本发明涉及肠道微生物的科学研究、临床诊断、药物开发等相关领域，尤其涉及一种肠道微生物基因组DNA的提取方法。
背景技术：
肠道内定植了数量众多、种类丰富的肠道菌群，它们和宿主间形成了互利共生的关系，对宿主的健康产生着重大影响.近年来，随着对肠道菌群调控作用研究的不断深入，发现肠道菌群不仅调控肠道活动，还影响宿主的脑功能和行为.因此人体的生理健康除受自身基因的调控外，还受到肠道菌群的影响。人体肠道内的细菌有1000-1150种，其中160种为优势菌种，存在不同类型的生态学相互作用。肠道细菌的300多万个基因被视为人类的“第二基因组”，在正常人体健康状态下，肠道微生物种群处于平衡状态，而在宿主患病期，菌群失调或紊乱。
近年来，随着高通量测序技术的不断发展及成熟，该技术在探究及鉴定环境微生物群落中也得到了广泛的应用，这种方法突破了微生物分离培养的限制，能够全面分析自然界的微生物类群及充分挖掘基因资源。然而，对于这种基于核酸的分子生物学技术，DNA提取质量的好坏会直接影响到微生物群落结构的分析结果。所以，肠道菌群的DNA提取是实验研究至关重要的一步。因肠道微生物基因组研究有着其特殊性，粪便成分复杂，并受到各种因素的影响，得到的基因组DNA纯度不高，导致下游实验如基因组测序数据的不稳定。近些年来，国内外相关机构对肠道菌群基因组DNA提取方法进行了比较和评估，发现现有的方法存在很多问题，比如一些未被消化的食物残渣、多糖、脲以及消化酶，其中有的成分会影响到后续的PCR分析，DNA提取效率普遍偏低，且稳定性差。因此怎样有效地排除这些物质的干扰成为提取高质量粪便总DNA的关键。
技术实现要素：
本发明旨在解决现有技术的不足，而提供一种肠道微生物基因组DNA的提取方法，用于肠道微生物基因组的DNA提取，为下游基因组DNA的检测和分析提供可靠的样本基础。
本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种肠道微生物基因组DNA的提取方法，具体步骤为：
(1)粪菌样本采集
对离心管进行灭菌处理；
取样时手带一次性无菌手套，持灭菌后的离心管，探入粪便排泄物中，打开离心管盖，将粪便样本装入离心管中，离心管充满后立刻盖严，并迅速取出，做好标记和记录，直接投入干冰中冻存，之后置于-80℃的环境中保存；
(2)菌体获得
取粪菌样品，然后向粪菌样品中加入经4℃预冷的PBS缓冲液，其中，加入的比例为每3克粪菌中加入10ml的PBS缓冲液，待样品融化后涡旋振荡1min，然后在4℃下采用1000r/min的速度离心5min，吸取上清液；样品重复震荡、离心、取上清液三次；
将四次融化洗涤后所得上清液在4℃下采用12000r/min的速度离心10min，弃掉离心管上层清液，向每管底部沉淀均加入TE缓冲液，其中，TE缓冲液的体积与之前加入的PBS缓冲液的体积比为100：17；混匀后吸取液体至同一个灭菌离心管中，充分震荡混匀，形成细胞悬液；
(3)粪菌基因组DNA提取和纯化
取细胞悬液置于无菌管中加入经4℃预冷的PBS缓冲液，其中细胞悬液、PBS缓冲液的体积比为1：50；
加入与细胞悬液等体积的无菌玻璃小珠、裂解液、酚氯仿，借助10ul枪头将细胞悬浮，然后涡旋震荡1min，放在冰上1min，重复四次；
采用12000r/min的速度离心5min，吸取上清液，并在上清液中加入等体积的酚氯仿，颠倒混匀，去蛋白，再次采用12000r/min的速度离心5min；
加入溶菌酶和异硫氰酸胍，其中，每1ul的细胞悬液加入15ug的溶菌酶和0.5ul的异硫氰酸胍，混匀后于37℃孵育1h；
加入蛋白酶K，混匀后于37℃孵育1h；
加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，抽提2次，在4℃下采用12000r/min的速度离心10min；
收集上清液，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，在4℃下采用12000r/min的速度离心3min；
吸取上清液，加入等体积的异丙醇，室温放置10min，采用12000r/min的速度离心10min；
弃上清液，留取沉淀物，在沉淀物中加入70％冰乙醇洗涤2次，自然干燥；
加入DEPC水，加入的DEPC水与取的细胞悬液的体积比为1：4；然后将产物置于-20℃的环境中保存。
特别的，粪菌基因组DNA提取和纯化过程中，裂解液的成分为：
体积浓度为2％的TritonX-100；
体积浓度为1％的表面活性剂十二烷基磺酸钠SDS；
100mmol/L的氯化钠；
10mmol/L、pH为7.8-8.2的Tris-HCl。
特别的，粪菌基因组DNA提取和纯化过程中，
酚氯仿中的苯酚、氯仿的体积比为25：24；
氯仿/异戊醇混合液中氯仿、异戊醇的体积比为24：1；
苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25﹕24﹕1。
粪菌样本采集过程中，利用离心管取样过程中伴随搅动，使样本更加均匀。
粪菌基因组DNA提取和纯化过程中，所述DEPC水为用焦碳酸二乙酯处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水。
本发明的有益效果是：本发明减少了有机溶剂的使用，成本低廉且提取的微生物总DNA纯度较高；异硫氰酸胍可以迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酶，得到的DNA质量高；能得到更加丰富的DNA种群信息，可更加全面地反映肠道微生物的多样性和群落结构组成，操作步骤较少，稳定性好，是一种实用可靠的粪便微生物DNA提取方法，可广泛应用于肠道微生态的研究。
附图说明
