本发明涉及植物生物技术领域，具体地，涉及一种高油酸转基因大豆事件E2D9050外源插入片段侧翼序列及其应用。
背景技术：
油酸是一类广泛存在于多种油料作物(如大豆、油菜、花生等)籽粒中的不饱和脂肪酸。研究表明，油酸具有重要的营养和保健功能。油酸能够降低人体血液中胆固醇的含量，减少其在血管上的沉积，有软化血管、预防动脉硬化等作用。营养界一般把油酸称为“安全脂肪酸”，油酸的含量多少，是评定食用油品质的重要标志。另外，由于脂肪酸不饱和程度较低，高比例的油酸可以有效提高食用油的稳定性。大豆种子油酸的含量一般为20～25％，而不饱和程度较高的亚油酸和亚麻酸比例则高达60％以上。尽管亚油酸被认为是一种重要的脂肪酸，而且对降低血液中胆固醇水平有一定作用，但富含亚油酸的植物油是高度不稳定的，当其暴露在空气中或烹调时产生的高温很容易发生过氧化作用，产生一些对健康有害的氧化产物，并伴有难闻的气味。同时在加工过程中易产生对人体有害的反式脂肪酸。与之相反的是，油酸是一种单价不饱和脂肪酸，其稳定性高，富含油酸的食用油可用于长时间的保存和高温烹调而不易氧化变质。再加上油酸本身所具有的营养和保健功能，使得油酸含量的多少在很大程度上决定了大豆优油脂的品质。因此，提高大豆油酸含量，培育高油酸大豆品种，对于提升大豆品质具有重要的意义。
在种子发育过程中，质体中的脂肪酸合成酶复合物催化乙酰CoA合成脂肪酸，并进入细胞质中合成三酯酰甘油。作为LA合成的前体，OA是多不饱和脂肪酸合成途径中最关键的步骤。Δ12-脂肪酸脱饱和酶(delta-twelve fatty acid desaturase 2 enzyme，FAD2，EC 1.3.1.35)是催化这一生化过程的关键酶，决定种子中多不饱和脂肪酸的含量。已有研究表明，抑制或过表达FAD2-1基因，可以显著改变油酸/亚油酸比例。Pham等研究发现，FAD2-1A和FAD2-1B双突变体大豆的油酸含量极显著提高(80％)。Zhang等通过反义RNA介导转录后基因沉默抑制大豆内源FAD2基因的表达，获得了油酸含量高达51.71％的转基因大豆。Wang等利用RNAi技术抑制大豆FAD2基因，获得了油酸含量为71.5％-81.9％的大豆品系。Haun等利用人工核酶技术(Transcription activator-like effector nucleases，TALEN)对大豆内源FAD2-1A和FAD2-1B进行定点突变，获得了油酸含量达80％的转基因大豆。吉林省农业科学院采用农杆菌介导法将外源RNAi GmFAD2-1B基因导入大豆栽培品种沈农9号(国审豆2007015)，获得高油酸转基因大豆事件E2D9050。连续多代脂肪酸组分分析表明，转基因大豆E2D9050油酸含量达到78.28％，显著高于受体品种沈农9号(油酸含量为19.74-21.15％)，提高2倍以上。另外，E2D9050亚油酸含量比对照降低50％以上，饱和脂肪酸-棕榈酸和硬脂酸降低至10.0％左右，其脂肪酸组成接近于橄榄油(油酸含量70～80％)。目前高油酸转基因大豆事件E2D9050已进入安全评价阶段，随着国家转基因生物新品种培育重大专项的推进，该转化事件及其衍生品种或品系有望进入商业化应用。
对转基因事件及其衍生品系或品种特异性检测，是实现转基因植物有效监督管理，保障转基因产业健康发展的重要技术手段。外源插入片段的侧翼序列和根据此侧翼序列建立的检测方法，是对转基因植物及其产品进行有效监督管理的一个重要依据。目前已经有相关专利和文献报道了转基因植物外源插入侧翼序列。张大兵等(2006)利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系MON863的外源插入片段的侧翼序列，建立了转基因MON863玉米的品系特异性检测方法。谢家建等(2007)利用TAIL-PCR、genome walking和LD-PCR等方法获得了转基因水稻克螟稻、Bt汕优863和科丰6号的外源插入片段的侧翼序列，杨正友等(2012)利用TAIL-PCR方法建立了转基因水稻品系SK-2的外源插入片段的侧翼序列，并建立了该品系特异性的检测方法。
