本发明涉及蛋白的提取方法，尤其涉及一种含硒植物蛋白的提取方法。
背景技术：
蛋白质是人体和动物生活所必须的营养成分，包括植物性蛋白和动物性蛋白。硒为动物和人体必需的微量元素之一，在土壤-植物-人体系统中，它最初来自于土壤，经过植物光合作用，最终主要以硒氨基酸和硒蛋白形式储存于植物体内，再通过食物链进入人体，因此含硒蛋白是人体补硒的重要的营养物质。
目前植物性硒蛋白的提取技术很多，包括三氯乙酸-丙酮沉淀(TCA)法、E-TCA(提取液添加了EGTA)法、酚提法、碱提法、酸提法和水提法等。提取蛋白质首先要将蛋白质溶解出来，综合内外因素的影响，将细胞内蛋白质提取出来，再用沉淀方法(如盐析、层析、超滤、等电点等)分离提取液中蛋白质，即得粗蛋白产品。然而，对于含硒蛋白的提取技术研究却不多，而且有关技术参数差异较大，众说纷纭。有机溶剂法提取蛋白应用较为广泛，具有沉淀蛋白质分辨力高、提取杂质较少、提取效率高的优点，但却存在高浓度有机溶剂易使蛋白质变性失活、提取出的蛋白无法溶解、有机试剂难去除和方法不可逆等缺点。水提法提取条件温和，环境危害小，蛋白色泽正常，其活性变化不大，但对于不同的植物中蛋白的性质，水提法的提取效率不同，局限性较大，是否适用于富硒植物含硒蛋白的提取，依然存在疑问。与传统的水溶液提取法相比，酶法提取和反应条件温和、选择性高、蛋白质提取纯度较高、产品中有毒物质含量低，但通过碱法与酶提取法对照实验却发现，采用两种方法提取蛋白质的提取率差异较大，碱法提取率要高于酶提法。碱提法具有工艺简单、成本低、分离效率较高的优点，但该方法受限于植物种类，使蛋白质提取效率或高或低，并且提取时间长，提取温度高，易使蛋白质发生失活与变性。盐溶法的应用也较为广泛，但在植物硒蛋白的提取方面效果欠佳，且盐溶性蛋白硒含量也较低。综上，如何从富硒植物中提取出更多的含硒蛋白，如何使提取蛋白中硒含量更高是当前含硒蛋白提取领域关注的核心问题。
遏蓝菜是一种超聚硒植物，而且它能够从土壤中有效的吸收并累积大量的硒元素，并以硒氨基酸形式保存在其蛋白组织中，因此遏蓝菜是一种用于提取植物性含硒蛋白的天然绿色原料。然而有关含硒蛋白提取方面的专利技术极为欠缺，遏蓝菜中水溶性蛋白含量高，且水溶性蛋白中硒含量也多，因此，研发出一种适合超聚硒植物遏蓝菜含硒蛋白提取的方法是十分重要的。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的实施例提供了一种基于遏蓝菜提取植物蛋白，且提取率高，提取蛋白的硒含量大的含硒植物蛋白的提取方法。
本发明的实施例提供一种含硒植物蛋白的提取方法，包括以下步骤：
S1.预处理遏蓝菜，得到高聚硒的粉末样品；
S2.向粉末样品中加入5-15倍体积的提取剂，置于25℃恒温水浴振荡器中振荡30-90min，振荡速率为200r/min，混合均匀，抽滤，取上清液，过5μm水系滤膜，得到提取液，4℃冷藏保存；
S3.调节提取液的pH为3.5，并搅拌均匀，加入0.4-0.8倍提取液体积的预冷的饱和盐溶液，边加边搅拌，4℃静置，至粗蛋白沉淀析出；
S4.将析出粗蛋白沉淀的提取液置于高速冷冻离心机中离心10min，温度为4℃，离心速率为10000r/min，弃上清液，得到下层蛋白沉淀；
S5.向下层蛋白沉淀中再次加入提取剂复溶，并搅拌至完全溶解，得到纯化的蛋白溶液；
S6.将蛋白溶液转移至透析袋中，封口，置于超纯水中进行透析24h，期间每隔6小时换一次超纯水；
S7.检验是否透析完全，若未透析完全，重复步骤S6，若透析完全，将透析袋中的液体转移出来，则得到含硒蛋白溶液，4℃保存；
