本发明涉及一种重组杆状病毒毒株的构建，也涉及了一种PCV2的Cap重组标记蛋白表达，故本发明中涉及重组杆状病毒毒株的构建及其表达的重组标记蛋白在PCV2诊断、预防中的应用，隶属生物
技术领域：
兽医生物制品研制方面。
背景技术：
：猪圆环病毒(Porcinecircovirus,PCV)是一种无囊膜的小型单链环状DNA病毒，系环状病毒科、圆环病毒属成员，基因组大小在1800bp左右。根据致病性、抗原性和基因结构等的差异，猪圆环病毒一般分为圆环病毒1型(PCV1)和圆环病毒2型(PCV2)。PCV1临床不致病，而PCV2感染可导致多种临床疾病，能引起猪只发生皮炎肾病综合征、断奶仔猪多系统衰竭综合征、肉芽肿性肠炎和母猪繁殖障碍等一系列相关综合侯群，也称圆环病毒病(Porcinecircovirusdisease，PCVD)，PCVD给养猪业造成巨大经济损失。PCV2的基因组共编码11个开放阅读框架(Openreadingframes，ORFs)，其中功能上重要的是ORF1和ORF2。ORF2编码病毒的核衣壳(Cap)蛋白，是病毒的唯一结构蛋白，同时也是病毒主要的免疫原性蛋白，可以刺激机体产生中和性抗体。因此，关于PCV2基因工程疫苗的研究基本集中在ORF2基因。至今，疫苗免疫仍然是防控PCV2最主要的手段，国内市场上的疫苗主要为灭活苗，目前的疫苗所产生抗体不能与野毒抗体相区别等缺陷。为了能区分疫苗产生的抗体和野毒产生的抗体，国外的Beach和我国的黄立平等，分别将GLU、KT3标签和V5标签插入到PCV2ORF2的末端，构建了携带分子标记的毒株，该毒株既能产生Cap蛋白又能产生标签蛋白，利用标签抗体作为检测抗体能够将标签毒株和亲本毒株区分开来(Beachetal.,2011；黄立平，2013)。然而他们在引入标签中用的融合PCR方法，至少使用了3对引物，操作过程繁琐，且耗时费力。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是：通过基因工程技术向特定基因位点引入可遗传的标记，将重组基因克隆至杆状病毒载体。其次，提供一种杆状病毒重组毒株，重组毒株在昆虫细胞中所表达的Cap标记蛋白具有良好的免疫原性，可作为PCV2亚单位疫苗和PCV2特异性抗体诊断的抗原。本发明的技术方案是：一种猪圆环病毒二型Cap标记蛋白的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建方法，包含以下步骤：(1)将PCV2GZ-RH1株(GenBank登录号：JQ809464)全基因克隆至pMD19-T载体，设计引物以重组T载体为模板通过PCR技术将V5Tag或FlagTag标签引入至PCV2的ORF2末端；(2)将携带标签的ORF2亚克隆至pFastBacHTA、pFastBacDual供体质粒，将亚克隆所得的阳性质粒转化入DH10Bac感受态细胞进行Bacmind杆粒的制备；(3)将Bacmind杆粒转染昆虫细胞，获得重组昆虫杆状病毒，重组昆虫杆状病毒扩增至P3代病毒。所述的引物为引物对F2/R2；F2、R2的基因序列如SeqIDNO.4、SeqIDNO.5所示；SeqIDNO.4：5′-GGATCCACTCAGTAATTTATTTCATATGGA-3′；SeqIDNO.5：5′-AAGCTTCTTTTTATCACTTCGTAATGGTTTTTATTATTCATTACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3′。所述的引物为引物对F3/R3，F3、R3的基因序列如SeqIDNO.6和SeqIDNO.7所示：SeqIDNO.6：5′-GGATCCACTCAGTAATTTATTTCATATGGA-3′；SeqIDNO.7：5′-AAGCTTACCTTTTTATCACTTCGTAATGGTTTTTATTATTCATTAGATTACAAGGATGACGACGATAAGAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3′。设计特异性引物对PCV2的ORF2进行PCR扩增，使ORF2携带标记，通过构建携带标记的ORF2重组杆状病毒表达载体转染昆虫细胞获得杆状病毒，并对携带标记的ORF2所编码的Cap标记蛋白进行生物学特性分析。本发明的有益效果：本发明分别只设计了1对引物即成功地将V5或Flag标签带入了ORF2的末端，该方法高效简便，为今后标记基因的引入提供了更好的实验操作方法；本发明为进一步进行PCV2亚单位标记疫苗、诊断抗原及其分子生物学研究奠定一定基础。附图说明图1为PCV2Cap标记蛋白的重组杆状病毒表达载体构建流程图；图2为PCV2全基因PCR扩增及T克隆质粒鉴定结果；M：DL2000DNAMarker；1：PCV2全基因PCR产物；2：PCV2全基因T克隆质粒PCR鉴定；3：PCV2全基因T克隆质粒双酶切鉴定；图3为pMD19-T-PCV2-V5、pMD19-T-PCV2-Flag构建鉴定结果；M：DL2000DNAMarker；1：PCV2-V5PCR扩增产物；2：PCV2-FlagPCR扩增产物；3：pMD19-T-PCV2-V5质粒PCR鉴定；4：pMD19-T-PCV2-Flag质粒PCR鉴定；5：pMD19-T-PCV2-V5质粒双酶切鉴定；6：pMD19-T-PCV2-Flag质粒双酶切鉴定；图4为pMD19-T-ORF2-V5、pMD19-T-ORF2-Flag构建鉴定结果；M：DL2000DNAMarker；1：ORF2-V5(两端引入BamHⅠ、HindⅢ)PCR扩增产物；2：ORF2-V5(两端引入SphⅠ、XhoⅠ)PCR扩增产物；3：ORF2-Flag(两端引入BamHⅠ、HindⅢ)PCR扩增产物；4：pMD19-T-ORF2-V5(两端引入BamHⅠ、HindⅢ)质粒PCR鉴定；5：pMD19-T-ORF2-V5(两端引入SphⅠ、XhoⅠ)质粒PCR鉴定；6：pMD19-T-ORF2-Flag(两端引入BamHⅠ、HindⅢ)质粒PCR鉴定；7：pMD19-T-ORF2-V5用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定；8：pMD19-T-ORF2-V5用SphⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