对现有专利和文献进行分析，目前尚未发现高油酸转基因大豆事件E2D9050外源插入片段侧翼序列相关的文章和专利报道。本研究通过基因组重测序技术和PCR技术，获得转基因大豆事件E2D9050外源插入片段左、右边界侧翼序列，并依据其序列特征，建立该转化事件特异性检测方法，为高油酸转基因大豆事件E2D9050及其衍生品种或品系商业化应用提供依据。在此基础上，提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供高油酸转基因大豆事件E2D9050外源插入片段左、右边界侧翼序列。本发明还提供该转基因事件特异性检测方法。
本发明通过如下技术方案实现：
本发明提供的转基因大豆事件E2D9050外源插入片段左、右边界侧翼序列如SEQ-2和SEQ-3所示，其特征在于，由来源于大豆基因组序列和来源于外源插入片段序列组成的DNA序列。其中：
外源插入片段左边界侧翼序列特征包括：
(1)SEQ-2第1-521位点序列来源于栽培大豆沈农9号基因组序列；
(2)SEQ-2第522-966位点序列来源于外源插入片段序列。
外源插入片段右边界侧翼序列特征包括：
(1)SEQ-3第1-376位点序列来源于外源插入片段序列；
(2)SEQ-3第377-988位点序列来源于栽培大豆沈农9号基因组序列。
本发明提供的转基因大豆事件E2D9050外源插入片段左边界和右边界侧翼序列通过如下方式获得：(1)以高油酸转基因大豆事件E2D9050为材料，采用基因组重测序技术，并检索大豆基因组数据库(http：//soybase.org/)，确定外源片段在参考大豆基因组(Wm82.a2.v1)中的具体插入位置为Chr04号染色体51410941位点，插入方式为反向单拷贝插入，并获得插入位点在参考大豆基因组上游和下游～2kb序列，如SEQ-1所示。(2)根据参考大豆基因组中外源片段上游和下游序列及插入片段序列设计引物，以E2D9050基因组总DNA为模板进行PCR扩增，获得转基因大豆事件E2D9050外源插入片段左、右边界侧翼序列如SEQ-2和SEQ-3所示。所述序列由来源于大豆基因组序列和来源于外源插入片段序列组成的DNA序列。
鉴于转基因事件中外源片段在植物基因组中的整合具有随机性的特点，不同转基因事件其外源片段在基因组中的插入位点不同。对于特定的转基因事件来说，其侧翼序列是特异的。因此，利用插入片段侧翼序列可以对转基因事件进行特异性检测。如利用包含部分侧翼序列和部分外源插入片段序列的探针进行杂交，或是设计包含部分侧翼序列和部分外源插入片段序列的特异性引物进行PCR扩增等。
本发明提供转基因大豆事件E2D9050特异性检测方法或制备检测试剂盒。其特征在于，利用转基因大豆事件E2D9050外源插入片段左边界侧翼序列，设计特异性检测引物或制备特异性探针。其中一条引物为依据SEQ-2第1-521位点序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ-2第522-966位点序列设计的反向引物，即所述两条引物组合为权利要求书1所述外源插入片段左边界侧翼序列特异性检测引物。
作为优选，所述外源插入片段左边界侧翼序列特异性检测引物为：
所述正向引物为：5’-ACGAATGAATAGGAGCGAAGAAGG-3’(SEQ-4)
所述反向引物为：5’-TGGGAAAACCCTGGCGTTACCC-3’(SEQ-5)
本发明提供转基因大豆事件E2D9050特异性检测方法或制备检测试剂盒。其特征在于，利用转基因大豆事件E2D9050外源插入片段右边界侧翼序列，设计特异性检测引物或制备特异性探针。其中一条引物为依据SEQ-3第1-376位点序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ-3第377-988位点序列设计的反向引物，即所述两条引物组合为权利要求书1所述外源插入片段右边界侧翼序列特异性检测引物。
作为优选，所述外源插入片段右边界侧翼序列特异性检测引物为：
所述正向引物为：5’-AGAGGCGGTTTGCGTATTGGA-3’(SEQ-6)
所述反向引物为：5’-GTTGACAATAGAAATAGACCAAAATAACC-3’(SEQ-7)
