本发明涉及一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，属于生物技术领域。
背景技术：
下丘脑-垂体-肾上腺轴（thehypothalamic-pituitary-adrenalaxis,hpaorhtpaaxis）是生物体内能够通过反馈调节稳定集体的一个系统。下丘脑的室旁核的分泌可以促进抗利尿激素和促肾上腺皮质激素释放激素作用于垂体，刺激垂体分泌肾上腺皮质激素，然后作用于肾上腺皮质分泌糖皮质激素。糖皮质激素通过绑定糖皮质激素受体（glucocorticoidreceptor，gr）可以反馈作用于下丘脑和垂体（分别抑制crh和acth的合成与分泌），形成反馈调节环路。hpa轴在包括免疫，压力应答等很多生理的稳态过程中起着重要的作用。临床的研究发现，几乎80%的抑郁症患者都发现糖皮质激素受体的表达降低的现象，并且青年期的不利因素会造成gr表达的异常，影响到成年后的情绪和精神疾病。所以研究gr的功能解析对于很多疾病的治疗提供新的思路。并且糖皮质激素受体作为研究抗抑郁病的过程中是一个非常有效的靶点。
斑马鱼是一种热带硬骨鱼，由于和人类基因的高度同源性和诸多的优势作为生物医学研究的模式生物已经达到将近四十年的历史。并且研究发现斑马鱼的糖皮质激素受体和人的糖皮质激素受体结构、功能和作用的机制具有高度的类似。由此利用遗传操作技术，构建了一种全身过量表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼。此斑马鱼品系可用来进行糖皮质激素受体相关的功能研究，也为以糖皮质激素受体为靶点的药物筛选提供便利。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，包括下列步骤：
第一步：利用斑马鱼基因克隆和酶切连接的方法构建得到载体tol2-crystallin启动子-egfp-pa-ef1α启动子-grcdna-pa-tol2；
第二步：将第一步得到的载体和tol2mrna共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；
第三步：培育所述受精卵获得全身过表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼。
优选的技术方案为：在第二步中，采用显微注射的方法。
优选的技术方案为：还包括提取f1代斑马鱼基因组，然后利用pcr方法对全身过表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼进行鉴定；所述pcr方法的的引物序列为：
正向引物：ggtgaacttcaagatccgcc；
反向引物：cttgtacagctcgtccatgc。
优选的技术方案为：所述tol2-crystallin启动子-egfp-pa-ef1α启动子-grcdna-pa-tol2载体的构建包括tol2-crystallin启动子-egfp-pa-tol2载体的构建、tol2-ef1α启动子-grcdna-pa-tol2载体的构建和利用同源重组的技术将crystallin启动子-egfp-pa片段重组进入tol2-ef1α启动子-grcdna-pa-tol2载体。
附图说明
附图1为载体图。
附图2为pcr电泳图。
附图3为可遗传的全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼眼睛有绿色荧光蛋白的表达。
附图4为荧光定量pcr反应测定糖皮质激素受体表达量和下游靶基因表达量。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明的优点是可遗传鱼是全身过表达的糖皮质激素受体，是可以反映体内的过量表达糖皮质激素受体后全身的生理，生化和行为。再者，本发明利用眼睛特异性egfp表达。这样可遗传的转基因斑马鱼更容易辨别。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
参见图1~4所示，须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例：一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法
一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，包括下列步骤：
第一步：利用斑马鱼基因克隆和酶切连接的方法构建得到载体tol2-crystallin启动子-egfp-pa-ef1α启动子-grcdna-pa-tol2；
第二步：将第一步得到的载体和tol2mrna共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；
第三步：培育所述受精卵获得全身过表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼。
鉴定可通过两种方式；第一种，直接观察斑马鱼研究，可遗传的全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼眼睛在荧光显微镜下有绿色。第二种，是提取f1代斑马鱼基因组，利用pcr方法，鉴定的引物序列为：正向引物：ggtgaacttcaagatccgcc；反向引物：cttgtacagctcgtccatgc。为了证明全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼是否成功，利用荧光定量pcr检测糖皮质激素受体和下游靶基因的表达。
优选的实施方式为：在第二步中，采用显微注射的方法。
优选的实施方式为：还包括提取f1代斑马鱼基因组，然后利用pcr方法对全身过表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼进行鉴定；所述pcr方法的的引物序列为：
正向引物seqidno.1：ggtgaacttcaagatccgcc；
反向引物seqidno.2：cttgtacagctcgtccatgc。
具体的pcr检测包括下列步骤：
a、基因组提取，步骤如下：取斑马鱼尾鳍，加入20μl50mmnaoh，95℃10min后加入20μl50mmtris，12000rpm离心2min，取上清做模板，pcr反应。正向引物seqidno.1、反向引物seqidno.2。
b、pcr反应如下：ddh2o：10.8μl；（2）dntps：2μl；taq酶buffer：2μl；正向引物：1μl；反向引物：2μl；模板dna2μl；taq酶：0.2μl。扩增程序。98℃3min，进入循环扩增阶段：98℃20s→65℃20s→72℃30sec，循环40次，最后在72℃保温10min，4℃∞。
c、pcr电泳结果如图2所示，图2中有372bp条带，即为可遗传斑马鱼。