定；9：pMD19-T-ORF2-Fla用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定；图5为pFastBacDual-ORF2-V5、pFastBacHTA-ORF2-V5与pFastBacHTA-ORF2-Flag转移载体构建鉴定结果；M：DL5000DNAMarker；1：pFastBacDual-ORF2-V5-ORF2-V5用SphⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定；2：pFastBacHTA-ORF2-V5用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定；3：pFastBacHTA-ORF2-Flag用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定；4：pFastBacDual-ORF2-V5质粒PCR鉴定；5：pFastBacHTA-ORF2-V5质粒PCR鉴定；6：pFastBacHTA-ORF2-Flag质粒PCR鉴定；图6为pFastBacDual-ORF2-V5-ORF2-Flag转移载体构建鉴定结果；M：DL2000DNAMarker；1：pFastBacDual-ORF2-V5-ORF2-Flag质粒；2：pFastBacDual-ORF2-V5-ORF2-Flag用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定；3：pFastBacDual-ORF2-V5-ORF2-Flag质粒PCR鉴定；图7为穿梭质粒制备鉴定结果；M：DL5000DNAMarker；1：Bacmid-Cap-V5-Cap-Flag质粒PCR鉴定；2：Bacmid-Cap-V5质粒PCR鉴定；3：Bacmid-Cap-Flag质粒PCR鉴定质粒；图8为接毒前后Sf9细胞生长状态比较(400×)；A：接杆状病毒前；B：接杆状病毒后72h；图9为IFA检测结果；A1～A4依次为Sf9细胞接rBacmid-Cap-V5毒株48h后：以PCV2Cap高免血清、V5标签单克隆抗体和PBS为一抗的IFA检测结果；B1～B3依次为Sf9细胞接rBacmid-Cap-Flag毒株48h后：以PCV2Cap高免血清、Flag标签单克隆抗体和PBS为一抗的IFA检测结果；C1～C3依次为Sf9细胞接rBacmid-Cap-V5-Cap-Flag毒株48h后：以PCV2Cap高免血清、V5标签单克隆抗体、Flag标签单克隆抗体和PBS为一抗的IFA检测结果；图10为接毒后细胞培养物Western-blotting检测结果；M：蛋白Marker；1、4和7：阴性对照；2：V5单克隆抗体为一抗，接rBacmid-Cap-V5毒株的Sf9细胞培养物WB检测；3：PCV2Cap高免血清为一抗，接rBacmid-Cap-V5毒株的Sf9细胞培养物WB检测；5：PCV2Cap高免血清为一抗，接rBacmid-Cap-Flag毒株的Sf9细胞培养物WB检测；6：Flag单克隆抗体为一抗，接rBacmid-Cap-V5杆粒转染获得的杆状病毒的Sf9细胞培养物WB检测；8～10：依次为V5单克隆抗体、Flag单克隆抗体、PCV2Cap高免血清为一抗，接rBacmid-Cap-V5-Cap-Flag毒株的Sf9细胞培养物WB检测。具体实施方式1材料■1.1毒株、质粒和细胞由贵州大学动物疫病研究所分离并保存的病毒PCV2GZ-RH1株；DH10Bac大肠杆菌感受态、Sf9细胞、pFastBacHTA、pFastBacDual质粒为Invitrogen公司产品；Top10大肠杆菌感受态、pMD19-TSimpleVector为宝生物工程(大连)有限公司产品。■1.2主要试剂TaKaRaMinBESTViralDNA/RNAExtractionKitVer.5.0核酸提取试剂盒、DNADL2000Marker、DNADL5000Marker、TaKaRaLATaq酶、PrimeScriptOneStepRT-PCRKitVer.2试剂盒、T4DNA连接酶、限制性内切酶XhoI、SphI、HindⅢ和BamHI等系宝生物工程(大连)有限公司产品；E.Z.N.A.TMGelExtractionKit(50)胶回收试剂盒系Omega公司产品；QuickPurePlasmidMinikit快速质粒小提试剂盒康为世纪生物科技有限公司产品；Grace昆虫细胞培养基(不含添加剂)、Sf-900IISFM培养基、脂质体转染试剂盒CellfectinII、PureLinkHiPure质粒大量提取试剂盒等系Invitrogen公司产品；硫酸卡那霉素、庆大霉素、硫酸卡那霉素、氨苄青霉素钠、HRP-羊抗猪IgG和HRP-羊抗鼠IgG为北京索莱宝科技有限公司产品，100×青霉素-链霉素溶液、TissueorCellTotalProteinExtractionKit动物全蛋白提取试剂盒、ECL超敏化学发光试剂盒、快速感受态细胞制备试剂盒(一步法)为上海生工生物工程(上海)股份有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯。■1.3主要实验仪器SW-CJ-IFD型单人单面超净工作台，苏州净化设备有限公司；CO2培养箱(3111)和-80℃超低温冰箱(702)，美国ThermoFisher有限公司；高速冷冻离心机，Heraens有限公司；倒置显微镜(CKX-41)，OLYMPUS公司；PCR扩增仪(TC-512)，TECHNE公司；水平电泳仪和电泳槽(DYY-7C)，北京市六一仪器厂；垂直电泳仪和电泳槽(Minn-PROTEA10Tetracell)，美国伯乐(Bio-RadLaboratories)公司；GelDOCXR凝胶成像系统(UniversityHoodⅡ)，美国伯乐(Bio-RadLaboratories)公司。2方法■2.1引物设计根据GenBank中PCV2序列以及有关文献，设计了7对引物，引物序列如表2-1。表2-1本研究中所使用的引物注：带下划线的引物序列系V5、Flag标签序列，斜体加粗为限制性核酸内切酶酶切位点。