本发明提供转基因大豆事件E2D9050外源插入片段左边界和右边界侧翼序列及特异性检测方法在转基因大豆事件E2D9050包括亲本、衍生品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品检测中的应用。根据E2D9050外源插入片段左边界侧翼序列设计特异性检测引物如SEQ-4和SEQ-5所示；或根据E2D9050外源插入片段右边界侧翼序列设计特异性检测引物如SEQ-6和SEQ-7所示。分别提取转基因大豆事件E2D9050根、茎、叶、花和种子DNA样品，并以受体非转基因大豆品种沈农9号及常规大豆品种作为对照，进行PCR扩增。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，并利用EB进行染色，以鉴定是否存在特异性扩增条带。所述转基因大豆事件E2D9050外源插入片段左边界扩增片段长度为391bp。所述转基因大豆事件E2D9050外源插入片段右边界扩增片段长度为173bp。
本发明中，转基因大豆事件E2D9050是利用农杆菌介导法将大豆GmFAD2-1B基因RNAi片段导入大豆栽培品种沈农9号获得的。E2D9050转化载体pTFi01-BCSP-GmFAD2-1Bi结构图谱如图1所示。所述载体携带GmFAD2-1B基因RNAi片段表达框和筛选标记基因BAR表达框。所述转化载体pTF101-BCSP-GmFAD2-1Bi和转基因大豆事件E2D9050公众可以从吉林省农业科学院获得。
本发明中，所述转基因大豆事件E2D9050特异性检测方法，PCR反应体系(25uL)为：10×PCR缓冲液2.5uL，10mmol/L dNTPs 0.5uL，5U/uL Taq酶0.5uL，DNA样品1.0uL，10umol/L正向引物0.5uL，10umol/L反向引物0.5uL，ddH2O 19.5uL。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 45s，共30个循环；72℃ 5min。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否存在特异性条带，分析样品中是否含有来源于E2D9050的成分。
本发明的有益效果
1.本发明首次公开高油酸转基因大豆事件E2D9050外源插入片段左边界和右边界侧翼序列。
2.本发明首次分析并确认高油酸转基因大豆事件E2D9050外源插入片段左、右边界侧翼序列组成，包括外源插入片段序列和栽培大豆沈农9号基因组序列，并确定外源片段在大豆基因组中的具体插入位点。
3.利用本发明提供外源插入片段左边界和右边界侧翼序列特征，建立高油酸转基因大豆事件E2D9050特异性定性PCR检测方法或制备检测试剂盒。
4.利用本发明提供的外源插入片段左、右边界侧翼序列及特异性检测方法，对转基因大豆事件E2D9050包括亲本、衍生品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品进行特异性检测，从而实现对转基因大豆及其产品的有效监督管理。
附图说明
图1.E2D9050转化载体pTF101-BCSP-GmFAD2-1Bi结构图谱
图2.转基因大豆事件E2D9050左边界侧翼序列特异性PCR检测.M：DNA分子量标准(DL2000)，1：E2D9050根，2：E2D9050茎，3：E2D9050叶片，4：E2D9050花，5：E2D9050种子，6：大豆品种沈农9号，7：大豆品种吉育47，8：大豆品种吉育72，9：玉米，10：棉花。
图3.转基因大豆事件E2D9050右边界侧翼序列特异性PCR检测.M：DNA分子量标准(DL2000)，1：E2D9050根，2：E2D9050茎，3：E2D9050叶片，4：E2D9050花，5：E2D9050种子，6：大豆品种沈农9号，7：大豆品种吉育47，8：大豆品种吉育72，9：玉米，10：棉花。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1.转基因大豆事件E2D9050外源片段插入位点分析
1.转基因大豆E2D9050基因组DNA提取