图1为本发明具体实施例中采用三种不同方法提取的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳后的对照图；
图中：
A为采用本发明对同一样本提取所得的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳的图；
B为采用十六烷基三甲基溴化铵法对同一样本提取所得的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳的图；
C为采用商业试剂盒(Tiangen DNA提取试剂盒)对同一样本提取所得的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳的图；
以下将结合本发明的实施例参照附图进行详细叙述。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
具体实施例：
一种肠道微生物基因组DNA的提取方法，具体步骤为：
(1)粪菌样本采集
对离心管进行灭菌处理；
取样时手带一次性无菌手套，持灭菌后的50ml离心管，探入粪便排泄物中，打开离心管盖，将粪便样本装入离心管中，离心管充满后立刻盖严，并迅速取出，做好标记和记录，直接投入干冰中冻存，之后置于-80℃的环境中保存；
(2)菌体获得
取3g粪菌样品，然后向粪菌样品中加入10ml经4℃预冷的PBS缓冲液，待样品融化后涡旋振荡1min，然后在4℃下采用1000r/min的速度离心5min，吸取上清液；样品重复震荡、离心、取上清液三次；
将四次融化洗涤后所得上清液在4℃下采用12000r/min的速度离心10min，弃掉离心管上层清液，向每管底部沉淀均加入1.7mlTE缓冲液，混匀后吸取液体至同一个10ml的灭菌离心管中，充分震荡混匀，形成细胞悬液；
(3)粪菌基因组DNA提取和纯化
取200uL细胞悬液置于无菌管中加入10ml经4℃预冷的PBS缓冲液；
加入200uL无菌玻璃小珠、200uL裂解液、200uL酚氯仿，借助10ul枪头将细胞悬浮，然后涡旋震荡1min，放在冰上1min，重复四次；
采用12000r/min的速度离心5min，吸取上清液，并在上清液中加入等体积的酚氯仿，颠倒混匀，去蛋白，再次采用12000r/min的速度离心5min；
加入3mg溶菌酶和100uL异硫氰酸胍，混匀后于37℃孵育1h；
加入蛋白酶K，混匀后于37℃孵育1h；
加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，抽提2次，在4℃下采用12000r/min的速度离心10min；
收集上清液，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，在4℃下采用12000r/min的速度离心3min；
吸取上清液，加入等体积的异丙醇，室温放置10min，采用12000r/min的速度离心10min；
弃上清液，留取沉淀物，在沉淀物中加入70％冰乙醇洗涤2次，自然干燥；
加入50uL的DEPC水，然后将产物置于-20℃的环境中保存。
特别的，粪菌基因组DNA提取和纯化过程中，裂解液的成分为：
体积浓度为2％的TritonX-100；
体积浓度为1％的表面活性剂十二烷基磺酸钠SDS；
100mmol/L的氯化钠；
10mmol/L、pH为7.8-8.2的Tris-HCl。
特别的，粪菌基因组DNA提取和纯化过程中，
酚氯仿中的苯酚、氯仿的体积比为25：24；
氯仿/异戊醇混合液中氯仿、异戊醇的体积比为24：1；
苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25﹕24﹕1。
粪菌样本采集过程中，利用离心管取样过程中伴随搅动，使样本更加均匀。
粪菌基因组DNA提取和纯化过程中，所述DEPC水为用焦碳酸二乙酯处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水。
结果分析：
首先，对同一样本提取所得的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，本发明的1-3泳道中的DNA聚集在23kb左右，且泳道干净，碎片较少没有弥散，这一点明显优于其它两种方法的结果。这表明本发明较传统的十六烷基三甲基溴化铵法即CTAB法和商业试剂盒法(Tiangen DNA提取试剂盒)能得到更加丰富的DNA种群信息，可更加全面地反映肠道微生物的多样性和群落结构组成，并且该方法操作步骤相对较少，稳定性好，因此是一种实用可靠的粪便微生物DNA提取方法，可广泛应用于肠道微生态的研究。
此外，用紫外分光光度计测量本发明、CTAB法、Tiangen DNA提取试剂盒法这三种方法所提取的DNA浓度和纯度，结果如下表：
结果同样证明本发明在提取的效率和准确率方面优势突出。
最后将三种方法提取到的粪便微生物总DNA用16S rDNA V3区通用引物进行PCR扩增，然后将PCR产物进行DGGE图谱多样性分析。结果如下表：
其中，本发明所提取DNA的丰富度为28，显著高于其它2种方法。并且，采用本方法所获得DNA的Shannon指数最高，表明所提取的DNA所反映的微生物多样性最高。
综上所述，本发明提取得到的DNA所代表细菌的丰富度和多样性显著提高，可全面地反映肠道微生物的多样性和群落结构，是一种较为理想的粪便微生物DNA提取方法。较其它已有方法，本发明减少了有机溶剂的使用，因而成本低廉且提取的微生物总DNA纯度较高；异硫氰酸胍可以迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酶，因此得到的DNA质量高。
上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。