■2.2PCV2Cap标记蛋白的重组杆状病毒表达载体的构建策略PCV2Cap标记蛋白的重组杆状病毒表达载体的构建策略(如图1所示，该图参照Bac-to-Bac表达系统操作手册绘制)：首先，通过PCR技术将V5、Flag标签分别引入PCV2ORF2的末端，再分别通过PCR技术获得携带相应酶切位点的PCV2的ORF2-V5、ORF2-V5Flag片段，将ORF2-V5、ORF2-V5Flag片段亚克隆至pFastBac供体质粒上转化入DH10Bac感受态细胞后获得Bacmind-Cap-V5、Bacmind-Cap-Flag、Bacmind-Cap-V5-Cap-Flag重组杆粒。通过所获得的杆粒转染昆虫细胞获得重组杆状病毒毒株rBacmind-Cap-V5、rBacmind-Cap-Flag、rBacmind-Cap-V5-Cap-Flag，进而验证Cap标记蛋白的表达情况。■2.3pMD19-T-ORF2-V5、pMD19-T-ORF2-Flag质粒的构建及鉴定■2.3.1病毒DNA的提取参照MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0核酸提取试剂盒操作说明，从病毒原液中提取病毒核酸，-80℃超低温冰箱保存备用。2.3.2感受态细胞的制备参照快速感受态细胞制备试剂盒(一步法)操作说明，制备Top10、DH10Bac感受态细胞，分装后-80℃保存备用。2.3.3pMD19-T-PCV2质粒的构建以2.3.1中所提DNA为模板，用F1/R1引物进行PCR扩增，以获得PCV2全长基因组，其反应体系如下：10×LATaqBuffer5.0μL10μMprimerR/F各2μLdNTPMixture8.0μLDNA5.5μLLATaq聚合酶0.5μLddH2O29.0μL总体积50.0μL程序如下：94℃5min；94℃1min，57℃40sec，72℃2min，共35个循环；72℃10min。将PCR产物进行电泳并根据E.Z.N.A.TMGelExtractionKit剂盒说明书纯化回收，将离心管中回收的目的DNA溶液置于-20℃冰箱中保存备用。将上述胶回收纯化后的目的基因连接至pMD19-TSimpleVector载体上，16℃连接过夜，连接体系如下：SolutionⅠ5.0μL目的片段4.5μLpMD19-TSimpleVector0.5μL总体积10.0μL将上述连接液转化至Top10感受态细胞，转化步骤参照《分子克隆实验指南》(第四版，作者：M.R.格林、J.萨姆布鲁克，科学出版社出版，2013年11月)，菌夜所涂LB琼脂平板过夜培养。从上述LB琼脂平板上挑取单菌落接种于5mL含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃200rpm/min恒温振荡培养12h。参照康为世纪生物科技有限公司的QuickPurePlasmidMinikit快速质粒小提试剂盒操作说明书抽提菌液质粒DNA，后收集质粒DNA，-20℃保存。取4uL上述方法所提质粒上样于1.5％琼脂糖凝胶胶孔内，75V电泳50min后，于凝胶成像系统中观察并拍照。将经琼脂糖凝胶电泳初步检测为阳性的克隆质粒DNA，分别进行质粒PCR鉴定及双酶切鉴定。质粒PCR反应体系如下：10×LATaqBuffer2.5μL引物F1/R1各1μLdNTPMixture4.0μL100倍稀释的克隆质粒DNA4.5μLLATaq聚合酶0.25μLddH2O11.75μL总体积25.0μL质粒PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火40sec，72℃延伸2min，共35个循环；72℃终延伸10min。质粒DNA双酶反应体系如下：10×KBuffer2.0μL克隆质粒DNA10.0μLHindⅢ1.0μLBamHⅠ1.0μLddH2O6.0μL总体积20.0μL酶切条件：37℃水浴孵育4h。将质粒PCR产物与双酶切产物各取6μL，分别用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测后，鉴定为阳性的重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司，测序鉴定。2.3.4pMD19-T-PCV2-V5、MD19-T-PCV2-Flag质粒的构建以2.3.3中经测序鉴定后的pMD19-T-PCV2质粒为模板(100倍稀释)，用F2/R2引物分别进行PCR扩增，从而将V5标签PCV2-ORF2末端。反应体系如下：反应条件如下：94℃5min；94℃1min，60℃40sec，72℃2min，共35个循环；72℃10min。参照2.3.3的方法：将PCR产物进行电泳和纯化回收，把纯化回收的DNA连至pMD19-TSimpleVector载体，将连接产物转化至Top10大肠杆菌中，将转化后的Top10大肠杆菌菌液均匀地涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37℃温箱中过夜培养。次日，于平板上挑取阳性菌落，并于含氨苄的LB液体培养基中37℃进行增菌培养。待菌液浑浊后根据提取质粒。用F2/R2(F3/R3)引物对上述所提质粒进行质粒PCR，条件同上，体系减半为25μL(所有试剂和模板均减半)，电泳检测PCR产物；用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶对构建的质粒进行双酶切鉴定，条件和体系如下：10×KBuffer2.5μLpMD19-T-PCV2-V5(pMD19-T-PCV2-Flag)10μLHindⅢ1μLBamHⅠ1μLddH2O10.5μL总体积25.0μL于37℃酶切作用4h，酶切产物进行电泳检测。将质粒PCR和双酶切鉴定为阳性的质粒送至宝生物工程(大连)有限公司进行测序。■2.4重组转移载体的构建及鉴定2.4.1ORF2-V5、ORF2-Flag的T克隆以构建的pMD19-T-PCV2-V5和pMD19-T-PCV2-Flag重组质粒稀释100倍后作为模板，用F4/R4、F5/R5、F6/R6引物进行扩增反应，以获得ORF2-V5和ORF2-Flag，条件体系如下：反应条件如下：94℃5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，共35个循环；72℃10min。