S8.调节含硒蛋白溶液的pH为3.5，并搅拌均匀，加入0.4-0.8倍含硒蛋白溶液体积的预冷的饱和盐溶液，边加边搅拌，4℃静置，至含硒蛋白沉淀析出；
S9.高速冷冻离心机离心10min，温度为4℃，离心速率为10000r/min，弃上清液，得到下层含硒蛋白沉淀,即得到含硒植物蛋白。
进一步，所述步骤S1中，取遏蓝菜的地上部分,洗净，在50℃烘干至恒重，粉碎，过100目筛，即得到高聚硒的粉末样品。
进一步，所述提取剂为超纯水、0.1mo/L NaOH溶液、0.1mo/L HCl溶液、0.5mol/L NaCl或0.1mol/L磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的pH为6.6-7.4。
进一步，所述步骤S3和S8中，用醋酸调节pH，饱和盐溶液为饱和硫酸铵溶液。
进一步，所述步骤S5中，向下层蛋白沉淀中再次加入提取剂复溶，并用玻璃棒搅拌，若无法完全溶解，则离心，去除不溶物。
进一步，所述步骤S7中，取透析液2ml，用氯化钡溶液检验是否透析完全，无沉淀产生则透析完全，有沉淀产生则未透析完全。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：方法简便，操作性强，适于大规模工业化生产；基于遏蓝菜提取植物蛋白，由于遏蓝菜中水溶性蛋白含量高，且水溶性蛋白中硒含量也多，显著提高了植物蛋白的提取率，提取率在20％以上，最高可至67.26％，以及植物性蛋白中的硒含量，硒含量在0.15％以上，最高可至0.37％。
附图说明
图1是本发明一种含硒植物蛋白的提取方法的一流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地描述。
请参考图1，本发明的实施例提供了一种含硒植物蛋白的提取方法，包括以下步骤：
S1.预处理遏蓝菜，取遏蓝菜的地上部分,洗净，在50℃烘干至恒重，粉碎，过100目筛，即得到高聚硒的粉末样品；
S2.向粉末样品中加入5-15倍体积的提取剂，提取剂为超纯水、0.1mo/L NaOH溶液、0.1mo/L HCl溶液、0.5mol/L NaCl或0.1mol/L磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的pH为6.6-7.4；
置于25℃恒温水浴振荡器中振荡30-90min，振荡速率为200r/min，混合均匀，抽滤，取上清液，过5μm水系滤膜，得到提取液，4℃冷藏保存；
S3.调节提取液的pH为3.5，优选用醋酸调节，并搅拌均匀，缓慢加入体积为提取液体积40-80％的预冷的饱和盐溶液，优选为饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，4℃静置，至粗蛋白沉淀析出；
S4.将析出粗蛋白沉淀的提取液置于高速冷冻离心机中离心10min，温度为4℃，离心速率为10000r/min，弃上清液，得到下层蛋白沉淀；
S5.向下层蛋白沉淀中再次加入提取剂复溶，并搅拌至完全溶解，若无法完全溶解，则离心，去除不溶物，再搅拌至完全溶解，得到纯化的蛋白溶液；
S6.将蛋白溶液转移至透析袋中，封口，置于超纯水中进行透析24h，期间每隔6小时换一次超纯水；
S7.检验是否透析完全，若未透析完全，重复步骤S6，若透析完全，将透析袋中的液体转移出来，则得到含硒蛋白溶液，4℃保存；
优选地，取少量透析液，如2ml，用氯化钡溶液检验是否透析完全，无沉淀产生则透析完全，有沉淀产生则未透析完全；
S8.调节含硒蛋白溶液的pH为3.5，并搅拌均匀，缓慢加入体积为含硒蛋白溶液体积40-80％的预冷的饱和盐溶液，边加边搅拌，4℃静置，至含硒蛋白沉淀析出；
