验证后，于lb液体培养基摇培，并利用商业化的试剂盒小量提取质粒。
实施例2、筛选标记psorp1δn777在大豆疫霉遗传转化中的应用
为验证该筛选标记的应用潜力，将上述带有氟噻唑吡乙酮抗性基因的质粒(pbs-psorp1δn777)转入大豆疫霉原生质体，以验证本发明所述筛选标记是否可应用于大豆疫霉遗传转化时转化子的筛选，以及该筛选标记用于大豆疫霉遗传转化时的工作效率。
具体操作过程如下：
以大豆疫霉野生型菌株为实验材料，参考fang等方法获得原生质体，通过peg-cacl2介导的方法向原生质体中转入带有氟噻唑吡乙酮抗性基因的载体(pbs-psorp1δn777)，经筛选获得阳性转化子，在阳性转化子中，载体中携带的氟噻唑吡乙酮抗性基因的表达盒在基因组中表达。
筛选转化子的方法为：
18℃黑暗条件下使原生质体再生1天，利用含氟噻唑吡乙酮进行转化子的第一次筛选，25℃黑暗条件下培养3天，利用氟噻唑吡乙酮进行第二次筛选，继续在25℃黑暗条件下培养2-3天，待菌落长出后将菌落转接至含有氟噻唑吡乙酮的带药10％v8固体平板，进行第三次筛选。
为保证转化子筛选效率及转化子的阳性率，第一次、第二次和第三次筛选转化子时氟噻唑吡乙酮在培养基中的浓度为0.005-0.05μg/ml之间，培养基为10％v8固体平板(100mlv8蔬菜汁，15g琼脂粉，1g碳酸钙，去离子水定容至1l)。
经过三次筛选获得的转化子转接至铺有玻璃纸的v8平板，菌落长出后收集菌丝，提取dna，利用引物vf1(序列：ctaacagacccgagatacacg)和vr1(序列：gcaccctattcaggagacaa)对筛选获得的转化子抗性标记进行扩增，pcr产物利用商业化的t克隆载体进行t克隆连接，送样测序验证，克隆测序结果若存在序列表1中序列1所示的核苷酸序列即为阳性转化子，以大豆疫霉野生型菌株作为阴性对照。
经过二次筛选获得的转化子菌落均能在第三次筛选时长出，且经过三次筛选获得的转化子均含有该筛选标记psorp1δn777基因，说明该标记应用于大豆疫霉遗传转化时，筛选阳性率为100％。
实施例3、转化子生物学性状分析
4株大豆疫霉阳性转化子，菌株编号分别为t777-1、t777-4、t777-5、t777-8，一株大豆疫霉野生型菌株p6497。
v8固体培养基：100mlv8蔬菜汁，1500转/分(5000g)下离心10min，取上清液与去离子水1：9比例稀释(100ml的上清液加入900ml去离子水)，加入1g碳酸钙，15g琼脂，高压蒸汽灭菌(121℃)20min。
(1)氟噻唑吡乙酮敏感性
将氟噻唑吡乙酮用二甲基亚砜(dmso)配成104μg/ml的母液。先配制1000倍的浓缩药液，然后用v8固体培养基将氟噻唑吡乙酮按照1000倍比例稀释成分别含0.001μg/ml，0.005μg/ml，0.01μg/ml，0.05μg/ml，0.1μg/ml，0.5μg/ml的浓度梯度的v8固体培养基。具体方法是用移液枪吸取氟噻唑吡乙酮药液加入已灭菌的冷却至45℃的60mlv8固体培养基中，将带药的培养基倒入直径为9㎝的培养皿中得到分别含0.001μg/ml，0.005μg/ml，0.01μg/ml，0.05μg/ml，0.1μg/ml，0.5μg/ml的v8培养基平板。设只加60μldmso的处理为空白对照，每个比例药剂设3次重复。
将大豆疫霉菌野生型菌株和转化子分别在不含药的v8平板上培养5天后，沿菌落边缘用打孔器打取直径为0.5cm的菌饼，菌丝面向下接种于上述的带药和对照培养基中，置于25℃培养箱中黑暗培养，5天后十字交叉法测量菌落直径。
结果如图2所示，转化质粒pbs-psorp1δn777得到的四株转化子均能够表现出抗氟噻唑吡乙酮的活性，均可以在含0.005-0.05μg/ml的氟噻唑吡乙酮的培养基上生长，而大豆疫霉野生型菌株p6497在氟噻唑吡乙酮浓度高于0.001μg/ml的培养基上均不能生长。
(2)孢子囊产量
打取10个野生型菌株p6497和4株转化子t777-1、t777-4、t777-5、t777-8菌落边缘菌柄(直径5mm)，放入装有20ml的10％v8液体培养基中(100mlv8蔬菜汁，1g碳酸钙，去离子水定容至1l)。25℃黑暗培养48h，倒掉培养基，用20ml无菌去离子水冲洗菌丝，共冲洗8次，间隔30min，之后静置10h，显微镜计数观察孢子囊的数目。
结果如表1所示，转化质粒pbs-psorp1δn777得到的四株转化子孢子囊产量与野生型菌株没有明显差异。
表1转化子的生物学性状分析
(3)游动孢子产量
将野生型菌株p6497和4株转化子t777-1、t777-4、t777-5、t777-8，分别接种在v8培养基上，25℃黑暗培养10天。然后用30ml的灭菌无菌自来水，间隔30min，洗菌丝10次，最后在培养皿中分别统一添加15ml的无菌自来水，25℃黑暗培养8h，游动孢子的数量通过血球计数板计数。
结果如表1所示，转化质粒pbs-psorp1δn777得到的四株转化子游动孢子产量与野生型菌株没有明显差异。
(4)休止孢萌发率
涂布大约500个孢子到10％v8固体培养基上，25℃黑暗培养4h，显微镜观察计数孢子萌发数量，芽管萌发的长度大于休止孢的直径视为孢子萌发。
结果如表1所示，转化质粒pbs-psorp1δn777得到的四株转化子休止孢萌发率与野生型菌株没有明显差异。
(5)致病性
采用离体叶片法测定大豆疫霉的致病性。将新鲜生长的5mm直径的野生型或转化子的菌饼接种于大豆(品种williams-rps)叶片正面中心位置，培养于保湿的培养皿中，25℃培养3天，用软件imagej计算病斑面积。
结果如表1所示，转化质粒pbs-psorp1δn777得到的四株转化子致病性与野生型菌株没有明显差异。
上述试验说明，转化质粒pbs-psorp1δn777能够利用氟噻唑吡乙酮进行转化子的筛选，同时对大豆疫霉的生物学表型没有显著的影响，可用于大豆疫霉的遗传转化子的筛选标记。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>刘西莉
<120>一种用于大豆疫霉遗传转化的氟噻唑吡乙酮抗性筛选标记
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