参照2.3.3的方法：将PCR产物进行电泳和纯化回收，把纯化回收的DNA连至pMD19-TSimpleVector载体，将连接产物转化至Top10大肠杆菌中，将转化后的Top10大肠杆菌菌液均匀地涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37℃温箱中过夜培养。次日，于平板上挑取阳性菌落，并于含氨苄的LB液体培养基中37℃进行增菌培养。待菌液浑浊后根据提取质粒。同理，用F4/R、F5/R5、F6/R6三对引物对上述所提质粒进行质粒PCR鉴定，体系减半为25μL(所有试剂和模板均减半)，扩增条件不变。用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对pMD19-T-ORF2-V5、pMD19-T-ORF2-Flag重组质粒分别进行双酶切鉴定、用限制性内切酶SphⅠ和XhoⅠ对pMD19-T-ORF2-V5重组质粒进行双酶切鉴定，条件和体系如下：10×KBuffer2.5μLpMD19-T-ORF2-V5(pMD19-T-ORF2-Flag)10.5μLHindⅢ(SphⅠ)1μLBamHⅠ(XhoⅠ)1μLddH2O10.0μL总体积25.0μL于37℃酶切作用4h。将酶切产物和质粒PCR产物进行电泳检测。将经质粒PCR和双酶切鉴定为阳性的质粒送至宝生物工程(大连)有限公司进行测序。2.4.2pFastBacHTA-ORF2-V5、pFastBacHTA-ORF2-Flag与pFastBacDual-ORF2-V5的构建及鉴定将2.4.1中构建的pMD19-T-ORF2-V5、pMD19-T-ORF2-Flag分别用限制性内切酶BamHⅠ与HindⅢ进行双酶切、pMD19-T-ORF2-V5用限制性内切酶SphⅠ与XhoⅠ进行双酶切，条件体系如下：于37℃酶切作用4h，将酶切产物的ORF2-V5和ORF2-Flag片段进行电泳后纯化回收，把纯化回收产物保存于-20℃备用。同时，用限制性内切酶BamHⅠ与HindⅢ对质粒pFastBacHTA、pFastBacDual进行双酶切、用限制性内切酶SphⅠ与XhoⅠ对质粒pFastBacDual进行双酶切，条件体系如下：10×KBuffer5.0μLpFastBacHTA、pFastBacDual21.0μLHindⅢ(SphⅠ)2.0μLBamHⅠ(XhoⅠ)2.0μLddH2O20.0μL总体积50.0μL于37℃酶切作用4h，分别将酶切产物进行电泳并纯化回收。把纯化回收产物保存于-20℃备用。将上述回收产物用T4连接酶进行连接：将经过BamHⅠ与HindⅢ酶切回收的ORF2-V5和pFastBacHTA连接，将经过BamHⅠ与HindⅢ酶切回收的ORF2-Flag和pFastBacHTA连接，将经过SphⅠ与XhoⅠ酶切回收的ORF2-V5和pFastBacDual连接，条件体系如下：10×T4DNALigaseBuffer2.0μLORF2-V5(ORF2-Flag)16.8μLpFastBacHTA(pFastBacDual)载体1.0μLT4DNALigase0.2μL总体积20.0μL于16℃连接，过夜。取10μL连接产物转化至Top10大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性菌落进行增菌培养，提取质粒，用F4/R4、F5/R5、F6/R6引物对相应的质粒进行质粒PCR鉴定。同时，用相应的限制性内切酶进行双酶切鉴定。其中质粒PCR鉴定条件同2.4.1，体系减半为25μL；双酶切鉴定条件同上，体系减为25μL。将酶切产物和质粒PCR产物进行电泳检测。将经质粒PCR和双酶切鉴定为阳性的pFastBacHTA-ORF2-V5、pFastBacHTA-ORF2-Flag与pFastBacDual-ORF2-V5质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。2.4.2共表达转移载体pFastBacDual-ORF2-V5-ORF2-Flag的构建及鉴定将2.4.1中构建的pFastBacDual-ORF2-V5用限制性内切酶BamHⅠ与HindⅢ进行双酶切后，纯化回收酶切产物，将其与2.4.1中保存的ORF2-Flag用T4连接酶进行连接，条件体系如下：10×T4DNALigaseBuffer2.0μLORF2-Flag16.8μLpFastBacDual-ORF2-V51.0μLT4DNALigase0.2μL总体积20.0μL于16℃连接，过夜。取10μL连接产物转化至Top10大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性菌落进行增菌培养，提取质粒，用F6/R6引物进行质粒PCR鉴定。同时，用限制性内切酶BamHⅠ与HindⅢ进行双酶切鉴定。其中质粒PCR鉴定条件同2.4.1，体系减半为25μL；双酶切鉴定条件同上，体系减为25μL。将酶切产物和质粒PCR产物进行电泳检测。将经质粒PCR和双酶切鉴定为阳性的共表达重组转移载体pFastBacDual-ORF2-V5-ORF2-Flag送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。■2.5Bacmid-Cap-V5、Bacmid-Cap-Flag和Bacmid-Cap-V5-Cap-Flag的制备将经测序鉴定构建成功的pFastBacHTA-ORF2-V5、pFastBacHTA-ORF2-Flag和pFastBacDual-ORF2-V5-ORF2-Flag重组转移载体转化入DH10Bac感受态细胞中(方法同2.3.3)。将转化后的DH10Bac大肠杆菌菌液均匀地涂布于含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素、100μg/mLBluo-gal和40μg/mLIPTG的LB琼脂板上，于37℃温箱中过夜培养48h，于平板上挑取挑选白斑菌落，并于含50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素的LB液体培养基中，37℃恒温恒湿培养箱增菌培养12h。