S9.高速冷冻离心机离心10min，温度为4℃，离心速率为10000r/min，弃上清液，得到下层含硒蛋白沉淀,即得到含硒植物蛋白。
本发明方法简便，操作性强，适于大规模工业化生产；基于遏蓝菜提取植物蛋白，由于遏蓝菜中水溶性蛋白含量高，且水溶性蛋白中硒含量也多，显著提高了植物蛋白的提取率，提取率在20％以上，最高可至67.26％，以及植物性蛋白中的硒含量，硒含量在0.15％以上，最高可至0.37％。
实施例1：
称取一定量的高聚硒的粉末样品，加入10倍体积的超纯水，室温25℃下置于恒温水浴振荡器中200r/min震荡1h，混合均匀，充分提取后，抽滤，取上清液，过5μm水系滤膜，得到提取液于4℃冷藏保存。
提取液取2ml，测定其pH值后，用低浓度醋酸溶液调节pH为3.5，搅拌均匀，向提取液中缓慢加入体积为提取液体积50％的预冷的饱和硫酸铵溶液，边加边轻轻搅拌，防止局部的硫酸铵浓度过高，置于4℃冰箱静置1h，观察粗蛋白沉淀的析出。然后置于高速冷冻离心机中(温度为4℃，离心速率为10000r/min)离心10min，弃上清液，向下层蛋白沉淀物中加入超纯水复溶，用玻璃棒搅拌至完全溶解，再一次离心除去不溶物(若全部溶解则省略此步骤)，得到纯化的蛋白溶液，转移至透析袋中，封口，置于超纯水中进行透析24h，进行脱盐过程，期间每隔6小时换超纯水。待透析结束后，取透析液2ml，用氯化钡溶液检验是否透析完全，无沉淀产生则透析完全，将透析袋中的液体转移至离心管中，即得到含硒蛋白溶液，蛋白溶液中的硒含量为308.4ppm，4℃保存待用，再次用低浓度醋酸溶液调节pH为3.5，搅拌均匀，缓慢加入50％体积预冷的饱和硫酸铵溶液，边加边轻轻搅拌，防止局部的硫酸铵浓度过高，置于4℃冰箱静置1h，直至纯化的含硒植物蛋白沉淀析出。所得蛋白产品的提取率为23.90％，含硒量为0.36％。
实施例2：
本实施例与实施例1的区别仅在于，提取剂为0.1mol/LNaOH溶液，余则与实施例1基本相同。
本实施例得到的蛋白溶液中的硒含量为147.9ppm，所得蛋白产品的提取率为62.82％，含硒量为0.37％。
实施例3：
本实施例与实施例1的区别仅在于，提取剂为0.1mol/L HCl溶液，余则与实施例1基本相同。
本实施例得到的蛋白溶液中的硒含量为404.5ppm，所得蛋白产品的提取率为22.82％，含硒量为0.25％。
实施例4：
本实施例与实施例1的区别仅在于，提取剂为0.5mol/LNaCl溶液，余则与实施例1基本相同。
本实施例得到的蛋白溶液中的硒含量为307.5ppm，所得蛋白产品的提取率为51.11％，含硒量为0.18％。
实施例5：
本实施例与实施例1的区别仅在于，提取剂为pH＝7、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，余则与实施例1基本相同。
本实施例得到的蛋白溶液中的硒含量为370.2ppm，所得蛋白产品的提取率为52.10％，含硒量为0.19％。
实施例6：
本实施例与实施例5的区别仅在于，称取5份质量相同的高聚硒的粉末样品，分别加入5、8、10、12、15倍体积的pH＝7、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，余则与实施例5基本相同。
结果显示，1：10的固液比时所得蛋白产品提取率最高，为52.29％，且固液比对产品中硒含量的影响不大。
实施例7：
本实施例与实施例5的区别仅在于，称取五份质量相同的高聚硒的粉末样品，加入10倍体积的pH＝7、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，室温25℃下置于恒温水浴振荡器中200r/min分别震荡30min、45min、60min、75min、90min，余则与实施例5基本相同。