(1)基因组DNA提取：取1-2g大豆幼嫩叶片，液氮研磨至粉末状，装入50mL离心管中。依次加入5mL提取液A(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，0.35mol/L山梨醇，5mmol/L EDTA，pH8.0，1％2-巯基乙醇)，3.5mL提取液B(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，4.0mol/LNaCl，1.8％CTAB，25mmol/L EDTA，pH8.0)，0.3mL 30％月桂酰肌氨酸钠和2％PVP-360，55℃下温育60～90分钟，期间轻摇几次。取出离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，上下颠倒轻摇15分钟，然后常温下离心10分钟(13000rpm)。吸取上清液，加入2/3体积预冷的混合有上清液1/10体积的乙酸钠的异丙醇，4℃13000rpm离心20分钟。弃上清，用冷75％乙醇漂洗。空气中干燥DNA至表面干燥后，于-20℃保存
(2)基因组DNA纯化：用200uL ddH2O溶解DNA，加入5uL RNase(10mg/mL)，37℃温育40分钟。用等体积的酚/氯仿抽提1-2次，室温下13000rpm离心10分钟。转移上清至一个新的1.5mL离心管，并用等体积预冷100％氯仿沉淀。室温下13000rpm离心10分钟。转上清至新的2mL离心管，用两倍体积冷的无水乙醇(混合1/10体积乙酸钠)沉淀DNA，然后于-20℃放置30分钟。13000rpm离心15分钟，75％乙醇漂洗2次后，于空气中干燥15-20分钟。50～100uL ddH2O溶解DNA。紫外分光光度计(Quawell Q5000)测定DNA浓度后，于-20℃保存备用。
2.转基因大豆E2D9050基因组重测序分析
委托北京百迈客生物科技有限公司对转基因大豆E2D9050进行重测序分析。将检测合格的样品基因组DNA用超声波片段化，然后对片段化的DNA进行纯化、末端修复、3′端加A、连接测序接头。再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增形成测序文库。质检合格的文库采用二代高通量测序Xten平台进行测序。对测序得到的48547060个原始reads(双端序列)进行质量评估，并过滤得到47765735个Clean Reads。然后将Clean Reads与参考基因组序列(Wm82.a2.v1，http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝Org_Gmax)进行比对。通过比对定位Clean Reads在参考基因组上的位置，统计各样品的测序深度、基因组覆盖度等信息。本次分析数据量为14.54Gbp的Clean Data，Q30达到85.03％。样品与参考基因组平均比对率为99.36％，平均覆盖深度为14X，基因组覆盖度为98.82％(至少一个碱基覆盖)。
将转基因大豆E2D9050重测序数据分别比对到参考基因组和外源插入序列，根据比对结果找出下列两类Paired_end reads：第一类为一端reads比对上参考基因组序列，另一端reads比对上插入序列；第二类为两端中任何一端reads一部分序列比对上参考基因组序列，另一部分比对上插入序列。采用bwa比对参考基因组，选取能比对上外源插入序列的全部reads，进行局部组装。根据组装的contig使用blastn分别比对外源插入序列和参考基因组结果，选取contig序列比对到染色体的区域，并对这些区域的bwa比对结果进行IGV截图验证，获得外源插入片段插入位置信息。分析结果表明，转基因大豆E2D9050外源片段插入位点为Chr04号染色体51410941位点，插入方式为反向单拷贝插入。插入位点在参考基因组序列中的位置及其上游和下游～2kb序列(Gm04：51411941..51409940)如SEQ-1所示。
实施例2.转基因大豆事件E2D9050外源插入片段左、右边界侧翼序列分析