待菌液浑浊后根据提取质粒。用F7/R7引物对上述提取的100倍稀释后杆粒进行PCR扩增鉴定，条件与体系如下：10×LATaqBuffer5.0μLF7/R7各2μLdNTPMixture8.0μL稀释100倍的rBacmid杆粒5.0μLLATaq聚合酶1μLddH2O27μL总体积50.0μL反应条件如下：94℃5min；94℃1min，58℃3min30sec，72℃1min30sec，共35个循环；72℃10min。反应结束后取出6μL，利用琼脂糖凝胶电泳进行分析。PCR鉴定构建正确后，参照Invitrogen公司的PureLinkHiPure质粒大量提取试剂盒说明提取质粒，将纯化的杆粒DNA置于4℃下保存。■2.6Sf9细胞的培养将Sf900ⅡSFM培养液、抗生素(100×青霉素-链霉素溶液)、细胞培养瓶及移液管等放入生物安全柜内，紫外线照射30min。快速地从液氮中取出Sf9昆虫细胞，置于40℃温水中，快速解冻。解冻后，迅速将细胞转移至装有5mLSf900ⅡSFM培养液的15mL灭菌离心管中，3000rpm室温离心5min，弃上清，加入5mLSf900ⅡSFM培养液，反复吹打细胞沉淀使细胞分散呈单个悬浮散在，转入细胞培养瓶中，静置于27℃无CO2恒温恒湿培养箱中培养至细胞贴壁，倒出旧培养液，再次加入5mL新的Sf900ⅡSFM培养液。每天在倒置显微镜下观察并记录细胞的生长情况。当细胞分裂、生长至铺满细胞瓶壁后，传代培养。后期使用加有10％FBS的Grace昆虫细胞培养基对Sf9细胞进行培养，且选择存活率>95％的对数期细胞进行转染。■2.7细胞转染及病毒粒子收集按照CellfectinII脂质体转染试剂盒说明操作，将2.5中抽提的经PCR鉴定正确的rBacmid-Cap-V5、rBacmid-Cap-V5及rBacmid-Cap-V5-Cap-Flag杆粒转染至Sf9细胞处于对数期(1.5～2.5×106个细胞/mL)，且存活率高于95％，27℃孵育培养，孵育4～5d后细胞出现明显病变时，收获转染细胞的上清，即为P1代毒。将病毒液置于4℃，避光保存，用于扩增种毒。细胞的病变将出现三个时期：早期(24h)，细胞直径增加，可以看到直径增大了25％-50％，细胞核增大，可能充满整个细胞；后期(24-72h)，细胞停止增长，细胞体积不再增大；极后期(＞72h)，细胞破裂，出现细胞凋亡。转染的过程如下：(1)在6孔板中进行转染在每孔中加入2mL不含添加剂的Grace昆虫细胞培养基(无抗生素和血清)。每孔中接种约8×105个(约0.5mL)Sf9细胞(注：切勿更换培养基或漂洗细胞，残留的培养基将提升转染效率)。室温下，置于生物安全柜中，使细胞贴壁15min。(2)对于每种转染样本，按下列方法制备复合物：a.使用前混匀CellfectinII，取8μL稀释于100μL不含添加剂的Grace培养基中(无抗生素、血清)，短暂涡旋混匀后将该混合物置于室温30min。b.取1μL杆粒稀释于100μL不含添加剂的Grace培养基中(无抗生素、血清)，轻轻混匀。c.将稀释后的杆粒与稀释的CellfectinII混合(总体积约210μL)，轻轻混匀，并在室温下孵育15～30min。(3)逐滴(2)c制作好的杆粒-脂质体混合物或转染混合物至(1)细胞中。27℃下孵育细胞5h。(4)吸出转染混合物，加入2mL完全培养基(含有添加剂的Grace昆虫细胞培养基和10％FBS)，并可向培养液中加入100×青霉素-链霉素溶液。(5)27℃孵育细胞72h，直至观察到病毒感染征象。(6)收集病变的细胞及其培养液，500r/min离心10min，收集上清，4℃避光保存，即为P1代重组杆状病毒。病毒的扩增：将P1代重组杆状病毒按5％的体积比感染处于对数生长期的Sf9昆虫细胞，27℃培养3～5d，至细胞出现明显病变时，吹打细胞使其脱落，分装于15mL离心管中，500r/min离心10min，收集上清，4℃避光保存，即得到P2代病毒。扩增至P2代病毒时，提取病毒DNA，用特异性引物对其进行PCR扩增，以确定外源基因是否整合到杆状病毒基因组中去。P3、P4代毒的获得亦如此。■2.8感染杆状病毒的Sf9细胞的IFA检测将长势良好的Sf9细胞转移至12孔板中(2mL/孔)，待六孔板中细胞培养24时，向每孔内接种50μL的P2代杆状病毒毒液，且以50μL细胞营养液作为阴性对照。接毒60h后，以猪抗PCV2Cap高免血清、His标签单克隆抗体、V5标签单克隆抗体、Flag标签单克隆抗体用PBS稀释(1:40)和PBS(阴性对照)作为一抗，并以羊抗猪IgG-FITC为二抗进行间接免疫荧光试验(IFA)试验步骤如下：(1)固定：取出六孔板，用灭菌PBS(PH＝7.4)清洗3次，且每次5min。清洗完后，将六孔板置于室温自然干燥后每孔加入-20℃预冷的70％的丙酮2mL，室温静止15min。(2)封闭：用灭菌PBS(PH＝7.4)清洗3次，每次5min，清洗完毕后每孔加入2mL新配制的含5％脱脂奶的PBS，于37℃恒温箱中2h。(3)封闭结束，用灭菌PBS(PH＝7.4)清洗3次，每孔加入1mL按1:40稀释的抗体，于37℃恒温箱中放置1h。(4)一抗作用完毕，取出六孔板用灭菌PBS(PH＝7.4)清洗3次，每次5min。在避光处，每孔加入1mL酶标二抗，于避光的37℃恒温箱中孵育1h。(5)二抗作用完毕后，取出六孔板于避光处，用灭菌PBS(PH＝7.4)清洗3次，每次5min。清洗完毕立即置于间接免疫荧光显微镜下观察、拍照记录结果。■2.9小量表达及感染细胞的Western-blotting检测扩增至P3代病毒时，收集细胞培养物进行处理，进行聚丙烯酞胺凝胶电泳上样量(40μg/孔)后，以猪抗PCV2Cap高免血清、His标签单克隆抗体、V5标签单克隆抗体、Flag标签单克隆抗体为一抗，并以羊抗猪HRP标记的相应二抗，进行Western-blotting分析：(1)总蛋白制备：收集细胞培养物，加入PMSF蛋白酶抑制剂至终浓度为100μg/mL，用超声波破碎仪将细胞裂解，4℃，3000rpm离心10min。(2)取上清，加2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5min，4℃，12000rpm离心10min。