结果显示，震荡60min时所得蛋白产品提取率最高，为54.20％，且蛋白产品中硒含量随时间增加而升高，且在60min左右时基本达到平衡。
实施例8：
称取五份一定量的高聚硒的粉末样品，分别加入10倍体积的pH为6.6、6.8、7.0、7.2、7.4的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，室温25℃下置于恒温水浴振荡器中200r/min震荡1h，混合均匀，充分提取后，抽滤，取上清液，过5μm水系滤膜，得到提取液于4℃冷藏保存。
提取液取2ml，测定其pH值后，用低浓度醋酸溶液调节pH为3.5，搅拌均匀，向提取液中缓慢加入体积为提取液体积50％的预冷的饱和硫酸铵溶液，边加边轻轻搅拌，防止局部的硫酸铵浓度过高，置于4℃冰箱静置1h，观察粗蛋白沉淀的析出。然后置于高速冷冻离心机中(温度为4℃，离心速率为10000r/min)离心10min，弃上清液，向下层蛋白沉淀物中分别加入相应pH值的磷酸盐缓冲液复溶，用玻璃棒搅拌至完全溶解，再一次离心除去不溶物(若全部溶解则省略此步骤)，得到纯化的蛋白溶液，转移至透析袋中，封口，置于超纯水中进行透析24h，进行脱盐过程，期间每隔6小时换超纯水。待透析结束后，取透析液2ml，用氯化钡溶液检验是否透析完全，无沉淀产生则透析完全。将透析袋中的液体转移至离心管中，即得到含硒蛋白溶液，4℃保存待用。再次用低浓度醋酸溶液调节pH为3.5，搅拌均匀，缓慢加入50％体积预冷的饱和硫酸铵溶液，边加边轻轻搅拌，防止局部的硫酸铵浓度过高，置于4℃冰箱静置1h，直至纯化的含硒植物蛋白沉淀析出。
结果显示，pH为7.4时所得蛋白产品提取率最高，为64.48％，且蛋白产品的硒含量受提取液酸碱度影响不大。
实施例9：
称取五份质量相同的高聚硒的粉末样品，分别加入10倍体积的pH为7.4的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，室温25℃下置于恒温水浴振荡器中200r/min震荡1h，混合均匀，充分提取后，抽滤，取上清液，过5μm水系滤膜，得到提取液于4℃冷藏保存。
取提取液2ml，测定其pH值后，用低浓度醋酸溶液调节pH为3.5，搅拌均匀，向提取液中缓慢加入40％、50％、60％、70％、80％体积预冷的饱和硫酸铵溶液，边加边轻轻搅拌，防止局部的硫酸铵浓度过高，置于4℃冰箱静置1h，观察粗蛋白沉淀的析出，然后置于高速冷冻离心机中(温度为4℃，离心速率为10000r/min)离心10min，弃上清液，向蛋白沉淀物中分别加入相应pH值的磷酸盐缓冲液复溶，用玻璃棒搅拌至完全溶解，再一次离心除去不溶物(若全部溶解则省略此步骤)得到纯化的蛋白溶液，转移至透析袋中，封口，置于超纯水中进行透析24h，进行脱盐过程，期间每隔6小时换水。待透析结束后，取透析液2ml，用氯化钡溶液检验是否透析完全，无沉淀产生则透析完全。将透析袋中的液体转移至离心管中，即得到含硒蛋白溶液，4℃保存待用。再次用低浓度醋酸溶液调节pH为3.5，搅拌均匀，缓慢加入相应体积的预冷的饱和硫酸铵溶液，边加边轻轻搅拌，防止局部的硫酸铵浓度过高。置于4℃冰箱静置1h，直至纯化的含硒植物蛋白沉淀析出。
结果显示，当加入60％的饱和硫酸铵溶液时，所得蛋白产品提取率最高，为67.26％，且蛋白产品的硒含量受其浓度影响较小。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。