利用荧光显微镜，将发育3-4天的斑马鱼放在绿色过滤镜片下观察，在可遗传的全身过表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼眼睛有绿色荧光蛋白的表达，结果如图3。
利用荧光定量pcr反应测定糖皮质激素受体表达量和下游靶基因表达量，结果如图4。
由图4可知，糖皮质激素受体和下游的靶基因在全身过表达糖皮质激素斑马鱼组中的表达明显升高，表明该转基因斑马鱼成功构建。
优选的实施方式为：所述tol2-crystallin启动子-egfp-pa-ef1α启动子-grcdna-pa-tol2载体的构建包括tol2-crystallin启动子-egfp-pa-tol2载体的构建、tol2-ef1α启动子-grcdna-pa-tol2载体的构建和利用同源重组的技术将crystallin启动子-egfp-pa片段重组进入tol2-ef1α启动子-grcdna-pa-tol2载体。
斑马鱼是一种热带淡水鱼类。由于其体积小，发育周期短，繁殖能力强，通体透明的优势，已经在生物基础研究领域广泛地应用。在本发明中所用的斑马鱼是ab品系的斑马鱼，ab品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。在斑马鱼的生理状况中，糖皮质激素的系统和人类是完全一样的，并且也具有保守的基因和保守的反馈调节系统。转基因激素是现在在斑马鱼研究中常用的集团因操作技术，能够对基因的功能，调节研究更加便利。本研究就是利用转基因技术获得转基因斑马鱼。
载体tol2-crystallin启动子-egfp-pa-ef1α启动子-grcdna-pa-tol2的构建具体包括：
一、tol2-crystallin启动子-egfp-pa-tol2载体的构建。
pcr反应扩增crystallin启动子，启动子克隆引物序列如下：正向引物序列seqidno.3：tcgagcaattggtgc，反向引物序列seqidno.4：tgctgggaaggctgg。pcr反应体系如下：斑马鱼基因组：1微升；正向引物：1微升；反向引物：1微升，kod酶缓冲液：25微升；kod酶：1微升；dntp:10微升；双蒸水：12微升。循环条件如下：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒；60℃退火20秒；68℃延伸30秒，最后延伸68℃10分钟。pcr产物大小为634bp，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，其序列为seqidno.5。将pcr产物进行胶回收后，和pt2xex-gfp载体分别进行酶切反应，酶切反应体系如下：xhol：1微升；bami：1微升；酶切缓冲液：2微升，胶回收产物10微升；双蒸水：6微升。混匀，在水浴锅中37℃水浴1小时。酶切后进行胶回收，回收片段进行连接反应，连接反应如下：载体酶切片段：1微升；crystallin启动子酶切片段7微升；t4连接酶：1微升；t4连接酶缓冲液：1微升。连接反应如下：pcr仪中，22℃1小时，16℃2小时。连接结束后进行转化反应，挑取正确的克隆。由此构建得到tol2-crystallin启动子-egfp-pa-tol2载体。
二、tol2-ef1α启动子-grcdna-pa-tol2载体的构建
利用pcr技术克隆grcdna。grcdna引物序列如下：正向引物序列seqidno.6：atggatcaaggaggactggag；反向引物序列seqidno.7：tcatttctggtgaaagagcag。pcr反应体系如下：斑马鱼cdna：1微升；正向引物：1微升；反向引物：1微升，kod酶缓冲液：25微升；kod酶：1微升；dntp:10微升；双蒸水：12微升。循环条件如下：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒；60℃退火20秒；68℃延伸1分钟，最后延伸68℃10分钟。pcr产物大小为1.8kb，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将pcr产物进行胶回收后，和pt2xex-gfp载体分别进行酶切反应，酶切反应体系如下：clai：1微升；bamhi：1微升；酶切缓冲液：2微升，胶回收产物10微升；双蒸水：6微升。混匀，在水浴锅中37℃水浴1小时。酶切后进行胶回收，回收片段进行连接反应，连接反应如下：载体酶切片段：1微升；grcdna酶切片段7微升；t4连接酶：1微升；t4连接酶缓冲液：1微升。连接反应如下：pcr仪中，22℃1小时，16℃2小时。连接结束后进行转化反应，挑取正确的克隆。由此构建得到tol2-ef1α启动子-grcdna-pa-tol2载体。ef1α启动子的序列seqidno.10。
三、tol2-crystallin启动子-egfp-pa-ef1α启动子-grcdna-pa-tol2载体的构建
利用同源重组的技术将crystallin启动子-egfp-pa片段重组进入tol2-ef1α启动子-grcdna-pa-tol2载体。反应过程如下：首先pcr扩增出crystallin启动子-egfp-pa片段。反应引物序列如下：正向引物序列seqidno.8：agatgatccccctgctcg；反向引物序列seqidno.9：agatgatccccctgctcg。pcr反应体系如下：crystallin启动子-egfp-pa质粒：1微升；正向引物：1微升；反向引物：1微升，kod酶缓冲液：25微升；kod酶：1微升；dntp:10微升；kod酶：1微升；双蒸水：12微升。循环条件如下：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒；60℃退火20秒；68℃延伸1分钟，最后延伸68℃10分钟。pcr产物大小为1.8kb，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将tol2-ef1α启动子-grcdna-pa-tol2载体单酶切线性化，酶切反应体系如下：xhol1：1微升；酶切缓冲液：2微升，胶回收产物10微升；双蒸水：7微升。混匀，在水浴锅中37℃水浴1小时。酶切后进行胶回收，回收片段进行重组反应，反应体系如下：酶切回收的tol2-ef1α启动子-grcdna-pa-tol2载体：1微升；pcr回收产物：7微升；重组缓冲液：2微升；重组酶：1微升。重组反应如下：55℃1小时；75℃30分钟。然后进行转化反应，挑取正确的克隆。载体图如图1所示。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
<110>苏州木芮生物科技有限公司
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