(3)制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶，其中浓缩胶按5％浓度制备，分离胶按10％浓度制备。(4)电泳：上样量40μg/孔，浓缩胶80V30min，分离胶120V通过预染蛋白Marker确定电泳终止时间。(6)转膜：半干转印，300mA，转膜时间为1h。(7)封闭：将膜完全浸没5％新配制脱脂奶，于37℃轻摇1h。(8)孵育一抗：用5％新配制脱脂奶稀释一抗，室温孵育15min，放4℃过夜。(9)洗涤：按10min/次，用TBST洗膜4次。(10)孵育二抗：用5％新配制脱脂奶稀释二抗，1:8000稀释，加入与一抗对应的HRP标记二抗，室温轻摇60h。(11)洗涤：按10min/次，用TBST洗膜4次，。(12)ECL曝光显示，观察结果。3结果与分析■3.1pMD19-T-ORF2-V5、pMD19-T-ORF2-Flag质粒的构建及鉴定■3.1.1pMD19-T-PCV2质粒的构建参照MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0核酸提取试剂盒操作说明，提取病毒核酸后用F1/R1引物进行PCR扩增，经电泳检测，条带在1800bp左右，与预期大小相符。将获得的PCV2GZ-RH1株病毒全基因克隆至pMD19-T载体，经氨苄抗性筛选、质粒PCR鉴定、双酶切鉴定表明pMD19-T-PCV2载体构建成功(结果见图2)；重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司测序鉴定，序列为1767bp；经生物信息学软件比对，结果正确。3.1.2pMD19-T-PCV2-V5、pMD19-T-PCV2-Flag质粒的构建以经测序鉴定后的pMD19-T-PCV2质粒为模板(100倍稀释)，用F2/R2、F3/R3两对引物分别进行PCR扩增，从而将V5与Flag标签分别PCV2-ORF2末端，将该产物连至pMD19-T载体，经氨苄抗性筛选、质粒PCR鉴定、双酶切鉴定表明pMD19-T-PCV2-V5、pMD19-T-PCV2-Flag重组质粒构建成功，结果见图3；重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司测序鉴定，序列正确。结果表明，V5与Flag标签成功引入PCV2。■3.2重组转移载体的构建及鉴定3.2.1ORF2-V5、ORF2-Flag的T克隆以所构建正确的pMD19-T-PCV2-V5和pMD19-T-PCV2-Flag重组质粒作为模板，用F4/R4、F5/R5、F6/R6引物进行PCR扩增反应，以获得两端携带不同酶切位点的ORF2-V5和ORF2-Flag目的片段。将PCR产物连至pMD19-T载体，经氨苄抗性筛选、质粒PCR鉴定，用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对pMD19-T-ORF2-V5、pMD19-T-ORF2-Flag重组质粒分别进行双酶切鉴定、用限制性内切酶SphⅠ和XhoⅠ对pMD19-T-ORF2-V5重组质粒进行双酶切鉴定(结果见图4)；重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司测序鉴定，序列正确，序列碱基无错配、缺失、突变。鉴定表明pMD19-T-ORF2-V5、pMD19-T-ORF2-Flag重组质粒构建成功。3.2.2pFastBacHTA-ORF2-V5、pFastBacHTA-ORF2-Flag与pFastBacDual-ORF2-V5的构建及鉴定将所构建成功的pMD19-T-ORF2-V5、pMD19-T-ORF2-Flag重组质粒和供体质粒pFastBacHTA分别用限制性内切酶BamHⅠ与HindⅢ进行双酶切，供体质粒pFastBacDual和构建成功的重组质粒pMD19-T-ORF2-V5用限制性内切酶SphⅠ与XhoⅠ进行双酶切，将酶切所获得的目的条带回收后用T4连接酶进行连接，连接产物转化至Top10大肠杆菌感受态细胞。经过抗性筛选，提取质粒进行PCR鉴定、双酶切鉴定后(结果见图5)，送至宝生物工程(大连)有限公司测序鉴定，序列正确。结果表明，pFastBacHTA-ORF2-V5、pFastBacHTA-ORF2-Flag与pFastBacDual-ORF2-V5转移载体构建成功。3.2.3共表达转移载体pFastBacDual-ORF2-V5-ORF2-Flag的构建及鉴定将上述构建的pFastBacDual-ORF2-V5用限制性内切酶BamHⅠ与HindⅢ进行双酶切后，将其与2.4.1中回收保存的ORF2-Flag用T4连接酶进行连接，取连接产物转化至Top10大肠杆菌感受态细胞。经过氨苄抗性筛选，提取质粒进行PCR鉴定、双酶切鉴定后(结果见图6)，送至宝生物工程(大连)有限公司测序鉴定，序列正确。结果表明，pFastBacDual-ORF2-V5-ORF2-Flag转移载体构建成功。■3.3Bacmid-Cap-V5、Bacmid-Cap-Flag和Bacmid-Cap-V5-Cap-Flag的制备将经测序鉴定构建成功的pFastBacHTA-ORF2-V5、pFastBacHTA-ORF2-Flag和pFastBacDual-ORF2-V5-ORF2-Flag重组转移载体转化入DH10Bac感受态细胞中。经过卡那霉素、庆大霉素、四环素抗性和蓝白斑反复筛选三次，提取质粒，用F7/R7(pUC/M13正向和反向)引物进行质粒PCR扩增(结果见图7)，结果显示获得了Bacmid-Cap-V5、Bacmid-Cap-Flag和Bacmid-Cap-V5-Cap-Flag杆状病毒质粒。■3.4细胞转染及病毒粒子收集按照CellfectinII脂质体转染试剂盒说明操作，将2.5中抽提的经PCR鉴定正确的杆粒转染至Sf9细胞处于对数期(1.5～2.5×106个细胞/mL)中，4d后细胞出现明显病变，收获转染细胞的上清，得到了P1代毒，并继续传代至P3代，且将所获得的三株重组杆状病毒依次命名为rBacmid-Cap-V5、rBacmid-Cap-V5及rBacmid-Cap-V5-Cap-Flag。