根据转基因大豆事件E2D9050外源插入序列及插入位点在大豆参考基因组中上、下游序列，设计PCR检测引物。E2D9050插入位点上游序列扩增引物为E2D9050LB-F1：(5’-CGAATGAATAGGAGCGAAGAAGGA-3’)和E2D9050LB-R1(5’-GCACCATCGTCAACCACTACATC-3’)；E2D9050插入位点下游序列扩增引物为E2D9050RB-F1(5’-AATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGG-3’)和E2D9050RB-R1(5’-TGAGGTCTGTATCTTCTCCATTGACG-3’)。
以E2D9050基因组DNA为模板，利用上述引物分别进行PCR扩增。PCR反应体系(25uL)为：10×PCR缓冲液2.5uL，10mmol/L dNTPs 0.5uL，5U/uL Taq酶0.5uL，样品DNA 1.0uL，10umol/L正向引物0.5uL，10umol/L反向引物0.5uL，ddH2O 19.5uL。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 3min，共35个循环；72℃ 15min。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。然后利用胶回收试剂盒纯化PCR产物，并连接到GENSTAR公司的EZ-T克隆载体。委托上海生工进行测序验证，并将测序结果与外源插入序列和参考基因组序列比对，最终获得转基因大豆事件E2D9050外源插入片段左边界侧翼序列如SEQ-2所示，右边界侧翼序列如SEQ-3所示。所述序列由来源于大豆基因组序列和来源于外源插入片段序列组成的DNA序列。
E2D9050外源插入片段左边界侧翼序列(SEQ-2)长度为966bp，其中，第1-521位点序列来源于栽培大豆沈农9号基因组序列，第522-966位点序列来源于外源插入片段序列。E2D9050外源插入片段右边界侧翼序列(SEQ-3)长度为988bp，其中，第1-376位点序列来源于外源插入片段序列，第377-988位点序列来源于栽培大豆沈农9号基因组序列。
实施例3.转基因大豆事件E2D9050特异性PCR检测
根据转基因大豆事件E2D9050外源插入片段左边界侧翼序列(如SEQ-2所示)和右边界侧翼序列(如SEQ-3所示)，分别设计特异性检测引物。左边界侧翼序列特异性检测引物组合中，其中一条引物为依据SEQ-2第1-521位点序列设计的正向引物，如SEQ-4所示；另一条引物为依据SEQ-2第522-966位点序列设计的反向引物，如SEQ-5所示。右边界侧翼序列特异性检测引物组合中，其中一条引物为依据SEQ-3第1-376位点序列设计的正向引物，如SEQ-6所示；另一条引物为依据SEQ-3第377-988位点序列设计的反向引物，如SEQ-7所示。
分别提取转基因大豆植株E2D9050根、茎、叶、花和种子DNA样品，DNA提取方法依实施例1中的方法。以受体非转基因大豆品种沈农9号、常规大豆品种吉育47、吉育72及玉米和棉花作为对照，进行PCR扩增。PCR反应体系(25uL)为：10×PCR缓冲液2.5uL，10mmol/L dNTPs 0.5uL，5U/uL Taq酶0.5uL，DNA样品1.0uL，10umol/L正向引物0.5uL，10umol/L反向引物0.5uL，ddH2O 19.5uL。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 45s，共30个循环；72℃ 5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，并利用EB进行染色，以鉴定是否存在特异性扩增条带。用上述特异性引物进行PCR扩增时，非转基因大豆品种沈农9号、常规大豆品种吉育47、吉育72及玉米和棉花均无扩增条带，只有转基因大豆E2D9050样品包括根、茎、叶、花和种子产生特异性扩增条带。其中，左边界侧翼序列扩增片段长度为391bp，如图2所示；右边界侧翼序列扩增片段长度为173bp，如图3所示。本研究表明，利用外源插入片段侧翼序列特异性引物进行PCR分析，可以特异性地检测样品中是否含有来源于E2D9050的成分。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。