细胞的病变了出现三个时期：早期(24h)，细胞直径增加，可以看到直径增大了25％-50％，细胞核增大，可能充满整个细胞；后期(24-72h)，细胞停止增长，细胞体积不再增大；极后期(＞72h)，细胞破裂，出现细胞凋亡，结果见图8。■3.5感染杆状病毒的Sf9细胞的IFA检测在Sf9细胞接P2代毒后培养60h的IFA检测结果显示(如表3-1，如图9)，3组IFA试验均能在以PCV2Cap高免血清为一抗，接种三株杆状病毒的Sf9细胞胞浆内观察到明显的特异性荧光；3组IFA试验均能在分别以V5标签单克隆抗体、Flag标签单克隆抗体为一抗，接种三株杆状病毒的Sf9细胞胞浆内观察到明显的特异性荧光；以PBS为一抗的对照中均未观察到明显的特异性荧光。结果表明Sf9细胞成功感染了杆状病毒，并表达了携带标签的Cap蛋白。3.6Western-blotting试验结果收集处理对P2代重组杆状病毒感染70h后的Sf9细胞培养物进行Western-blotting试验分析，结果显示(如图10)，在分别以PCV2Cap高免血清、V5、Flag单克隆抗体为一抗，在接种P2代重组杆状病毒感染70h后的Sf9细胞培养物中检测到了30KDa左右的目的片段(His+Cap+V5或者His+Cap+Flag的分子量之和为30kDa左右)，在以接种营养液作为阴性对照的样品中未检测到特异性条带。结果表明表本研究成功利用Bac-to-Bac系统表达了携带V5和Flag标记的蛋白，且具有较好的抗原性，与PCV2Cap高免血清反应良好。序列表<110>贵州大学<120>一种猪圆环病毒二型Cap标记蛋白的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建方法<160>7<210>1<211>1767<212>DNA<213>PCV2GZ-RH1<400>1AATTCAACCTTAACCTTCCTTATTCTGTAGTATTCAAAGGGCACAGTGAGGGGGTTTGAG60CCCCCTCCTGGGGGAAGAAAATCATTAATATTAAATCTCATCATGTCCACATTCCAGGAG120GGCGTTCTGACTGTGGTTTTCTTGACAGTATAACCGATGGTGCGGGAGAGGCGGGTGTTG180AAGATGCCATTTTTCCTTCTCCAGCGGTAACGGTGGCGGGGGTGGACGAGCCAGGGGCGG240CGGCGGAGGATCTGGCCAAGATGGCTGCGGGGGCGGTGTCTTCGTCTGCGGAAACGCCTC300CTTGGATACGTCATCGCTGAAAACGAAAGAAGTGCGCTGTAAGTATTACCAGCGCACTTC360GGCAGCGGCAGCACCTCGGCAGCACCTCAGCAGCAACATGCCCAGCAAGAAGAGTGGAAG420AAGCGGACCCCAACCACATAAAAGGTGGGTGTTCACGCTGAATAATCCTTCCGAAGACGA480GCGCAAGAAAATACGGGAGCTCCCAATCTCCCTATTTGATTATTTTATTGTTGGCGAGGA540AGGTAATGAGGAGGGCCGAACACCCCACCTACAGGGGTTCGCTAATTTTGTGAAGAAGCA600AACTTTTAATAAAGTGAAGTGGTATTTTGGTGCCCGCTGCCACATCGAGAAAGCGAAAGG660AACAGATCAGCAGAATAAAGAATATTGCAGTAAAGAAGGCAACTTACTGATAGAATGTGG720AGCTCCTAGATCTCAAGGACAACGGAGTGACCTCTCTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGA780GAGCGGGAGTCTGGTGACCGTTGCAGAGCAGCACCCTGTAACGTTTGTCAGAAATTTCCG840CGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGAGCGGGAAAATGCAGAAGCGTGATTGGAAGACGAA900TGTACACGTCATTGTGGGGCCACCTGGGTGTGGCAAAAGCAAATGGGCTGCTAATTTTGC960AGACCCGGAAACCACATACTGGAAACCACCTAGAAACAAGTGGTGGGATGGTTACCATGG1020TGGAGAAGTGGTTGTTATTGATGACTTTTATGGCTGGCTGCCGTGGGATGATCCACTGAG1080ACTCTGTGATCGATATCCTTTGACTGTTGAGACTAAAGGTGGAACTGTACCTTTTTTGGC1140CCGCAGTATTCTGATTACCAGCAATCAGACCCCGTTGGAATGGTACTCCTCAACTGCTGT1200CCCAGCTGTAGAAGCTCTCTATCGGAGGATTACTTCCTTGGTATTTTGGAAGAATGCTAC1260AGAACAATCCACGGAGGAAGGGGGCCAGTTCGTCACCCTTTCCCCCCCATGCCCTGAATT1320TCCATATGAAATAAATTACTGAGTCTTTTTTATCACTTCGTAATGGTTTTTATTATTCAC1380CTAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAAATTCTCTGAATTGTACATACATGGTTATA1440CGGATATTGTAGTCCTGGTCGTATATACTGTTTTCGAACGCAGTGCCGAGGCCTACATGG1500TCTACATTTCCAGTAGTTTGTAGTCTCAGCCAGAGTTGATTTCTTTTGTTATTGGGTTGG1560AAGTAATCGATTGTCCTATCAAGGACAGGTTTCGGGGTAAAGTACCGGGAGTGGTAGGAG1620AAGGGCTGGGTTATGGTATGGCGGGAGGAGTAGTTTACATAGGGGTCATAGGTTAGGGCA1680TTGGCCTTTGTTACAAAGTTATCATCTAGAATAACAGCAGTGGAGCCCACTCCCCTGTCA1740CCCTGGGTGATTGGGGAGCAGGGCCAG1767<210>2<211>744<212>DNA<213>ORF2-V5<400>2ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTCCGCAGACGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGC60CAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGG120AAAAGTGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCATCGGTTATACCGTCAAGAAAACC180ACAGTCAGAACGCCCTCCTGGAATGTGGACATGATGAGATTTAATATTAATGATTTTCTT240CCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCTCACTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGGAAG300GCTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCAATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCC360ACTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCAATGCCCTAACCTATGACCCC420TATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGGTAC480TTTACCCCGAAACCTGTCCTTGATAGGACAATCGATTACTTCCAACCCAATAACAAAAGA540AATCAACTCTGGCTGAGACTACAAACCACTGGAAATGTAGACCATGTAGGCCTCGGCACT600GCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGACTACAATATCCGTATAACCATGTATGTACAA660TTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTGGTAAGCCTATCCCTAACCCT720CTCCTCGGTCTCGATTCTACGTAA744<210>3<211>726<212>DNA<213>ORF2-Flag<400>3ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTCCGCAGACGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGC60CAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGG120AAAAGTGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCATCGGTTATACTGTCAAGAAAACC180ACAGTCAGAACGCCCTCCTGGAATGTGGACATGATGAGATTTAATATTAATGATTTTCTT240CCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCTCACTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGGAAG300GTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCAATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCC360ACTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCAATGCCCTAACCTATGACCCC420TATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGGTAC480TTTACCCCGAAACCTGTCCTTGATAGGACAATCGATTACTTCCAACCCAATAACAAAAGA540AATCAACTCTGGCTGAGACTACAAACCACTGGAAATGTAGACCATGTAGGCCTCGGCACT600GCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGACTACAATATCCGTATAACCATGTATGTACAA660TTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTGATTACAAGGATGACGACGAT720AAGTAA726<210>4<211>30<212>DNA<213>人工合成<400>4GGATCCACTCAGTAATTTATTTCATATGGA30<210>5<211>106<212>DNA<213>人工合成<400>5AAGCTTCTTTTTATCACTTCGTAATGGTTTTTATTATTCATTACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT106<210>6<211>30<212>DNA<213>人工合成<400>6GGATCCACTCAGTAATTTATTTCATATGGA30<210>7<211>90<212>DNA<213>人工合成<400>7AAGCTTACCTTTTTATCACTTCGTAATGGTTTTTATTATTCATTAGATTACAAGGATGACGACGATAAGAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT90当前第1页1 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